Спосіб отримання стероїдних гормонів in vitro

Реферат: UA 108917 U UA 108917 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до галузі ветеринарії та ветеринарної біотехнології, саме до способів отримання стероїдних гормонів, зокрема до способу отримання комплексу гормонів: тестостерону, естрадіолу і прогестерону in vitro. Корисна модель може бути використана для отримання комплексу стероїдних гормонів «тестостерон-естрадіол-прогестерон», виготовлення їх лікарських форм і препаратів та використання у практиці ветеринарної медицини для стимулювання репродуктивної функції самок і лікування безпліддя. Відомі способи отримання гормонів, зокрема естрогенів (естрадіолу, прогестерону) та препаратів з гормональною активністю з використанням тваринницької сировини: гіпофізу для отримання препаратів фолікулостимулюючого гормону; сім'яників самців - для отримання лідази, а крові самок, в тому числі, сироватки крові жеребих кобил - для отримання препаратів з гонадотропною (фолікулостимулюючим та лютеїнізуючим гормонами) активністю (Буркат В.П. та ін. Довідник з репродуктивної біотехнології великої рогатої худоби. - Львів, 2004. - С. 29-30.). Відомий також синтетичний спосіб синтезу відповідних гормонів з простих хімічних речовин: холестерину та амінокислот з коротким ланцюгом («Справочник ветеринарных препаратов применяемых в ветеринарии и животноводстве» / под ред. Дидовца С.Р. - К.: «Урожай», 1975. 351 с). Недоліками цих способів є те, що при отриманні гормонів (їх препаратів) синтетичним шляхом необхідне високотехнологічне обладнання та реактиви для їх синтезу, а для біологічних - необхідна значна кількість тваринницької сировини та спеціально обладнані лабораторії (цехи) для оброблення матеріалу, виділення та виготовлення препаратів гормонів. Крім цього, при використанні наведених способів виготовлення препаратів гормонів, зокрема естрогенів, отримують тільки один гормон. Найбільш перспективними для отримання комплексу стероїдних гормонів «тестостеронестрадіол-прогестерон» є використання біотехнологічного методу з культивуванням клітин, здатних синтезувати вказані біологічно активні сполуки. Так, існує спосіб отримання естрогенів з використанням клітин гранульозного шару фолікулів яєчників корів і суміші (1:1) середовищ Дюльбекко в модифікації Іґла : Хем F-12 з додаванням 1 мкМ/мл андростенедіону, 1 мкМ/мл інсуліну і 0,1% БСА. (Roberts Aj., Echternkamp S.E. In Vitro Production of Estradiol by Bovine Granulosa Cells: Evaluation of Culture Condition, Stage of Follicular Development and Location of Cells Within Follicles // Biology of Reproduction - 1994. - 51. - P. 273-282). Однак, недоліком вказаного способу є використання для культивування клітин гранульози двох середовищ, до яких додатково додають гормональні препарати та БСА. Найближчим по суті до способу, що заявляється, є «Спосіб отримання естрогенів in vitro» (Остапів Д.Д., Сачко Р.Г, Акимишин М.М. та ін. Спосіб отримання естрогенів in vitro. Патент України на корисну модель (UA). - № 59121; МПК (2011/01): A61D 7/00, № u201010103, Заявл. 16.08.2010, Опубл. 10.05.2011, Бюл. № 9. - 2011. - 4 с.) з використанням клітин гранульозного шару фолікулів яєчників корів і суміші синтетичне середовище RPMI-1640, з додаванням у співвідношенні компонентів (в мас. %): клітини гранульозного 5-7 млн. шару фолікулів клітин/мл еструсна сироватка корів 8-12 % фолікулярна рідини 10-12 % гепарин (5 тис. од.) 0,0005-0,0015 синтетичне середовище до 100 %. Проте, використання вказаного способу забезпечує тільки у 3-5 разів вище продукування естрадіолу і прогестерону за культивування клітин гранульози. Заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує отримання одночасно вищих концентрацій стероїдних гормонів: тестостерону, естрадіолу і прогестерону. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб, який би забезпечував отримання підвищеної концентрації стероїдних гормонів у комплексі «тестостерон-естрадіолпрогестерон», покращував фізіологічні властивості клітин гранульозного шару фолікулів яєчників корів і розкривав потенційну їх здатність утворювати стероїдні гормони, зменшував потребу в постійному пошуку і підборі тварин, час на відбір матеріалу, знижував додаткові витрати на зберігання та виготовлення, був простий у виробництві та застосуванні. Технічний результат досягають культивуванням клітин гранульозного шару фолікулів яєчників корів, які фізіологічно мають здатність синтезувати стероїдні гормони. Для виконання вказаного способу необхідно отримати з фолікулів яєчників корів клітини гранульозного шару, відмити у синтетичних середовищах таких як Dulbeccos modified Eagle medium (DME), Basal Medium Eagle (BME; Sigma) чи RPMI-1640 та культивувати 14-16 діб. У середовище культивування слід додавати у такому співвідношенні компоненти (в мас. %): 1 UA 108917 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 еструсна сироватки корів 8-12 % фолікулярна рідина 10-12 % гепарин (5 тис. од.) 0,001-0,0015 мл синтетичне середовище до 100 % і додатково вводять інсулін (3-5 мкг/ мл). Ефективність способу ґрунтується на здатності клітин гранульозного шару синтезувати стероїдні гормони у комплексі «тестостерон-естрадіол-прогестерон» в оптимальному співвідношенні для організму самок, а інтенсивність синтезу забезпечується складниками синтетичного середовища (амінокислотами, антиоксидантами, мінеральними солями, енергетичними субстратами - глюкозою, піруватом, сукцинатом) та доданих біологічних компонентів, які забезпечують фізіологічні процеси в клітинах гранульозного шару й синтезують вказані гормони. Додаткове введення інсуліну в дозі 3-5 мкг/мл у середовище культивування стимулює ріст і стероїдогенез клітин. Культура клітин гранульозного шару фолікулів здатна асимілювати неорганічні та органічні компоненти синтетичного середовища, а інсулін, доданий у склад середовища культивування, забезпечує підвищений синтез стероїдних гормонів. При такому способі культивування культура клітин гранульозного шару забезпечує отримання комплексу: «тестостерон-естрадіол-прогестерон» і є простим біотехнологічним способом отримання комплексу гормонів для виготовлення їх лікарських форм і препаратів та використання у практиці ветеринарної медицини для стимулювання репродуктивної функції самок і лікування безпліддя. При проведенні заявником патентно-інформаційного пошуку знайдено технічне рішення, в якому є ряд суттєвих ознак спільних із заявленим - використання біотехнологічного способу отримання комплексу стероїдних гормонів «тестостерон-естрадіол-прогестерон» при культивуванні клітин гранульозного шару фолікулів яєчників корів («Спосіб отримання естрогенів in vitro» Остапів Д.Д., Сачко Р.Г, Акимишин М.М. та ін. Спосіб отримання естрогенів in vitro. Патент України на корисну модель (UA). - № 59121; МПК (2011/01): A61D 7/00, №и 2010 10103, Заявл. 16.08.2010, Опубл. 10.05.2011, Бюл. № 9. - 2011. - 4 с.). Однак, даних суттєвих ознак недостатньо для одержання технічного результату заявленого рішення. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з ознаками заявленого способу отримання естрогенів in vitro не знайдено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію корисної моделі «новизна». У джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено відомостей про способи отримання стероїдних гормонів, які б містили ознаки, що відрізняють заявлену корисну модель від прототипу: використання клітин гранульозного шару фолікулів у синтетичних середовищах RPMI-1640 з додаванням (в мас. %): еструсна сироватка корів 8-12 % фолікулярна рідина 10-12 % гепарин (5 тис. од.) 001-0,0015 мл синтетичне середовище до 100 % і додаткове введення у склад середовища культивування інсуліну (3-5 мкг/мл). Корисна модель може бути використана у фармацевтичній галузі та ветеринарній біотехнології для виготовлення препаратів з вмістом комплексу стероїдних гормонів «тестостерон-естрадіол-прогестерон» та у практиці ветеринарної медицини для лікування й стимулювання репродуктивної функції самок сільськогосподарських тварин і тому відповідає критерію корисної моделі «промислова придатність». Для реалізації заявленої корисної моделі необхідно отримати клітини гранульозного шару фолікулів яєчників корів. Для цього, після забою корів, відбирають яєчники. Методом аспірації фолікулів отримують фолікулярну рідину з клітинами гранульозного шару, яку центрифугують за 2000 об./хв., супернатант відділяють, а осад клітин суспензують у середовищах відповідно до об'єму фолікулярної рідини: Dulbeccos modified Eagle medium (DME), Basal Medium Eagle (BME; Sigma) чи RPMI-1640 з додаванням: еструсної сироватки корів 8-12 %; фолікулярної рідини - 1012 %, гепарину (5 тис. од.) - 0,001-0,0015 мл), синтетичне середовище - до 100 % і додатково вводять інсулін (3-5 мкг/мл). Отримані клітини гранульози культивують у вищевказаних середовищах протягом 14-16 діб у герметично закритому ексикаторі за 5,0 % СО 2, 100 % вологості і температури 38,5 °C. За дотримання умов антисептики додаткове введення у склад середовища культивування антибіотиків та антимікотиків не доцільне. Після 14-16 добового культивування відбирають 2/3 середовища культивування. У відібраному середовищі культивування містяться продукти синтезу клітин гранульозного шару - гормони (нМоль/л): естрадіол - 1,3-20,9, прогестерон - 6,9-56,7 і тестостерон - 0,1-0,6. 2 UA 108917 U 5 10 15 Для оцінювання ефективності заявленого способу отримання естрогенів було проведено дослід конкретного виконання рішення. На м'ясопереробному підприємстві відбирають яєчники корів. В умовах лабораторії отримують клітини гранульозного шару з фолікулів і їх культивують впродовж 30-32 діб. При цьому, для встановлення ефективності заявленого способу клітини гранульози розділяють на дві частини. Одна частина культивується у середовищі - прототипі, інша - за заявленим способом. Вміст стероїдних гормонів «тестостерон-естрадіол-прогестерон» у вихідній культурі клітин (0 доба культивування) та середовищі культивування через 7-8, 14-16 і 30-32 доби визначають імуноферментним методом. Встановлено, що при культивуванні клітини гранульози синтезують стероїдні гормони і виділяють їх в середовище культивування (табл.). Так, у вихідній культурі клітин (0 доба культивування) концентрація естрадіолу - 2,5±1,08, прогестерону 7,3±2,42 і тестостерону - 0,03±0,001 нМоль/л. Збільшення тривалості культивування до 2-3 діб характеризується підвищенням концентрацій гормонів: у прототипі естрадіолу на 69,6 %, прогестерону - 71,6 % і тестостерону - 85,0 % та в заявленому способі, відповідно, 79,2, 76,3 і 85,0%. Таким чином, у середовищі з додаванням інсуліну приріст концентрацій стероїдних гормонів вищий: естрадіолу на 9,6 %, прогестерону 4,7 %, а тестостерону - на рівні прототипу. Через 7-8 діб культивування концентрації стероїдних гормонів у прототипі проявляли тенденцію до зниження естрадіолу. Таблиця Інтенсивність синтезу естрогенів клітинами гранульозного шару фолікулів корів. Концентрація гормонів, нМоль/л Доба n 0 12 Естрадіол 2,5±1,08 2-3 7-8 14-16 30-32 7 9 26 18 8,2±0,64 7,4±1,48 4,6±0,81 1,3±0,45 2-3 7-8 14-16 30-32 7 9 12 18 12,0±4,31 20,9±1,51 19,1±4,88 9,0±0,96 Прогестерон 7,3±2,42 прототип 25,7±5,27 16,6±2,57 11,3±4,54 21,6±1,33 заявлений спосіб 30,7±9,74 56,7±1,21 37,9±1,46 6,9±0,74 Тестостерон 0,03±0,001 0,2±0,08 0,1±0,01 0,4±0,11 0,4±0,21 0,2±0,04 0,6±0,16 0,6±0,08 0,2±0,06 20 25 30 35 40 на 9,8 %, прогестерону на 35,5 % і тестостерону на 50 %, порівняно з 2-3 добовими. У заявленому способі концентрації гормонів продовжує зростати, відповідно, на 42,6, 45,9 і 66,7 %. Після 14-16 діб культивування, порівняно до 7-8 добових, концентрація естрадіолу в культурі клітин прототипу знижується на 37,9 % до 4,6±0,81 нМоль/л, а у заявленому середовищі - не змінюється (19,1±4,88 нМоль/л). Через 14-16 діб концентрація естрадіолу за використання заявленого способу вища більше, ніж у 4 рази, порівняно з прототипом. Отже, використання заявленого способу забезпечує підвищення концентрації естрадіолу в 7,6 разів, порівняно з вихідним рівнем (0 доба культивування). Концентрація прогестерону протягом 7-16 діб у прототипі майже не змінюється і становить 11,3-16,6 нМоль/л, а у заявленому способі знижується на 33,2 %, порівняно з максимальним значенням і на 14-16 добу становить 37,9±1,46 нМоль/л, що на 70,2 % вище, ніж у прототипі. Концентрація тестостерону у прототипі через 14-16 діб культивування зростає на 75,0 % до 0,4±0,11 нМоль/л, порівняно з 7-8 добовою культурою клітин, а у заявленому способі не змінюється і становить 0,6±0,08 нМоль/л. При культивуванні клітин гранульози 30-32 доби у прототипі концентрація естрадіолу ще знижується на 71,8 % до 1,3±0,45 нМоль/л, а прогестерону - підвищується майже в 2 рази до 21,6±1,33 нМоль/л, порівняно з 14-16 добовими. У заявленому способі концентрація досліджуваних гормонів також знижується, відповідно, до 9,0±0,96 і 6,9±0,74 нМоль/л. Концентрація тестостерону у прототипі у вказаний період досліджень становить 0,4±0,21 нМоль/л, а у заявленому способі 0,2±0,06 нМоль/л, різниця між значеннями - 50,0 %, однак статистично не вірогідна (р > 0,05). 3 UA 108917 U Отже, за використання заявленого способу отримання естрогенів клітини гранульози доцільно культивувати 14-16 діб у середовищі RPMI-1640, з заміною 2/3 об'єму середовища через 7-8 діб, що забезпечує стабільний стероїдогенез і вищі концентрації естрадіолу на 75,9 %, прогестерону - 70,1 % і тестостерону - 33,3 %, порівняно з прототипом. 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 1. Спосіб отримання стероїдних гормонів in vitro, який включає типове синтетичне середовище RPMI-1640, клітини гранульозного шару фолікулів, еструсну сироватку корів, фолікулярну рідину, гепарин, який відрізняється тим, що до його складу додатково вводять інсулін, за такого співвідношення компонентів: клітини гранульозного шару 5-7 млн. фолікулів клітин/мл фолікулярна рідина 10-12 еструсна сироватка корів 8-12 0,0005гепарин (5 тис. од.) 0,0015 мл інсулін 3-5 мкг/мл синтетичне середовище RPMIдо 100 %. 1640 2. Спосіб отримання стероїдних гормонів in vitro за п. 1, який відрізняється тим, що клітини гранульозного шару отримують з фолікулів яєчників корів і культивують 14-16 діб, з заміною 2/3 об'єму середовища культивування через 7-8 діб. 15 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4