Штам agrobacterium, модифікований для збільшення частоти трансформації рослин

Реферат: UA 112968 C2 (12) UA 112968 C2 Винахід стосується способу трансформації рослини, який включає контактування клітини рослини зі штамом Agrobacterium, що має недостатність функції RecA, який містить щонайменменше одну допоміжну плазміду рТі, яка включає фрагмент 14,8 КрnТ з pSBl, і плазміду рТі, яка містить щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, причому ділянка Т-ДНК включає щонайменше праву границю Т-ДНК і екзогенну ДНК, яка прилягає до границі, де плазміди містять точки початку реплікації, які відрізняються між собою, а також до штаму Agrobacterium, що має недостатність функції RecA, також до рослини, одержаної за заявленим способом. UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За даною заявкою заявляється пріоритет попередньої заявки США № 61/368965, поданої 29 липня 2010 року. Розкриття попередньої заявки розглядається як частина розкриття даної заявки. Відомий рівень техніки Трансформація рослин звичайно охоплює методи, необхідні і використовувані для введення в рослинні клітини здатного експресуватися в рослинах чужорідного гена, так що можуть бути отримані здатні до запліднення потомки рослин, які стабільно підтримують і експресують чужорідний ген. Були трансформовані численні представники, класифіковані як однодольні і дводольні рослини. Трансгенні сільськогосподарські культури, а також фрукти й овочі становлять комерційний інтерес. Такі культури включають, але не обмежуються цим, маїс, рис, сою, канолу, соняшник, люцерну, сорго, пшеницю, бавовну, арахіс, томати, картоплю тощо. Незважаючи на розвиток систем трансформації рослин для введення в рослинні клітини здатного експресуватися в рослинах чужорідного гена, бажані додаткові удосконалення, які дозволять підвищити ефективність трансформації і забезпечать істотні переваги для подолання робочих недоліків при трансформації рослин чужорідними генами. Відомо декілька способів уведення чужорідного генетичного матеріалу в рослинні клітини й отримання рослин, які стабільно підтримують і експресують уведений ген. Такі способи включають доставку генетичного матеріалу, нанесеного на мікрочастинки, із прискоренням прямо в клітини (наприклад, у патенті США № 4945050 і патенті США № 5141131). Інший спосіб трансформації включає технологію з застосуванням карбіду кремнію або технологію WHISKERS™. Див., наприклад, патент США № 5302523 і патент США № 5464765. Метод електропорації також використовувався для трансформації рослин. Див., наприклад, патент WO 87/06614, патент США № 5472869, патент США № 5384253, патенти WO 92/09696 і патент WO 93/21335. Крім того, може бути використане злиття протопластів рослин з ліпосомами, які містять ДНК, призначену для доставки, пряме введення ДНК, а також інші можливі способи. Після інтеграції ДНК у рослинний геном, вона звичайно стає відносно стабільною протягом наступних поколінь. Трансформовані клітини ростуть усередині рослин звичайним чином. Вони можуть утворювати статеві клітини і передавати характерну(-ні) особливість(-ості) трансформації потомкам рослин. Такі рослини можуть бути вирощені нормальним чином і можуть схрещуватися з рослинами, які мають ті ж самі трансформовані наслідувані фактори або інші наслідувані фактори. Отримані в результаті гібридні індивідууми мають відповідні фенотипічні властивості, наприклад, здатність контролювати харчування комах-шкідників рослин. Для введення ДНК у рослинні клітини-хазяїни може бути також використаний ряд альтернативних методів. Ці методи включають, але не обмежуються цим, трансформацію за допомогою Т-ДНК, яка доставляється Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як агентів трансформації. Рослини можуть бути трансформовані з використанням методу з застосуванням Agrobacterium, як описано, наприклад, у патенті США № 5177010, патенті США № 5104310, європейській патентній заявці № 0131624B1, європейській патентній заявці № 120516, європейській патентній заявці № 159418B1, європейській патентній заявці № 176112, патенті США № 5149645, патенті США № 5469976, патенті США № 5464763, патенті США № 4940838, патенті США № 4693976, європейській патентній заявці № 116718, європейській патентній заявці № 290799, європейській патентній заявці № 320500, європейській патентній заявці № 604662, європейській патентній заявці № 627752, європейській патентній заявці № 0267159, європейській патентній заявці № 0292435, патенті США № 5231019, патенті США № 5463174, патенті США № 4762785, патенті США № 5004863 і патенті США № 5159135. Використання векторів, які містять Т-ДНК, для трансформації рослинних клітин інтенсивно досліджувалося й адекватно описане в європейській патентній заявці 120516; An et al., (1985, EMBO J. 4:277-284), Fraley et al., (1986, Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46) і Lee and Gelvin (2008, Plant Physiol. 146: 325-332), і добре обґрунтовано в даній галузі техніки. Відома біологія перенесення Т-ДНК із Agrobacterium у рослинні клітини. Див., наприклад, Gelvin (2003) Microbiol. Molec. Biol. Rev. 67:16-37; і Gelvin (2009) Plant Physiol. 150:1665-1676. Як мінімум щонайменше правий пограничний повтор Т-ДНК, але часто як правий пограничний повтор, так і лівий пограничний повтор плазміди Ti або Ri повинні бути з'єднані у вигляді фланкуючої ділянки генів, які бажано ввести в рослинну клітину. Лівий і правий пограничні повтори Т-ДНК є ключовими цис-діючими послідовностями, необхідними для перенесення ТДНК. У повному геномі Agrobacterium закодовані різні транс-діючі компоненти. Головними серед них є білки, які кодовані генами vir, які звичайно виявляються у вигляді серій оперонів у плазмідах Ti або Ri. Різні плазміди Ti і Ri до деякої міри відрізняються за набором генів vir, наприклад, vir є присутнім не завжди. Білки, які кодовані генами vir, виконують багато різних 1 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 функцій, включаючи, у вигляді згадування деяких характеристик, впізнавання і сигналізацію при взаємодії рослинна клітина/бактерії, індукцію транскрипції гена vir, утворення секреторного каналу типу IV, впізнавання пограничних повторів Т-ДНК, утворення T-ланцюгів, перенесення Tланцюгів у рослинну клітину, імпорт T-ланцюгів у ядро рослинної клітини й інтеграцію Tланцюгів у хромосомі клітинного ядра рослини. Див., наприклад, Tzfira and Citovsky (2006) Curr. Opin. Biotechnol. 17:147-154. Якщо для трансформації використовують штами Agrobacterium, ДНК, призначену для введення в рослинну клітину, можна клонувати у спеціальних плазмідах, наприклад, або в проміжному (човниковому) векторі, або в бінарному векторі. Проміжні вектори не здатні до незалежної реплікації в клітинах Agrobacterium, але маніпуляції з ними і їхньою реплікацією можна проводити в розповсюджених штамах Escherichia coli для молекулярного клонування. Такі проміжні вектори включають послідовності, звичайно обмежені рамками ділянок пограничних правих і лівих повторів Т-ДНК, вони можуть включати маркерний ген селекції для добору трансформованих рослинних клітин, клонуючий лінкер, клонуючий полілінкер або іншу послідовність, яка може функціонувати як сайт для введення генів, призначених для трансформації рослинної клітини. Клонування і керування генами, які бажано перенести в рослини, таким чином, може бути легко здійснене за допомогою стандартних методів у E. coli з використанням як клонуючого вектора човникового вектора. Після закінчення маніпуляцій човниковий вектор може бути згодом введений у штами Agrobacterium, призначені для трансформації рослин, для наступної роботи. Проміжний човниковий вектор може бути перенесений у Agrobacterium за допомогою допоміжної плазміди (шляхом кон'югації бактерій), шляхом електропорації, за допомогою опосередкованої хімічно прямої трансформації ДНК або за допомогою інших відомих методів. Човникові вектори можуть бути інтегровані в плазміду Ti або Ri або в їхні похідні за допомогою гомологічної рекомбінації, завдяки послідовностям, які гомологічні в плазміди Ti або Ri або їхніх похідних і в проміжної плазміди. Це подія гомологічної рекомбінації (тобто інтеграції плазміди) тим самим є засобом стабільної підтримки зміненого човникового вектора в Agrobacterium із точкою початку реплікації й інших функцій підтримки плазміди, забезпечуваними частиною плазміди Ti або Ri у коінтегративній плазміді. Плазміда Ti або Ri також включає ділянки vir, які включають гени vir, необхідні для перенесення Т-ДНК. Плазміда, яка несе ділянку vir, звичайно являє собою мутовану Ti або Ri плазміду (допоміжну плазміду), з якої вилучена ділянка Т-ДНК, включаючи праві і ліві пограничні повтори Т-ДНК. Такі плазміди, які походять від pTi, які мають функціонуючі гени vir і позбавлені усього або по суті усього з T-ділянки і супровідних елементів, при описі в даному документі позначаються як допоміжні плазміди. Супербінарна система являє спеціалізований приклад човникового вектора/системи гомологічної рекомбінації (розглянуто в оглядах Komari et al., (2006) у: Methods in Molecular nd Biology (K. Wang, ed.) No.343: Agrobacterium Protocols (2 Edition, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41; і Komori et al., (2007) Plant Physiol. 145:1155-1160). Штам хазяїна Agrobacterium tumefaciens, застосовуваний із супербінарною системою, являє собою LBA4404(pSB1). Штам LBA4404(pSB1) несе дві плазміди pAL4404 і pSB1, які незалежно реплікуються. pAL4404 являє собою допоміжну плазміду, яка походить від Ti плазміди, яка містить інтактний набір генів vir (від Ti плазміди pTiACH5), але яка не має ділянки Т-ДНК (і, отже, не має послідовностей лівих і правих пограничних повторів). Плазміда pSB1 постачає додатковим частковим набором генів vir, які походять з pTiBo542; цей частковий набір генів vir включає оперон vir і оперон vir, а також гени vir і vir1. Одним прикладом човникового вектора, використовуваного в супербінарній системі, є pSB11, який містить клонуючий полілінкер, який слугує як сайт введення генів, призначених для трансформації рослинної клітини, до якого примикають ділянки правих і лівих пограничних повторів Т-ДНК. Човниковий вектор pSB11 не здатний до незалежної реплікації в Agrobacterium, але стабільно підтримується у вигляді коінтегративної плазміди при інтеграції в pSB1 за допомогою гомологічної рекомбінації між загальними послідовностями, які є присутніми у pSB1 і pSB11. Таким чином, повністю модифікована ділянка Т-ДНК, введена в LBA4404(pSB1) у модифікованому векторі pSB11, продуктивно діє в ньому і переноситься в рослинні клітини за допомогою білків Vir, які походять від двох різних джерел плазмід Ti Agrobacterium (pTiACH5 і pTiBo542). Супербінарна система, як доведено, є особливо придатною для трансформації видів однодольних рослин. Див. Hiei et al., (1994) Plant J. (6:271-282 і Ishida et al., (1996) Nat. Biotechnol. 14:745-750. Крім генів vir, які несуть плазміди Ti Agrobacterium, інші, які походять з хромосом гени, які контролюють вірулентність (які позначаються як гени chv), відомі як контролюючі визначені аспекти взаємодій клітин Agrobacterium і рослинних клітин і в такий спосіб, впливають на сумарну частоту трансформації рослин (Pan et al., (1995) Molec. Microbiol. 17:259-269). Деякі з 2 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 генів, які походять з хромосом, необхідних для вірулентності і приєднання, згруповані разом у хромосомному локусі на відрізку в 29 тисяч основ (Matthysse et al., (2000) Biochim. Biophys. Acta 1490:208-212). Незалежно від конкретної застосовуваної плазмідної системи, клітини Agrobacterium, трансформовані таким чином, використовуються для трансформації рослинних клітин. Рослинні експланти (наприклад, частини листя, сегменти стебла, коренів, а також протопласти або культивовані в суспензії клітини) можуть бути успішно прокультивовані з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes для перенесення ДНК у рослинну клітину. Потім може бути здійснена регенерація цілих рослин з інфікованого рослинного матеріалу з наступним вміщенням у придатні умови росту і культуральне середовище, яке може містити антибіотики або гербіциди для селекції трансформованих рослинних клітин. Отримані в такий спосіб рослини можна потім тестувати на присутність вставленої ДНК. Ці методи введення чужорідного генетичного матеріалу в рослини можуть бути використані для введення сприятливих ознак у рослини. Наприклад, мільярди доларів витрачаються щороку для контролювання комах-шкідників і ще мільярди втрачаються через заподіяний ними збиток. Синтетичні інсектициди на основі органічної хімії є головними засобами, використовуваними для контролювання комах-шкідників, але в деяких ділянках важливу роль відіграють біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, які походять від Bacillus thuringiensis (Bt). Здатність створювати стійкі до комах рослини шляхом уведення генів інсектицидних білків Bt відіграє революційну роль у сучасному сільському господарстві і підвищує цінність інсектицидних білків і їхніх генів. Для створення стійких до комах трансгенних рослин використано декілька білків Bt, які успішно розроблені й у багатьох випадках зареєстровані і впроваджені в промисловість. Вони включають Cry1Ab, Cry1Ca, Cry1Fa і Cry3Bb у кукурудзі, Cry1Ac і Cry2Ab у бавовні і Cry3A у картоплі. Комерційні продукти, які експресують білки Bt, експресують один білок за винятком випадків, коли бажаний об'єднаний спектр із 2 білків (наприклад, об'єднання Cry1Ab і Cry3Bb у кукурудзі для додавання стійкості до лускокрилих метеликів шкідників і довговусих блішок, відповідно) або коли незалежна дія білків робить їх корисними як засіб для затримки розвитку стійкості в сприйнятливих популяцій комах (наприклад, об'єднання Cry1Ac і Cry2Ab у бавовні для забезпечення керування стійкістю до гусениці листовійки-брунькоїда тютюну). Це значить, що деякі з якостей трансгенних рослин, стійких до комах, які привели до швидкого і широкого використання цієї технології, у результаті також приводять до того, що популяції шкідників будуть виробляти стійкість до інсектицидних білків, продукованих цими рослинами. Запропоновано декілька стратегій для збереження придатності ознак стійкості до комах, створених на основі Bt, які включають розгортання білків при високій дозі в поєднанні з укриттям і чергування з різними токсинами або їхнє спільне розгортання (McGaughey et al. 1998, Nature Biotechnol. 16:144-146). Якщо проводять селекцію білків Bt для використання в поєднанні, необхідно, щоб вони виявляли свій інсектицидний ефект незалежно так, щоб стійкість, яка розвинулася до одного білка, не додавала стійкості до другого білка (тобто щоб не спостерігалося перехресної стійкості до білків). Оцінка надійності перехресної стійкості звичайно здійснюється з використанням популяцій видів шкідників, звичайно чутливих до інсектицидного білка, які були відібрані по стійкості до інсектицидних білків. Якщо, наприклад, популяція шкідників, відібрана по стійкості до "білка A", чутлива до "білка B", то можна вважати, що не існує перехресної стійкості, і що поєднання білка A і білка B повинно бути ефективним відносно стримування стійкості до білка A окремо. При відсутності популяцій стійких комах оцінки можуть бути зроблені на основі інших характеристик, які приблизно стосуються механізму дії і потенціалу перехресної стійкості. Припущено використання зв'язування, опосередкованого рецепторами, для ідентифікації інсектицидних білків, імовірно, які не виявляють перехресної стійкості (патент США № 6855873). Ключовим моментом передбачання відсутності сумарної перехресної стійкості в цьому підході є те, що інсектицидні білки не конкурують за рецептори в чутливих видів комах. У тому випадку, коли два токсини Cry з Bt конкурують за той самий рецептор, то потім, якщо цей рецептор мутує у цієї комахи так, що один з токсинів не буде більше зв'язуватися з цим рецептором і в такий спосіб не буде більше інсектицидним відносно цієї комахи, це також повинно бути аргументом на користь того, що комаха буде також стійкою до другого токсину (який конкурентно зв'язується з тим же рецептором). Однак якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, це може слугувати вказівкою на те, що комаха не повинна бути стійкою одночасно до цих двох токсинів. 3 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Cry1Fa є придатним для контролю багатьох видів лускокрилих шкідників, включаючи європейського кукурудзяного метелика (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) і трав'яну совку (FAW; Spodoptera frugiperda), і активний проти вогнівки цукрової тростини (SCB; Diatraea saccharalis). Білок Cry1Fa при продукції в зернових рослинах з індукованою подією TC1507 є відповідальним за лідируючу у галузі ознаку стійкості для контролю FAW. Cry1Fa додатково використовують у продуктах HERCULEX®, SMARTSTAX™ і WIDESTRIKE™. Можливість проведення досліджень (конкурентного або гомологічного) зв'язування з рецептором з використанням білка Cry1Fa обмежена, тому що найбільш загальноприйнятий метод, доступний для мічення білків у методах визначення зв'язування з рецептором, веде до інактивації інсектицидної активності білка Cry1Fa. Cry1Ab і Cry1Fa являють собою інсектицидні білки, у даний час використовувані (окремо) у трансгенній кукурудзі для захисту рослин від різних комах-шкідників. Головним шкідником кукурудзи, проти якого ці білки надають захист, є європейський кукурудзяний метелик (ECB). Патентна заявка США № 2008/0311096 частково стосується використання Cry1Ab для контролювання стійкої до Cry1F популяції ECB. У даній заявці описуються штами Agrobacterium tumefaciens, які модифіковані для підвищення частоти трансформації рослин. При використанні цих штамів надаються нові системи трансформації рослин для введення в рослинні клітини чужорідних генів, здатних експресуватися в рослинах. Крім того, ці штами забезпечують додатковими удосконаленнями, які дозволяють підвищити ефективність трансформації і надають істотні переваги в подоланні робочих недоліків при трансформації рослин чужорідними генами. Короткий виклад суті винаходу У даному документі описуються штами Agrobacterium, які несуть гени, які підсилюють трансформацію, у плазміді, здатній реплікуватися незалежно від хромосоми Agrobacterium, плазміді Ti, і бінарні вектори трансформації рослин, а також способи їхнього застосування. Штами Agrobacterium є дефектними відносно функцій рекомбінації ДНК; що веде до нестабільності або реорганізації бінарних векторів трансформації рослин, і вони несуть гени, які підсилюють трансформацію, у плазміді, здатній реплікуватися незалежно від хромосоми Agrobacterium, плазміді Ti, і бінарні вектори трансформації рослин. Описуються також додаткові штами Agrobacterium, які несуть гени, які підсилюють трансформацію, інтегровані в хромосому Agrobacterium, у локусі, який не перешкоджає або яким-небудь іншим чином не порушує нормальний ріст і здатність клітин Agrobacterium до трансформації рослин, і їхнє застосування. В одному варіанті здійснення описаних у даному документі способів рослина трансформується в результаті контактування клітини рослини зі штамом Agrobacterium, який має щонайменше одну допоміжну плазміду pTi, яка включає 14,8 KpnІI фрагмент pSB1, і плазміду pTi, яка має щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, причому ділянка Т-ДНК включає щонайменше праву границю Т-ДНК і екзогенну ДНК, яка прилягає до границі, де плазміди мають різні точки початку реплікації відносно один одного. У додатковому варіанті здійснення описаних у даному документі способів рослина трансформується в результаті контактування клітини рослини з бактерією роду Agrobacterium, яка має 14,8 KpnІІ фрагмент VirBCDG і плазміду pTi, яка має щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, де 14,8 KpnІІ фрагмент VirBCDG інтегрований у нейтральний сайт інтеграції хромосоми бактерії. У додатковому варіанті здійснення описаних у даному документі способів штам Agrobacterium включає щонайменше одну допоміжну плазміду pTi, яка включає 14,8 KpnІІ фрагмент pSB1, і плазміду pTi, яка має щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК, де плазміди мають різні точки початку реплікації відносно один одного. У додатковому варіанті здійснення штам Agrobacterium з посилюючими трансформацію властивостями включає 14,8 KpnІІ фрагмент VirBCDG, виділений з pSB1, і плазміду pTi, яка має щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК. В іншому варіанті здійснення геномний локус nilА Agrobacterium tumefaciens включає полінуклеотидну послідовність, яка інтегрована в геномний локус nilА. У додатковому варіанті здійснення штам LB4404 Agrobacterium включає 14,8 KpnІІ фрагмент VirBCDG pSB1 у допоміжній плазміді pTi і плазміду pTi, яка має щонайменше одну обеззброєну ділянку Т-ДНК і яка має екзогенну ДНК, яка прилягає щонайменше до однієї границі Т-ДНК Agrobacterium, де плазміди мають різні точки початку реплікації відносно один одного. У додатковому варіанті здійснення штам LB4404 Agrobacterium включає щонайменше один ген vir з 14,8 KpnІІ фрагмента VirBCDG, виділеного з pSB1, інтегрований у нейтральний сайт інтеграції хромосоми Agrobacterium. 4 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У додаткових варіантах здійснення пропонуються рослини, які створені відповідно до описаних в даному документі способів трансформації. У ще одному варіанті здійснення фертильна трансгенна зернова рослина або її нащадок експресує інсектицидні кількості білка Cry1Ca, інсектицидного білка Cry1F, інсектицидного білка Cry1Abl і толерантні до гербіцидів кількості білка AAD-1, де білки Cry1Ca, Cry1F, Cry1Ab1 і AAD1 спільно експресуються з одного локусу рекомбінантної ДНК, стабільно включеної в геном рослини. Опис фігур Фіг. 1. Показана схема клонування для конструкції плазміди pDAB9292. Фіг. 2. Показана карта плазміди pDOW3719. Фіг. 3. Показана схема клонування для конструкції плазміди pDAB9698. Фіг. 4. Показані карти бінарних векторних плазмід pDAB101513 і pDAB101514. Фіг. 5. Показана карта бінарної векторної плазміди pDAB101556. Докладний опис винаходу Штами Agrobacterium відрізняються від інших за своєю здатністю трансформувати рослинні клітини. Онкогенні штами Agrobacterium дикого типу відомі своєю здатністю індукувати галли (пухлинний надлишковий ріст) у багатьох рослин-хазяїнів, особливо у видів дводольних. Ця трансформація нормально зростаючих рослинних клітин у пухлинні клітини з відсутністю їхньої саморегуляції виникає як результат перенесення спеціальних послідовностей ДНК (Т-ДНК), які кодують гени, експресовані в рослинах, які кодують рослинні гормони, з індукуючої пухлину (Ti) плазміди в рослинні клітини, де вони стабільно інтегруються в хромосоми рослини. Плазміда Ti зі штаму Bo542 (тобто pTiBo542) примітна тим, що при розміщенні в хромосомних середовищах Agrobacterium вона стимулює індукцію особливо великих інтенсивно зростаючих пухлин у деяких рослин (Hood et al., (1986) J. Bacteriol. 168:1291-1301). Гени, відповідальні за цей фенотип "супервірулентності", знаходяться в pTiBo542 поза ділянками Т-ДНК. При подальшому дослідженні було виявлено, що плазміда, яка містить "15,8" тисяч пар основ (т.п.о.) фрагмента KpnІІ, який походить з pTiBo542, яка містила повні оперони virG, virB і virC, стимулювала посилене утворення пухлини штамом A281 у порівнянні зі штамами, які не мають плазміду (Jin et al., (1987) J. Bacteriol. 169:4417-4425). Ген virG плазміди pTiBo542, як вважається, є відповідальним за супервірулентний фенотип штаму Agrobacterium A281. virG з pTiBo542 викликає підвищення експресії virВ у 1,7 разів у порівнянні з virG з pTiА6 через розходження між двома генами в промоторних ділянках, кодуючих послідовностях і 3'-нетрансльованих ділянках (Chen et al., (1991) Molec. Gen. Genet. 230:302-309). Таким чином, ген virG з pTiBo542 може бути вигідно використаний для стимуляції більш високої ефективності перенесення Т-ДНК, і в результаті цього, більш високої частоти трансформації рослин, особливо, коли він присутній у великому фрагменті KpnІІ плазміди pTiBo542, яка несе також оперони virВ і virС плазміди pTiBo542. Повна, анотована послідовність pTiBo542 була відправлена в GENBANK з номером надходження DQ058764 12 травня 2005 р. Аналіз карти рестрикції фрагмента KpnІ і анотації генів показують, що повний оперон virВ (який включає гени virB1, virB2, virB3, virB4, virB5, virB6, virB7, virB8, virB9, virB10 і virB11), ген virG, оперон virС (який включає гени virС1 і virС2) і частина оперона virD, яка включає ген virD1, можливо виділити з фрагмента KpnІ, який включає 14815 пар основ (п.о.). Передбачається, що розмір "15,8 т.п.о." фрагмента KpnІ, на який посилаються в статті Jin et al. (вище), був визначений за рухливістю фрагмента в агарозному гелі, і що реальний розмір зазначеного фрагмента складає в дійсності 14,8 т.п.о. Фахівець в галузі молекулярної біології повинен розуміти, що визначення розміру таких великих фрагментів ДНК за допомогою визначення рухливості при електрофорезі в агарозному гелі може відрізнятися від реального розміру фрагмента, визначеного аналізом послідовності ДНК на 1 т.п.о. або більше. Для полегшення опису цей фрагмент, який походить з pTiBo542, у даному документі буде позначатися як фрагмент 14,8 KpnІ VirBCDG. Варіант здійснення способів, описаних у даному документі, включає використання для трансформації рослини посилюючих трансформацію властивостей, кодованих у фрагменті 14,8 KpnІ VirBCDG, виділеному з pSB1, у штамах Agrobacterium, які несуть щонайменше одну обеззброєну допоміжну плазміду Ti, де фрагмент 14,8 KpnІ VirBCDG несеться плазмідою, яка має точку початку реплікації групи несумісності, відмінної від IncР. Додатковий варіант здійснення включає штам Agrobacterium, як описано, для використання в цьому способі. Ділянку Т-ДНК, призначену для введення в рослину з використанням штаму Agrobacterium, може переносити плазміда, яка має ділянку Т-ДНК, яка примикає щонайменше до однієї границі ТДНК Agrobacterium, причому плазміда має точку початку реплікації групи несумісності IncР або групи несумісності, яка сумісна з групою несумісності фрагмента 14,8 KpnІ VirBCDG, який 5 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переноситься плазмідою, яка має точку початку реплікації групи несумісності, відмінної від IncР. Ділянка Т-ДНК цієї плазміди може прилягати до правої і лівої границь Т-ДНК Agrobacterium. Плазміди приписують до груп несумісності (генотипове позначення: inc; позначення групи Inc) на основі послідовностей, які містяться в плазміді. Детермінанта inc звичайно служить як перешкода для співіснування в того самого хазяїна інших плазмід тієї ж або родинної групи несумісності і допомагає підтримувати визначену кількість копій плазміди в клітині. Див., наприклад, Fernandez-Lopez, et al., (2006) FEMS Microbiol. Rev. 30:942-66; і Adamczyk and Jagura-Burdzy (2003) Acta Biochim. Pol. 50:425-53. Дві плазміди несумісні, якщо одна з них у присутності іншої менш стабільна, ніж сама по собі. Коли дві плазміди однієї і тієї ж групи несумісності знаходяться в одній і тій же клітині, може відбуватися конкуренція за клітинні ресурси. Та плазміда, яка здатна реплікуватися швидше або надає яку-небудь іншу перевагу, буде представлена серед копій у непропорційному ступені, що допускається системою несумісності. Зненацька виявилося, що плазміди можуть бути також несумісними, коли обидві вони мають ті самі функції свого розподілу в дочірніх клітинах. Плазміди звичайно потрапляють тільки в одну з багатьох існуючих груп несумісності. Нараховується більш 30 відомих груп несумісності. Плазміди, які належать до групи несумісності IncР, всебічно досліджені, і сконструйована велика кількість плазмід, які походять з цієї групи IncР (Schmidhauser et al., (1988) Biotechnology 10:287-332). Приклади плазмід, які містять групу несумісності IncР, включають: pMP90RK, pRK2013, pRK290, pRK404 і pRK415. Ці плазміди можуть підтримуватися в численних бактеріальних штамах, включаючи E. coli і Agrobacterium tumefaciens. Приклади інших груп несумісності включають, але не обмежуються цим: IncN, IncW, IncL/M, IncT, IncU, IncW, IncY, IncB/O, IncFII, IncII, IncK, IncCom9, IncFI, IncFII, IncFIII, IncHIl, IncHI2, IncX, IncA/C, IncD, IncFIV, IncFV/FO, IncFVI, IncHl 3, IncHII, Incl2, IncI, IncJ, IncV, IncQ тощо, включаючи їхні варіанти, наприклад, які мають істотну подібність послідовності або функціональне відношення. У таблиці 1 перераховано декілька загальновідомих груп несумісності і представлені приклади плазмід, які представляють ці групи несумісності (це перерахування груп несумісності і плазмід пропонується тільки як приклад і не призначене для обмеження груп несумісності і плазмід, використовуваних у штамах Agrobacterium і описаних у даному документі способах). Інший варіант здійснення описаних у даному документі способів включає використання посилюючих трансформацію властивостей, кодованих фрагментом 14,8 KpnІ VirBCDG, виділеним з pSB1, у штамах Agrobacterium, які мають недостатність функції RecА і несуть щонайменше одну обеззброєну допоміжну плазміду pTi, де фрагмент 14,8 KpnІ VirBCDG несеться плазмідою, яка має точку початку реплікації групи несумісності, відмінної від IncР. Додатковий варіант здійснення включає штам Agrobacterium, як описано в даному документі, для використання в цьому способі. Ділянка Т-ДНК, призначена для введення в рослину з використанням цього штаму Agrobacterium, може переноситися плазмідою, яка має ділянку ТДНК, яка примикає щонайменше до однієї границі Т-ДНК Agrobacterium, причому плазміда має точку початку реплікації групи несумісності IncР або групи несумісності, яка сумісна з групою несумісності фрагмента 14,8 KpnІ VirBCDG, який несеться плазмідою, яка має точку початку реплікації групи несумісності, відмінної від IncР. Ще один варіант здійснення описаних у даному документі способів включає використання посилюючих трансформацію властивостей, кодованих фрагментом 14,8 KpnІ VirBCDG, виділеним з pSB1, і вставленим щонайменше в одну обеззброєну допоміжну плазміду pTi, де фрагмент 14,8 KpnІ VirBCDG інтегрований у нейтральний сайт інтеграції, локалізований на хромосомі штаму Agrobacterium, відмінного від штаму C58. Додатковий варіант здійснення включає штам Agrobacterium, як описано, для використання в цьому методі. Ділянка Т-ДНК, призначена для введення в рослину з використанням цього штаму Agrobacterium, додатково включає плазміду, яка має ділянку Т-ДНК, яка примикає щонайменше до однієї границі Т-ДНК Agrobacterium. Хоча відомі супербінарні системи, наприклад, див. патенти WO 94/00977A1, WO 95/06722A1 і WO 95/16031Al, і вони додатково описані Komari et al., (вище) і Komori et al., (вище), ці системи мають ряд недоліків. Робочий недолік супербінарної системи, який долається штамами Agrobacterium і описаними в даному документі способами, полягає в необхідності створення коінтегративної плазміди з pSB1 і pSB11 (і їхніми похідними), як засіб, за допомогою якого змінена Т-ДНК, переноситься на похідних pSB11, стабільно підтримується в Agrobacterium. Ця подія коінтеграції створює пару великих (приблизно 2,3 т.п.о.) прямо повторюваних послідовностей через рекомбінацію між гомологічними ділянками pSB1 і pSB11. Як добре відомо фахівцям в галузі молекулярної біології, великі повторювані послідовності, такі як ці, є кращими мішенями для внутрішньомолекулярної рекомбінації, що в кінцевому підсумку 6 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приводить до делецій ДНК і інших перебудов, особливо, коли повтори є частиною структури плазміди. У супербінарній системі Agrobacterium такі перебудови можуть привести до часткової перебудови або повної втрати ділянки Т-ДНК, уведеної похідними pSB11, приводячи в кінцевому підсумку до незначного перенесення або до відсутності перенесення бажаних чужорідних генів у клітини рослини-хазяїна. Додатковий недолік описаної вище супербінарної системи, який також долається штамами Agrobacterium і описаними в даному документі способами, полягає в тому, що створення коінтегративної плазміди з похідних pSB1 і pSB11 генерує велику плазміду (мінімум більше 43 т.п.о.), яка має дві різні точки початку реплікації (ori) ColЕ1-типу (група несумісності pMB1/ColЕ1), а також третій ori, який походить від плазміди RK2 (група несумісності IncР). Хоча в нормальних умовах ColЕ1 ori є нефункціонуючим у Agrobacterium, відомі геномні мутації, які дозволяють стабільно підтримувати плазміди, які мають ColЕ1 ori, у Agrobacterium (Ruslyakova et al., (1999) Russian J. Genet. 35:327-331). У клітинах, які мають такі мутації, плазміда, така як коінтегративна плазміда похідних pSB1:pSB1l, яка має 3 функціонуючих точки початку реплікації, як можна чекати, буде вкрай нестабільною. Таким чином, супербінарна система має дефекти, на які вигідно спрямовані елементи штамів Agrobacterium і способи трансформації рослин, описані в даному документі. Структура ДНК чужорідного гена або генів, призначених для введення й експресії в трансгенних рослинних клітинах за допомогою трансформації, опосередкованої Agrobacterium, може мати сильний вплив на стабільність бінарної векторної плазміди або човникової векторної плазміди, які несуть ці гени в клітинах Escherichia coli і Agrobacterium. Нестабільність частково виявляється, коли чужорідні гени включають компоненти генів, які застосовуються множину разів у генних конструктах. Наприклад, не є незвичайним, що конкретний промотор, здатний до експресії в рослинах, може бути використаний для стимуляції експресії ділянок різних білків, які кодують, у трансгенній рослині. Інші компоненти гена, такі як 3'-нетрансльовані ділянки (3'UTR) (тобто послідовності термінації транскрипції і послідовності, які визначають додавання поліаденілування) і навіть дуже подібні кодуючі ділянки білків можуть дуплікуватися або бути присутнім у множинних копіях у межах однієї ділянки Т-ДНК. Як указувалося вище, ці елементи повторюваних послідовностей, які можуть існувати або в інвертованій, або в прямій орієнтації, є мішенями для внутрішньомолекулярних рекомбінацій, що може приводити до делецій ДНК і інших перебудов, особливо коли повтори є частиною структури плазміди. Розроблена множина спеціалізованих штамів E. coli, які слугують як хазяїни для молекулярного клонування, що допомагає подолати такі труднощі як нестабільність (наприклад, штами STBL2™, STBL3™ і STBL4™, пропоновані INVITROGEN; Carlsbad, CA). Загальною характеристикою всіх таких клонуючих штамів E. coli є присутність геномної мутації в гені recА. Білок RecА являє собою багатофункціональний фермент, який відіграє роль у гомологічній рекомбінації, репарації ДНК і індукції бактеріальної відповіді SOS. У процесі гомологічної рекомбінації білок функціонує в якості ДНК-залежної АТФази, стимулюючи кон'югацію хромосом, утворення гетеродуплексу й обмін ланцюгами між гомологічними ДНК. Таким чином, клітина з недостатністю функції RecА більш схильна до збереження стійкості гомологічних послідовностей ДНК без перебудови або делеції. Штами Agrobacterium з недостатністю RecА розроблені з метою сприяння в рішенні проблем нестабільності, які спостерігаються при клонуванні великих фрагментів ДНК, які містять повторювані послідовності (Klapwicj et al., (1979) Molec. Gen. Genet. 173:171-175; Farrand et al., (1989) J. Bacteriol. 171:5314-5321; Lazo et al., (1991) Bio/Technology 9:963-967). Ці штами, як доведено, придатні для сприяння стабілізації конструктів високої молекулярної маси, які трансформують, в деяких випадках (Frary and Hamilton, (2001) Transgenic Res. 10:121-132), але не у всіх випадках (Song et al., (2003) Theor. Appl. Genet.107:958-964). Таким чином, можуть бути вигідно використані хромосомні середовища Agrobacterium, які є дефектними відносно recА у розроблювальних штамах, які високоефективні в підтримці плазміди і здатності трансформувати рослину. У доповнення до використання хромосомних середовищ Agrobacterium з недостатністю recА у розроблювальних штамах для застосування в способах, описаних у даному документі, функціонування recА може бути відключене в існуючого або отриманого штаму з метою зробити штам, придатним для способів, описаних у даному документі. Див., наприклад, Farrand et al. (вище). Наприклад, може бути створений штам з функціонуючим RecА і будь-якими бажаними хромосомними добавками, наприклад, додаванням генів vir, потім функція RecА може бути блокована. Можуть бути використані вектори BIBAC, сконструйовані для можливості ефективної трансформації великими фрагментами ДНК рослинних і нерослинних клітин-хазяїнів. Див., наприклад, патент США № 5733744, патент США № 5977439 і патентну заявку США № 7 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2002/0123100A1. Одним штамом Agrobacterium, який може бути використаний з векторами BIBAC, є штам UIA143 з недостатністю RecА, розроблений Farrand et al., (вище). При вдосконаленнях системи BIBAC для підвищення здатності створених штамів Agrobacterium до трансформації рослин використані підгрупи генів, розташованих у фрагменті 14,8 KpnІ VirBCDG, у поєднанні з іншими генами vir. Зокрема, був використаний ген virG із фрагмента 14,8 KpnІ VirBCDG, один або в поєднанні з генами virЕ1 і virЕ2 з pTiА6 у штамі UIA143 з недостатністю RecА. Див., наприклад, Hamilton et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:9975-9979; Hamilton, (1997) Gene 200:107-116; Frary and Hamilton (вище). Крім того вектор, який підходить, використовуваний для трансформації рослинної клітини з застосуванням способів, описаних у даному документі, може містити ген маркера селекції, який кодує білок, який надає трансформованим рослинним клітинам стійкості до антибіотика або гербіциду. Індивідуально застосовуваний ген маркера селекції може дозволити відповідно відібрати трансформовані клітини, у той час як ріст клітин, які не містять вставленої ДНК, може бути подавлений за допомогою обраної сполуки. Вибір конкретного(-их) застосовуваного(-их) гена(-ів) маркерів селекції може залежати від дизайну експерименту або переваги, але може бути використаний кожен з наступних маркерів селекції, також як будь-який інший ген, не перерахований у даному описі, який може функціонувати як маркер селекції. Приклади маркерів селекції включають, але не обмежуються цим, гени, які забезпечують стійкість або толерантність до антибіотиків, таких як канаміцин, G418, гігроміцин, блеоміцин і метотрексат, або до гербіцидів, таких як фосфінотрицин (біалафос), гліфосат, імідазолінони, похідні сульфонілсечовини, триазолопіримідини, хлоросульфурон, бромоксиніл і DALAPON. У доповнення до маркера селекції може бути також використаний репортерний ген. У деяких випадках репортерний ген може бути використаний без маркера селекції. Репортерні гени являють собою гени, які звичайно не надають переваг у рості організму або тканини реципієнта. Репортерні гени звичайно кодують білок, який надає фенотипічну зміну або ферментативну властивість. Придатні репортерні гени включають, але не обмежуються цим, гени, які кодують глюкуронідазу (GUS), люциферазу світлячка або флуоресцентні білки, такі як зелений флуоресцентний білок і жовтий флуоресцентний білок. У доповнення до численних способів трансформації рослин, тип тканини, яка вводиться в контакт із чужорідними генами, також може варіюватися. Така тканина може включати, але не обмежуватися цим, ембріональну тканину, тканину калуса типів I і II, гіпокотиль і меристему. Майже всі рослинні тканини можуть бути трансформовані в процесі дедиференціювання з використанням придатних методів у межах даного рівня техніки. Фахівець в галузі трансформації рослин повинен розуміти, що для отримання трансформованих рослин доступні численні методи і що вони можуть бути модифіковані і спеціалізовані для пристосування до біологічних розходжень між різними видами рослин-хазяїнів. Незалежно від конкретного застосовуваного методу трансформації, чужорідний ген може бути включений у вектор для перенесення генів, адаптований для експресії чужорідного гена в рослинній клітині в результаті включення у вектор рослинного промотору. У доповнення до рослинних промоторів для експресії чужорідних генів у рослинних клітинах можуть бути ефективно використані промотори з різноманітних джерел. Наприклад, можуть бути використані промотори бактеріального походження, такі як промотор октопінсинтази, промотор нопалінсинтази, промотор манопінсинтази; промотори вірусного походження, такі як промотори 35S і 19S вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV), промотор з паличкоподібного вірусу цукрової тростини тощо. Промотори, які походять від рослин, включають, але не обмежуються цим, промотор малої субодиниці (ssu) рибулозо-1,6-біфосфат (RUBP) карбоксилази, промотор бетаконгліциніну, промотор фазеоліну, промотор ADH (алкогольдегідрогенази), промотори білків теплового шоку, промотор ADF (фактора деполімеризації актину) і тканиноспецифічні промотори. Промотори можуть також містити визначені елементи енхансерних послідовностей, які можуть поліпшувати ефективність транскрипції. Типові енхансери включають, але не обмежуються цим, інтрон 1 алкогольдегідрогенази 1 (ADH1) і інтрон 6 ADH1. Можуть бути використані конститутивні промотори. Конститутивні промотори керують постійною експресією генів майже у всіх типах клітин і майже в усі періоди часу (наприклад, промотор актину, промотор убіквітину, промотор CaMV 35S). Тканиноспецифічні промотори відповідають за експресію генів у конкретних типах клітин або тканин, таких як листя або насіння. Приклади інших промоторів, які можуть бути використані, включають промотори, які активні протягом визначеної стадії розвитку рослини, а також активні в конкретних тканинах і органах рослин. Приклади таких промоторів включають, але не обмежуються цим, промотори, які специфічні для коренів, промотори, специфічні для пилка, специфічні для ембріональної стадії, специфічні 8 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для кукурудзяних рилець, специфічні для бавовняного волокна, специфічні для ендосперму насіння і специфічні для флоеми. За певних умов може бути бажане використання індуцибельного промотору. Індуцибельний промотор відповідає за експресію генів у відповідь на специфічний сигнал, такий як фізичний стимул (наприклад, промотори генів білків теплового шоку); світло (наприклад, промотор рибулоза-біс-фосфат-1,5-карбоксилази): гормон (наприклад, глюкокортикоїд); антибіотик (наприклад, тетрациклін); метаболіти і стрес (наприклад, посуху). Можуть бути також використані інші бажані елементи транскрипції і трансляції, які функціонують у рослинах, такі як, наприклад, 5'-нетрансльовані лідируючі послідовності, послідовності термінації транскрипції РНК і послідовності додавання сигналу поліаденілування. Може бути використаний будь-який придатний, специфічний для рослин трансферний вектор для гена, відомий у даній галузі техніки. Трансгенні зернові культури, які містять ознаки стійкості до комах (IR), переважають у зернових і бавовняних рослинах по всій північній Америці, і використання цих ознак розширюється в усьому світі. Комерційні трансгенні зернові культури, які поєднують ознаки IR і стійкості до гербіцидів (HT), створені багатьма посівними компаніями. Вони включають поєднання ознак IR, які додаються інсектицидними білками Bt (Bacillus thuringiensis), і ознак HT, таких як толерантність до інгібіторів ацетолактатсинтази (ALS), таких як похідні сульфонілсечовини, імідазолінони, триазолопіримідин, сульфонаніліди тощо, інгібіторів глутамінсинтетази (GS), таких як біалафос, глуфосинат тощо, інгібіторів 4гідроксифенілпіруватдіоксигенази (HPPD), таких як мезотрион, ізоксафлутол тощо, інгібіторів 5енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (EPSPS), таких як гліфосат тощо, і інгібіторів ацетилкоензим А-карбоксилази (АССази), таких як галоксифоп, хізалофоп, диклофоп тощо. Відомі інші приклади, у яких пропоновані у вигляді трансгенних білки забезпечують толерантність рослини до хімічних класів гербіцидів, таких як гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі піридилоксіацетатів (див. патент WO 2007/053482A2) або гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі арилоксифеноксипропіонатів (див. патент WO 2005107437A2,A3). Здатність контролювати множинні проблеми відносно шкідників за допомогою ознак IR є цінною концепцією комерційного продукту, і перевага цієї концепції продукту збільшується, якщо ознаки контролю над комахами й ознаки контролю над бур'янами поєднуються в тій самій рослині. Більш того, підвищена цінність може бути досягнута шляхом поєднань в одній рослині ознак IR, які додаються інсектицидним білком Bt, з однією або більше додатковими ознаками HT, такими як зазначені вище ознаки, плюс одна або більше додаткових ознак, які вводяться (наприклад, інша стійкість до комах, яка додається іншими інсектицидними білками або які походять від Bt, або стійкість до комах, яка додається такими механізмами як RNAi тощо, стійкість до захворювань, толерантність до стресу, поліпшене використання азоту тощо), або ознак виходу (наприклад, високий вміст олій, склад корисних для здоров'я олій, поліпшення поживних властивостей тощо). Такі поєднання можуть бути отримані або шляхом звичайної селекції (наприклад, за допомогою селекційного набору), або разом з новою подією трансформації, яка включає одночасну індукцію множинних генів (наприклад, за допомогою молекулярного набору). Переваги включають здатність керувати комахами-шкідниками і поліпшений контроль над бур'янами в зернових культур, що надає вторинні переваги виробнику і/або споживачу. Таким чином, штами Agrobacterium і способи, описані в даному документі, можуть бути використані для надання трансформованих рослин зі поєднаннями ознак, які включають повний агрономічний пакет, який поєднає поліпшену якість зернових культур із здатністю гнучкого й ефективного за ціною контролю над кількістю виходу агрономічної продукції. Гени virG різних плазмід pTi були досліджені для розуміння їхньої здатності підвищувати частоту трансформації рослин. Liu et al., (1992, Plant Molec. Biol. 20:1071-1087) визначили, що додаткові копії генів virG із множинних джерел (тобто з різних плазмід pTi, але включаючи pTiBo542) підвищували транзиторну трансформацію деяких рослин, і величина ефекту залежала від особливості допоміжної плазміди pTi, з якою був з'єднаний конкретний ген virG. Мутант гена virG (приблизно з pTiА6), названий virGN54D (мутація з заміною амінокислоти Asn54 на Asp), конститутивно експресувався в Agrobacterium (індукція генів virG дикого типу вимагає кислого pН, високої концентрації моносахаридів і присутності фенольних індукторів, таких як ацетосирінгон). Див. Pazour et al., (1992) J. Bacteriol. 174:4169-4174. VirGN54D плазміди pTiА6 був ефективний відносно трансформації маїсу, у той час як множинні копії батьківського virG дикого типу були неефективні. Див. Hansen et al., (1994) J. Bacteriol. 174:4169-4174. Описана "потрійна" система (тобто система з трьох плазмід), у якій копія конститутивного мутанта гена virGN54D з pTi15955 одночасно знаходилася в плазміді, яка походить від pBBR1, у штамі Agrobacterium tumefaciens, який містив обеззброєну допоміжну pTi плазміду pAL4404, і 9 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бінарний вектор, який несе гени для трансформації рослин. Див. van der Fits et al., (2000) Plant Molec. Biol. 43:495-502. Конститутивно експресуючий ген virGN54D, як виявлено, значно підвищував ефективність як транзиторної, так і стабільної трансформації в деяких видів рослин. Плазміди, які містять ділянку контролю реплікції pBRR1, не можуть бути класифіковані як приналежні до будь-якої відомої групи несумісності і, отже, можуть співіснувати із широким спектром інших плазмід в одного хазяїна. Більш того, у тютюну, бавовни і рису була спеціально протестована здатність впливати на ефективність трансформації рослин у різних поєднань генів vir: мутантного гена virGN54D, який походить з pTiА6, гена virG з pTiBo542, генів VirЕ1/E2 з pTiА6, і поєднання останніх двох наборів генів. Див. Park et al., (2000) Theor. Appl. Genet. 101:1015-1020. Підвищення ефективності трансформації спостерігали в деяких видів рослин і при додаткових копіях генів vir. У європейській патентній заявці № 2042602A1 і патентній заявці США № 2010/0132068A1 описуються космідні бінарні вектори і "бустерні" плазміди, які у випадку присутності в клітині Agrobacterium, яка несе допоміжну плазміду pTi, складають додаткові приклади потрійних плазмідних систем. Бустерні плазміди, як розкривається в цих документах, мають точку початку реплікації групи несумісності IncW і включають плазміду pVGW, яка має ген virGN54D, і плазміду pVGW2, яка є похідною від pVGW, яка має модифікації для полегшення клонування і селекції. Функції, кодовані генами хромосом у Agrobacterium, класично визначаються за допомогою двох генетичних підходів. Перший, або прямий, генетичний метод включає отримання молекулярного клону гена, який піддається дослідженню, з наступним вміщенням клонованого гена в генетичне середовище, у якому може бути оцінений фенотип "посилення функції". Другий, або "метод зворотної генетики", вимагає порушення структури гена шляхом вставки або делеції послідовностей у гені або довкола нього в хромосомі з наступним визначенням того, які білки або фенотипи вилучені в результаті втрати функції гена. Цей підхід використовували для конструювання раніше описаного мутанта штаму C58 з недостатністю RecА. Див. Farrand et al., вище. Фахівці в галузі генетичного конструювання в клітинах Agrobacterium повинні розуміти, що для створення можливості здійснення таких експериментів по порушенню структури генів описані різноманітні вектори і численні методи. Як доведено, метод є особливо придатним при використанні для ідентифікації генів, які не втягнені в життєздатність, ріст і здатність до трансформації мутантного штаму. Один такий генетичний локус у штамі C58 Agrobacterium являє собою локус pgl/picА. Див. Lee et al., (2001) Plant Microbe Interact. 14:577-579; і Lee (2006) In: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) № 343: Agrobacterium Protocols (2nd Edition, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ. pp.55-66. Клітини, у яких ген virD2 інтегрований у цей хромосомний локус за допомогою гомологічної рекомбінації, як виявлено, мають фенотип трансформованої рослини, ідентичний фенотипу, який виникає в штамів A. tumefaciens, які несуть ген virD2, локалізований на плазміді, яка реплікується. Див. Lee et al., вище. Крім того, ділянка Т-ДНК, інтегрована в локус pgl/picА штаму C58, може бути функціонально доставлена в рослинну клітину (Oltmanns et al., 2010. Plant Physiol. 152:1 158-1166). Таким чином, у штамі C58 локус pgl/picА може слугувати в якості "нейтрального сайта інтеграції" для введення генів у хромосому C58. При застосуванні в даному описі "нейтральний сайт інтеграції" позначає ген або хромосомний локус, у природі присутній у хромосомі клітини Agrobacterium, чия нормальна функція не потрібна для росту клітини або для здатності клітини здійснювати всі її функції, необхідні для трансформації рослини. При порушенні структури шляхом інтеграції послідовності ДНК, у нормі не присутньої в гені, клітина, яка несе ген з порушеним нейтральним сайтом інтеграції, може продуктивно здійснювати трансформацію рослини. Як приклад Hoekema et al. (1984, EMBO J. 3:2485-2490) продемонстрували, що функціональна T-ділянка, інтегрована в неохарактеризований локус у хромосомі C58 за допомогою транспозиції Tn3, продуктивно переносилася в рослинні клітини. Штами Agrobacterium, обговорювані в даному описі, можуть бути вигідно використані для введення одного або більше генів у рослину, наприклад, для додавання рослині індивідуальних або множинних інсектицидних або гербіцидних властивостей. Наприклад, штами Agrobacterium можуть бути використані для введення одного або більше, двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше генів у рослину. Шляхом використання штамів Agrobacterium, описаних у даному документі, полінуклеотид, який містить послідовності обраного гена, вставляють в одне місце розташування в рослинну клітину при трансформації рослинної клітини. Відносно розміру ділянок Т-ДНК, використовуваних для вставки генів, ділянки Т-ДНК можуть дорівнювати або складати більше 15000 пар нуклеотидних основ, дорівнювати або складати більше 20000 пар нуклеотидних основ, дорівнювати або складати більше 25000 пар нуклеотидних основ, дорівнювати або складати більше 26000 пар нуклеотидних основ, дорівнювати або складати більше 27000 пар нуклеотидних основ, 10 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дорівнювати або складати більше 28000 пар нуклеотидних основ, дорівнювати або складати більше 29000 пар нуклеотидних основ або дорівнювати або складати більше 30000 пар нуклеотидних основ. При використанні штамів Agrobacterium, описаних у даному документі, обрані послідовності генів можуть мати гомологію послідовностей, яка дорівнює або становить 60%, яка дорівнює або становить 65%, яка дорівнює або становить 67%, яка дорівнює або становить 69,5%, яка дорівнює або становить 70%, яка дорівнює або становить 75%, яка дорівнює або становить 80%, і зберігати ідентичність їхній транскрибованих послідовностей. Типи генів, які можуть бути введені, можуть кодувати інсектицидні білки, гербіцидні білки або суміш інсектицидних білків і гербіцидних білків. Конкретні приклади генів, які можуть бути введені, включають гени, які кодують інсектицидний білок Cry1Ca, інсектицидний білок Cry1F, інсектицидний білок Cry1Ab1, і гербіцидний білок AAD1, які можуть бути введені в різних поєднаннях або у вигляді набору, який включає всі чотири гени. З використанням цих штамів Agrobacterium можуть бути трансформовані види однодольних (з однією сім'ядолею) і дводольних (із двома сім'ядолями) рослин. У даному описі розкривається також геномний локус nilА Agrobacterium tumefaciens, у який може бути інтегрована полінуклеотидна послідовність. Така інтегрована полінуклеотидна послідовність може включати будь-який ген vir або оперон vir або інші придатні гени. У прикладах 17-20 представлена ідентифікація, характеристика і використання геномного локусу nilА Agrobacterium tumefaciens, а також продукція штамів Agrobacterium tumefaciens з множиною генів vir, локалізованих у хромосомі. Геномний локус nilА або будь-який локус, який характеризується 85-100% ідентичністю послідовності, може бути ідентифікований в інших штамах Agrobacterium, використовуваних в описаних у даному документі методах ідентифікації і характеристики, і будь-які такі ідентифіковані локуси nilА можуть бути використані подібним з описаним у даному документі чином для інтеграції генів vir або інших придатних генів, які можуть, наприклад, підвищувати ефективність трансформації рослин. Методи ідентифікації і характеристики таких геномних локусів, описаних у даному документі, можуть також використовуватися для ідентифікації інших нейтральних сайтів інтеграції в хромосомі Agrobacterium, у яку можуть бути інтегровані полінуклеотидні послідовності, які містять гени vir або інші гени так, щоб штам Agrobacterium залишався здатним до трансформації рослин. Уже відомі деякі хромосомні сайти, які можуть бути використані в якості нейтральних сайтів інтеграції, наприклад, сайт RecА у штамі з недостатністю RecА, і локус pgl/picА у штамі C58 Agrobacterium tumefaciens. Однак існує необхідність в ідентифікації нових нейтральних сайтів у штамах Agrobacterium tumefaciens у доповнення до C58, тому що локус pgl/picА не визначається в деяких інших штамах, наприклад, у штамі LBA4404 (Oltmanns et al., вище). Додаткові хромосомні сайти, які можуть бути використані в якості нейтральних сайтів інтеграції, описані в патенті США № 6323396. Таким чином, розкритий також штам Agrobacterium з геном vir, інтегрованим у нейтральний сайт інтеграції в хромосомі Agrobacterium. Такий штам Agrobacterium може використовувати геномний локус nilА або інший нейтральний сайт інтеграції для інтеграції генів vir. Таким способом можуть бути додані в хромосому множинні типи придатних генів, забезпечуючи відсутність необхідності у використанні T-допоміжних плазмід. Наприклад, можуть бути використані додаткові гени vir і множинні копії придатних генів vir з різних штамів. У даному документі розкритий також штам Agrobacterium, який містить гени vir на допоміжній плазміді, яка має точку початку реплікації групи несумісності, відмінної від IncР, і плазміду, яка має ділянку Т-ДНК, яка прилягає щонайменше до однієї границі Т-ДНК Agrobacterium, причому плазміда має точку початку реплікації групи несумісності IncР. Додатково розкриті рослини, створені за допомогою описаних у даному документі способів, з використанням штамів Agrobacterium, описаних у даному документі. Такі рослини стабільно інтегрують будь-які ділянки Т-ДНК, уведені з використанням розкритих у даному описі способів. Більш того, такі рослини експресують будь-які гени і виявляють будь-які генетичні ознаки, які додаються цими ділянками Т-ДНК. Крім того, будь-який нащадок рослин, створених за допомогою описаних у даному документі способів, з використанням штамів Agrobacterium, описаних у даному документі, стабільно експресує будь-які гени і виявляє будь-які генетичні ознаки, які додаються тими ділянками Т-ДНК, які знайдені в батьківської рослини. У конкретному варіанті здійснення описується рослина, яка стабільно експресує інсектицидні білки Cry1Ca, інсектицидні білки Cry1F, інсектицидні білки Cry1Ab1 і гербіцидні білки AAD1. Це рослина, наприклад, може являти собою маїс. Поряд з тим, що в даному документі описуються визначені приклади штамів Agrobacterium, обговорювана функціональність може бути переміщена в інші штами Agrobacterium з тими ж самими критеріями, наприклад, в інші штами, які мають недостатність RecА або можуть бути 11 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 створені з недостатністю RecА. Приклади інших штамів, які можуть бути використані з описаними в даному документі штамами і способами, включають, але не обмежуються цим, штам C58 Agrobacterium tumefaciens, штам Chry5 Agrobacterium tumefaciens, штами Agrobacterium rhizogenes, штам EHA101 Agrobacterium tumefaciens, штам EHA105 Agrobacterium tumefaciens, штам MOG101 Agrobacterium tumefaciens і штам T37 Agrobacterium tumefaciens. Усі патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації, на які посилаються в даному описі або які цитуються в ньому, включені як посилання в повному обсязі в тому ступені, у якому вони не є несумісними з точними вказівками цього опису. Далі випливають приклади, які ілюструють методи використання штамів Agrobacterium і використання описаних у даному документі методів на практиці. Ці приклади не повинні розглядатися як лімітовані. Усі відсотки розраховані по масі і всі пропорції сумішей розчинників по об’єму, якщо не зазначено інакше. Усі температури приведені в градусах Цельсію. Якщо спеціально не зазначено або не позначено інакше, терміни "a", "an" і "the" при застосуванні в даному описі позначають "щонайменше один". Приклад 1: Конструювання делеційного варіанта плазміди pUCD2 Конструкція плазміди pUCD2 була описана Close et al., (1984, Plasmid 12:111-118), і повна послідовність 13239 п.о. ДНК розкрита вперше в даному описі у вигляді DNA SEQ ID NO:1. pUCD2 несе чотири гени, які додають бактеріальну стійкість до антибіотиків: конкретно стійкість до спектиноміцину, канаміцину, тетрацикліну й ампіциліну (Фіг. 1). Стандартні методи молекулярної біології, як вказується, наприклад, у Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition., COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, Plainview, N.Y.) і Ausubel et al., (1995, Current Protocols in Molecular Biology, (GREENE PUBLISHING AND WILEYINTERSCIENCE, New York) і їх відновленнях, застосовували на цій і іншій стадіях, описаних у цьому прикладі і в інших прикладах даного розкриття. Перша модифікація відносно pUCD2 була зроблена за допомогою розщеплення ДНК pUCD2 ферментами рестрикції Sac I і Sac II і лігування в основному дволанцюжкового фрагмента, який має придатні "липкі кінці", які звішуються, сумісні зі створеними під дією Sac I- або Sac II звішуваннями. Цей дволанцюжковий олігонуклеотид (Фіг. 1) був створений за допомогою відпалу двох комплементарних олігонуклеотидних послідовностей, розкритих як SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:3. Послідовності SEQ ID NO:2 і SEQ ID NO:3 конструюються для відновлення функціонуючого гена стійкості до канаміцину при лігуванні ДНК pUCD2, розщепленої Sac I і Sac II. За допомогою цієї маніпуляції створена плазміда pDAB9290 (Фіг. 1), яка відрізняється від pUCD2 делецією кодуючої ділянки стійкості до спектиноміцину, видаленням сайту впізнавання ферментом рестрикції Kpn І з кодуючої ділянки стійкості до канаміцину, і створенням нового сайту Kpn І нижче кодуючої ділянки стійкості до канаміцину. Для додавання відсутності функціональності генам, які кодують стійкість до тетрацикліну і стійкість до ампіциліну, проводили подальші маніпуляції з ДНК плазміди pDAB9290 за допомогою первісного розщеплення ферментами рестрикції Pst I і Sal I, обробки кінців, які звішуються ліворуч, цими ферментами за допомогою набору QUICK BLUNTING™ (NEW ENGLAND BIOLABS; Ipswich, MA) для створення тупих кінців і самолігування для замикання в коло утворених у такий спосіб фрагментів. Отримана плазміда (pDAB9291) зберігає тільки ген стійкості до бактеріального антибіотика канаміцину і має унікальний сайт для розщеплення за допомогою Kpn I нижче гена стійкості до канаміцину. Послідовність pDAB9291 розкрита як SEQ ID NO:4. Плазміда pDAB9291 має дві точки початку реплікації, одну (група несумісності colЕ1), яка походить від плазміди pBR322, і другу, яка походить від плазміди pSa (група несумісності W). Таким чином, плазміда pDAB9291 здатна підтримувати середню кількість копій у E. coli і Agrobacterium. Приклад 2: Клонування фрагменту 14,8 Kpn І virBCDG у pDAB9291 Фрагмент 14,8 т.п.о. Kpn I, який містить оперони virG, virВ і virС і ген virDl з "супервірулентною" pTiBo542 (Фіг. 1), був виділений із плазміди pSB1 (Komari et al., вище; і Komori et al., вище) і клонований в унікальний сайт Kpn I pDAB9291. Були отримані плазміди, які містять кожну з двох можливих орієнтацій вставленого фрагмента, і названі pDAB9292 і pDAB9293. Одна плазміда pDAB9292 (Фіг. 1) була обрана для подальшої роботи. Послідовність ДНК pDAB9292 розкрита як SEQ ID NO:5. Приклад 3: Конструювання штаму Agrobacterium з недостатністю RecА, який несе допоміжну плазміду pTiEHA105 Штам UIA143 Agrobacterium являє собою штам з недостатністю RecА, який має генетичний фонC58, і він був сконструйований і описаний Farrand et al., (вище). Хромосомний ген recА був вилучений і замінений касетою генів, які додають стійкість до еритроміцину при 150 мкг/мл. Штам UIA143 не містить плазміди Ti або похідного плазміди Ti. 12 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Штам EHA105 Agrobacterium сконструйований і описаний Hood et al., (1993, Transgenic Research 2:208-221), несе допоміжну плазміду (називану в даному описі pTiEHA105), яка походить від "супервірулентної" плазміди pTiBo542. ДНК плазміди pTiEHA105 отримували зі штаму EHA105 і вводили за допомогою електропорації в клітини штаму UIA143, приготовлені як електрокомпетентні за допомогою стандартних методів (Weigel and Glazebrook, (2002) Arabidopsis: A Laboratory Manual. COLD SPRING HARBOR PRESS, Cold Spring Harbor, NY, 354 pages; Mersereau et al., (1990) Gene 90:149-151; Mattanovich, et al., (1989) Nucl. Acids Res. 17:6747)). Клітини штаму UIA143, трансформовані плазмідою pTiEHA105, відбирали по їхній здатності рости в мінімальному середовищі AB (Watson, et al., (1975) J. Bacteriol. 123:255-264) з використанням очищеного агару і манопіну (2 мг/мл) як єдине джерело вуглецю й азоту для росту (Guyon et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2693-2697; Dessaux et al., (1987) Molec. Gen. Genet. 208:301-308). Присутність pTiEHA105 підтверджували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням праймерів, створених для ампліфікації фрагментів генів virD2 і virG плазміди pTiBo542, і додатково характеризували, аналізуючи за допомогою блотингу по 32 Саузерну сумарної ДНК, отриманої з кандидатних колоній, зондуючи P-міченої ДНК плазміди pTiEHA101, очищеної центрифугуванням у градієнті хлориду цезію. Цей штам Agrobacterium (тобто UIA143, який містить pTiEHA105) названий DA2552. Приклад 4: Конструювання штаму Agrobacterium з недостатністю RecА, який несе допоміжну плазміду pTiС58∆ Штам Z707 походить шляхом заміни повної ділянки Т-ДНК плазміди pTiС58 штаму C58 Agrobacterium tumefaciens геном npt I Tn903, який додає стійкості до канаміцину. Повна ділянка vir отримана в результаті плазміди, яка називається в даному описі pTiС58A, була інтактною ліворуч (Hepburn et al., (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969). Допоміжну плазміду pTiС58∆ зі штаму Z707 очищали центрифугуванням у градієнті хлориду цезію і вводили електропорацією у електрокомпетентні клітини UIA143. Трансформант відбирали на основі, який походить з плазміди pTiС58∆ гена стійкості до канаміцину і гена, який походить з хромосоми, стійкості до еритроміцину, і штам був названий DA2569. Присутність pTiС58∆ у DA2569 підтверджували ПЛР-ампліфікацією, з використанням праймерів для визначення відібраних ділянок генів vir і аналізуючи за допомогою блотингу по Саузерну сумарної ДНК, отриманої з кандидатних колоній 32 DA2569, зондуючи P-міченою ДНК плазміди pTiС58∆, очищеної центрифугуванням у градієнті хлориду цезію з клітин штаму Z707. Приклад 5: Конструювання штаму Agrobacterium з недостатністю RecА, який несе допоміжну плазміду pMP90 Штам GV3101(pMP90) Agrobacterium tumefaciens несе делеційний варіант pTiС58, називаний pMP90, з якого вилучена повна ділянка Т-ДНК і замінена геном, який додає стійкості до гентаміцину (Koncz and Schell, (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396). ДНК плазміди pMP90 отримують такими методами як центрифугування в градієнті хлориду або цезію MACHEREYNAGEL NUCLEOBOND XTRA MAXI KIT "LOW COPY" (MACHEREY-NAGEL Inc.; Bethelem, PA) і вводять електропорацією у клітини UIA143. Трансформант відбирають на основі, який походить з плазміди pMP90 гена стійкості до гентаміцину (100 мкг/мл) і штам позначають DAt20538. Присутність pMP90 у DAt20538 підтверджують ПЛР-ампліфікацією, з використанням праймерів для визначення відібраних ділянок генів vir і аналізуючи за допомогою блотингу по Саузерну сумарної ДНК, отриманої з DAt20538. Приклад 6: Конструювання штаму Agrobacterium з недостатністю RecА, який несе допоміжну плазміду pMP90RK Допоміжну плазміду pMP90, описану в прикладі 5, додатково модифікували за допомогою введення (шляхом подвійного кросинговера з гомологічною рекомбінацією) 42 т.п.о. фрагмента EcoR I, який походить з плазміди pRK2013 (Figurski and Helinski, (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1648-1652). 42 т.п.о. фрагмент містить гени, які походять з плазміди RK2, для реплікації і мобілізації плазміди (наприклад, trfA, tra1, tra2, tra3 і oriT), і ген, який додає стійкості до канаміцину. За допомогою цієї маніпуляції заміняли ген стійкості до гентаміцину плазміди pMP90, і отриману в результаті плазміду позначили як pMP90RK (Koncz and Schell, вище). ДНК плазміди pMP90RK отримують такими методами як центрифугування в градієнті хлориду або цезію MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND XTRA MAXI KIT "LOW COPY" і вводять електропорацією у електрокомпетентні клітини UIA143. Трансформант відбирають на основі, який походить з плазміди pMP90RK гена стійкості до канаміцину, і штам позначають як DAt20539. Присутність pMP90RK у DAt20539 підтверджують ПЛР-ампліфікацією з використанням праймерів для визначення відібраних ділянок генів vir і аналізуючи за допомогою блотингу по Саузерну сумарної ДНК, отриманої з DAt20539. 13 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 7: Електропорація ДНК pDAB9292 у штам DA2552 Agrobacterium Електрокомпетентні клітини DA2552 отримували, використовуючи стандартний протокол (див. приклад 3). 50 мкл компетентних клітин DA2552 відморожували на льоді і трансформували з використанням від 300 до 400 нг ДНК плазміди pDAB9292. Суміш ДНК і клітин піддавали електропорації з використанням попередньо охолоджених кювет для електропорації (0,2 см) і електропоратора BIO-RAD GENE PULSER (BIO-RAD Inc.; Hercules, CA.) при наступних умовах: напруга: 2,5 кВ, тривалість імпульсу: 5 мсек, вихідна ємність: 25 мкФ, опір: 200 Ом. Після електропорації до кювети додавали 1 мл бульйону YEP (г/л: екстракт дріжджів 10, пептон 10, NaCl 5), і суспензію клітин у YEP переносили в 15 мл пробірку для культивування. Клітини інкубували при 28 °C при обережному перемішуванні протягом 4 годин, після цього культуру висівали на чашки з YEP + агаром, який містить канаміцин 50 мкг/мл і еритроміцин 150 мкг/мл. Чашки інкубували протягом від 2 до 4 днів при 28 °C, і колонії збирали і висівали штрихом на свіжі чашки YEP + агар з антибіотиками, як зазначено вище, і інкубували при 28 °C протягом від 1 до 3 днів. Приналежність цих колоній до Agrobacterium підтверджували при використанні тесту на кетолактозу (Bouzar et al., (1995) In: Methods in Molecular Biology (K. Gartland and M. Davey, eds.) Agrobacterium Protocols. (Vol. 44) HUMANA PRESS, Totowa, NJ. pp. 9-13. Декілька позитивних відносно кетолактози колоній відбирали для вихідних 3 мл YEP (з антибіотиками) культур, які висіваються, які росли протягом ночі при 28 °C при перемішуванні. 300 мкл кожної висіяної культури використовували для інокуляції 200 мл YEP (з антибіотиками) з ростом культури протягом ночі при 28 °C при перемішуванні при 200 об./хв. Плазмідну ДНК отримували з 165 мл кожних 200 мл культури, яка виростала протягом ночі, з використанням набору MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND® XTRA MAXI PLASMID DNA PURIFICATION. Дотримувались протоколу виробника за винятком використання 30 мл кожного з буферів RES, LYS і NEU. Елюйовану ДНК зберігали при 4 °C. Гідроліз ферментом рестрикції BamН I плазмідної ДНК використовували для підтвердження присутності pDAB9292 у цих ізолятах, і колонії, які мають коректні патерни, потім додатково очищали, використовуючи два пасажі ізоляту одиночної колонії. Плазмідну ДНК отримували з культур, інкубованих протягом ночі, як описано вище, і аналіз за допомогою гідролізу ферментами рестрикції використовували для підтвердження присутності інтактної pDAB9292. Як гідролізований стандарт включали плазмідну ДНК вектора pDAB9292, початково використаного для трансформації DA2552. Чотири окремих реакції гідролізу (Pst I, Bam I, Mfe I і Hind III) проходили з використанням від 750 нг до 1 мкг ДНК. Реакції давали проходити протягом від 1 до 2 годин, і результат аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (0,8% мас./об.), і фрагменти ДНК візуалізували фарбуванням бромідом етидію. Цей штам Agrobacterium (тобто DA2552, який несе pDAB9292) названий DAt13192. Цей штам створює основу для рекомбінантно-дефіцитної "потрійної" системи трансформації рослин. Приклад 8: Електропорація ДНК pDAB9292 у штам GV3101(pMP90) Agrobacterium Клітини штаму GV3101(pMP90) Agrobacterium tumefaciens (Koncz and Schell, вище) робили електрокомпетентними за допомогою стандартного протоколу (див. приклад 3). 50 мкл компетентних клітин GV3101(pMP90) відморожували на льоді і трансформували з використанням від 300 до 400 нг ДНК плазміди pDAB9292. Суміш ДНК і клітин піддавали електропорації з використанням попередньо охолоджених кювет для електропорації (0,2 см) і електропоратора BIO-RAD GENE PULSER при наступних умовах: напруга: 2,5 кВ, тривалість імпульсу: 5 мсек, вихідна ємність: 25 мкФ, опір: 200 Ом. Після електропорації до кювети додавали 1 мл бульйону YEP і суспензію клітин у YEP переносили в 15 мл пробірку для культивування. Клітини інкубували при 28 °C при обережному перемішуванні протягом 4 годин, після цього культуру висівали на чашки з YEP + агаром, який містить канаміцин 50 мкг/мл і гентаміцин 100 мкг/мл. Чашки інкубували протягом від 2 до 4 днів при 28 °C, і колонії збирали і висівали штрихом на свіжі чашки YEP + агар з антибіотиками, як зазначено вище, і інкубували при 28 °C протягом від 1 до 3 днів. Приналежність цих колоній до Agrobacterium підтверджували при використанні тесту на кетолактозу. Декілька позитивних відносно кетолактози колоній відбирали для вихідних 3 мл YEP (з антибіотиками) культур, які висіваються, які росли протягом ночі при 28 °C при перемішуванні. 300 мкл кожної висіяної культури використовували для інокуляції 200 мл YEP (з антибіотиками) з ростом культури протягом ночі при 28 °C при перемішуванні при 200 об/хв. Плазмідну ДНК отримували з 165 мл кожних 200 мл культури, яка виростала протягом ночі, з використанням набору MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND® XTRA MAXI PLASMID DNA PURIFICATION. Дотримуючись протоколу виробника за винятком використання 30 мл кожного з буферів RES, LYS і NEU. Елюйовану ДНК зберігали при 4 °C. Гідроліз ферментом рестрикції BamН I плазмідної ДНК використовували для підтвердження присутності pDAB9292 у цих ізолятах, і колонії, які мають коректні патерни, потім додатково 14 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 очищали, використовуючи два пасажі ізоляту одиночної колонії. Плазмідну ДНК отримували з культур, інкубованих протягом ночі, як описано вище, і аналіз за допомогою гідролізу ферментами рестрикції використовували для підтвердження присутності інтактної pDAB9292. Як гідролізований стандарт включали плазмідну ДНК вектора pDAB9292, початково використаного для трансформації GV3101(pMP90). Чотири окремих реакції гідролізу (Pst I, BamН I, Mfe I і Hind III) проходили з використанням від 750 нг до 1 мкг ДНК. Реакції давали проходити протягом від 1 до 2 годин, і результат аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (0,8% мас./об.), і фрагменти ДНК візуалізували фарбуванням бромідом етидію. Ізолят GV3101 A. tumefaciens, який несе допоміжну плазміду pMP90 Ti і pDAB9292, названий DAt20712. Приклад 9: Електропорація ДНК pDAB9292 у штам LBA4404 Agrobacterium Клітини штаму LBA4404 Agrobacterium tumefaciens (Ooms et al., (1982) Plasmid 7:15-29) робили електрокомпетентними за допомогою стандартного протоколу (див. приклад 3). 50 мкл компетентних клітин LBA4404 відморожували на льоді і трансформували з використанням від 300 до 400 нг ДНК плазміди pDAB9292. Суміш ДНК і клітин піддавали електропорації з використанням попередньо охолоджених кювет для електропорації (0,2 см) і електропоратора BIO-RAD GENE PULSER при наступних умовах: напруга: 2,5 кВ, тривалість імпульсу: 5 мсек, вихідна ємність: 25 мкФ, опір: 200 Ом. Після електропорації до кювети додавали 1 мл бульйону YEP, і суспензію клітин у YEP переносили в 15 мл пробірку для культивування. Клітини інкубували при 28 °C при обережному перемішуванні протягом 4 годин, після цього культуру висівали на чашки з YEP + агаром, який містить канаміцин 50 мкг/мл і стрептоміцин 250 мкг/мл. Чашки інкубували протягом від 2 до 4 днів при 28 °C, і колонії збирали і висівали штрихом на свіжі чашки YEP + агар з антибіотиками, як зазначено вище, і інкубували при 28 °C протягом від 1 до 3 днів. Приналежність цих колоній до Agrobacterium підтверджували при використанні тесту на кетолактозу і їх додатково очищали, використовуючи два пасажі ізоляту одиночної колонії. Декілька позитивних відносно кетолактози колоній відбирали для вихідних 3 мл YEP (з антибіотиками) культур, які висіваються, які росли протягом ночі при 28 °C при перемішуванні. 300 мкл кожної висіяної культури використовували для інокуляції 200 мл YEP (з антибіотиками) з ростом культури протягом ночі при 28 °C при перемішуванні при 200 об/хв. Плазмідну ДНК отримували з 165 мл кожних 200 мл культури, яка виростала протягом ночі, з використанням набору MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND® XTRA MAXI PLASMID DNA PURIFICATION. Дотримуючись протоколу виробника за винятком використання 30 мл кожного з буферів RES, LYS і NEU. Елюйовану ДНК зберігали при 4 °C. Присутність інтактної плазміди pDAB9292 підтверджували за допомогою гідролізу ферментами рестрикції. Як гідролізований стандарт включали плазмідну ДНК вектора pDAB9292, початково використовуваного для трансформації LBA4404. Три окремих реакції гідролізу (Pst I, BamН I і Hind III) проходили з використанням від 750 нг до 1 мкг ДНК. Реакції давали проходити протягом від 1 до 2 годин, і результат аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (0,8% мас./об.), і фрагменти ДНК візуалізували фарбуванням бромідом етидію. Ізолят LBA4404 A. tumefaciens, який несе pDAB9292, названий DAt20711. Цей штам створює основу для рекомбінантно-профіцитної "потрійної" системи. Приклад 10: Електропорація ДНК pDAB9292 у штам DAt20538 Agrobacterium Електрокомпетентні клітини DAt20538 отримують з використанням стандартного протоколу (див. приклад 3). 50 мкл компетентних клітин DAt20538 розморожують на льоді і трансформують за допомогою від 300 до 400 нг ДНК плазміди pDAB9292. Суміш ДНК і клітин електропорують, використовуючи попередньо охолоджені кювети для електропорації (0,2 см) і електропоратор BIO-RAD GENE PULSER, при наступних умовах: напруга: 2,5 кВ, тривалість імпульсу: 5 мсек, вихідна ємність: 25 мкФ, опір: 200 Ом. Після електропорації в кювету додають 1 мл бульйону YEP, і суспензію клітин у YEP переносять у 15 мл пробірку для культивування. Клітини інкубують при 28ºС при легкому перемішуванні протягом 4 годин, після чого культуру висівають на YEP + агар, який містить канаміцин у концентрації 50 мкг/мл і гентаміцин у концентрації 100 мкг/мл. Чашки інкубують протягом від 2 до 4 днів при 28ºС, відбирають колонії і наносять їх штрихом на свіжі чашки з YEP + агар з антибіотиками, як зазначено вище, і інкубують при 28ºС протягом від 1 до 3 днів. За допомогою кетолактозного тесту підтверджують, що ці колонії являють собою Agrobacterium, і позитивні відносно кетолактози колонії потім виділяють за допомогою двох пасажів ізоляту одиночної колонії. Відбирають колонії для ініціації культур у 3 мл YEP (з антибіотиками) для інокуляції, які вирощують протягом ночі при 28ºС при струшуванні. 300 мкл кожної з культур для інокуляції використовують для інокуляції 200 мл YEP (з антибіотиками) нічної культури, вирощуваної при 28ºС зі струшуванням при 200 об/хв. Плазмідну ДНК отримують з 165 мл з кожних 200 мл нічної 15 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 культури за допомогою набору MACHEREY-NAGEL NUCLEOBOND® XTRA MAXI PLASMID DNA PURIFICATION. Дотримуючись протоколу виробника, за винятком того, що використовують 30 мл кожного з буферів RES, LYS і NEU. Елюйовану ДНК зберігають при 4°С. Для підтвердження наявності інтактної плазміди pDAB9292 використовують рестрикційний аналіз. Як гідролізований стандарт включають плазмідну ДНК вектора pDAB9292, початково використаного для трансформації DAt20538. Проводять чотири окремі реакції гідролізу, такі як Pst I, BamН I, Mfe I і Hind III, з використанням від 750 нг до 1 мкг ДНК. Реакції дають розвинутися протягом від 1 до 2 годин й аналізують за допомогою електрофорезу в агарозному гелі (0,8% мас./об.), і фрагменти ДНК візуалізують фарбуванням етидію бромідом. Ізолят A. tumefaciens DAt20538, який несе pDAB9292, названий DAt20538(pDAB9292). Приклад 11: Конструювання векторів для трансформації рослин, які містять багаторазово повторювані елементи послідовності, і введення в штами Agrobacterium У даному описі ілюструється придатність сконструйованого штаму Agrobacterium tumefaciens з недостатністю функції RecА у поєднанні з допоміжними генами, забезпечуваними фрагментом 14,8 KpnІ VirBCDG. Бінарний вектор для трансформації рослин, pDAB101513 (Фіг. 4A), був TM сконструйований у штамі E. coli для клонування STBL2 за допомогою поєднання стандартних методів клонування (як описано, наприклад, у Sambrook et al., (1989, вище) і Ausubel et al., TM (1995, вище)) і технології GATEWAY (INVITROGEN). Бінарний вектор pDAB101513 базується на точці початку реплікації типу IncР плазміди RK2, і основа вектора містить бактеріальний ген, який додає стійкості у спектиноміцину (SpcR на фігурі 4) у концентрації 100 мкг/мл. Граничні повтори Т-ДНК беруть початок від ділянки TL pTi15955. Усередині правої граничної ділянки (ТДНК граничної ділянки B на Фіг. 4) і потрійної лівої граничної ділянки (Т-ДНК граничної ділянки A на Фіг. 4) ділянки Т-ДНК плазміди pDAB101513 розташовані 4 експресовані в рослинах, які містять оптимізовані для рослин кодони, які кодують білки послідовності (CDS), транскрипція кожної з який керується промотором убіквітину 1 маїсу з 1991 п.н. з асоційованим інтроном 1 (патент США № 5510474). Три кодуючі ділянки кодують окремі білки Bt Cry1 (Cry1Ca, SEQ ID NO:7; Cry1Fa, SEQ ID NO:9; і Cry1Ab, SEQ ID NO: 11), причому кожна з них містить приблизно 3500 п.н. Ці кодуючі ділянки були оптимізовані для експресії в рослинах маїсу з використанням таблиці кращих для маїсу (Zea mays) кодонів, розрахованої на основі аналізу 706 ділянок, які кодують білки маїсу, які були отримані з депозитів GENBANK. Додаткові вказівки, які стосуються конструювання й отримання синтетичних генів, можна знайти, наприклад, у WO 97/13402A1, патенті США № 6166302 і патенті США № 5380831. Три ділянки, які кодують білки B.t, співвідносяться одна з одною у такий спосіб: ділянка, яка кодує, cry1Ca (SEQ ID NO: 6) і ділянка, яка кодує, cry1Fa (SEQ ID NO:8) мають 67% гомологію послідовності; кодуючі ділянки cry1Ca (SEQ ID NO: 6) і cry1Ab (SEQ ID NO: 10) мають 69,5% гомологію послідовності, а кодуючі ділянки cry1Fa (SEQ ID NO:8) і cry1Ab (SEQ ID NO: 10) мають 67% гомологію послідовності. Крім того, C-кінцеві 1600 п.н. CDS cry1Ca, cry1Fa і cry1Ab мають 73% гомологію послідовності. Кожна з цих трьох кодуючих ділянок закінчується Per5 3'-нетрансльованою ділянкою маїсу (3'UTR) (патент США № 6384207). Четвертий ген включає ділянку, яка кодує, aad1 з оптимізованими для рослин кодонами (SEQ ID NO: 12), яка кодує маркерний білок селекції AAD1 (SEQ ID NO: 13) (патент США № 7838733). Ділянка, яка кодує, aad1 не є спорідненою CDS cry1Ca, cry1Fa або cry1Ab. Ділянка, яка кодує, aad1 була сконструйована з використанням таблиці кращих для рослин кодонів. Таблиця кращих для маїсу кодонів була розрахована на основі аналізу 706 послідовностей, які кодують білки маїсу, які були отримані з послідовностей, депонованих у GENBANK. Таблиці використовуваних кодонів для тютюну (Nicotiana tabacum, 1268 CDS), каноли (Brassica napus, 530 CDS), бавовни (Gossypium hirsutum, 197 CDS) і сої (Glycine max; ca. 1000 CDS) були завантажені із сайту http://www.kazusa.or.jp/codon/. Кращий набір кодонів, який включає часто використовувані кодони, загальні для наборів даних для маїсу і дводольних, при відповідній зміні масштабу середніх відносних величин розраховували після видалення будьякого додаткового кодона, використовуваного рідше, ніж приблизно 10% від сумарного використання кодонів для даної амінокислоти в одному з типів рослин. Ген aad1 закінчується 3'UTR ліпази маїсу (патент США № 7179902). Таким чином, усередині ділянки Т-ДНК pDAB101513, яка містить 22729 п.н., чотири копії промотору ubi1 маїсу включають у цілому 7964 основ, організованих у вигляді чотирьох прямих повторів з майже 2 т.п.н. (тисяч пар нуклеотидів), причому кожен повтор на 100% подібний до інших. Три копії Per5 3'UTR включають у цілому 1095 основ, організованих у вигляді трьох прямих повторюваних одиниць, причому кожна з них на 100% подібна до інших, а три кодуючі ділянки cry1Ca, cry1Fa і cry1Ab організовані у вигляді прямих повторів, які мають гомологію одна з одною від 67% до 73%. У цілому T-ділянка pDAB101513 включає приблизно 86% послідовностей з високою повторюваністю і для зручності може бути зображена в такий спосіб: 16 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 RB> промотор Ubi1:cry1Ca CDS:Per5 3’UTR>промотор Ubi1: cry1Fa CDS:Per5 3’UTR>промотор Ubi1 cry1Ab CDS:Per5 3’UTR>промотор Ubi1: aad1 CDS:Lip 3’UTR>LB Природа високої повторюваності цього конструкта необхідна для того, щоб завершити стадії TM клонування в штамі E. coli для клонування STBL2 , який був спеціально сконструйований для підтримки цілісності клонів, які містять такі послідовності ДНК із високою повторюваністю. Плазміду pDAB101513 уводили шляхом електропорації в електрокомпетентні клітини A. tumefaciens штаму EHA105 (який набув стійкості до стрептоміцину в результаті спонтанної хромосомної мутації), і стійкі до спектиноміцину/стрептоміцину ізоляти перевіряли за допомогою рестрикційного аналізу на предмет наявності інтактної плазміди pDAB101513 перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80°С. Цей штам названий EHA105(pDAB101513). Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин, отриманих із заморожених у гліцерині партій EHA105(pDAB101513), містять перебудовані версії або версії з делеціями плазміди pDAB101513. Для трансформацій маїсу збирали всі клітини штаму EHA105(pDAB101513) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх точно, як описано в прикладі 13. Плазміда pDAB101513 була успішно введена шляхом електропорації в електрокомпетентні клітини A. tumefaciens штаму DA2552 (по суті штаму, який є версією, EHA105 з недостатністю RecА) з отриманням штаму DA2552(pDAB101513). Трансформанти, відібрані на основі стійкості до еритроміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80°С. Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин, отриманих із заморожених у гліцерині партій, містять інтактну плазміду pDAB101513. Збирали всі клітини штаму DA2552(pDAB101513) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу (приклад 13). Плазміда pDAB101513 була успішно введена шляхом електропорації в електрокомпетентні клітини A. tumefaciens штаму DAt13192 (штаму DA2552, який несе плазміду pDAB9292) з отриманням штаму DAt13192(pDAB101513). Трансформанти, відібрані на основі стійкості до еритроміцину, канаміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80ºС. Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин, отриманих із заморожених у гліцерині партій, містять інтактну плазміду pDAB101513. Збирали всі клітини штаму DAt13192(pDAB101513) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу (див. приклад 13). Подібним чином було сконструйоване похідне pSB11 (човникового вектора супербінарної системи), яке містить ділянку Т-ДНК, аналогічну ділянці Т-ДНК pDAB101513. Декількаразові спроби сконструювати супербінарну плазміду за допомогою стандартних методів у LBA4404(pSB1) були невдалими. Усі спроби приводили до виділення коінтегративних плазмід на основі pSB1 з великими перебудовами і делеціями. Приклад 12: Конструювання вектора pDAB101514, який трансформує, рослини, який містить множинні повторювані елементи послідовності, і введення в штами Agrobacterium У даному описі додатково ілюструється придатність сконструйованого штаму A. tumefaciens з недостатністю функції RecА у поєднанні з допоміжними генами vir, забезпечуваними фрагментом 14,8 KpnІ VirBCDG. Бінарний вектор, який трансформує рослини, pDAB101514 (Фіг. TM 4B) був сконструйований у клонуючому штамі STBL2 E. coli. Структура бінарного вектора pDAB101514 є майже такою ж, як і структура pDAB101513 (див. попередній приклад), за винятком експресійних елементів, використовуваних для керування експресією гена cry1Ca. Транскрипція cry1Ca CDS у pDAB101514 керується промотором бацилоподібного вірусу цукрової тростини з 1429 п.н. (SCBV; Tzafrir et al., (1998) Plant Molec. Biol. 38:347-356). 5’UTR складається по суті з інтрону 6 гена алкогольдегідрогенази маїсу (GENBANK номер реєстрації X04049), із прилягаючими 20 основами екзону 6 і 11 основами екзона 7. Транскрипція цього гена термінується pinII 3’UTR картоплі (An et al., (1989) Plant Cell. 1:115-122). Експресійні елементи, використовувані для контролю експресії генів cry1Fa, cry1Ab і aad1, є тими ж, як і використані в pDAB101513. Таким чином, у межах ділянки Т-ДНК pDAB101514, яка складається з 22586 п.н., три копії промотору ubi1 маїсу включають у цілому 5973 основ, організованих у вигляді 3 прямих повторів, кожен з яких складається з майже 2 т.п.н., причому кожен повтор на 100% подібний до інших. Дві копії Per5 3'UTR включають у цілому 730 основ, організованих у вигляді двох прямих повторюваних одиниць, причому кожна з них на 100% подібна до інших, а три кодуючі ділянки cry1Ca, cry1Fa і cry1Ab організовані у вигляді прямих повторів, які мають гомологію послідовності ДНК одна з одною від 67% до 73%. У цілому T-ділянка pDAB101514 17 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включає приблизно 76% послідовностей з високою повторюваністю, і фізична організація для зручності може бути зображена в такий спосіб: RB>промотор SCBV: cry1Ca CDS:pinII 3’UTR>промотор Ubi1: cry1Fa CDS:Per5 3’UTR>промотор Ubi1 cry1Ab CDS:Per5 3’UTR>промотор Ubil:aad1 CDS:Lip 3’UTR>LB Природа високої повторюваності цього конструкта необхідна для того, щоб завершити стадії TM клонування в штамі E. coli для клонування STBL2 , який спеціально сконструйований для підтримки цілісності клонів, які містять такі послідовності ДНК із високою повторюваністю. Плазміду pDAB101514 уводили шляхом електропорації в електрокомпетентні клітини A. tumefaciens штаму EHA105 (який набув стійкості до стрептоміцину в результаті спонтанної хромосомної мутації), і стійкі до спектиноміцину/стрептоміцину ізоляти перевіряли за допомогою рестрикційного аналізу на предмет наявності інтактної плазміди pDAB101514 перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80°С. Цей штам був названий EHA105(pDAB101514). Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин EHA105(pDAB101514), отриманих із заморожених у гліцерині партій, містять перебудовані версії або версії з делеціями плазміди pDAB101514. Для трансформацій маїсу збирали всі клітини штаму EHA105(pDAB101514) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх за допомогою методів, розкритих у прикладі 13. Плазміда pDAB101514 була успішно введена шляхом електропорації в електрокомпетентні клітини A. tumefaciens штаму DA2552 (по суті штаму, який є версією, EHA105 з недостатністю RecА) з отриманням штаму DA2552(pDAB101514). Трансформанти, відібрані на основі стійкості до еритроміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80°С. Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин, отриманих із заморожених у гліцерині партій, містять інтактну плазміду pDAB101514. Збирали всі клітини штаму DA2552(pDAB101514) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу за допомогою методів, розкритих у прикладі 13. Плазміда pDAB101514 була успішно введена шляхом електропорації в клітини A. tumefaciens штаму DAt13192 (штаму DA2552, який несе плазміду pDAB9292) з отриманням штаму DAt13192(pDAB101514). Трансформанти, відібрані на основі стійкості до еритроміцину, канаміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80°С. Було виявлено, що численні індивідуальні культури з клітин DAt13192(pDAB101514), отриманих із заморожених у гліцерині партій, містять інтактну плазміду pDAB101514. Збирали всі клітини штаму DAt13192(pDAB101514) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу за допомогою методів, розкритих у прикладі 13. Подібним чином було сконструйоване похідне pSB11 (човникового вектора супербінарної системи), яке містить ділянку Т-ДНК, аналогічну ділянці Т-ДНК pDAB101514. Декількаразові спроби сконструювати супербінарну плазміду за допомогою стандартних методів у LBA4404(pSB1) були невдалими. Усі спроби приводили до виділення коінтегративних плазмід на основі pSB1 з великими перебудовами і делеціями. Приклад 13: Трансформація маїсу штамами Agrobacterium, які несуть бінарні вектори pDAB101513 і pDAB101514 Опосередковувана Agrobacterium трансформація маїсу. Насіння гібриду Hi-II F1 (Armstrong et al., (1991) Maize Genet. Coop. Newslett. 65:92-93) висаджували в 5-галлонові (18,9 л) горщики, які містять суміш з 95% середовища METRO-MIX 360 для вирощування без ґрунту (SUN GRO HORTICULTURE; Bellevue, WA) і 5% суглинного ґрунту. Рослини вирощували в оранжереї з використанням поєднання натрієвих і метал-галоїдних ламп високого тиску з режимом освітлення світло 16 годин:темрява 8 годин. Робили контрольоване перезапилення сестриних рослин з отриманням незрілих зародків F2 для трансформації. Колоски маїсу збирали через приблизно 8-10 днів після запилення, коли незрілі зародки мали розмір між 1,0 мм і 2,0 мм. Інфікування і спільне культивування. Колоски маїсу очищали, і поверхню стерилізували за допомогою щітки і рідкого мила, занурення в 20% наявний у продажі відбілювач (який містить 5% гіпохлориту натрію) протягом приблизно 20 хвилин і наступного триразового промивання стерильною водою. Суспензію клітин A. tumefaciens, які несуть pDABl01513 або pDAB101514, бінарні вектори, які містять три гени, які кодують білки Bt Cry1Ca, Cry1Fa і Cry1Ab і які містять маркерний ген селекції рослин aad-1, отримували перенесенням 1 або 2 петель бактерій (вирощених протягом 2-3 днів при 28ºС у середовищі агару з YEP, яке містить відповідні антибіотики) у 5 мл рідкого середовища для інфікування (LS Basal Medium (Linsmaier and Skoog, 18 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (1965) Physiologia Plantarum 18: 100-127) з вітамінами N6 (Chu et al., (1975) Scientia Sinica 18:659-668), 1,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксіоцтовою кислотою (2,4-D), 68,5 г/л сахарозою, 36,0 г/л глюкозою, 6 мМ L-проліном, p 5,2], яке містить 200 мкМ ацетосирінгону. Розчин перемішували до отримання однорідної суспензії, і концентрацію доводили до кінцевої оптичної густини приблизно 0,4 при 550 нм. Незрілі зародки виділяли прямо в мікроцентрифугальну пробірку, яка містить 2 мл середовища для інфікування. Середовище видаляли і заміняли 1 мл розчину Agrobacterium, і розчин Agrobacterium/зародок інкубували протягом від 5 до 10 хвилин при кімнатній температурі. Після цього зародки переносили в середовище для спільного культивування (LS Basal Medium, вітаміни N6, 1,5 мг/л 2,4-D, 30,0 г/л сахарози, 6 мМ L-пролін, 0,85 мг/л AgNO3, 2,8 TM г/л GELLAN GUM (PHYTOTECHNOLOGY LABORATORIES; Lenexa, KS), pН 5,8), яке містить 200 мкМ ацетосирінгону, і культивували протягом 3-4 днів при 20ºС у темряві. Після спільного культивування зародки переносили в заспокійливе середовище, яке містить солі MS і вітаміни (Frame et al., 2011 , Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. В: Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA, LLC. pp 327-341), 6 мМ L-проліну, 100 мг/л міо-інозиту, 500 мг/л MES (2-(N-морфоліно)етансульфокислоти моногідрату; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.), 30 г/л сахарози, 1,5 мг/л 2,4-D, 0,85 AgNO3, 250 TM мг/л цефотаксиму, 2,8 г/л GELLAN GUM , p 5,8. Через приблизно 7 днів зародки переносили в те ж середовище з добавкою 100 нМ галоксифопу. Трансформовані ізоляти були ідентифіковані через приблизно 8 тижнів і були об'єднані шляхом перенесення у свіже селективне середовище з 2-тижневими інтервалами для регенерації й аналізу. Регенерація й отримання насіння. Для регенерації культури переносили в середовище для індукції "28" (солі MS і вітаміни, 30 г/л сахарози, 5 мг/л бензиламінпурину, 0,25 мг/л 2,4-D, 250 TM мг/л цефотаксиму, GELLAN GUM , p 5,7) з добавкою 100 нМ галоксифопу. Інкубація -2 -1 відбувалася протягом 1 тижня в умовах слабкого освітлення (14 мкЕйнштейн·м ·сек ) і потім -2 -1 протягом 1 тижня в умовах сильного освітлення (приблизно 89 мкЕйнштейн·м ·сек ). Тканини потім переносили в середовище для регенерації "36" (таке ж, як середовище для індукції, крім відсутності регуляторів росту рослин). Коли проростки досягали довжини від 3 см до 5 см, їх переносили в скляні пробірки для культивування, які містять середовище SHGA [(солі і вітаміни Schenk and Hildebrandt, PHYTOTECHNOLOGIES LABR.), 1,0 г/л міо-інозиту, 10 г/л сахарози і 2,0 TM г/л GELLAN GUM , p 5,8], для забезпечення подальшого росту і розвитку пагонів і коріння. Рослини переносили на ту ж ґрунтову суміш, що й описана раніше, і вирощували до цвітіння в оранжереї. Збирали зразки тканин рослини і використовували в біотестах з комахами за допомогою методів, розкритих у прикладі 14, і для молекулярних і біохімічних аналізів. Фахівці в галузі техніки трансформації маїсу повинні розуміти, що для трансформації маїсу і добору трансформованих рослин придатні інші методи при використанні інших експресованих маркерних генів селекції рослин (наприклад, генів стійкості до гербіцидів). Приклад 14: In vitro біотести зразків листя проти комах-шкідників маїсу Аналізованими видами лускокрилих були кукурудзяна щипавка (CEW; Helicoverpa zea (Boddie)), кукурудзяний метелик (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) і трав'яна совка (FAW; Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)). Яйця цих комах були отримані від BENZON RESEARCH (Carlisle, PA). Біотест першого рівня: Високопродуктивний 96-ямковий біотест. 96-ямкові планшети (TPPUS; St. Louis, MO) частково заповнювали 2% розчином агару (SIGMA-ALDRICH), і давали агару застигнути. За допомогою стандартного ручного пробійника для паперів готували по три зразки дисків з листя діаметром 1/8 дюйма (3,2 мм) для кожного з двох видів комах (CEW і FAW), які тестуються у цьому форматі. Один диск листка вміщували в одну ямку 96-ямкового планшета; використовували три планшети для кожної тестованої комахи (один для кожної репліки/диск листка). Для введення яєць комахи в кожну ямку 96-ямкового планшета використовували пристрій для висівання яєць. Планшети потім закривали перфорованими клейкими кришками, а також накривали пластиковою кришкою, прикладеною до планшета. Планшети витримували при 30ºС, 40% відносної вологості (RH) в режимі освітлення 16 годин світло:8 годин темрява протягом трьох днів. Класифікацію проводили з використанням шкали 0-1-2, у якій 0 позначає ушкодження 50% диска листка в кожній ямці. Показники ушкодження для кожного тесту усереднювали і використовували в парі з аналізом експресії білка для проведення кореляційного аналізу. Активними проти шкідника, який тестується, вважали рослини з показником ушкодження комахою 0,67 або менше. 19 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Біотест другого рівня: 32-ямковий біотест. 32-ямкові планшети (C-D INTERNATIONAL; Pitman, NJ) частково заповнювали 2% розчином агару, і давали агару застигнути. З кожної 2 рослини брали фрагменти листків розміром приблизно 1 квадратний дюйм (6,45 см ) і вміщували по одному в ямки 32-ямкових планшетів. У кожну ямку вміщували один шматочок листка, і тестували по два шматочки листка на одну рослину і на одну комаху. Комахи (CEW і FAW) у масовому порядку переносили за допомогою кисті, поміщаючи в кожну ямку по 10-20 новонароджених личинок. Планшети закривали перфорованими клейкими кришками, які забезпечували вентиляцію під час тестування. Планшети витримували при 28ºС, 40% RH при режимі освітлення 16 годин світло:8 годин темрява протягом трьох днів. Після закінчення тестування для кожного шматочка листка отримували показник простого відсотка ушкодження. Показники ушкодження для кожного тесту усереднювали і використовували в парі з аналізом експресії білка для проведення кореляційного аналізу. Активними проти шкідника, який тестується, вважали рослини із середніми оцінками ушкодження комахою 25% або менше. Статистичний аналіз. Всі аналізи проводили в JMP 8.0.2 (SAS INSTITUTE Inc., Cary, North Carolina). Для виявлення значимих розходжень між впливами і рослинами негативного контролю для даних з ушкодженням комахою використовували односторонній аналіз ANOVA. Для подальшої оцінки значимих розходжень між впливами також використовували метод ТакіКрамера HSD порівняння середніх значень. Крім того, для аналізу кореляції між кількістю експресованого білка і вимірами активності комах використовували лінійний регресійний (метод найменших квадратів) аналіз. Результати біотестів підсумовані в таблиці 2. Приклад 15: Біохімічна і молекулярна характеристика тканин маїсу, трансформованих pDAB101513 Були проведені численні експерименти по трансформації сконструйованими штамами A. tumefaciens EHA105(pDAB101513), DA2552(pDAB101513) і DAt13192(pDAB101513). Кількість копій чотирьох трансгенів у трансгенних рослинах T0 була встановлена за допомогою тестів гідролізу зондів (Bubner and Baldwin, (2004) Plant Cell Rep. 23:263-271) з використанням специфічних для генів олігонуклеотидів. Білкові екстракти з рослин, які містять від 1 до 3 копій ("низька копійність") генів, додатково перевіряли на предмет продукції білків Bt Cry1Ca, Cry1Fa і Cry1Ab і білка AAD1 за допомогою методів ELISA з використанням наявних у продажі наборів TM антитіл (ENVIROLOGIX , Portland, MA). Були виявлені рослини, які продукують усі чотири білки (таблиця 3). Крім того, шматочки листків рослин піддавали біотестуванню на предмет активності проти трьох комах-шкідників маїсу: кукурудзяної щипавки (CEW, Helicoverpa zea), трав'яної совки (FAW, Spodoptera frugiperda) і європейського кукурудзяного метелика (ECB, Ostrinia nubilalis) у тестах поїдання (приклад 14). Були виявлені рослини, які містять усі чотири трансгени в малій кількості копій, продукують усі чотири білки і мають активність проти всіх трьох комах-шкідників (таблиця 4). В експериментах зі штамами EHA105(pDAB101513) або DA2552(pDAB101513) не було отримано трансформованих рослин, які не відповідали цим критеріям (таблиця 4). Таким чином, особливістю штаму DAt13192, який має делецію хромосомного гена recА, який додатково включає повний набір генів vir з pTiBo542, який міститься на pTiEHA105, і також який додатково включає частковий набір генів vir pTiBo542, який міститься у фрагменті 14,8 KpnІ VirBCDG вектора pDAB9292, служить те, що він здатний ефективно продукувати трансформовані рослини маїсу з великими ділянками Т-ДНК, які складаються з елементів послідовності з високою повторюваністю. Приклад 16: Біохімічна і молекулярна характеристика тканин маїсу, трансформованих pDAB101514 Були проведені численні експерименти по трансформації сконструйованими штамами A. tumefaciens EHA105(pDAB101514), DA2552(pDAB101514) і DAt13192(pDAB101514). Кількість копій чотирьох трансгенів у трансгенних рослинах T 0 була встановлена за допомогою тестів гідролізу зондів (Bubner and Baldwin, вище) з використанням специфічних для генів олігонуклеотидів. Білкові екстракти з рослин, які містять від 1 до 3 копій ("низька копійність") генів додатково перевіряли на предмет продукції білків Bt Cry1Ca, Cry1Fa і Cry1Ab і білка AAD1 за допомогою методів ELISA з використанням наявних у продажу наборів антитіл TM (ENVIROLOGIX , Portland, MA). Крім того, шматочки листків рослин піддавали біотестуванню на предмет активності проти трьох комах-шкідників маїсу в тестах поїдання (приклад 14). Були виявлені рослини, які містять усі чотири трансгени в малій кількості копій, продукують усі чотири білки і мають активність проти всіх трьох комах-шкідників (таблиця 5). В експериментах зі штамами EHA105(pDAB101514) або DA2552(pDAB101514) не було отримано трансформованих рослин, які не відповідали цим критеріям. Таким чином, особливістю штаму DAt13192, який має делецію хромосомного гена recА, який додатково включає повний набір генів vir з pTiBo542, 20 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 який міститься на pTiEHA105, і також який додатково включає частковий набір генів vir pTiBo542, який міститься у фрагменті 14,8 KpnІ VirBCDG вектора pDAB9292, служить те, що він здатний ефективно продукувати трансформовані рослини маїсу з великими ділянками Т-ДНК, які складаються з елементів послідовності з високою повторюваністю. Приклад 17: Ідентифікація і характеристика нейтрального сайту інтеграції в хромосомі Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Індукований у рослині локус picА/pgl хромосоми штаму C58 A. tumefaciens (GENBANK номер реєстрації AE0009243) був ідентифікований як несуттєвий ген, у який можуть бути інтегровані фрагменти ДНК (Rong et al., (1990) J. Bacteriol. 172:5828-5836; Rong et al., (1991) J. Bacteriol. 173:5110-5120). Про схожий нейтральний сайт інтеграції в геномі штаму LBA4404 A. tumefaciens не повідомлялося. У даному описі заявники описують ідентифікацію і секвенування геномної ділянки LBA4404, яка включає послідовності з частковою гомологією локусу picА/pgl C58. Клітини LBA4404 (INVITROGEN) вирощували в середовищі YM (г/л: дріжджовий екстракт, 0,4; маніт, 10; NaCl, 0,1; MgSO4 7H2O, 0,2; K2HPO4 3H2O, 0,5) при 30ºС протягом ночі. Геномну ДНК отримували з 1 мл культури за допомогою набору EASY DNA (INVITROGEN) відповідно до протоколів виробника. Були сконструйовані вироджені праймери на основі двох ділянок гомології між послідовністю білка PicА C58 і гомологами, виявленими в Arabidopsis thaliana, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Alkaliphilus metalliredigenes і Clostridium acetobutylicum. Геномну ДНК LBA4404 використовували як матрицю для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) TM із застосуванням HERCULASE MASTER MIX (STRATAGENE; San Diego, CA) і вироджених праймерів AtnilА1Fa (5’-GACAGTCCNAATACSGAYGG-3’; SEQ ID NO:14; відповідного амінокислотам 273-279 білка PicА C58) і Atnil3R (5’-GTYTTSAGNCGSAGSCCSCGRTCSGT-3’; SEQ ID NO:15, який відповідає комплементарному ланцюгу, який кодує амінокислоти 364-369 білка PicА C58). Використовували наступні умови термоциклу: 1 цикл 94ºС, 2 хв; 25 циклів [94ºС, 30 сек; 55ºС 30 сек; 72ºС, 60 сек]; 1 цикл 72ºС, 7 хв. Позначення вироджених нуклеотидів у послідовностях праймерів відповідають нуклеотидам ДНК у такий спосіб: N = A, C, G або T; Y = T або C; R = A або G; і S = C або G. Був виділений продукт із 285 пар основ (п.н.), клонований у вектор pCR2.1-TOPO (INVITROGEN) у клітинах Escherichia coli TOP 10 (INVITROGEN), і була визначена послідовність ДНК. Було виявлено, що послідовність гомологічна, але не ідентична ділянці гена picА C58 (85% ідентичність послідовності), і геномна ділянка LBA4404, яку вона представляє, позначається в даному описі як фрагмент nilА. Були сконструйовані додаткові праймери, комплементарні фрагменту з 285 п.н. nilА LBA4404, для використання як якорі при ампліфікації за допомогою ПЛР геномних фрагментів, які примикають по обидва боки до послідовності з 285 п.н. У реакціях ПЛР їх використовували в парах із праймерами, сконструйованими на основі послідовностей фланкуючих ділянок гена picА C58. Були визначені послідовності ампліфікованих фрагментів, які беруть початок від послідовності з 285 п.н. і розширених в обидва боки, які примикають до фрагмента nilА, і використані для конструювання інших праймерів для наступних реакцій ПЛР. При використанні матриці геномної ДНК LBA4404 із праймерами nilА2F (5'-CCATCCTCATAACACCAGCT-3'; SEQ ID NO:16) і nilА2R (5'-GCAGATCATCGATACGACCA-3'; SEQ ID NO:17), був отриманий фрагмент ПЛР із приблизно 2 тисячі основ (т.п.н.), який був клонований у pCR®-BLUNT II/XL-TOPO® з використанням набору для клонування TOPO TA (INVITROGEN) з отриманням плазміди pDOW3719 (Фіг. 2). Аналіз послідовності уставленого фрагмента pDOW3719 дав послідовність з 1796 п.н. (SEQ ID NO:18), яка включає найбільш довгу відкриту рамку зчитування (ORF), яка кодує передбачуваний білок з 531 амінокислот. Більш коротка ORF у тій же рамці зчитування кодує передбачуваний білок з 523 амінокислот. Передбачуваний білок з 523 амінокислот LBA4404 має 88% подібність, 85% ідентичність з білком PicА C58. Послідовності, які кодують, для передбачуваного білка з 523 амінокислот LBA4404 і білка PicА C58 мають 81% ідентичність. Таким чином, фрагмент nilА LBA4404 являє собою геномний сегмент, який включає передбачуваний ген, істотно дивергуючий від гена picА C58. У даному розкритті геномна послідовність з 1,8 т.п.н., представлена SEQ ID NO:18, позначається як локус nilА. Як очікується, плазміда pDOW3719, яка містить точку початку реплікації colЕ1, не реплікується автономно в клітинах A. tumefaciens. ДНК плазміди pDOW3719 використовували для трансформації штаму LBA4404 A. tumefaciens шляхом електропорації. Відбір по стійкості до канаміцину (яка носиться pDOW3719) виявив трансформанти з pDOW3719, інтегрованої в хромосому LBA4404 за допомогою рекомбінації, опосередкованої ділянками гомології з 1,8 т.п.н., які є в хромосомі LBA4404 і pDOW3719. Таке явище інтеграції веде до створення лінійної копії послідовності плазмідного вектора pDOW3719, оточеної по обидва боки відтепер дуплікованою ділянкою гомології з 1,8 т.п.н. Трансформанти LBA4404 зі стійкістю до канаміцину були виділені і піддані скринінгу на наявність вставки pDOW3719 за допомогою аналізу ПЛР. Як 21 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 матрицю використовували препарати геномної ДНК трансформантів з 5 наборами праймерів: і) праймера M13F у парі з праймером M13R, який примикає до вставки в pDOW3719, ii) праймера M13F у парі з праймером AS4R (який включає основи, комплементарні залишкам з 1041 по 1060 SEQ ID NO: 18), iii) праймера M13F у парі з праймером AS10R (який включає основи, комплементарні залишкам з 1320 по 1337 SEQ ID NO: 18), iv) праймера M13F у парі з праймером AS11R (який включає основи, комплементарні залишкам з 1391 по 1406 SEQ ID NO: 18), і v) праймера M13R у парі з праймером AS9F (який включає основи з 634 по 649 SEQ ID NO: 18). У контрольних реакціях усі ці набори праймерів ампліфікували фрагменти очікуваного розміру при використанні в якості матриці ДНК плазміди pDOW3719. Однак, коли як матрицю використовували геномну ДНК зі стійкого до канаміцину трансформанту LBA4404, ПЛР із використанням пари праймерів M13F і M13R не дала ампліфікованих продуктів, що вказує на те, що інтактна (неінтегрована) ДНК плазміди pDOW3719 не очищалася разом з геномною ДНК. Аналіз ПЛР зразків геномної ДНК із чотирма іншими парами праймерів показав утворення фрагментів ДНК очікуваного розміру. Ці результати вказують на те, що стійкість до канаміцину трансформантів LBA4404 забезпечується ДНК pDOW3719, яка була інтегрована в геном. Один такий трансформант [LBA4404nilA-int1] був використаний для перевірки явища, яке полягає в тому, що геномна вставка в локус nilА включає здатність штаму трансформувати Arabidopsis thaliana. Бінарним вектором pDAB3779, який містить експресований у рослинах ген, TM який кодує білок PAT (який додає стійкості до гербіциду BASTA ), трансформували клітини штамів LBA4404nilA-int1 і LBA4404 з відбором по стійкості до спектиноміцину. Ці штами потім використовували для проведення експериментів із трансформацією Arabidopsis з використанням методів Weigel and Glazebrook (вище). Різниці в частоті трансформації, отримуваної для двох штамів, не спостерігалося. Таким чином, особливість варіантів здійснення і методів, описаних у даному описі, полягає в тому, що вставка фрагмента чужорідної ДНК у хромосомний локус nilА штаму LBA4404 A. tumefaciens, який включає SEQ ID NO: 18, не робить впливу на ріст рослини або здатність рослини до трансформації таким сконструйованим штамом. Приклад 18: Конструювання суіцидного похідного pDOW3719 для інтегрування в локус nilА LBA4404 Вставка сайту множинного клонування в локус nilА, клонований у pDOW3719, була здійснена за допомогою ПЛР із подовженням за допомогою сплайсингового перекриття (SOE) (Horton et al., (1990) BioTechniques 8:528-535). Реакції ПЛР SOE проводили з використанням TM HERCULASE master mix відповідно до протоколів виробника. Частину локусу nilА ампліфікували з використанням ДНК pDOW3719 як матрицю з праймером nilА5’ (5’CCGGCTCTTCCAGCTCCTCATGCACGAACAACGAGAAACGAGC-3’; SEQ ID NO: 19) у парі з праймером nilА_MCS_SOEF (5’GAATGGTGAAACCTCTAGATTAATTAAGGATCCCCGGGTACCGAAAAGCCCGACATTGC-3’; SEQ ID NO:20) з отриманням фрагмента з приблизно 800 п.н. Другу частину локусу nilА ампліфікували з використанням ДНК pDOW3719 як матрицю і праймера nilА_MCS_SOEF (5’GCAATGTCGGGCTTTTCGGTACCCGGGGATCCTTAATTAATCTAGAGGTTTCACCATTC-3’; SEQ ID NO:21) у парі з праймером nilА3’ (5’-GGAATTCTCAGTGGCTTTCATGGGTTTTCTCG-3’; SEQ ID NO:22) з отриманням фрагмента з приблизно 900 п.н. Отримані фрагменти потім очищали в гелі TM (NUCLEOSPIN , CLONTECH; Mountain View, CA) і використовували як матрицю для ампліфікації з праймерами nilА5’ і nilА3’ з отриманням фрагмента з 1,6 т.п.н., послідовність якого розкрита як SEQ ID NO:23 (nilА MCS). Отриманий фрагмент гідролізували за допомогою Pvu I і Sap I (NEB) і лігували з використанням ДНК-лігази T4 (NEB) із ДНК pBCSK+sacBI (INVITROGEN), гідролізованої тими ж самими ферментами рестрикції. Клітини E. coli TOP10 трансформували сумішшю лігування, і трансформанти відбирали на агарі із соєю LB TEKNOVA; Hollister, CA) з добавкою 30 мкг/мл хлорамфеніколу. Клони піддавали скринінгу за допомогою рестрикційного гідролізу з використанням Pvu I і Kpn I (NEB). Ділянка локусу nilА позитивних клонів була підтверджена секвенуванням, і отримана плазміда була названа pDOW3721. Особливість pDOW3721 полягає в тому, що до сайту множинного клонування (MCS), який містить послідовності, пізнавані ферментами рестрикції Sph I, Kpn I, Sma I, BamН I, Pac I, Ase I і Xba I, примикає з однієї сторони послідовність LBA4404 з 852 п.н., а з іншої сторони послідовність LBA4404 з 745 п.н. Таким чином, фрагмент чужорідної ДНК може бути клонований у MCS pDOW3721 і, отже, інтегрований у хромосомний локус nilА LBA4404 шляхом гомологічної рекомбінації, опосередковуваної фланкуючими послідовностями з LBA4404. Одиночні події кросовера, за допомогою яких уся послідовність плазміди pDOW3721 інтегрується в хромосому LBA4404, можуть бути розділені на подвійні події кросовера за допомогою зворотної селекції на 22 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 середовищах, які містять сахарозу. На таких середовищах сахароза перетворюється в токсичний продукт після ферментативного розкладання під дією білка SacВ, кодованого геном sacВ (Reid and Collmer, (1987) Gene 57:239-246; Quandt et al., (1993) Gene 127:15-21). Таким чином, трансформанти, здатні виживати на середовищі вирощування, яке містить сахарозу, повинні бути піддані другій події кросовера, яке видаляє основу векторної плазміди pDOW3721 із хромосоми і залишає зруйнований локус nilА, який містить інтегрований фрагмент чужорідної ДНК. У багатьох повідомленнях за останні 10 років було показано, що перенесення послідовностей основи вектора є повністю звичайним явищем. Частина рослин із придбаними послідовностями основи вектора в трансформантах звичайно варіювала між 20% і 50% і іноді досягала 75% або більше. У якості одного приклада придатності pDOW3721 був отриманий фрагмент 14,8 KpnІ VirBCDG із плазміди pSB1 і лігований за допомогою ДНК-лігази T4 із ДНК pDOW3721, гідролізованої KpnІ. Клітини E. coli TOP10 трансформували сумішшю лігування, і трансформанти відбирали на агарі із соєю LB з добавкою 30 мкг/мл хлорамфеніколу. Клони були піддані скринінгу за допомогою рестрикційного гідролізу EcoR I і Hind III. Отримана плазміда була названа pDOW3722. Приклад 19: Ідентифікація нуклеотидних послідовностей вище і нижче nilА Штам LBA4404nilA-int1 A. tumefaciens, який містить інтегровану в геном плазміду pDOW3719 (Фіг. 2 і приклад 18), використовували для ідентифікації додаткових послідовностей, розташованих вище і нижче геномної ділянки nilА. pDOW3719 містить ПЛР амплікон з 1796 п.н. локусу nilА штаму LBA4404 A. tumefaciens, клонованого в PCR-BLUNT II/XL-TOPO® (INVITROGEN). Ця плазміда була інтегрована в геном штаму LBA4404 A. tumefaciens за допомогою гомологічної рекомбінації. Колонії, які містили інтегровану плазміду, були ідентифіковані по стійкості до канаміцину (приклад 17). Інтегрована плазміда й елементи, які містяться в ній, можуть бути використані як інструменти для виділення і характеристики додаткових нуклеотидних послідовностей методом "порятунку плазміди". Геномну ДНК (гДНК) отримували з клітин штаму LBA4404nilA-int1 відповідно до протоколу виділення бактеріальної геномної ДНК (Sambrook et al., вище). Один мікрограм гДНК роздільно гідролізували наступними ферментами (усі отримані від NEB): Hind III, BamН I, Pst I, Asc I і Sac II. Ці ферменти рестрикції були обрані спеціально для отримання фрагментів гДНК, які розташовані вище і нижче локусу nilА. Ферменти рестрикції Hind III, BamН I і Pst I були обрані тому, що пізнавані ними сайти унікальні в послідовності pDOW3719. Більше того, ці пізнавані ферментами сайти розташовані в ділянках сполуки ампліконового фрагмента локусу nilА і вектора PCR-BLUNT II/XL-TOPO® (Фіг. 2). Розщеплення гДНК цими ферментами і самолігування отриманих фрагментів приводить, таким чином, до порятунку фрагмента плазміди, який містить неохарактеризовані геномні послідовності, ліговані поруч із сайтами зв'язування прямого універсального праймера M13 або зворотного універсального праймера M13 плазміди pDOW3917. Такі клони виділяють шляхом трансформації сумішшю лігування клітин E. coli з відбором по гену стійкості до канаміцину, який несеться pDOW3917. Крім того, плазміда pDOW3719 не містить сайти, пізнавані ферментами рестрикції Asc I і Sac II. Тому фрагменти гДНК, створювані цими ферментами рестрикції, повинні давати гібридний фрагмент ДНК, який охоплює всю довжину послідовності інтегрованої плазміди pDOW3719 і включає ділянки гДНК, які примикають по обидва боки до інтегрованого плазміді pDOW3719. Фрагменти гДНК, отримані в результаті гідролізу ферментами рестрикції, як описано вище, самолігували за допомогою лігази T4 (ROCHE APPLIED SCIENCES; Indianapolis, IN). Продуктами лігування трансформували клітини E. coli ONESHOT® TOP10 (INVITROGEN), і клітини висівали на середовище LB, яке містить канаміцин (50 мкг/мл). Відбирали індивідуальні колонії, і плазмідну ДНК виділяли і характеризували по патернам гідролізу ферментами рестрикції плазміди. Клони, які містили плазміди, які виявляють узгоджуваний один із одним патерн смуг після гідролізу ферментами рестрикції, відокремлювали для використання в реакціях секвенування. Нуклеотидні послідовності гДНК вище і нижче локусу nilА визначали за допомогою методу "прогулянки по геному". Були сконструйовані секвенуючі праймери, які відповідають відомій TM послідовності гДНК (яка присутня у pDOW3719), і використані з набором CEQ DYE TERMINATOR CYCLE SEQUENCING відповідно до рекомендацій виробника (BECKMAN COULTER; Fullerton, CA). На основі виявленої послідовності був сконструйований другий ряд праймерів, розташованих у раніше невідомої геномної послідовності, і ці праймери були використані для отримання додаткових даних секвенування. Цей процес повторювали доти, поки не була визначена вся наявна нуклеотидна послідовність гДНК. Цей метод дав 2936 п.н. послідовності вище локусу nilА і 4361 п.н. послідовності нижче локусу nilА. Разом з 1796 п.н. 23 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 раніше ідентифікованого локусу nilА вперше ідентифіковані послідовності фланкуючих зверху і знизу ділянок охоплюють послідовність з 9093 п.н., яка включає геномну ділянку nilА (SEQ ID NO:24), яка поширюється в обох напрямках від початково ідентифікованого локусу nilА. Приклад 20: Конструювання вектора для інтегрування в геномну ділянку nilА LBA4404 Був сконструйований і створений інтеграційний вектор для опосередковуваної гомологією інтеграції послідовностей чужорідної ДНК у геномну ділянку nilА A. tumefaciens LBA4404. Фрагмент із 6,3 т.п.н. геномної ділянки nilА, який охоплює локус nilА, ампліфікували за TM допомогою ПЛР із використанням набору для ПЛР FAILSAFE (EPICENTRE®, Madison, WI). Ампліфікований фрагмент лігували у вектор PCR®8/GW/TOPO® (INVITROGEN), і позитивні клони були підтверджені за допомогою гідролізу ферментами рестрикції і перевірки послідовності ДНК. Отриманий вектор, pDAB9615, був додатково модифікований додаванням олігонуклеотидного фрагмента, який містить множину унікальних сайтів впізнавання ферментами рестрикції. Ці сайти рестрикції, оточені ділянками з 3244 п.н. і 3128 п.н. геномної ділянки nilА, служать у якості сайтів клонування для введення чужорідних нуклеотидних послідовностей. Отриманий вектор був названий pDAB9618 (Фіг. 3). Фрагмент із 15549 п.н., який містить фрагмент 14,8 KpnІ VirBCDG з pSB1 і бактеріальний ген стійкості до канаміцину, отримували шляхом гідролізу ДНК pDAB9292 за допомогою Kpn I плюс Bst1107 I. Цей фрагмент потім лігували з ДНК pDAB9618, яка була гідролізована Kpn I плюс Swa I, з отриманням вектора pDAB9621 (Фіг. 3). Потім використовували реакцію GATEWAY® для переміщення частини pDAB9621, яка містить 14,8 KpnІ VirBCDG і бактеріальний ген стійкості до канаміцину й оточеного з кожної сторони послідовностями з 3 т.п.н. геномної ділянки nilА TM LBA4404, у вектор GATEWAY® PDEST 14 за допомогою реакції AN L-R CLONASE® (INVITROGEN). Отримана плазміда, pDAB9698 (Фіг. 3, SEQ ID NO:25), була підтверджена за допомогою гідролізу ферментами рестрикції і реакцій секвенування ДНК. pDAB9698 служила як інтеграційний вектор для інтегрування генів vir з pTiBo542 pSB1 (які знаходяться у фрагменті 14,8 KpnІ VirBCDG) у хромосомну ділянку nilА штаму LBA4404 A. tumefaciens. Приклад 21: Хромосомна інтеграція фрагмента 14,8 KpnІ VirBCDG за допомогою гомологічної рекомбінації ДНК плазміди pDAB9698 отримували з використанням набору NUCLEOBOND® AX ANION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY PLASMID DNA ISOLATION (MACHEREY-NAGEL). Очищену плазмідну ДНК електропорували в клітини LBA4404 A. tumefaciens (INVITROGEN). Коротко, 500 нг плазмідної ДНК інкубували з клітинами при 4ºС протягом 10 хвилин. Цю суміш переносили піпеткою в охолоджену на льоді 0,2 см кювету GENE PULSER® (BIO-RAD) і електропорували за допомогою BIO-RAD GENE PULSER при наступних установках: вихідна ємність 25 мкФ, розширник ємності 960 мкФ, опір 200 Ом і напруга 2,5 кВ. Відразу після електропорації додавали 950 мкл середовища SOC (INVITROGEN), і суміш переносили в пробірку Falcon 2059 (BECTON DICKINSON AND CO.; Franklin Lakes, NJ). Після цього трансформовані клітини інкубували при 28ºС протягом від 5 до 6 годин. Після інкубації клітини висівали на окремі чашки із середовищем YEP, яке містить канаміцин (50 мкг/мл). Чашки вирощували в переверненому стані при 28ºС протягом від 36 до 48 годин. Одиночні колонії відбирали і розмножували в 5 мл рідкого середовища YEP, яке містить канаміцин (50 мкг/мл), протягом приблизно 36 годин при 28ºС. Ці культури використовували для отримання партій культур у гліцерині шляхом ретельного перемішування з рівним об’ємом 100% стерильного гліцерину з наступним заморожуванням і збереженням при -80ºС. Приклад 22: Фенотипічне і молекулярне підтвердження хромосомної інтеграції фрагмента 14,8 KpnІ VirBCDG Як очікується, pDAB9698, який містить точку початку реплікації colЕ1, не реплікується автономно в клітинах A. tumefaciens. Після трансформації клітин LBA4404 ДНК pDAB9698 стабільна стійкість до канаміцину виникає в результаті інтеграції ДНК pDAB9698 в автономно репліковані генетичні елементи Agrobacterium. Ці плазмідні інтегранти звичайно поділяються на чотири класи, які можуть бути використані відповідно до різних варіантів здійснення штамів Agrobacterium і методами їхнього використання, як описано в даному описі. Перший клас включає клітини, у яких ДНК pDAB9698 інтегрована в сайт, віддалений від геномної ділянки nilА, за допомогою негомологічної рекомбінації. Ці клітини повинні бути стійкі до канаміцину завдяки гену стійкості до канаміцину, розташованому поруч із фрагментом 14,8 KpnІ VirBCDG, і додатково стійкі до ампіциліну завдяки гену стійкості до ампіциліну, який міститься в основі TM вектора pDAB9698 (pDEST 14). Другий клас включає клітини, у яких ДНК pDAB9698 інтегрована в автономно репліцюючу допоміжну плазміду pAL4404 Ti (у природних умовах яка є резидентною у LBA4404) за допомогою гомологічної рекомбінації, опосередковуваної генами VirBCDG з pTiBo542, які знаходяться на pDAB9698, і генами VirBCDG з pTiACH5, які 24 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 знаходяться на pAL4404. Ці клітини також повинні бути стійкі і до канаміцину, і до ампіциліну. Третій клас включає клітини, у яких ДНК pDAB9698 інтегрована в геномну ділянку nilА LBA4404 за допомогою одиночної події гомологічної рекомбінації (кросовера), опосередковуваного або послідовностями геномної ділянки nilА із приблизно 3 т.п.н., які знаходяться на pDAB9698 і примикають до фрагмента з 15549 п.н., який містить фрагмент 14,8 KpnІ VirBCDG з pSB1 і ген стійкості до канаміцину. Ці клітини також повинні бути стійкі і до канаміцину, і до ампіциліну. Четвертий клас включає клітини, у яких одиночна подія кросовера клітин зазначеного вище класу 3 піддається другій події кросовера, опосередковуваного відтепер дуплікованими послідовностями геномної ділянки nilА з 3 т.п.н., які виникли в результаті одиночної події кросовера. Залежно від того, яка з послідовностей, які примикають до геномної ділянки nilА з 3 т.п.н., викликала одиночну подію кросовера, і яка з цих послідовностей, які примикають, викликає другу подію кросовера, отримані клітини повинні бути або чутливими до канаміцину і стійкими до ампіциліну, або стійкими до канаміцину і чутливими до ампіциліну. Кращі клітини, описані в даному описі, включають останній клас, тобто клітини, які стійкі до канаміцину і чутливі TM до ампіциліну. Ці події подвійного кросовера, які не містять основу pDEST 14 плазміди, бажані, оскільки вони не містять зверхрухливих генетичних елементів, таких як точка початку реплікації colЕ1 і ген стійкості до ампіциліну. Позитивні трансформанти, виділені в прикладі 21, були піддані скринінгу на бажану подію інтеграції, опосередковану подвійною гомологічною рекомбінацією. Стійкі до канаміцину ізоляти, які містять фрагмент із 15549 п.н., який включає фрагмент 14,8 KpnІ VirBCDG з pSB1 і ген TM стійкості до канаміцину (і не включає основу вектора pDEST 14), були ідентифіковані по чутливості до ампіциліну. Позитивні трансформанти вирощували в 3 мл середовища YEP, яке містить канаміцин (50 мкг/мл), при 28ºС протягом приблизно 36 годин. Ці культури потім висівали штрихом на тверді середовища YEP, які містять роздільно наступні різні антибіотики (концентрації в мкг/мл): рифампіцин, 100; канаміцин, 50; стрептоміцин, 125; хлорамфенікол, 50; еритроміцин, 200; тетрациклін, 12,5; і ампіцилін, 100. Чашки інкубували при 28ºС протягом 48 годин, і колонії, які виросли, підраховували. Був ідентифікований штам, який був стійкий до канаміцину, рифампіцину (хромосомний маркер) і стрептоміцину (маркер pAL4404; Ooms et al., вище). Більш того, штам був чутливий до хлорамфеніколу, еритроміцину і тетрацикліну. Але найважливіше, штам був чутливий до ампіциліну. Цей лікарський скринінговий фенотип указує на бажану подію подвійної кросоверної гомологічної рекомбінації, де фрагмент із 15549 п.н., який містить фрагмент 14,8 KpnІ VirBCDG з pSB1 і ген стійкості до канаміцину, інтегрований у хромосому LBA4404 A. tumefaciens. Цей штам названий DAt16174. Наявність генів VirBCDG з pTiBo542 у штамі DAt16174 було додатково підтверджене за допомогою молекулярної характеристики. Геномна ДНК штаму DAt16174 була виділена з використанням протоколу виділення бактеріальної геномної ДНК (Sambrook et al., вище, і її відновлення). Були сконструйовані ПЛР праймери для ампліфікації фрагментів, які перекриваються, інтегрованих у хромосому генів VirBCDG. Реакції ПЛР із використанням TM праймерів, описаних у таблиці 6, були проведені за допомогою набору ПЛР FAILSAFE (EPICENTRE®) відповідно до указівок виробника. Через великий сумарний молекулярний розмір інтегрованих генів VirBCDG були проведені реакції ампліфікації з отриманням п'яти фрагментів, які перекриваються. Амплікони очікуваного розміру очищали з агарозних гелів за допомогою набору QIAEX II GEL EXTRACTION KIT (QIAGEN; Valencia, CA) відповідно до протоколу виробника. Ці фрагменти були клоновані у вектор PCR2.1®-TOPO®TA з використанням набору PCR2.1®-TOPO®TA CLONING® KIT (INVITROGEN). Колонії бактерій з передбачуваною наявністю клонів ампліконів ПЛР були підтверджені за допомогою гідролізу ферментами рестрикції. Послідовності ДНК ампліконових фрагментів були визначені за TM допомогою набору CEQ DYE TERMINATOR CYCLE SEQUENCING KIT відповідно до інструкцій виробника, і дані секвенування були проаналізовані з використанням програми TM SEQUENCHER , версія 4.1.4 (GENE CODES CORP.; Ann Arbor, MI). Отримані послідовності дали безупинну послідовність з 22 т.п.н., яка охоплювала весь фрагмент із 15549 п.н., який містить фрагмент 14,8 KpnІ VirBCDG з pSB1 і ген стійкості до канаміцину, плюс обидві ділянки з приблизно 3 т.п.н., які примикають до геномної ділянки nilА і додатково розширені вгору і вниз від геномних ділянок nilА (тим самим включаючи хромосомну послідовність LBA4404, яка початково не містилася в pDAB9698). Приналежність штаму DAt16174 до Agrobacterium tumefaciens була перевірена за допомогою кетолактозного тесту. Приблизно трансформовані колонії висівали штрихом на агар з лактозою і інкубували при 28ºС протягом 48 годин. Чашки потім наповняли розчином Бенедикта і відслідковували при кімнатній температурі. Ізоляти, які перетворювали розчин 25 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Бенедикта і підстилаючий агар із синього в жовтий, були в такий спосіб підтверджені як Agrobacterium. Особливість штаму DAt16174 A. tumefaciens полягає в тому, що його можна з користю використовувати як агент трансформації рослин для перенесення генів Т-ДНК із бінарних векторів, які містять точки початку реплікації, наприклад, класів IncР, IncW або VS1. У широкому плані введений бінарний вектор може містити точку початку реплікації будь-якого класу, здатного до реплікації в Agrobacterium за умови, що він сумісний із точкою початку реплікації pTi (і зв'язаними функціями) резидентної плазміди pAL4404 у DAt16174. Таким чином, ділянка можливих застосувань штаму DAt16174 охоплює спільна присутність у штамі DAt16174 більше однієї бінарної векторної плазміди, якщо плазміди містять сумісні точки початку реплікації (тобто стосуються різних груп несумісності). Селекція таких уведених бінарних векторів не повинна бути зв'язана з маркерами селекції, які додають стійкість до канаміцину, рифампіцину або стрептоміцину, оскільки штам DAt16174 стійкий до цих трьох антибіотиків. Бінарні вектори можуть реплікуватися автономно в клітинах і E. coli, і Agrobacterium. Вони включають послідовності, обрамлені правою і лівою ділянками пограничних повторів Т-ДНК, які можуть включати маркерний ген селекції, придатний для добору трансформованих клітин рослини, клонуючий лінкер, клонуючий полілінкер або іншу послідовність, яка може діяти як сайт введення генів, призначених для трансформації рослинної клітини. Ними можна прямо трансформувати клітини Agrobacterium шляхом електропорації, шляхом прямої опосередкованої хімічно трансформації ДНК, уведенням за допомогою бактеріальної кон'югації або за допомогою інших методів. Використовувана як клітина-хазяїн Agrobacterium містить щонайменше одну плазміду, яка несе ділянку vir. Ділянка vir необхідна для отримання білків Vir, які виконують усі необхідні функції, які приймають участь у перенесенні Т-ДНК у рослинну клітину. Плазміда, яка несе ділянку vir, звичайно являє собою мутантну плазміду Ti або Ri (допоміжну плазміду), з якої була вилучена ділянка Т-ДНК, включаючи лівий і правий пограничні повтори Т-ДНК. Приклади штамів Agrobacterium, які містять допоміжні плазміди і придатні для трансформації рослин, включають, наприклад, LBA4404, GV3101(pMP90), GV3101(pMP90RK), GV2260, GV3850, EHA101, EHA105 і AGL1. Численні приклади бінарних векторних систем розглянуті в огляді Hellens et al., (2000, Trends Plant Sci. 5:446-451). Крім того, переваги трансформації рослин, які додаються штаму LBA4404(pSB1) [використовуваному в супербінарній системі] опероном virВ з pTiBo542 (який включає гени virB1, virB2, virB3, virB4, virB5, virB6, virB7, virB8, virB9, virB10 і virB11), геном virG, опероном virС (який включає гени virС1 і virС2) і частиною оперону virD, який включає ген virD1, які містяться в плазміді pSB1, зберігаються в штамі DAt16174. Оскільки перераховані вище супербінарні гени vir інтегровані в хромосому LBA4404, штам DAt16174 позначається як штам SUPERCHROME. На відміну від супербінарної системи, для використання штаму DAt16174 не потрібно утворення нестабільних супербінарних плазмід за допомогою гомологічної рекомбінації між pSB1 і човниковими векторами, такими як pSB11. Додатковою перевагою штаму SUPERCHROME є можливість введення в штам стандартних бінарних векторів для трансформації рослин. Приклад 23: Біохімічна і молекулярна характеристика тканин маїсу, трансформованого різними штамами Agrobacterium, які несуть pDAB101556 Бінарний вектор для трансформації рослин pDAB101556 (Фіг. 5) був сконструйований TM шляхом поєднання стандартних методів клонування і технології GATEWAY . Бінарний вектор pDAB101556 ґрунтується на точці початку реплікації типу IncР плазміди RK2, і основа вектора містить бактеріальний ген, який додає стійкості до спектиноміцину в концентрації 100 мкг/мл. Пограничні повтори Т-ДНК беруть початок від ділянки TL pTi15955. Усередині правої границі (RB) і множинних лівих границь (LB) ділянки Т-ДНК плазміди pDAB101556 розташовані 2 експресуємі в рослинах послідовності, які кодують білок (CDS). Перший ген (маркер селекції) включає ділянку, яка кодує, для білка-маркера селекції AAD1 (SEQ ID NO: 13) (патент США № 7838733), який знаходиться під транскрипційним контролем промотору убіквітину 1 маїсу з 1991 п.н. з асоційованим інтроном 1 (патент США № 5510474). Цей ген закінчується 3'UTR ліпази маїсу (патент США № 7179902). Другий ген (маркер для скринінгу) включає CDS для жовтого флуоресцентного білка (YFP, у точності як розкрито в патенті США № 7951923), транскрипція якої контролюється промотором убіквітину 1 маїсу з асоційованим інтроном 1. Цей ген закінчується 3'UTR Per5 маїсу (патент США № 6384207). Плазміда pDAB101556 була успішно введена шляхом електропорації в клітини штаму LBA4404 A. tumefaciens з отриманням штаму LBA4404(pDAB101556). Це поєднання штам/плазміда, таким чином, включає стандартну бінарну систему трансформації рослин. Трансформанти, відібрані на основі стійкості до стрептоміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у 26 UA 112968 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гліцерині партій і їхнім збереженням при -80ºС. Збирали всі клітини штаму LBA4404(pDAB101556) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу за допомогою методів, розкритих у прикладі 24. Плазміда pDAB101556 була успішно введена шляхом електропорації в клітини штаму DAt13192 A. tumefaciens (див. приклад 7) з отриманням штаму DAt13192(pDAB101556). Це поєднання штам/плазміда, таким чином, включає потрійну систему трансформації рослин з недостатністю рекомбінації. Трансформанти, відібрані на основі стійкості до еритроміцину, канаміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80ºС. Збирали всі клітини штаму DAt13192(pDAB101556) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу за допомогою методів, розкритих у прикладі 24. Було почато декілька спроб уведення ДНК плазміди pDAB101556 у штам DAt20711 (див. приклад 9), потрійну систему з ефективною рекомбінацією. В усіх випадках було виявлено, що в цьому штамі плазміда pDAB101556 нестабільна, і штам Dat2071l(pDAB101556) не був сконструйований. Плазміда pDAB101556 була успішно введена шляхом електропорації в клітини штаму DAt16174 A. tumefaciens (приклад 22) з отриманням штаму DAt16174(pDAB101556). Це поєднання штам/плазміда, таким чином, включає SUPERCHROME/бінарну систему трансформації рослин. Трансформанти, відібрані на основі стійкості до стрептоміцину, канаміцину і спектиноміцину, перевіряли за допомогою гідролізу плазмідної ДНК ферментами рестрикції перед отриманням заморожених у гліцерині партій і їхнім збереженням при -80ºС. Збирали всі клітини штаму DAt16174(pDAB101556) з агарової чашки, інокульованою замороженою в гліцерині партією, і використовували їх для трансформацій маїсу за допомогою методів, розкритих у прикладі 24. Приклад 24: Трансформація маїсу штамами Agrobacterium, які несуть бінарний вектор pDAB101556 Отримання незрілих зародків. Насіння сорту B104 було висаджене в 3,5-дюймові (88,9 мм) горщики SVD з METRO MIX 360 (SUN GRO HORTICULTURE Inc.; Bellevue, WA). Коли рослини досягали стадії росту V4-V5, їх переносили в 4-галонові (15,1 л) горщики, які містять суміш 1:1 METRO MIX 360 і кальциновану глину PROFILE GREENS GRADE (PROFILE PRODUCTS LLC; TM Buffalo Grove, IL) з 20 грамами OSMOCOTE 19-6-12 і 20 грамами IRONITE як добавки. Рослини вирощували в оранжереї при використанні поєднання 1000 Вт HPS (натрієва лампа високого тиску) і 1000 Вт MH (метал-галоїдних) ламп із установленим режимом освітлення 16:8 2 освітлення/темрява, якщо освітленість зовні не перевищувала 450 Вт/м . Для отримання незрілих зародків для трансформації проводили контрольоване сестрине запилення або самозапилення. Незрілі зародки були отримані через 10-13 днів після запилення, коди зародки мали розмір приблизно від 1,6 до 2,0 мм. Інфікування і спільне культивування. Поверхню колосків маїсу стерилізували зануренням у TM 20% наявний у продажі відбілювач з поверхнево-активною речовиною LIQUINOX (1 або 2 краплі на 500 мл) протягом 20 хвилин і наступним триразовим промиванням стерильною водою. Суспензію клітин Agrobacterium, які містять бінарний вектор pDAB101556, отримували з бактерій, вирощених на твердому середовищі AB при 20ºC протягом від 2 до 3 днів, з наступним вирощуванням на твердому середовищі YEP при 28ºС протягом від 1 до 3 днів. Обидва середовища AB і YEP містили добавки відповідних антибіотиків, як описано в прикладі 23, для кожного штаму Agrobacterium, тестованого з бінарним вектором pDAB101556. Петлі з клітинами, які зшкребли з чашки YEP, переносили в рідке середовище для інфікування об’ємом від 10 до 15 мл, яке містить: солі MS (Frame et al., вище), модифіковані ISU вітаміни MS (Frame et al., вище), 3,3 мг/л дикамба-етанолу, 68,4 г/л сахарози, 36 г/л глюкози, 700 мг/л L-проліну, pН 5,2, і утримуючу 100-200 мкМ ацетосирінгону. Розчин м'яко відбирали і зливали піпеткою з використанням 5 мл стерильної піпетки або перемішували в змішувачі до отримання однорідної суспензії, і концентрацію доводили до оптичної густини приблизно 1,0 при 600 нм (ОГ 600) з використанням спектрофотометра Hewlett-Packard P8452a. Спільне культивування. Незрілі зародки виділяли прямо в мікроцентрифугальну пробірку, яка містить 2 мл середовища для інфікування. Середовище видаляли і заміняли свіжим середовищем для інфікування об’ємом від 1 до 2 мл, після чого його замінювали 1,5 мл розчину Agrobacterium. Розчин Agrobacterium і зародок інкубували протягом 5 хвилин при кімнатній температурі і потім переносили в середовище для спільного культивування, яке містить солі MS, модифіковані ISU вітаміни MS, 3,3 мг/л дикамба-етанолу, 30 г/л сахарози, 700 мг/л Lпроліну, 100 мг/л міо-інозиту, 100 мг/л ферментативного гідролізату казеїну, 15 мг/л AgNO3, 100 27 UA 112968 C2 TM 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 200 мкМ ацетосирінгону і 2,3 м/л GELRITE (SIGMA-ALDRICH; St. Louis, MO), при pН 5,8. Інкубація спільного культивування продовжувалася протягом 3 днів у темряві при 20ºС. Відновлення і відбір. Після спільного культивування зародки переносили в неселективне відновлювальне середовище на основі MS, яке містить солі MS, модифіковані ISU вітаміни MS, 3,3 мг/л дикамба-етанолу, 30 г/л сахарози, 700 мг/л L-проліну, 100 мг/л міо-інозиту, 100 мг/л ферментативного гідролізату казеїну, 15 мг/л AgNO 3, 0,5 г/л MES, 250 мг/л цефотаксиму і 2,3 г/л TM GELRITE при pН 5,8. Інкубацію продовжували протягом 7 днів у темряві при 28ºС. Після 7 днів періоду відновлення зародки переносили в селективне середовище. Для відбору тканин маїсу, трансформованих супербінарною або бінарною плазмідою, яка містить експресований у рослинах маркерний ген селекції aad-1, використовували відновлювальне середовище на основі MS (вище) з добавкою галоксифопу. Зародки спочатку переносили в селективне середовище I, яке містить 100 нм галоксифопу, і інкубували протягом 2 тижнів, а потім переносили в селективне середовище II з 500 нм галоксифопу і інкубували ще протягом 2 тижнів. Трансформовані ізоляти були отримані протягом періоду приблизно 5 тижнів при 28ºС у темряві. При необхідності, виділені ізоляти поєднували шляхом перенесення у свіже селективне середовище II ще на 2 тижні перед перенесенням у середовища для регенерації. Фахівці в галузі техніки трансформації маїсу повинні розуміти, що для відбору трансформованих рослин придатні інші методи при використанні інших експресуємих маркерних генів селекції рослин (наприклад, генів стійкості до гербіцидів). Регенерація I. Після процесу відбору культури переносили в середовищедля регенерації I на основі MS, яке містить солі MS, модифіковані ISU вітаміни MS, 60 г/л сахарози, 350 мг/л Lпроліну, 100 мг/л міо-інозиту, 50 мг/л ферментативного гідролізату казеїну, 1 мг/л AgNO 3, 250 TM мг/л цефотаксиму, 2,5 г/л GELRITE і 500 нМ галоксифопу, при pН 5,8. Інкубацію продовжували протягом 2 тижнів при 28ºС у темряві. Регенерація II. Культури переносили в середовище для регенерації II на основі MS, яке містить солі MS, модифіковані ISU вітаміни MS, 30 г/л сахарози, 100 мг/л міо-інозиту, 250 мг/л TM цефотаксиму, 2,5 г/л GELRITE і 500 нМ галоксифопу, при pН 5,8. Через 3 тижні при 28ºС при режимі освітлення 16/8 годин білим флуоресцентним світлом (приблизно 80 мкЕйнштейн·м 2 -1 ·сек ) проростки вилучали і переносили в середовище для подовження пагонів/коренів на основі MS (або на основі ½ MS), яке складається із солей MS (або солей ½ MS), модифікованих TM ISU вітамінів MS, 0,5 г/л MES, 30 г/л сахарози, 100 мг/л міо-інозиту, 2,5 г/л GELRITE , при pН 5,8. Коли проростки досягали довжини від 4 до 6 см, їх переносили в ростову камеру і в остаточному підсумку в оранжерею. Отримання насіння. Регенеровані рослини переносили в 3,5-дюймові (88,9 мм) горщики SVD з METRO MIX 360 і вміщували в ростову камеру для загартовування. Коли рослини досягали стадії росту V3, їх переміщали в оранжерею, а на стадії росту V4/V5 їх переносили в 5-галонні (18,9 л) горщики, які містять суміш 1:1 METRO MIX 360 і кальциновану глину PROFILE GREENS TM GRADE з 20 грамами OSMOCOTE 19-6-12 і 20 грамами IRONITE як добавки. Рослини вирощували в оранжереї при режимі освітлення 16:8 освітлення/темрява. За допомогою контрольованого запилення (зворотне схрещування з B104) було отримане насіння T1. Насіння збирали через 6 тижнів після запилення. Були проведені численні експерименти по трансформації маїсу сконструйованими штамами A. tumefaciens LBA4404(pDAB 101556), DAt13192(pDAB101556) і DAt16174(pDAB101556), і трансгенні клітини, відібрані при інгібуючих концентраціях галоксифопу, використовували для регенерації проростків і подальших досліджень. У цілому при трансформаціях LBA4404(pDAB101556) було зафіксовано 16 подій, при трансформаціях DAt13192(pDAB101556) було зафіксовано 49 подій, а при трансформаціях DAt16174(pDAB101556) було зафіксовано 60 подій (таблиця 7). Кількість копій трансгена aad-1 у трансгенних рослинах T0 було встановлено за допомогою тестів гідролізу зондів (Bubner and Baldwin, вище) з використанням специфічних для гена олігонуклеотидів. Аналізи Саузерн-блотингом розщепленої NcoІ ДНК, отриманої з відібраних подій методом екстракції цетилтриметиламонію бромідом, були проведені з використанням ампліфікованого ПЛР фрагмента гена aad-1 у вигляді міченого 32P зонда. Крім того, за допомогою тестів гідролізу зондів була виявлена наявність інтегрованих послідовностей основи вектора, які беруть початок від pDAB101556. Таким чином, штам DAt16174, SUPERCHROME штам, який включає повний набір генів vir з pTiACH5, які знаходяться на pAL4404, і додатково включає частковий набір генів vir з pTiBo542, інтегрованих у локус nilА хромосоми LBA4404, здатний ефективно продукувати трансформовані рослини маїсу. Крім того, хоча загальна ефективність трансформації цим штамом трохи нижче ефективності потрійного штаму, якість викликуваних SUPERCHROME подій є чудовою, оскільки 28