Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур м’якої пшениці за agrobacterium-опосередкованої трансформації

Реферат: Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур м'якої пшениці за Agrobacteriumoпосередкованої трансформації включає: отримання калюсу з експлантів апікальних меристем або незрілих зародків; інокуляцію калюсів суспензією агробактерії; кокультивацію калюсів з суспензією агробактерії; добір стійких калюсних ліній на селективних середовищах з канаміцином; експлантацію стійких калюсів на регенераційне середовище для індукції соматичного ембріогенезу; культивування до отримання проростків. Для прискорення та збільшення частоти регенерації після Agrobacterium-oпосередкованої трансформації використовують модифіковане регенераційне середовище, яке містить: амоній азотнокислий; калій азотнокислий; кальцій хлористий; магній сірчанокислий; калій фосфорнокислий однозаміщений; залізо сірчанокисле; етилендіамінтетраацетат натрію; борну кислоту; марганець сірчанокислий; цинк сірчанокислий; калій йодистий; натрій молібденовокислий; мідь сірчанокисла; кобальт хлористий; мезоінозит; аспарагінову кислоту; глютамінову кислоту; цистеїн; емоксипін; цефотаксим; цефепім; тіамін-НСl; піридоксин-НСl; нікотинову кислоту; азотнокисле срібло; тидіазурон; дикамбу; сахарозу; агар-агар; бідистильовану воду. UA 111284 U (12) UA 111284 U UA 111284 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології, зокрема методів генетичної інженерії, і може бути використана для забезпечення прискореного отримання вихідного селекційного матеріалу пшениці, стійкого до стресових чинників довкілля. На сьогодні при створенні сортів пшениці, стійких до стресових чинників довкілля, все більшого значення набувають методи генетичної інженерії. Трансгенні рослини пшениці були отримані в ряді лабораторій світу, при цьому більшість сучасних методик по отриманню трансгенних форм даної культури, і зокрема метод Agrobacterium-oпосередкованої трансформації, передбачають етап культивування тканин in vitro, що має ряд недоліків, основним з яких є залежність частоти генетичної трансформації від морфогенетичного потенціалу культивованих тканин. Тому, однією із задач при роботі з культурою in vitro є розробка методів регенерації, як біотехнологічного інструменту для створення нових форм рослин і, зокрема, пшениці. Пшениця залишається складною культурою для проведення біотехнологічних робіт, оскільки процеси калюсогенезу та утворення пагонів в умовах in vitro значною мірою визначаються складом живильного середовища. За Agrobacterium-oпосередкованої трансформації пшениці необхідно проводити кокультивацію калюсів з агробактерією, що негативно впливає на подальшу регенерацію пагонів. Крім цього, для елімінаціії агробактерії використовуються високі дози антибіотику, що теж має негативний вплив на морфогенний потенціал калюсів, зменшує імовірність регенерації і відповідно отримання трансгенних форм (Cheng M., Fry J., Pang S., Zhou Н., Horinaka С., Duncan D., Conner Т., Wan Y. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens // Plant Physiol. - 1997. - V. 115. - P. 971-980). Відомий спосіб підвищення частоти регенерації калюсних культур пшениці за Agrobacteriumoпосередкованої трансформації (Гончарук О.М., Бавол А.В., Дубровна О.В. Підвищення частоти регенерації калюсних культур пшениці за Agrobacterium-опосередкованої трансформації // Вісник українського товариства генетиків і селекціонерів. -2014. -Т. 12, № 2. - С. 159-165). Проте значним недоліком даного способу (прототипу) є низька регенераційна здатність трансформованих клітинних ліній, яка не перевищує 3-12 %, що не забезпечує отримання достатньої кількості рослин-регенерантів для залучення в селекційний процес. В основу корисної моделі поставлена задача підвищення регенераційної здатності калюсних культур м'якої пшениці за Agrobacterium-опосередкованої трансформації для прискореного отримання та збільшення кількості рослин-регенерантів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі підвищення регенераційної здатності калюсних культур м'якої пшениці за Agrobacterium-опосередкованої трансформації, який включає: отримання калюсу з експлантів апікальних меристем або незрілих зародків; інокуляцію калюсів суспензією агробактерії; кокультивацію калюсів з суспензією агробактерії; добір стійких калюсних ліній на селективних середовищах з канаміцином; експлантацію стійких калюсів на регенераційне середовище для індукції соматичного ембріогенезу; культивування до отримання проростків. Відповідно до корисної моделі для підвищення частоти регенерації використовують пересадку трансформованих калюсів на певний об'єм (30 мл) модифікованого середовища Мурасіге-Скуга (МС) (Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Planta. -1962. -V. 15. -P. 473-497), у якому 6бензиламінопурин замінений на тидіазурон, вилучена аскорбінова кислота, зменшена кількість аспарагінової кислоти, цефотаксиму і сахарози та додатково містить цефепім і емоксипін при таких співвідношеннях компонентів, мг/л: амоній азотнокислий - 1650,0; калій азотнокислий 1900,0; кальцій хлористий - 440,0; магній сірчанокислий - 370,0; калій фосфорнокислий однозаміщений - 170,0; залізо сірчанокисле - 27,95; етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота - 6,2; марганець сірчанокислий - 22,3; цинк сірчанокислий - 8,6; калій йодистий 0,83; натрій молібденовокислий - 0,25; мідь сірчанокисла - 0,025; кобальт хлористий - 0,025; мезоінозит - 100,0; аспарагінова кислота - 50,0; глютамінова кислота - 10,0; цистеїн - 20,0; емоксипін - 10,0; цефотаксим - 250,0; цефепім - 250,0; тіамін-НСІ - 1,0; піридоксин-НСІ - 0,5; нікотинова кислота - 0,5; азотнокисле срібло - 5,0; тидіазурон - 1,0; дикамба - 2,0; сахароза 20000,0; агар-агар - 8000,0; бідистильована вода - до 1 л. Запропонований спосіб характеризується такими суттєвими ознаками: отримання калюсу з експлантів апікальних меристем або незрілих зародків; інокуляцію калюсів суспензією агробактерії; кокультивацію калюсів з суспензією агробактерії; добір стійких калюсних ліній на селективних середовищах з канаміцином; експлантацію стійких калюсів на регенераційне середовище для індукції соматичного ембріогенезу; культивування до отримання проростків. На відміну від прототипу, який передбачає (таблиця 1, середовище 1) 2-кратне пасажування ліній на ньому, що значно подовжує тривалість індукції рослин-регенерантів, при здійсненні 1 UA 111284 U 5 запропонованого способу регенераційні процеси спостерігаються вже у калюсів 1 пасажу, що значно зменшує час культивування та прискорює процес отримання рослин-регенерантів. Новою, відмінною від прототипу ознакою, є прискорене отримання рослин - регенерантів на модифікованому середовищі (МС-131), у якому 6-бензиламінопурин замінений на тидіазурон, вилучена аскорбінова кислота, зменшена кількість аспарагінової кислоти, цефотаксиму і сахарози, та додатково містить цефепім та емоксипін у таких співвідношеннях компонентів мг/л: тідіазурон - 1,0, аспарагінова кислота - 50,0; цефотаксим - 250,0; сахароза - 20000,0; цефепім 250,0; емоксипін - 10,0. Таблиця 1 Концентрація компонентів регенераційного середовища, мг/л Компоненти Амоній азотнокислий Калій азотнокислий Кальцій хлористий Магній сірчанокислий Калій фосфорнокислий однозаміщений Залізо сірчанокисле Етилендіамінтетраацетат натрію Борна кислота Марганець сірчанокислий Цинк сірчанокислий Калій йодистий Натрій молібденовокислий Мідь сірчанокисла Кобальт хлористий Мезоінозит Аспарагінова кислота Аскорбінова кислота Глутамінова кислота Цистеїн Емоксипін Цефотаксим Цефепім Тіамін-НСІ Піридоксин- НСІ Нікотинова кислота Азотнокисле срібло Тидіазурон Бензиламінопурин Дикамба Сахароза Агар-агар Бідистильована вода Середовище 1 МС-31 (прототип) 1650,0 1900,0 440,0 370,0 170,0 27,95 37,23 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 100,0 150,0 100,0 10,0 20,0 500,0 1,0 0,5 0,5 5,0 1,0 2,0 30000,0 8000,0 до 1 літра Середовище 2 МС-131 (заявлене) 1650,0 1900,0 440,0 370,0 170,0 27,95 37,23 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 100,0 50,0 10,0 20,0 10,0 250,0 250,0 1,0 0,5 0,5 5,0 1,0 2,0 20000,0 8000,0 до 1 літра 10 15 20 Використання модифікованого регенераційного середовища дозволяє у більш коротший термін та більшій кількості отримувати рослини-регенеранти за Agrobacterium-oпосередкованої трансформації пшениці і відповідно збільшити кількість генетично-модифікованих форм і таким чином забезпечити скорочення і спрощення біотехнологічного процесу та зменшити матеріальні затрати для його виконання. Це стало можливим здійснити на основі даних, які були одержані в результаті проведення попередніх досліджень, що здійснювалися за використання штамів AGLO з векторними конструкціями рВі-2Е та рВі-ОАТ на сорті м'якої пшениці Зимоярка. При застосуванні модифікованого живильного середовища МС (МС-131) відмічається збільшення кількості морфогенних калюсів, що за Agrobacterium-oпосередкованої трансформації утворюють пагони у 2-3 рази частіше порівняно з прототипом, про що свідчать дані таблиці 2. 2 UA 111284 U 5 10 Спосіб здійснюється наступним чином: на агаризованому середовищі Мурасіге-Скуга такого складу: мг/л: амоній азотнокислий - 1650,0; калій азотнокислий - 1900,0; кальцій хлористий 440,0; магній сірчанокислий - 370,0; калій фосфорнокислий однозаміщений - 170,0; залізо сірчанокисле - 27,95; етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота - 6,2; марганець сірчанокислий - 22,3; цинк сірчанокислий - 8,6; калій йодистий - 0,83; натрій молібденовокислий - 0,25; мідь сірчанокисла - 0,025; кобальт хлористий - 0,025; L-аспарагін - 150,0, піклорам - 2 мг/л; азотнокисле срібло - 10,0; мезоінозит - 100,0; тіамін-НСІ - 1,0; піридоксин-НСІ - 0,5; нікотинова кислота - 0,5; дикамба (2,4 Д) - 2,0; сахароза - 30000,0; агар-агар - 8000,0; бідистильована вода - до 1 л отримують калюсні культури з експлантів незрілих зародків або апікальних меристем пагонів. Таблиця 2 Частота регенерації у калюсних ліній пшениці сорту Зимоярка за Agrobacterium-oпосередкованої трансформації Калюсна лінія Лінія 1 Лінія 2 Лінія 3 Лінія 4 Лінія 5 Лінія 1 Лінія 2 Лінія 3 Лінія 4 Лінія 5 15 20 25 30 35 40 Середовище МС-31 МС-31 МС-31 МС-31 МС-31 МС-131 МС-131 МС-131 МС-131 МС-131 Кількість висаджених калюсів, шт. 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Кількість калюсів, що утворювали рослинирегенеранти, шт. 3 7 8 6 12 8 15 17 11 25 Частота регенерації, % 3,0±1,7 7,0±2,6 8,0±2,7 6,0±2,4 12,0±3,2 8,0±2,7 15,0±3,6 17,0±3,8 11,0±3,1 25,0±4,3 Проводять Agrobacterium-oпосередковану трансформацію калюсу бактеріальною суспензією та переносять у чашки Петрі на живильне середовище для кокультивування. Після кокультивації проводять клітинну селекцію протягом 2 пасажів на селективному середовищі з канаміцином - 100 мг/л та добирають стійкі калюсні форми. Стійкі калюси для індукції соматичного ембріогенезу переносять на регенераційне середовище МС-131 такого складу мг/л: амоній азотнокислий - 1650,0; калій азотнокислий 1900,0; кальцій хлористий - 440,0; магній сірчанокислий - 370,0; калій фосфорнокислий, однозаміщений - 170,0; залізо сірчанокисле - 27,95; етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота - 6,2; марганець сірчанокислий - 22,3; цинк сірчанокислий - 8,6; калій йодистий 0,83; натрій молібденовокислий - 0,25; мідь сірчанокисла - 0,025; кобальт хлористий - 0,025; мезоінозит - 100,0; аспарагінова кислота - 50,0; глютамінова кислота - 10,0; цистеїн - 20,0; емоксипін - 10,0; цефотаксим - 250,0; цефепім - 250,0; тіамін-НСІ - 1,0; піридоксин-НСІ - 0,5; нікотинова кислота - 0,5; азотнокисле срібло - 5,0; тидіазурон - 1,0; дикамба - 2,0; сахароза 20000,0; агар-агар - 8000,0; бідистильована вода - до 1 л. Живильне середовище (рН-5,8) розливають у мірні колби та автоклавують при температурі 120 °C протягом 20 хвилин (тиск 1,05 атм). В стерильні чашки Петрі діаметром 80 мм розливають по 30 мл регенераційного середовища. На кожну чашку висаджують оптимальну кількість калюсної маси, яка становить 40 штук агрегатів, діаметром до 5 мм на відстані 10 мм один від одного. Культивування проводять за температури 24±2 °C, 16-годинному фотоперіоді і освітленні 3-4 клк до появи нормально розвинутих пагонів. Отримані рослини-регенеранти переносять на середовище для укорінення. Порівняльний аналіз заявленого способу з прототипом показав, що заявлений спосіб відрізняється новими суттєвими ознаками, які полягають в тому, що для підвищення регенераційної здатності та прискореного отримання рослин-регенерантів, стійкі калюси пересаджують на модифіковане середовище (МС-131), у якому 6-бензиламінопурин замінений на тидіазурон, вилучена аскорбінова кислота, зменшена кількість аспарагінової кислоти, цефотаксиму і сахарози, та яке додатково містить цефепім та емоксипін у таких співвідношеннях компонентів мг/л: тидіазурон - 1,0, аспарагінова кислота - 50,0; цефотаксим 250,0; сахароза - 20000,0; цефепім - 250,0; емоксипін - 10,0. Сукупність заявлених ознак прискорює процес отримання рослин-регенерантів м'якої пшениці за Agrobacterium 3 UA 111284 U 5 опосередкованої трансформації та збільшує їх кількість у 2-3 рази і таким чином забезпечує скорочення біотехнологічний процесу і зменшення матеріальних затрат для його виконання. Заявлений спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур м'якої пшениці за Agrobacterium-опосередкованої трансформації, шляхом використання модифікованого живильного середовища, дозволяє прискорити процес отримання генетично модифікованих рослин-регенерантів пшениці та збільшити їх кількість, чим і обумовлена ефективність його застосування. Використання заявлених ознак забезпечує скорочення біотехнологічного процесу і зменшення матеріальних затрат для його виконання. Може бути використаний для одержання толерантних рослин-регенерантів в біотехнології та селекції м'якої пшениці. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 30 Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур м'якої пшениці за Agrobacteriumoпосередкованої трансформації, який включає: отримання калюсу з експлантів апікальних меристем або незрілих зародків; інокуляцію калюсів суспензією агробактерії; кокультивацію калюсів з суспензією агробактерії; добір стійких калюсних ліній на селективних середовищах з канаміцином; експлантацію стійких калюсів на регенераційне середовище для індукції соматичного ембріогенезу; культивування до отримання проростків, який відрізняється тим, що для прискорення та збільшення частоти регенерації після Agrobacterium-oпосередкованої трансформації використовують модифіковане регенераційне середовище, у якому зменшена кількість аспарагінової кислоти, цефотаксиму і сахарози, та яке додатково містить тидіазурон, цефепім та емоксипін у таких співвідношеннях компонентів мг/л: амоній азотнокислий - 1650,0; калій азотнокислий - 1900,0; кальцій хлористий - 440,0; магній сірчанокислий - 370,0; калій фосфорнокислий однозаміщений - 170,0; залізо сірчанокисле - 27,95; етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота - 6,2; марганець сірчанокислий - 22,3; цинк сірчанокислий - 8,6; калій йодистий - 0,83; натрій молібденовокислий - 0,25; мідь сірчанокисла - 0,025; кобальт хлористий - 0,025; мезоінозит - 100,0; аспарагінова кислота - 50,0; глютамінова кислота - 10,0; цистеїн - 20,0; емоксипін - 10,0; цефотаксим - 250,0; цефепім - 250,0; тіамін-НСl - 1,0; піридоксин-НСl - 0,5; нікотинова кислота - 0,5; азотнокисле срібло - 5,0; тидіазурон - 1,0; дикамба - 2,0; сахароза - 20000,0; агар-агар - 8000,0; бідистильована вода - до 1 л. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4