Спосіб одержання вакцини проти clostridium difficile

Реферат: Винахід стосується способу одержання вакцини проти Clostridium difficile, що продукують АВтоксин, який полягає у тому, що (а) культивують Clostridium difficile в умовах, при яких продукується АВ-токсин, і збирають культуру; (б) розщеплюють АВ-токсин ферментативно in vitro з використанням інозитгексафосфату як кофактора, і (в) поєднують композицію, отриману на стадії (б), з фармацевтично прийнятним носієм. UA 105508 C2 (12) UA 105508 C2 UA 105508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до способу одержання вакцин і відповідно до отриманих вакцин. Передумови створення винаходу Clostridium difficile, споротвірна грамнегативна бактерія, відповідальна за 60 % випадків асоційованої з антибіотиками діареї й практично за 100 % випадків ураження пацієнтів псевдомембранозним колітом. Механізм, який обумовлює спалах захворювання, поки не повністю вивчений. Він може бути пов'язаний як зі залежними від хазяїна, так і зі залежними від штаму факторами, оскільки не у всіх заражених C. difficile пацієнтів розвивається захворювання. Клінічні симптоми у заражених пацієнтів можуть варіюватися від безсимптомного прояву захворювання до небезпечного для життя токсичного мегаколона. C. difficile, подібно багатьом іншим патогенам, які викликають хвороби у тварин, включаючи людину, продукує токсини. Токсин являє собою отрутну субстанцію, яка продукується живими клітинами або організмами, що має активність у дуже низьких концентраціях. Токсини можуть являти собою невеликі молекули, пептиди або білки, і вони мають здатність викликати хворобу при контакті або при їх поглинанні тканинами організму у результаті взаємодії з біологічними макромолекулами, такими як ферменти або клітинні рецептори. C. difficile продукує два токсини, токсин A (TcdA) і токсин B (TcdB), які є причинними факторами асоційованої з антибіотиками діареї або псевдомембранозного коліту. Вони являють собою дуже великі (308 кДа й 269 кДа) бактеріальні білки, які є представниками сімейства так званих великих клостридіальних цитотоксинів (LCT) поряд із TcsH і TcsL C. sordellii і Tcnα C. novyi. Всі ці токсини відрізняються високим ступенем гомології послідовностей, подібною структурою доменів і несуть глікозилтрансферазний фрагмент. TcdA і TcdB являють собою одноланцюгові білки, які відрізняються організацією, що забезпечує потрійну функцію. Їх C-кінцевий домен забезпечує зв'язування з плазматичною мембраною клітини-мішені, гідрофобна середня частина являє собою передбачуваний транслокаційний домен, а N-кінцевий каталітичний домен білків несе сайт глікозилтрансферази. Процес поглинання цитозолем клітини-мішені поки недостатньо вивчений. Однак звичайно вважається, що токсини поглинаються шляхом ендоцитозу після зв'язування з рецепторами клітинної поверхні. Після підкислення ендосом у цитозоль транслокується тільки N-кінцевий домен токсину. Цей процес транслокації, ймовірно, опосередковується формуванням пор, оскільки TcdA формує пори у штучних мембранах при низьких значеннях pH. Для активації токсину потрібне протеолітичне розщеплення між амінокислотами Leu543 і Gly544, що приводить до вивільнення невеликого фрагмента масою 63 кДа, який переносить N-кінцевий каталітичний домен у цитозоль. Більший (207 кДа) C-кінцевий фрагмент TcdB залишається у мембранній фракції. N-кінцевий фрагмент масою 63 кДа має повну цитотоксичну активність. Після вивільнення N-кінцевий глікозилтрансферазний домен може вільно переміщатися у цитозолі, інактивуючи його білки-мішені, тобто ГТФази сімейства Rho/Rac. Ці білки беруть участь у багатьох клітинних функціях, наприклад, в організації актинового цитоскелета, контролі транскрипції, полярності й проліферації клітин. Оскільки RhoГТФази відіграють важливу роль у багатьох функціях імунної системи, включаючи захисні реакції проти патогенів, експресію цитокінів і передачу сигналів імунними клітинами, вони є оптимальними мішенями для бактеріальних токсинів. У цей час установлено, що активація токсинів C. difficile відбувається шляхом автокаталітичного розщеплення (Reineke та ін., Nature, 446, 2007, сс. 415-419). Крім того, було встановлено, що інозитгексафосфат (Ins6P, IP6, CAS номер [83-86-3]) відіграє роль ефективного активатора й кофактора у зазначеному автокаталітичному розщепленні токсину B (Reineke та ін., вище). Ця несуча великий заряд молекула, очевидно, має декілька функцій й може брати участь у стабілізації конформації токсину. У цей час установлено, що активація токсину за допомогою автокаталітичного розщеплення може мати місце також у випадку аналогічних токсинів інших організмів, включаючи LCT токсин A (TcdA) і B (TcdB) Clostridium difficile, летальний токсин (TcsL) і геморагічний токсин (TcsH) Clostridium sordellii і α-токсин (Tcnα) Clostridium novyi, RTX-токсини Vibrio cholerae (VcRTX), V. vulnificus (VvRtx), V. splendidus (VsRtx), Xenorhabdus nematophila (XnRtx), X. bovienii (XbRtx), Yersinia pseudotuberculosis (YpRtx), Y. mollaretti (YmMfp2) і Bordetella pertussis (FhaL1-4) (Sheahan K.L. та ін., EMBO J, 26(10), 2007, сс. 2552-2561.) Listonella anguillarum, Photorhabdus luminescens, Aeromonas hydrophila і Yersinia enterocolitica (Lupardus P.J. та ін., SCIENCE, 322(5899), 2008, сс. 265-268). Всі ці токсини можна класифікувати як "AB-токсини", як буде описано нижче. У міжнародній заявці на патент WO 2008/014733 описаний метод лікування викликаної Clostridium інфекції, який полягає у тому, що пацієнтові вводять інгібітор або активатор (IP6) автокаталітичного розщеплення. 1 UA 105508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У декількох публікаціях описані вакцини на основі C. difficile. Вакцини, в яких TcdA і TcdB інактивують за допомогою хімічного агента формаліну, описані у Sougioultzis S. L. та ін., Gastroenterology, 128, 2005, сс. 764-770; Kotloff, Infect. Immun. 2001; у WO 00/20304 і у Ghose та ін., Infect. Immun., 75(6), 2007, сс. 2826-2832. Вакцини, що містять рекомбінантно експресовані поліпептиди, які являють собою ліганд C-кінцевого домену TcdA або TcdB, описані у WO 98/59053, WO 00/61761, WO 00/61762, WO 97/02836, у Pavliakova та ін., Infect Immun, 68(4), 2000, сс. 2161-2166; Ward та ін., Infect Immun, 67(10), 1999, сс. 5124-5132; і Lyerly та ін., Current Microbiol 21, сс. 29-32). У WO 2007/146139 описана молекула ДНК з оптимізованими кодонами, яка кодує домен TcdA і TcdB, що зв'язується з рецептором, та її застосування як ДНК-вакцина. У WO 2004/041875 описані нетоксичні мутанти TcdB та їх застосування для вакцинації. У Genth H. та ін., Infect. Immun., 68, 2000, сс. 1094-1101 описаний метод створення токсину В Clostridium difficile з дефіцитом ферментів як антиген, що застосовується для імунізації. Вакцини, як правило, готують шляхом створення препарату, що містить антигенні компоненти зазначених патогенів, і змішування їх із фармацевтично прийнятним носієм. Для одержання ефективної імунної відповіді й за економічними причинами бажаним є застосування препаратів, отриманих із бактеріальних культур за допомогою лише невеликої кількості стадій процесування або фракціонування. У випадку продукуючих токсини організмів проблема полягає у тому, що включені у такі препарати токсини не можна вводити без їх інактивації. Таким чином, у підходах, відомих із існуючого рівня техніки, передбачається створення вакцин проти бактеріальних патогенів, які продукують AB-токсини, типу C. difficile, шляхом хімічної інактивації токсинів, рекомбінантної експресії нетоксичного домену токсинів (C-кінцевий домен, що зв'язується з рецептором або "B»-домен) або одержання нетоксичних мутантів токсинів. Однак всі ці міри приводять до втрати антигенних епітопів патогенного організму, які можуть впливати на ефективність і/або вартість вакцини. Короткий виклад сутності винаходу Даний винахід відноситься до способу одержання вакцини проти бактеріальних патогенів, які продукують AB-токсин, який полягає у тому, що (а) культивують патоген в умовах, при яких продукується AB-токсин, і збирають культуру; (б) розщеплюють AB-токсин ферментативно in vitro; і (в) поєднують композицію, отриману на стадії (б), з фармацевтично прийнятним носієм. У кращому об'єкті винаходу ферментативне розщеплення є автокаталітичним. У кращому об'єкті винаходу в якості кофактора ферментативного розщеплення застосовують інозитфосфат, переважно інозитгексафосфат. Іншим кращим об'єктом винаходу є описаний вище спосіб, у якому клітини відокремлюють від культурального середовища після її збору й AB-токсин розщеплюють у культуральному середовищі. Спосіб, запропонований у винаході, можна застосовувати для одержання вакцин проти патогенів роду Clostridium, переважно C. difficile, C. sordellii, C. botulinum, C. perfringens, C. tetani або C. novyi, або роду Vibrio, переважно V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus або V. splendidus, або V. Anguillarum, або роду Xenorhabdus, переважно X. nematophila, X. bovienii, або роду Yersinia, переважно Y. pseudotuberculosis, Y. pestis, Y. enterocolitica або Y. mollaretti, або роду Bordetella, переважно B. pertussis, B. parapertussis або B. bronchiseptica, або роду Actinobacillus, переважно A. pleuropneumoniae або A. suis, і E. coli. У композицію вакцини можна додавати ад'ювант. Наступним об'єктом даного винаходу є вакцина, отримана за допомогою описаного вище способу. Наступним об'єктом даного винаходу є застосування вакцини, отриманої за допомогою описаного вище способу, для вакцинації тварин, включаючи людину, проти інфекції, викликаної бактеріальними патогенами, які продукують AB-токсини. Наступним об'єктом даного винаходу є спосіб вакцинації тварин, включаючи людину, проти інфекції, викликаної бактеріальними патогенами, які продукують AB-токсини, який полягає у тому, що вводять в ефективній кількості вакцину, отриману за допомогою способу, запропонованого у винаході, тварині, включаючи людину. Докладний опис винаходу Даний винахід відноситься до поліпшеного способу одержання вакцин проти бактеріальних патогенів, які продукують токсини AB-типу (AB-токсини). Даний винахід відноситься також до витонченого способу інактивації AB-токсинів за допомогою автокаталітичного ферментативного процесу in vitro, перевагою якого є використання протеолітичної активності, яка властива зазначеним токсинам. Для цієї мети для композиції, що містить токсини, створюють умови, при яких може відбуватися зазначене ферментативне розщеплення. Зокрема, протеолітичну 2 UA 105508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інактивацію AB-токсину можна індукувати шляхом додавання необхідного кофактора, такого як інозитфосфат. За допомогою зазначеного протеолітичного розщеплення токсичний домен A відокремлюють від домену-транспортера B, і це приводить до втрати у нього здатності проникати у цитозоль клітин, де він повинен перебувати для прояву своєї токсичної дії. У результаті композиція, що утворилася, більше не є токсичною або є істотно менше токсичною, ніж одноланцюговий AB-токсин, при введенні у живі організми. З іншого боку, цей тип інактивації зберігає природну конформацію й антигенні епітопи білків, що є важливим для забезпечення ефективності вакцини. У контексті даного опису поняття "AB-токсин" застосовують для позначення одноланцюгового бактеріального токсину, що аналогічно LCT містить каталітичний домен (домен A) і зв'язується з рецептором/транслокаційний домен (домен B або домен-транспортер), і в якому активація каталітичного домену in vivo відбувається шляхом автокаталітичного розщеплення, що приводить до вивільнення каталітичного домену у цитозоль. Прикладами ABтоксинів є, зокрема, LCT, які включають токсин A (TcdA) і токсин B (TcdB) Clostridium difficile, летальний (TcsL) і геморагічний токсин (TcsH) Clostridium sordellii і α-токсин (Tcnα) Clostridium novyi. Крім того, AB-токсини включають RTX-токсини Vibrio cholerae (VcRTX), V. vulnificus (VvRtx), V. splendidus (VsRtx), Xenorhabdus nematophila (XnRtx), X. bovienii (XbRtx), Yersinia pseudotuberculosis (YpRtx), Y. mollaretti (YmMfp2), Y. enterocolitica (YST), Listonella anguillarum (VaRtx) і Bordetella pertussis (FhaL1-4). Таким чином, спосіб, запропонований у винаході, можна застосовувати для одержання вакцин проти інфекції, викликаної бактеріальними патогенами, які продукують AB-токсини, такими як перераховані вище бактерії. Вакцина являє собою фармацевтичний препарат, який застосовують для підвищення імунітету до конкретного захворювання у тварини, включаючи людину. Вакцини можуть бути профілактичними (які призначені, наприклад, для попередження або полегшення впливів майбутньої інфекції, викликаної будь-яким патогеном, який зустрічається у природних умовах, або "диким" патогеном), або терапевтичними, тобто можуть являти собою вакцини, які застосовують у ситуації, коли хазяїн уже інфікований патогеном із наявністю клінічних симптомів захворювання або без них. Вакцини можуть містити вбиті мікроорганізми, модифіковані живі (ослаблені) мікроорганізми, препарати антигенних субодиниць мікроорганізмів (наприклад, фракції або рекомбінантно експресовані поліпептиди) або, що є кращим у контексті даного винаходу, токсоїди, тобто інактивовані токсичні сполуки, у тих випадках, коли вони у вихідному (неактивованому) стані викликають захворювання. Вакцина може містити ад'ювант, тобто агент, що може стимулювати імунну систему й підвищувати відповідь на вакцину, не маючи сам якої-небудь специфічної антигенної дії. Прикладами звичайно застосовуваних ад'ювантів є галуни (гідратований алюмосульфат калію), фосфат алюмінію, гідроксид алюмінію, сквален або ад'юванти на масляній основі. Кращим ад'ювантом є Carbopol 934P, який поступає у продаж (Carbomer 934P; фірма Noveon, Inc., Педриктаун, шт. Нью-Джерсі, США), що може бути присутнім у кількості, яка становить приблизно 2 мл/л. Карбопол являє собою полімер акрилової кислоти, зшитий з поліалілсахарозою. Перша стадія способу являє собою культивування патогену в умовах, при яких продукується AB-токсин. Культивування бактеріальних клітин добре відоме у даній галузі. Стандартні методи для різних видів відомі й прийнятні зразки мікроорганізмів доступні з публічних колекцій. Зазначені вище мікроорганізми культивують у відповідності зі специфічними для них вимогами. Клостридії культивують в анаеробній атмосфері, у той час як представників Yersinia, Xenorhabdus, Bordetella і Vibrio можна культивувати в аеробних умовах. Представники Yersinia є холодостійкими, ці організми культивують, як правило, при 28 °C. Кожний організм має потребу у специфічному складі середовища для росту, що добре відомо у даній галузі. AB-токсин, як правило, вивільняється у культуральне середовище на пізній стаціонарній фазі росту культури. Після збору часто доцільно відокремлювати клітини від культурального середовища, оскільки AB-токсини присутні у середовищі у достатній концентрації. Це можна здійснювати центрифугуванням. Після відділення клітин центрифугуванням їх відкидають і супернатант піддають додатковій обробці. Потім токсини у середовищі деактивують шляхом ферментативного розщеплення, переважно з використанням їх автокаталітичних властивостей. Для досягнення розщеплення умови потрібно відповідним чином регулювати для прояву ферментативної активності. Найбільше важливим є додавання кофактора, що підсилює ферментативну активність. В якості кофактора можна застосовувати інозитфосфат, зокрема інозитгексафосфат, у концентраціях, що становлять від 1 мкмоль/л до 10 ммолей/л, більше переважно 10-100 мкмолей/л, однак для цієї мети можна використовувати інші аналоги або похідні, такі як 1,3,4- або 3,4,6-трифосфат, 1,2,3,4-, 1,3,4,5-, 3,4,5,6 або 1,4,5,6-тетрафосфат, або 1,2,3,4,5-, 1,2,3,5,6-, 1,3,4,5,6-, 2,3,4,5,6-пентафосфат, які мають таку ж ефективність, але 3 UA 105508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для цього можуть вимагатися більше високі концентрації. Значення pH повинно перебувати у діапазоні 6,5-8,5, і значення pH культурального середовища, як правило, вже перебуває у цьому діапазоні. В іншому варіанті буфер можна додавати або здійснювати його заміну, наприклад, шляхом діалізу або ультрафільтрації, наприклад, Трис-HCl при pH 8,5. Прийнятні температури становлять 20 - 40 °C. Розщеплення, як правило, повинно завершуватися протягом 1-24 год. і його можна оцінювати за допомогою аналізу, такого як описаний у прикладах, для того, щоб уникати залишкової токсичності. Різні види токсинів можна очищати зі збору й/або культурального середовища перед інактивацією. Якщо патоген продукує більше одного виду токсинів, то ці види токсинів можна ізолювати один від одного перед інактивацією. Наприклад, C. difficile продукує два токсини: токсин A (TcdA) і токсин B (TcdB), як зазначено вище. Ці два білки можна розділяти, наприклад, відповідно до методу, описаному у прикладі 4, перед здійсненням інактивації, а потім використовувати у препараті вакцини або індивідуально, або у сполученні один із одним. Токсоїд A і/або токсоїд B C. difficile, тобто токсин A і/або токсин B, інактивовані згідно з даним винаходом, є кращими для вакцинацій антигенами. Токсоїди можна додатково очищати після автокаталітичного розщеплення, збагачуючи більше довгими C-кінцевими отриманими у результаті розщеплення фрагментами (наприклад, фрагментами голотоксину A, що складається з амінокислот 543-2710, або фрагментами голотоксину B, що складається з амінокислот 544-2666 або 545-2666). У препаратах вакцин можна додатково поєднувати очищені токсоїди, запропоновані у винаході, з інактивованими AB-токсинами інших патогенів. Потім на основі отриманого препарату одержують остаточну препаративну форму, призначену для передбачуваного застосування вакцини. Наприклад, його можна використовувати у тій формі, в якій він присутній, у водному середовищі, що являє собою фармацевтично прийнятний носій. Середовище можна змінювати, наприклад, шляхом розведення, діалізу, ультрафільтрації або додаткових стадій очищення, наприклад, за допомогою афінної хроматографії. Препарат антигену можна сушити за допомогою виморожування для зберігання, здійснюючи відновлення водою перед застосуванням. При необхідності можна додавати ад'юванти. Ад'юванти можуть являти собою, наприклад, емульсії типу вода у маслі, масло у воді, багатофазні емульсії або емульсії, в яких відсутні мінеральні масла, ад'юванти на основі алюмінію, полімерні ад'юванти типу Carbopol®, сквалену, ліпосом, мікрочастинок, імуностимулюючих комплексів, і ад'юванти, що активують каскад Toll-подібного рецептора. Вакцини можна вводити шляхом підшкірної, внутрішньошкірної, внутрішньом'язової, внутрішньовенної або внутрішньочеревинної ін'єкції. Частота ін'єкцій і доза залежать від видівмішеней. Чутливими видами є людина, собаки, кішки, кролики, свині, корови, риби, гризуни й коні. Вакцинація являє собою профілактичну обробку, і за допомогою вакцинації матері можна забезпечувати захист потомства. Час проведення вакцинації починається після зникнення материнських антитіл, і при цьому можуть вимагатися бустер-вакцинації через 4 тижні або у більше пізні моменти часу. Таким чином, ще одним об'єктом даного винаходу є вакцина проти індукованої Clostridium діареї, що містить токсоїд A і/або токсоїд B Clostridium difficile, де зазначений токсоїд A і/або токсоїд B отримані з токсину A і/або токсину B шляхом автокаталітичного розщеплення, необов'язково у сполученні з фармацевтично прийнятним носієм. У деяких варіантах здійснення винаходу токсоїд A складається з амінокислот 543-2710 послідовностей, депонованих у публічних базах даних (EMBL, NCBI) під реєстраційними номерами YP_001087137, ZP_05349827 або YP_003213641. В інших варіантах здійснення винаходу токсоїд B складається з амінокислот 544-2666 або 545-2666 послідовностей, депонованих у публічних базах даних (EMBL, NCBI) під реєстраційними номерами YP_001087135, ZP_05349824, ZP_05328744, YP_003217086 або YP_003213639. Вакцина може містити також ад'ювант. Приклади Приклад 1: Одержання вакцини на основі Clostridium difficile Зразки Clostridium difficile можна одержувати з публічних колекцій, наприклад, Американської колекції типових культур (ATCC), Манассас, шт. Віргінія, США, реєстраційний № ATCC 9689, ATCC 43255. Культуру вирощують у ферментері у середовищі BHI (серцевомозкова витяжка, фірма Becton Dickinson, Гейдельберг, Німеччина; див. American Pharmaceutical Association, The national formulary, 9-е вид., 1950, APA, Washington, D.C.) в анаеробних умовах при 37 °C протягом 3-4 днів. Два великих цитотоксини TcdA і TcdB вивільняються на пізній стаціонарній фазі росту. У цей момент часу культуру збирають і бактерії осаджують центрифугуванням при 8000 × g протягом 10 хв. Супернатант застосовують без обробки або можна здійснювати збагачення препарату токсином шляхом гель-фільтрації (наприклад, на S300 Sephacryl), афінної хроматографії, аніонообмінної хроматографії й/або 4 UA 105508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ультрафільтрації. Потім до супернатанту або препарату, збагаченому токсином, додають відновник дитіотреїтол у кінцевій концентрації 1-50 ммолей/л, після чого додають хелатуючий агент тетраацетат етилендіаміну у кінцевій концентрації 10-100 ммолей/л. Після цього додають інозитгексафосфат (IP6) у кінцевій концентрації від 1 мкмоля/л до 10 ммолей/л, наприклад, у концентрації 10 або 100 мкмолей/л, і композицію інкубують при 37 °C протягом періоду часу, що становить від 2 до 24 год., у прийнятному буфері типу Трис-HCl, pH 6,5-8,5. Повноту розщеплення можна оцінювати за допомогою гель-електрофорезу у присутності додецилсульфату натрію (ДСН-ПААГ) і фарбування білків. Потім на основі препарату, що утворився, готують кінцеву препаративну форму, призначену для цільового застосування як вакцина. Наприклад, її можна застосовувати без зміни у сполученні з водним середовищем, що служить як фармацевтично прийнятний носій. Середовище можна змінювати, наприклад, шляхом розведення, діалізу, ультрафільтрації або за допомогою додаткових стадій очищення, наприклад, афінної хроматографії. При необхідності можна додавати ад'юванти. Придатні для застосування ад'юванти можуть являти собою, наприклад, емульсії типу вода у маслі, масло у воді, багатофазні емульсії або емульсії на основі немінеральних масел, ад'юванти на основі алюмінію, полімерні ад'юванти типу карбополу, сквалену, ліпосом, мікрочастинок, імуностимулюючих комплексів, і ад'юванти, що активують каскад Toll-подібного рецептора. Вакцину можна вводити шляхом підшкірної, внутрішньошкірної, внутрішньом'язової, внутрішньовенної або внутрішньочеревинної ін'єкції. Частота ін'єкцій і доза залежать від видів-мішеней. Чутливими видами є людина, собаки, кішки, кролики, свині, корови, риби, гризуни й коні. Вакцинація являє собою профілактичну обробку, і за допомогою вакцинації матері можна забезпечувати захист потомства. Час проведення вакцинації починається після зникнення материнських антитіл, і при цьому можуть вимагатися бустер-вакцинації, які здійснюють через 4 тижні або у більше пізні моменти часу. Приклад 2: Аналіз активності CHO-клітини (клітини яєчника китайського хом'ячка, наприклад, DSM ACC110, Німецька колекція мікроорганізмів і клітинних культур, ГмбХ, Брауншвейг, Німеччина) висівають в 96- або 24-ямкові титраційні мікропланшети (по 100 мкл на ямку), наприклад, у середовище Хема F10, наприклад, доповнену наприклад, 5 % FCS (фетальна теляча сироватка), та інкубують при 37 °C протягом ночі у зволоженій атмосфері до досягнення конфлюентності. Їх промивають розчином Рингера, який не містить двовалентних іонів типу магнію й кальцію, потім в ямки вносять по 100 мкл (96-ямковий планшет) або 400 мкл (24-ямковий планшет) розчину Рингера без Mg і Ca. Потім в ямки за допомогою піпетки вносять відповідно 100 або 400 мкл препарату -1 -8 вакцини, що описаний у прикладі 1, і відповідні серійні розведення (від 10 до 10 ) кожного зразка, взяті з дублюванням. BHI-середовище, оброблене аналогічно препарату вакцини, служить як негативний контроль. Як позитивний контроль застосовують неопрацьований супернатант C. difficile. Планшети інкубують при 37 °C у зволоженій атмосфері протягом 3-24 год., потім клітини досліджують за допомогою мікроскопа. Клітини, оброблені препаратом вакцини, також як і негативний контроль, не повинні мати морфологічних змін. У клітин, до яких додавали неопрацьований клітинний супернатат, повинні бути присутніми ознаки цитопатичного впливу, які характеризуються, насамперед, придбанням округлої форми й розвитком морфологічної будови "астроцитного типу". Якщо в оброблених вакциною клітинах є ознаки цитопатичного впливу, аналогічні позитивному контролю, то ферментативне розщеплення було неповним і його варто повторювати. Приклад 3: Вакцинація тварин Золотавих (сірійських) хом'ячків можна застосовувати для створення стандартизованої тваринної моделі інфекцій, викликаних C. difficile. В експерименті використовують тварин вагою від 60 до 100 г. Тваринам вводять препарат вакцини у різних концентраціях (1-100 мкг) шляхом внутрішньочеревинної або підшкірної ін'єкції. Вакцина або не містить ад'ювант, або містить повний ад'ювант Фрейнда (у співвідношенні 1:1 з препаратом вакцини), або Ribi (монофосфорил ліпід A і емульсія дикориноміколату трегалози) як ад'ювант. Оброблене аналогічно вакцині BHI-середовище служить як негативний контроль. Через 2 тижні після останньої вакцинації тваринам вводять кліндаміцин у дозі 10-100 мг/кг внутрішньочеревинно або орогастрально. Через 24 год. їх інокулюють шляхом годування через шлунковий зонд або 4 канюлю з кінцем круглої форми, вводячи щонайменше 10 життєздатних патогенних мікроорганізмів C. difficile на тварину або 100 КТО (колонієтворних одиниць) відповідно. Ефективність захисної дії вакцини оцінюють шляхом клінічного моніторингу діареї або на основі визначення коефіцієнта смертності. Приклад 4: Вакцинація тварин Clostridium difficile 5 UA 105508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У цих дослідженнях AB-токсини Clostridium difficile інактивують, використовуючи властиву їм функцію автокаталітичного розщеплення, і застосовують як вакцини для тварин. Для одержання токсину 1 мл робочої культури C. difficile (референс-штам VPI10463, ATCC 43255) переносять у попередньо оброблені й стерильні діалізні мішки, що містять 200 мл 0,9 % NaCl. Діалізний мішок поміщають у 1,3 л BHI-середовища та інкубують протягом 5 днів при 37 °C в анаеробній камері. Через 5 днів вміст діалізного мішка центрифугують (5000 об/хв, 4 °C, 15 хв) і здійснюють фракціонування шляхом осадження супернатанта персульфатом амонію. Першу стадію осадження (токсин A) здійснюють, додаючи 45 % (NH)4SO4 і перемішуючи протягом 3 год. при 4 °C. Після центрифугування розчину протягом зазначеного періоду часу (5000 об/хв, 4 °C і 30 хв) здійснюють другу стадію осадження (токсин B), додаючи (NH) 4SO4 до кінцевої концентрації 70 %. Другу фракцію перемішують протягом 3 год. при 4 °C і після цього здійснюють повторне центрифугування (5000 об/хв, 4 °C і 30 хв). Дебрис, що утворився у результаті здійснення стадій осадження, суспендують у 5 мл 50мМ Трис/HCl, pH 7,5. Дві фракції (токсин A і B), отримані у результаті осадження за допомогою (NH) 4SO4, додатково очищають шляхом центрифугування у градієнті щільності сахарози. Для цієї мети одержують градієнт щільності сахарози, нашаровуючи по 4,5 мл наступних у порядку зростання зазначених концентрацій розчинів сахарози, в ультрацентрифужну пробірку: 10 %, 18,75 %, 27,50 %, 36,25 % і 45 % сахарози у 50мМ Трис/HCl, pH 7,5. Фракції, що містять токсини, вносять у верхню частину пробірки й центрифугують протягом 3,5 год. при 4 °C і 100000 × g. Отриманий градієнт збирають і розділяють на аліквот по 2 мл. Вміст токсину у зразках оцінюють за допомогою аналізів цитотоксичності з використанням CHO-K1-клітин. Для цієї мети CHO-K1-клітини (ATCC CCL-61) вирощують у середовищі DMEM/F10, що містить 10 % FCS, 0,5 % L-глутаміну й 0,5 % пеніциліну/стрептоміцину. В 96-ямкових титраційних мікропланшетах готують моношари клітин (приблизно по 4000 на ямку) та інкубують при 37 °C і 5 % CO2 протягом 24 год. Після інкубації готують 10-кратні розведення зразків, що містять токсини. Після видалення середовища з клітин додають розведення токсинів. Через 24 год. оцінюють цитотоксичну дію за допомогою інвертованого мікроскопа. Для оцінки цитотоксичності застосовують наступну схему: позитивна дія (+): > 90 % округлених клітин, негативна дія (-): 90 % клітин через 3 год. і 24 год. Округлення клітин визначають за допомогою мікроскопа через 3 год. і 24 год. відповідно до описаного вище методу. Визначають титр нейтралізуючих антитіл як значення, що відповідає найбільшому розведенню сироватки, при якому відбувається повне інгібування округлення клітин через 24 год. Завданням даного дослідження було визначення, чи будуть мати біологічну сумісність повторні підшкірні імунізації з використанням різних доз комбінації інактивованого токсину A і B, і чи може при цьому індукуватися захист від викликаної C. difficile інфекції. Для цієї мети застосовують 12 самців сірійського хом'ячка, довільно розділених на 4 групи у момент їх внесення у пристрій для здійснення досліду. У кожну групу входить по 3 тварини. Вакцинацію груп здійснюють у різні дні й за допомогою зростаючих доз із метою реєстрації потенційних токсичних дій, що виникають після вакцинації. Група 2 Група 3 3 3 100 мкл системи ад'ювантів (фірма Sigma) на дозу Токсоїд A/B, кожний Токсоїд A/B, кожний Токсоїд A/B, кожний по 1-а імунізація по 1 мкг по 1 мкг 1 мкг Токсоїд A/B, кожний Токсоїд A/B, кожний Токсоїд A/B, кожний по 2-а імунізація по 2 мкг по 3 мкг 4 мкг Токсоїд A/B, кожний Токсоїд A/B, кожний Токсоїд A/B, кожний по 3-я імунізація по 4 мкг по 4 мкг 4 мкг N (тварин) Об'єм дози Група 1 3 Схема досліду: 7 Група 4 3 Ад'ювант Ад'ювант Ад'ювант UA 105508 C2 День дослідження -5 0 2 4 14 16 18 30 38 43 44 45-47 48-51 52 5 10 15 20 Процедура Відбір зразків крові для одержання вихідних даних, приблизно по 100 мкл сироватки на тварину Обробка груп A і Г у відповідності зі зазначеним, підшкірно, 100 мкл, і визначення ваги тіла Обробка групи Б у відповідності зі зазначеним, підшкірно, 100 мкл, і визначення ваги тіла Обробка групи В у відповідності зі зазначеним, підшкірно, 100 мкл, і визначення ваги тіла Обробка груп A і Г у відповідності зі зазначеним, підшкірно, 100 мкл, і визначення ваги тіла Обробка групи Б у відповідності зі зазначеним, підшкірно, 100 мкл, і визначення ваги тіла Обробка групи В у відповідності зі зазначеним, підшкірно, 100 мкл, і визначення ваги тіла Обробка груп A-Г у відповідності зі зазначеним, підшкірно, 100 мкл, і визначення ваги тіла Відбір зразків крові, приблизно 100 мкл сироватки на тварину Обробка антибіотиком (кліндаміцин 2 мг/тварину), орально 8 Контрольне зараження Clostridium difficile (1,77×10 /тварину) орально, через 24 год. після обробки антибіотиком; визначення ваги тіла Клінічне обстеження 5 разів на день Клінічне обстеження 3 рази на день Відбір зразків крові тварин, що вижили Одержання зрізів тканин тварин - у день 52 у випадку загибелі або у день вмертвіння (якщо у тварин розвилися серйозні симптоми, що спричиняють страждання) Всіх тварин, що не мають клінічних симптомів після підшкірної вакцинації, можна піддавати обробці більше високою дозою токсину, яка становить аж до 4 мкг кожного з токсоїдів A і B. Крім того, у тварин з контрольної групи не виявлено ніяких реакцій на підшкірну вакцинацію, що свідчить про те, що система ад'ювантів фірми Sigma добре переноситься при підшкірному застосуванні. Визначення ваги тіла протягом декількох днів протягом досліду також свідчить про гарну переносимість вакцинації. У всіх тварин виявлене збільшення ваги тіла аж до контрольного зараження. Збільшення ваги тіла у вакцинованих токсином тварин виявилося порівнянним із цим показником у контрольній групі. Крім того, останнє визначення ваги перед контрольним зараженням токсином вакцинованих тварин (середні значення: група 1: 140,3 г; група 2: 136,3 г; група 3: 144 г) підпадає під діапазон значень ваги контрольних тварин (середнє значення: група 4: 141 г). Після контрольного зараження у день досліду 44 тварини у контрольній групі гинули протягом 2-3 днів. Для порівняння, у всіх тварин, вакцинованих розщепленими токсинами, тривалість життя виявилася більше довгою, а у 2 тварин практично були відсутні клінічні симптоми до кінця експерименту (група 1, тварина № 1; група 3, тварина № 1). У тварини № 1 з групи 1 були виявлені лише більше м'які екскременти у день досліду 47, але відбулося швидке відновлення, і у наступний день досліду клінічні симптоми не були виявлені, і це зберігалося аж до кінця експерименту. В іншої тварини (тварина № 1 із групи 3), яка вижила до кінця експерименту, були виявлені більше м'які екскременти, злегка волога забруднена промежина й було виявлено невелике зниження спонтанної активності від дня досліду 47 до дня досліду 50. У нього не виявлені клінічні симптоми у день досліду 51. 8 UA 105508 C2 Група Група 1 Група 2 Група 3 Група 4 (контрольна група) 5 Загибель/вмертвіння у досліду Кінець досліду (день 52) 48 50 48 48 48 Кінець досліду (день 52) 48 50 46 47 47 № тварини 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 день На основі цих результатів установлено, що імунізація токсоїдом A/B може індукувати імуногенність і частковий захист: тривалість життя всіх вакцинованих тварин була більше тривалою, ніж у контрольних тварин. Хоча контрольне зараження виявилося летальним для всіх контрольних тварин, 2/9 вакцинованих тварин вижили до кінця експерименту. Крім того, аналіз сироватки хом'ячків у досліді по нейтралізації цитотоксичності підтвердив розвиток імунологічної відповіді. Група (кількість хом'ячків) 1(3) 2(3) 3(3) 4(3) Тварина 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1-3 Титр нейтралізуючих Титр нейтралізуючих цитотоксичність антитіл у цитотоксичність антитіл у сироватці сироватці d=-5 d=38 Антитіла до А Антитіла до В Антитіла до А Антитіла до В 0 0 50 ≤10 0 0 25 10 0 0 50 ≤10 0 0 25 ≤10 0 0 50 ≤10 0 0 50 ≤10 0 0 10 10 0 0 50 ≤10 0 0 50 ≤10 0 0 0 0 10 15 20 25 30 Ніяких цитотоксичних нейтралізуючих антитіл до токсину A або B не виявлено у сироватці до вакцинації й у тварин із контрольної групи нейтралізуючі антитіла були відсутні аж до дня 38, коли відбирали останній раз зразки крові. У всіх вакцинованих тварин вироблялися нейтралізуючі антитіла до обох токсинів після трьох вакцинацій (день досліду 38), що чітко демонструє імуногенність препарату інактивованого токсину. Крім того, дозвільна доза може бути занадто високою для застосування на цій чутливій моделі, створеній на хом'ячках, і може мати потребу у додатковій адаптації. На основі коефіцієнтів виживаності груп, оброблених різними вакцинами, не вдалося виявити дозової залежності. Це може бути пов'язане з невеликими розходженнями у застосовуваних концентраціях токсоїдів, і тому всіх вакцинованих тварин можна розглядати як таких, які належать до однієї вакцинованої групи. У сукупності результати зазначеного експерименту демонструють, що інактивований автокаталітичним розщепленням токсин добре переноситься, може індукувати імунологічну відповідь і частковий захист від інфекції. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб одержання вакцини проти Clostridium difficile, що продукують АВ-токсин, який полягає у тому, що (а) культивують Clostridium difficile в умовах, при яких продукується АВ-токсин, і збирають культуру; 9 UA 105508 C2 5 10 15 20 25 (б) розщеплюють АВ-токсин ферментативно in vitro, причому як кофактор застосовують інозитфосфат; і (в) поєднують композицію, одержану на стадії (б), з фармацевтично прийнятним носієм. 2. Спосіб за п. 1, у якому як кофактор ферментативного розщеплення застосовують інозитгексафосфат. 3. Спосіб за п. 1 або п. 2, у якому клітини відокремлюють від культурального середовища після збору і АВ-токсин розщеплюють у культуральному середовищі. 4. Спосіб за одним із пп. 1-3, у якому АВ-токсин перед здійсненням розщеплення очищають від зібраного продукту, переважно від культурального середовища. 5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, у якому токсин А очищають від токсину В перед розщепленням. 6. Спосіб за будь-яким із пп. 1-5, у якому у композицію додають ад'ювант. 7. Вакцина проти Clostridium difficile, які продукують АВ-токсин, яка включає фармацевтично ефективну кількість активного інгредієнта і фармацевтично прийнятний носій, де активний інгредієнт одержаний шляхом (а) культивування Clostridium difficile в умовах, при яких продукується АВ-токсин, і збору культури; (б) розщеплення АВ-токсину ферментативно in vitro, при якому кофактор використовують інозитфосфат. 8. Вакцина за п. 7, що містить токсоїд А і/або токсоїд В Clostridium difficile. 9. Вакцина проти індукованої Clostridium діареї, що включає фармацевтично ефективну кількість токсоїду А і/або токсоїду В Clostridium difficile, одержаного з токсину А і/або токсину В шляхом автокаталітичного розщеплення з використанням як кофактора інозитфосфату, і фармацевтично прийнятний носій. 10. Застосування вакцини за п. 7 або 8 для вакцинації тварин, включаючи людину, проти інфекцій, викликаних Clostridium difficile. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 10