Спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатально діагностованою уретеропієлокалікоектазією

Спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатально діагностованою уретеропієлокалікоектазією, який включає визначення в сечі активності лізосомного ферменту Спосіб відноситься до медицини, а саме до дитячої урології і може бути використаний у дітей з пренатальне діагностованою уретеропієлокалікоектазією. Актуальність питання обумовлена тим, що виявлені в пренатальному періоді зміни нирки та верхніх сечових шляхів плода, які інтерпретують як гідронефроз або мегауретер плода, з одного боку, мають високу схильність до регресії цих змін після народження дитини і не потребують хірургічного втручання, а з другого - можуть прогресувати та за умов несвоєчасного застосування лікувальних заходів призвести до незворотних порушень функції нирки та її втрати. Основні діагностичні методи візуалізації та оцінки ступеня уретеропієлокаліко-ектазії у дітей перших місяців і років життя не відбивають функціональний стан ураженої нирки внаслідок незрілості нефронів у цьому віковому періоді. Ось чому адекватна оцінка функціонального стану нирки з пренатальне діагностованою уретеропієлокалікоєктазією (гідронефроз, мегауретер) у дітей перших місяців або років життя за допомогою методів, що не несуть променевого навантаження на організм дитини, може суттєво вплинути на визначення об'єму діагностичних досліджень для верифікації клінічної значущості змін нирки та верхніх сечових шляхів, діагностова Р - галактозид ази , який відрізняється тим, що додатково в динаміці через кожні 3-4 місяці визначають активність лізосомних ферментів р - галактозид ази та N-ацетил -p-D-глкжозамінідази , при цьому стале збільшення рівня активності (3-галактозидази вище за 14,6 мкмоль/год/ммоль креатиніну, а рівня активності N-ацетил-(S-D-глюкозамІнідази - вище за 17,1 мкмоль/год/ммоль креатиніну, оцінюють як стійке погіршення функціонального стану паренхіми нирки. них пренатальне за допомогою УЗД вагітних жінок, та на обрання найбільш обгрунтованої тактики ведення цієї групи дітей, а саме: розрізнення дітей на тих, яким показано хірургічне відновлення прохідності сечоводу та на тих, яким оперативне втручання може бути відстроченим або взагалі не показаним. Таким вимогам відповідають методи вимірювання рівнів активності найбільш реноспецифІчних ферментів сечі, які віддзеркалюють функціональний стан паренхіми нирок, зокрема стан тубулярного нефротелію, оскільки, як відомо, загибель нефрону, як структурної одиниці нирки, за умов клінічне значущої обструкції верхніх сечових шляхів починається саме з його канальцевого відділу. Доступність сечі, як біоматеріалу для дослідження активності ферментів, також має певну перевагу перед іншими діагностичними методами. Відомий спосіб оцінки функціонального стану канальцевого епітелію нирок [1], який полягає у визначенні рівнів активності лізосомного ферменту N-ацетил- р - D-глюкоза мі нідази, основним місцем локалізації якого є звивисті канальці проксимального відділу нефрону, у сечі, яка взята під час фізіологічного сечовипускання у день операції та у сечі з ниркової' миски або сечоводу безпосередньо під час оперативного втручання, у дітей з хроніч (О со 10736 ною однобічною обструктивною уропатією. Недоліками способу є одноразовість визначення активності N-ацетил-p-D-глкжозамінідази у сечі хворої дитини, визначення її у надто пізній термін задавненої стадії обструктивного процесу (у день операції), а також неможливість використання способу у динаміці спостереження (визначення рівнів активності ферменту у сечі з ниркової миски або сечоводу). Відомий також спосіб діагностики пошкодження епітелію проксимальних канальців нирок у дітей при гломерулонефриті [2], взятий нами за прототип, який полягає у визначенні в сечі дітей активності р -галактозидази за кількістю 4метилумбелліферона, що відщепився в результаті ферментативної реакції від 4-метилумбелліферилР -D-галактопиранозиду. Недоліком способу є те, що активність ферменту (3-галактозидази визначали у сечі дітей флюориметричним методом, який потребує додаткового устаткування. Крім того, при реєстрації контрольних рівнів активності ферментів в сечі дітей та розрахунку ВІДПОВІДНИХ меж розподілу між здоровими та хворими дітьми не враховували середнє квадратичне відхилення ( ё ) - величину, що дає уявлення про ступінь варіювання оцінюваних показників. В основу винаходу поставлена задача удосконалити спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатальне діагностованою урє-теропієлокалікоектазією шляхом визначення в динаміці через кожні 3-4 місяці рівнів активності в сечі найбільш органоспецифічних для нирок ферментів- р -галактозидази та N-ацетил- р -Dглюкозамінідази та оцінки функціонального стану паренхіми нирки, зокрема канальцевого відділу нефрону, в залежності від певних рівнів активності вищезгаданих ферментів, що дасть можливість виявити ступінь змін функціонального стану паренхіми нирки та використати одержані результати в якості додаткових критеріїв щодо показань до подальшого обстеження цих пацієнтів та встановлення раціональної тактики лікування - хірургічної або консервативної. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатальне діагностованою уретеропієлокалі-коектазією включає визначення в сечі активності лізосомного ферменту р -галактозидази, згідно з винаходом, додатково в динаміці через кожні 3-4 місяці визначають активність лізосомних ферментів р -галактозидази та N-ацетил- р -D* глюкозамінідази, та стале збільшення рівня активності р -галактозидази вище за 14,6мшоль/год/ммоль креатиніну, а рівня активності N-ацетил- р -D-глюкозамінідази вище за 17,1мшопь/год/ммопь креатиніну, оцінюють як стійке погіршення функціонального стану паренхіми нирки. Відомо, що р -галактозидаза та N-ацетил- р -Dглкжозамінідаза - це лізосомні ферменти, але ргалактозидаза є розчиненою в матриксі цієї орга нели, а N-ацетил-p-D-глюкозамінідаза - частково пов'язаною з її мембраною, тобто ці ферменти різняться між собою внутрішньолізосомною локалізацією. Одночасне визначення у динаміці спостереження рівнів активності двох ферментів, що мають тубулярну локалізацію та певні реноспецифічні властивості, забезпечує більш точну та відповідно більш надійну та більш об'єктивну оцінку функціонального стану нефротелію канальцевого відділу нефрону. Спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатальне діагностованою уретеропієлокалікоектазією виконують наступним чином: у дітей в сечі із сечового міхура, що одержана шляхом фізіологічного сечовипускання, при визначенні активності р -галактозидази в пробірку беруть 0,2мл профільтрованої сечі додають 0,Змл 0,1М цитратного буферу рН 4,0 та 0,2мл субстрату, який включає 5мМ розчин 2-нітрофеніл- J -D3 гал а кто пі ран оз иду у 0,1 М цитратному буфері рН 4,0. При визначенні активності N-ацетил- (і -Dглюкозамінідази в пробірку беруть 0,2 мл профільтрованої сечі і додають до них 0,Змл 0,1М цитратного буферу рН 4,15 та 0,2мл субстрату, який включає ЮмМ розчин 4-нітрофенІл-2-ацетамідо-2дезоксі-р-О-глюкопіранозиду у 0,1 М цитратному буфері рН 4,15. Подальше виконання ферментатиних реакцій є загальним для визначення як активності J5галактозидази, так і N-ацетил-p-Dглюкозамінідази. Проби інкубують ЗО хвилин при 37°С, потім реакцію зупиняють додаванням 0,8мл 0,1 М розчину вуглекислого натрію. Оптичну щільність пара-нітрофенолу, що утворився, вимірюють на фотоелектроколориметрі при 400нм проти контрольної проби, у яку розчин субстрату вносять після припинення ферментативної реакції. Ферментативну активність р-галактозидази та N-ацетил- р -D-глюкозамінідази сечі розраховують у мкмолях пара-нітрофенолу, що утворився протягом 1 години, із розрахунку на 1 ммопь креатикіну сечі, вміст якого визначають за кольоровою реакцією Яффе з пікриновою кислотою. Активність ЛІЗОСОМНИХ ферментів ргалактозидази та N-ацетил- р -D-глюкозамінідази визначають в динаміці через кожні 3-4 місяці протягом 1,5-2 років від початку спостереження. Апробація способу, що заявляється, проведена в інституті урології АМН України у 17 дітей віком від 6 місяців до 4 років, яким первинний діагноз уретеропієлокалікоектазії було встановлено пренатальне, а також у 62 дітей віком від 4 МІСЯЦІВ до 16 років з верифікованим діагнозом вродженого обструктивного однобічного гідронефрозу або мегауретеру та у 25 практично здорових дітей у віці від б місяців до 16 років (контрольна група). Отримані результати показали, що рівні активності обох ферментів не залежать від віку досліджуваних. У сечі здорових дітей активність ргалактозидази з урахуванням середньої арифметичної величини та Ті похибки (М±т) дорівнює 9,58±0,68мкмоль пара-нітрофенолу, що утворився 10736 за 1 годину із розрахунку на 1 ммоль креатиніну сечі, середнє квадратичне відхилення (S }=3,37. Активність N-ацетил- р - D-глюкоза мі нідази 11,64±0,72мкмоль/год/ммоль креатиніну, S =3,61. Для визначення меж рівнів активності ргалактозидази та N-ацетил- р -D-глюкозамінідази у сечі здорових дітей дотримувалися рекомендацій В.В.Власова (3), який пропонує для встановлення меж референтних інтервалів використовувати формулу М±1,55. З урахуванням величин середнього квадратичного відхилення (1,5 S) верхні межі активності р -галактозидази та N-ацетил- р -Dглюкозамінідази у сечі здорових дітей дорівнюють 14,6 та 17,1мкмоль/год/ммоль креатиніну відповідно, тобто рівні активності р -галактозидази та N ацетил-[І-D-глюкозамінідази, що є стало вищими за ці величини, розцінюють як показники дисфункції паренхіми нирки, зокрема канальцевого відділу нефрону. Порівняння середніх величин рівнів активності р-галактозидази та N-ацетил- р -Dглкжозамінідази у сечі дітей з верифікованим діагнозом вродженого обструктивного однобічного гідронефрозу та вродженого обструктивного однобічного мегауретеру з контрольною групою здорових дітей виявило статистичне вірогідне підвищення активності обох ферментів у сечі хворих дітей, що підтверджує правильність підходу до встановлення меж розподілу між здоровими та хворими дітьми у способі, що заявляється. Дані наведені в таблиці. Таблиця Активність Р-галактозидази (р -Гал) та N-ацетил- р -D-глюкозамінідази (НАГ) в сечі дітей, хворих на вроджені однобічні гідронефроз та обструктивний мега-уретер (у мкмолях пара-нітрофенолу, що утворився за 1 годину інкубації при 37°С із розрахунку на 1 ммоль креатиніну) № Активність р -Гал (М±т) Групи обстежених АКТИВНІСТЬ НАГ (М±т) № п/п 1 3 гідронефрозом п=49 22,33±1,45 17,05±1,55 2 3 обструктивним мегауретером п=13 32,67± 5,52 17,56±3,41 3 Контрольна група п=25 11,64±0,72 9,58±0,68 Рі-з< 0,01 0,001 Ргз< 0,05 0,001 Таким чином, якщо у дітей з пренатальне встановленою уретеропієлока-лікоектазією рівні активності р-галактозидази та N-ацетил-р-Dглюкозамінідази відповідають контрольним значенням, це свідчить про неушкодженість клітинних та лізосомних мембран та про можливість подальшого спостереження та консервативного ведення цих пацієнтів, а стале підвищення активності рівнів цих ферментів більше за величини, що дорівнюють 14,6 та 17,1мкмоль/год/ммоль креатиніну відповідно, - про стійке порушення функціонального стану паренхіми нирки, зокрема канальцевого відділу нефрону, та про необхідність зміни тактики лікування в бік хірургічної корекції'. Точність способу: похибка у двох паралельних визначеннях для (р-галактозидази не перебільшує ±3,3%, для Nацетил- р -D-глюкозамінідази - ± 3,9%. Наводимо приклади практичного застосування запропонованого способу. Приклад 1. Хворий P., і.х. № 667, 4 роки. У дитини пренатальне встановлено наявність правобічної уретеропієлокалікоектазії. При обстеженні в клініці у 6-ти місячному віці ехографічно діагностовано зміни правої нирки та сечоводу, що кваліфіковані як обструктивний мегауретер. Загальні аналізи крові та сечі без особливостей. Бактеріальний засів сечі негативний (-). Розміри лівої нирки, за даними УЗО, у 6-ти місячному віці становили 7,7см на 2,8см, індекс резистентності внутрішньониркових артерій, за даними сонодопплерографм, -0,64. За даними УЗО, стан правої нирки, її збиральної системи та сечоводу розцінюють як уретеропієлокалікоектазію із розширенням ниркової миски до 1,5см, ниркових ча шечок до 0,8см та сечоводу у верхній та нижній третині до 0,9см та 1,2см відповідно. Разом з цим рівень індексу резистентності внутрішньо-ниркових артерій дорівнює 0,68, що стало обґрунтуванням для визначення тактики ведення пацієнта консервативним шляхом. Клінічний діагноз: Вроджений правобічний обструктивний мегауретер, 1 стадія. При динамічній оцінці ступеня уретеропієлокалікоектазії за допомогою ехографічних даних, включаючи оцінку стану внутрішньо ниркової гемодинаміки, впродовж 3-х років встановлено відсутність органічної обструкції сечоводно-міхурового сегменту сечоводу та зменшення ступеня уретеропієлокалікоектазіґ: ниркова миска становить 0,5см, чашечки - 0,6см, розміри сечоводу у верхній та нижній третині відповідно 0,5см та 0,9см, індекс резистентності - 0,67. Застосуванні запропонованого способу показало, що активність як (3-галактозидази, так і "Мацетил-р-О-глюкозамінідази у сечі із сечового міхура є у межах норми, а саме 5,57 та 15,69мкмоль/год/ммоль креатиніну, що вказує на неушкодженість клітинних та лізосомних мембран нефротелію та відповідно на задовільний стан паренхіми нирки. Контрольне обстеження через З місяці також свідчить, що рівні активності обох ферментів у сечі цього пацієнта перебувають у межах норми: активність р -галактозидази - 11,02, активність N-ацетил-р -D-глюкозамінідази 15,88мкмоль/год/ммоль креатиніну, що також вказує на задовільний стан паренхіми нирки Контрольне обстеження ще через 3 місяці показало, що рівні активності ферментів продовжували залиша 10736 тися у межах нормальних величин, так, активність р-галактозидази сечі дорівнювала 3,5, а активність N-ацетил- (J -D-глюкозамінідази 9,45мкмоль/год/ммоль креатиніну, що свідчить про задовільний функціональний стан паренхіми нирки у цього пацієнта. Контрольне обстеження ще через 4 місяці показало, що рівні активності обох ферментів продовжували залишатися у межах нормальних показників, активність ргалактозидази сечі - 8,81, активність N-ацетил- рD-глюкозамінідази - 11,16мкмоль/год/ммоль креатиніну, що свідчить про відсутність порушень з боку функціонального стану нирок у даного пацієнта, що стало підставою для визначення консервативної тактики його ведення без застосування рентгенологічних методів діагностики з періодичністю обстеження у 6 місяців. Приклад 2. Хворий Г., і.х. № 174, 2 роки 11 місяців. У дитини пренатальне встановлено наявність лівобічної пієлокалікоектазії. При обстеженні в клініці у 3-х та 6-ти місячному віці ехографічно діагностовано зміни лівої нирки, що кваліфіковані як підозра на обструкцію мисково-сечоводного сегменту зліва. За даними загальних аналізів крові та сечі відхилень від норми не виявлено. Бактеріальний засів сечі негативний. За даними УЗО в 3-х місячному віці розміри правої нирки та її збиральної системи відповідають віковій нормі; зліва діагностовано пієло калі кое ктазію з розширенням ниркової миски до 2,3см, ниркових чашечок до 1,0см. У той же час рівень індексу резистентності внутріш-ньониркових артерій становив 0,69, що дозволило продовжувати подальше ведення хворого консервативним шляхом. При контрольному УЗО в 2-річному віці встановлено суттєву регресію пієлокалікоектазії зліва: розмір ниркової миски становив 1,3см, ниркові чашечки зменшились до 0,7см, товщина паренхіми нирки складає 0,9-,0см. Індекс резистентності варіює від 0,67 на верхньому та нижньому сегментах нирки до 0,70 - в середньому. На підставі отриманих даних встановлено клінічний діагноз: функціональна обструкція мисковосечоводного сегменту зліва та визначена тактика подальшого консервативного моніторингу пієлокалікоектазії. Застосування запропонованого способу показало, що рівень активності ргалактозидази у сечі із сечового міхура становив 22,44, а рівень активності N-ацетил- р -Dглюкозамінідази - 10,91мкмоль/год/ммоль креатиніну, тобто у цього пацієнта мало місце підвищення у сечі тільки одного з досліджуваних ферментів, а саме р-галактозидази, що вказує на помірно виражене пошкодження тубулярного нефротелію хворої нирки та відповідно на помірно виражене порушення її функціонального стану. Контрольне обстеження через 11 місяців показало, що ргвень активності р-галактозидази у сечі із сечового міхура становив 19,75, що є підвищеним, рівень активності N-ацетил- р -D-глюкозамінідази 13,97мкмоль/год/ммоль креатиніну, що є у межах норми. Стале підвищення рівня активності у сечі тільки одного з ферментів, а саме активності ргалактозидази, при сталих нормальних величинах 8 рівня активності N-ацетил- р -D-глюкозамінідази, свідчить про помірне порушення функціонального стану нирки, що дало підставу рекомендувати пацієнту продовжувати консервативне лікування, подальше динамічне спостереження та контрольне обстеження через 3 місяці. Приклад 3. Хвора Г., і.х. № 319, 1 рік 10 місяців. У дитини пренатальне встановлено наявність правобічної пієлокалікоектазії. При обстеженні в КЛІНІЦІ в 6-ти місячному віці ехографічно діагностовано зміни правої нирки, що кваліфіковані як підозра на обструкцію мисково-сечоводного сегменту справа. Загальні аналізи крові та сечі без особливостей. Бактеріальне дослідження сечі без патології. При УЗО в динаміці в 6 місяців, 1 рік і 1 місяць та 1 рік і 10 місяців встановлено повільне прогресування правобічної пієлокалікоектазії, яке характеризувалося збільшенням розмірів ниркової миски з 1,6см до 1,7 та 2,3см, ниркових чашечок з 0,9 до 1,0 та 1,5см у відповідні терміни обстеження при стабільних показниках товщини паренхіми нирки (0,8см, 1,0 см та 0,9см). Рівень Індексу резистентності внутрішньо ниркових артерій при останньому обстеженні зріс з 0,69 до 0,73. Клінічний діагноз: Правобічний гідронефроз, 1 стадія. Застосування запропонованого способу показало, що активність р -галактозидази сечі є підвищеною до 19,57мкмоль/год/ммоль креатиніну (14,6 - верхня межа нормальних величин) активність Nацетил- р -D-глюкозамінідази сечі знаходиться близько до верхньої межі норми 16,31мкмоль/год/ммоль креатииіну (верхня межа 17,1), що свідчить про помірне порушення проникності канальцевого епітелію проксимального відділу нефрону та відповідно про помірне порушення функціонального стану паренхіми нирки. Контрольне обстеження через 7 місяців показало, що активність р-галактозидази сечі продовжує залишатися підвищеною - 17,3мкмоль/год/ммоль креатиніну, також має місце підвищення активності Nацетил-р-D-глюкозамінідази сечі до 26,61 мкмоль/год/ммоль креатиніну. Підвищення одночасно обох ферментів у сечі пацієнтки свідчить про імовірність погіршення функціонального стану хворої нирки. Контрольне обстеження через 4,5 місяців показало відсутність позитивної' динаміки змін рівнів активності досліджуваних ферментів: активність р -галактозидази сечі залишалася підвищеною - 17,5мкмоль/год/ммоль креатиніну, активність N-ацетил-р -D-глюкозамінідази сечі також залишалася підвищеною 21,84мкмоль/год/ммоль креатиніну. Таке стале підвищення рівнів активності обох ферментів у сечі цієї пацієнтки свідчить про стійке погіршення функціонального стану правої нирки, зокрема стану канальцевого нефротелію. У зв'язку з цим, а також враховуючи результати ехографічних даних, хворій 16.03.2005 року було проведено відновлюване оперативне лікування з приводу вродженого гідронефрозу справа. Пацієнтці рекомендовано контрольні обстеження через 3 та 6 місяців після операції. З наведених прикладів видно, що у всіх 10736 трьох пацієнтів наявність уретеропієлокалікоектазії було встановлено пренатальне та підтверджено в постнатальному періоді. Загальні аналізи крові та сечі дітей - без особливостей, бактеріальний засів сечі у всіх дітей - стерильний. Результати візуалізаціиних методів обстеження (УЗО та сонодопплерографія) свідчать про наявність уретеропієлокалікоектазгі, але лише опосередковано характеризують особливості змін функціонального стану паренхіми нирок в динаміці. Тільки застосування способу, що заявляється, дозволяє дати вірогідну оцінку відсутності або наявності порушень функціонального стану канальцевого епітелію нефрону у кожної конкретної' дитини та завдяки регулярним спостереженням у динаміці помітити найбільш ранні ознаки дисфункції канальцевого нефротелію, які свідчать про порушення внутрішньонирковоі гемодинаміки, притаманне клінічне значущій обструкції сечоводу, що дає підставу для визначення адекватної та своєчасної тактики подальшого ведення таких хворих; продовжувати спостереження, лікувати консервативно або здійснювати корекцію обструктивного процесу хірургічним шляхом. Суттєві відмінності способу, що заявляється, встановлення меж розподілу між здоровими та хворими дітьми з використанням величин середнього арифметичного ряду та середнього квадратичного відхилення та застосування одночасного визначення рівнів активності двох ферментів, що мають лізосомну локалізацію, але по-різному по Комп'ютерна верстка Д. Дорошенко 10 в'язані зі структурними компонентами цієї органели, у динаміці спостереження - наділяють його перевагами перед вже існуючими способами, зокрема способом, що взятий за прототип, підвищуючи його діагностичні можливості та дозволяючи об'єктивно та цілеспрямовано відбивати у динаміці спостереження навіть незначні зміни стану обструктивної нефропатії у дітей з пренатальне діагностованою уретеропієлокалікоектазією. Таким чином, спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатальне діагностованою уретеропієлокалікоектазією є точним, надійним, безпечним для хворого та має високі діагностичні характеристики: діагностична специфічність способу становить 92%, діагностична чутливість - 86,8%, діагностична Інформативність ОО,*: /о. Джерела інформації", прийняті до уваги при експертизі: 1. Urinary levels of the renal tubular enzyme Nacetyl-p-D-glucosaminidase in unilateral obstructive uropathy / Carr M.C., Peters C.A., Retik A.B., Mandell J. //J. Urology. -1994. - Vol. 151, N 2. - P. 442-445. 2. Патент 2075083 РФ, МПК6 G 01 N 33/68. Способ диагностики повреждения эпителия проксимальных канальцев почек у детей при гломерулонефрите /Дивеева А.С., Ишкабулов Д.И., Каримова Н.А.; № 92005076; 10.11.92; Опуб. 10.03.97. Бюл. № 8. - 5 с (прототип). 3. Власов В.В. Эффективность диагностических исследований. - М.: Медицина, 1988. - С. 180. Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601 УКРАЇНА (19) UA (11)10736 из» U (51)7 G01 N33/48 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ видається під відповідальність власника патенту (54) СПОСІБ ОЦІНКИ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ПАРЕНХІМИ НИРКИ У ДІТЕЙ З ПРЕНАТАЛЬНО ДІАГНОСТОВАНОЮ УРЕТЕРОПІЄЛОКАЛІКОЕКТАЗІЄЮ (21)и200505562 (22)10.06.2005 (24)15.11.2005 (46) 15.11.2005, Бюл. №11, 2005 р. (72) Петербургський Володимир Федорович, Сеймівський Данило Антонович, Мигаль Людмила Якимівна, Нікуліна Галина Григорівна (73) ІНСТИТУТ УРОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ (56) (57) Спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатально діагностованою уретеропієлокалікоектазією, який включає визначення в сечі активності лізосомного ферменту Спосіб відноситься до медицини, а саме до дитячої урології і може бути використаний у дітей з пренатальне діагностованою уретеропієлокалікоектазією. Актуальність питання обумовлена тим, що виявлені в пренатальному періоді зміни нирки та верхніх сечових шляхів плода, які інтерпретують як гідронефроз або мегауретер плода, з одного боку, мають високу схильність до регресії цих змін після народження дитини і не потребують хірургічного втручання, а з другого - можуть прогресувати та за умов несвоєчасного застосування лікувальних заходів призвести до незворотних порушень функції нирки та її втрати. Основні діагностичні методи візуалізації та оцінки ступеня уретеропієлокаліко-ектазіі у дітей перших МІСЯЦІВ І років життя не відбивають функціональний стан ураженої нирки внаслідок незрілості нефронів у цьому віковому періоді. Ось чому адекватна оцінка функціонального стану нирки з пренатальне діагностованою уретеропієлокалікоєктазією {гідронефроз, мегауретер) у дітей перших місяців або років життя за допомогою методів, що не несуть променевого навантаження на організм дитини, може суттєво вплинути на визначення об'єму діагностичних досліджень для верифікації клінічної значущості змін нирки та верхніх сечових шляхів, діагностова (3-галактозидази , який відрізняється тим, що додатково в динаміці через кожні 3-4 місяці визначають активність лізосомних ферментів Р - галактозидази та N-ацетил-p-D-глюкозамінІдази , при цьому стале збільшення рівня активності р-галактозидази вище за 14,6 мкмоль/год/ммоль креатиніну, а рівня активності N - ацетил - р - D - глюкозамін ідази - вище за 17,1 мкмоль/год/ммоль креатиніну, оцінюють як стійке погіршення функціонального стану паренхіми нирки. них пренатальне за допомогою УЗД вагітних жінок, та на обрання найбільш обґрунтованої' тактики ведення цієї групи дітей, а саме: розрізнення дітей на тих, яким показано хірургічне відновлення прохідності сечоводу та на тих, яким оперативне втручання може бути відстроченим або взагалі не показаним. Таким вимогам відповідають методи вимірювання рівнів активності найбільш реноспецифічних ферментів сечі, які віддзеркалюють функціональний стан паренхіми нирок, зокрема стан тубулярного нефротелію, оскільки, як відомо, загибель нефрону, як структурної одиниці нирки, за умов клінічне значущої обструкції верхніх сечових шляхів починається саме з його канальцевого відділу. Доступність сечі, як бюматеріалу для дослідження активності ферментів, також має певну перевагу перед іншими діагностичними методами. Відомий спосіб оцінки функціонального стану канальцевого епітелію нирок [1], який полягає у визначенні рівнів активності лізосомного ферменту N-ацетил- р -D-глюкозамінідази, основним місцем локалізації якого є звивисті канальці проксимального відділу нефрону, у сечі, яка взята під час фізіологічного сечовипускання у день операції' та у сечі з ниркової миски або сечоводу безпосередньо під час оперативного втручання, у дітей з хроніч со со 10736 ною однобічною обструктивною уропатією. Недоліками способу є одноразовість визначення активності N-ацетил-р-D-глюкозамінідази у сечі хворої дитини, визначення її у надто пізній термін задавненої стадії обструктивного процесу (у день операції), а також неможливість використання способу у динаміці спостереження (визначення рівнів активності ферменту у сечі з ниркової миски або сечоводу) Відомий також спосіб діагностики пошкодження епітелію проксимальних канальців нирок у дітей при гломерулонефриті [2], взятий нами за прототип, який полягає у визначенні в сечі дітей активності р -галактозид ази за кількістю 4метилумбелліферона, що відщепився в результаті ферментативної реакції від 4-метилумбелліферилР -D-галактопиранозиду. Недоліком способу є те, що активність ферменту (3-галактозидази визначали у сечі дітей флюориметричним методом, який потребує додаткового устаткування. Крім того, при реєстрації контрольних рівнів активності ферментів в сечідітей та розрахунку відповідних меж розподілу між здоровими та хворими дітьми не враховували середнє квадратичне відхилення ( 5 ) - величину, що дає уявлення про ступінь варіювання оцінюваних показників. В основу винаходу поставлена задача удосконалити спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатальне діагностованою уре-теропієлокалікоектазією шляхом визначення в динаміці через кожні 3-4 місяці рівнів активності в сечі найбільш органоспецифічних для нирок ферментів- 3 -галактозидази та N-ацетил- р -Dглюкозамінідази та оцінки функціонального стану паренхіми нирки, зокрема канальцевого відділу нефрону, в залежності від певних рівнів активності вищезгаданих ферментів, що дасть можливість виявити ступінь змін функціонального стану паренхіми нирки та використати одержані результати в якості додаткових критеріїв щодо показань до подальшого обстеження цих пацієнтів та встановлення раціональної тактики лікування - хірургічної або консервативної. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатальне діагностованою уретеропієлокалі-коектазією включає визначення в сечі активності лізосомного ферменту р -галактозидази, згідно з винаходом, додатково в динаміці через кожні 3-4 місяці визначають активність лізосомнюс ферментів р-галактозидази та N-ацетил-p-Dглюкозамінідази, та стале збільшення рівня активності р -галактозидази вище за 14,6мкмоль/год/ммоль креатиніну, а рівня активності N-ацетил- р -D-глюкозамінІдази вище за 17,1мкмоль/год/ммоль креатиніну, оцінюють як стійке погіршення функціонального стану паренхіми нирки. Відомо, що р-галактозидазата N-ацетил-p-Dглюкозамінідаза - це лізосомні ферменти, але ргалактозидаза є розчиненою в матриксі цієї орга нели, а N-ацетил-[5-D-глюкозамінідаза - частково пов'язаною з її мембраною, тобто ці ферменти різняться між собою внутрішньолізосомною локалізацією. Одночасне визначення у динаміці спостереження рівнів активності двох ферментів, що мають тубулярну локалізацію та певні реноспецифічні властивості, забезпечує більш точну та відповідно більш надійну та більш об'єктивну оцінку функціонального стану нефротелію канальцевого відділу нефрону. Спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатальне діагностованою уретеропієлокалікоектазією виконують наступним чином: у дітей в сечі із сечового міхура, що одержана шляхом фізіологічного сечовипускання, при визначенні активності р -галактозидази в пробірку беруть 0,2мл профільтрованої сечі додають 0,Змл 0,1 М цитратного буферу рН 4,0 та 0,2мл субстрату, який включає 5мМ розчин 2-нітрофеніл-р-Огалактопіранозиду у 0,1М цитратному буфері рН 4,0. При визначенні активності N-ацетил-p-Dглюкозамінідази в пробірку беруть 0,2 мл профільтрованої сечі і додають до них 0,Змл 0,1 М цитратного буферу рН 4,15 та 0,2мл субстрату, який включає ЮмМ розчин 4-нітрофеніл-2-ацетамідо-2дезоксі- р -D-глкжопіранозиду у 0,1 М цитратному буфері рН 4,15. Подальше виконання ферментатиних реакцій є загальним для визначення як активності ргалактозидази, так і N-ацетил-p-Dглюкозамінідази. Проби інкубують ЗО хвилин при 37°С, потім реакцію зупиняють додаванням 0,8мл 0,1М розчину вуглекислого натрію. Оптичну ЩІЛЬНІСТЬ пара-нітрофенолу, що утворився, вимірюють на фотоелектроколориметрі при 400нм проти контрольної проби, у яку розчин субстрату вносять після припинення ферментативної реакції. Ферментативну активність р-галактозидази та N-ацетил- р -D-глюкозамінідази сечі розраховують у мкмолях пара-нітрофенолу, що утворився протягом 1 години, із розрахунку на 1 ммоль креатиніну сечі, вміст якого визначають за кольоровою реакцією Яффе з пікриновою кислотою. Активність ЛІЗОСОМНИХ ферментів ргалактозидази та N-ацетил- р -D-глюкозамінідази визначають в динаміці через кожні 3-4 місяці протягом 1,5-2 років від початку спостереження. Апробація способу, що заявляється, проведена в Інституті урології АМН України у 17 дітей віком від 6 місяців до 4 років, яким первинний діагноз уретеропієлокалікоектазії було встановлено пренатальне, а також у 62 дітей віком від 4 місяців до 16 років з верифікованим діагнозом вродженого обструктивного однобічного гідронефрозу або мегауретеру та у 25 практично здорових дітей у віці від б місяців до 16 років (контрольна група). Отримані результати показали, що рівні активності обох ферментів не залежать від віку досліджуваних. У сечі здорових дітей активність ргалактозидази з урахуванням середньої арифметичної величини та и похибки (М±т) дорівнює 9,58±О,68мкмоль пара-нітрофенолу, що утворився 6 10736 за 1 годину із розрахунку на 1 ммоль креатиніну сечі, середнє квадратичне відхилення (5 )=3,37. Активність N-ацетил- р -D-глюкозамінідази 11,64±0,72мкмоль/год/ммоль креатиніну, 8=3,61. Для визначення меж рівнів активності р галактозидази та N-ацетил- р -D-глюкозамінідази у сечі здорових дітей дотримувалися рекомендацій В.В.Власова (3), який пропонує для встановлення меж референтних інтервалів використовувати формулу M+1.5S . З урахуванням величин середнього квадратичного відхилення (1,55) верхні межі активності р -галактозидази та N-ацетил- р -Dглгокозамінідази у сечі здорових дітей дорівнюють 14,6 та 17,1мкмоль/год/ммоль креатиніну відповідно, тобто рівні активності р-галактозидази та N ацетил-р-D-глюкозамінідази, що є стало вищими за ці величини, розцінюють як показники дисфункції паренхіми нирки, зокрема канальцевого відділу нефрону. Порівняння середніх величин рівнів активності Р -галактозидази та N-ацетил-p-Dглюкозамінідази у сечі дітей з верифікованим діагнозом вродженого обструктивного однобічного гідронефрозу та вродженого обструктивного однобічного мегауретеру з контрольною групою здорових дітей виявило статистичне вірогідне підвищення активності обох ферментів у сечі хворих дітей, що підтверджує правильність підходу до встановлення меж розподілу між здоровими та хворими дітьми у способі, що заявляється. Дані наведені в таблиці. Таблиця Активність Р-галактозидази (р -Гал) та N-ацетил- р -D-глюкозамінідази (НАГ) в сечі дітей, хворих на вроджені однобічні гідронефроз та обструктивний мега-уретер (у мкмолях пара-нітрофенолу, що утворився за 1 годину інкубації при 37°С із розрахунку на 1 ммоль креатиніну) № Активність р -Гал (М±гп) Групи обстежених Активність НАГ (M+m) №п/п 1 2 3 3 гідронефрозом п=49 3 обструктивним мегауретером п=13 Контрольна група п=25 Різ< Р 2 -з< Таким чином, якщо у дітей з пренатальне встановленою уретеропієлока-лікоектазією рівні активності р-галактозидази та N-ацетил- р -Dглюкозамінщази відповідають контрольним значенням, це свідчить про неушкодженість клітинних та лізосомних мембран та про можливість подальшого спостереження та консервативного ведення цих пацієнтів, а стале підвищення активності рівнів цих ферментів більше за величини, що дорівнюють 14,6 та 17,1мкмоль/год/ммоль креатиніну відповідно, - про стійке порушення функціонального стану паренхіми нирки, зокрема канальцевого відділу нефрону, та про необхідність зміни тактики лікування в бік хірургічної корекції'. Точність способу: похибка у двох паралельних визначеннях для (р -галактозидази не перебільшує ±3,3%, для Nацетил- р -D-глюкозамінідази - ± 3,9%. Наводимо приклади практичного застосування запропонованого способу. Приклад 1. Хворий P., і.х. № 667, 4 роки. У дитини пренатальне встановлено наявність правобічної уретеропієлокалікоектазії. При обстеженні в КЛІНІЦІ у 6-ти місячному віці ехографічно діагностовано зміни правої нирки та сечоводу, що кваліфіковані як обструктивний мегауретер. Загальні аналізи крові та сечі без особливостей. Бактеріальний засів сечі негативний (-). Розміри лівої нирки, за даними УЗО, у 6-ти місячному віці становили 7,7см на 2,8см, індекс резистентності внутрішньониркових артерій, за даними сонодопплерографії, -0,64. За даними УЗО, стан правої' нирки, її збиральної системи та сечоводу розцінюють як уретеропієлокалікоектазію із розширенням ниркової' миски до 1,5см, ниркових ча 17,05±1,55 17,56±3,41 9,58±0,68 0,01 0,05 22,33±1,45 32,67± 5,52 11,64±0,72 0,001 0,001 шечок до 0,8см та сечоводу у верхній та нижній третині до 0,9см та 1,2см відповідно. Разом з цим рівень індексу резистентності внутрішньо-ниркових артерій дорівнює 0,68, що стало обґрунтуванням для визначення тактики ведення пацієнта консервативним шляхом. Клінічний діагноз: Вроджений правобічний обструктивний мегауретер, 1 стадія. При динамічній оцінці ступеня уретеропієлокалікоектазії за допомогою ехографічних даних, включаючи оцінку стану внутрішньониркової гемодинаміки, впродовж 3-х років встановлено відсутність органічної обструкції' сечоводно-міхурового сегменту сечоводу та зменшення ступеня уретеропієлокалікоектазії: ниркова миска становить 0,5см, чашечки - 0,6см, розміри сечоводу у верхній та нижній третині відповідно 0,5см та 0,9см, індекс резистентності - 0,67. Застосуванні запропонованого способу показало, що активність як (3-галактозидази, так і "Мацетил-р-О-глюкозамінідази у сечі із сечового міхура є у межах норми, а саме 5,57 та 15,69мкмоль/год/ммоль креатиніну, що вказує на неушкодженість клітинних та лізосомних мембран нефротелію та відповідно на задовільний стан паренхіми нирки. Контрольне обстеження через З місяці також свідчить, що рівні активності обох ферментів у сечі цього пацієнта перебувають у межах норми: активність р-галактозидази - 11,02, активність N-ацетил- р -D-глюкозамінідази 15,88мкмоль/год/ммоль креатиніну, що також вказує на задовільний стан паренхіми нирки. Контрольне обстеження ще через 3 місяці показало, що рівні активності ферментів продовжували залиша 10736 тися у межах нормальних величин, так, активність р -галактозидази сечі дорівнювала 3,5, а активність N-ацетил-р -D-глюкозамінїдази 9,45мкмоль/год/ммоль креатиніну, що свідчить про задовільний функціональний стан паренхіми нирки у цього пацієнта. Контрольне обстеження ще через 4 місяці показало, що рівні активності обох ферментів продовжували залишатися у межах нормальних показників, активність ргалактозидази сечі - 8,81, активність N-ацетил- р D-глюкозамінідази - 11,16мкмоль/год/ммоль креатиніну, що свідчить про відсутність порушень з боку функціонального стану нирок у даного пацієнта, що стало підставою для визначення консервативної' тактики його ведення без застосування рентгенологічних методів діагностики з періодичністю обстеження у 6 місяців. Приклад 2. Хворий Г., і.х. № 174, 2 роки 11 місяців. У дитини пренатальне встаноалено наявність лівобічної пієлокалікоектазії. При обстеженні в клініці у 3-х та 6-ти місячному віці ехографічно діагностовано зміни лівої нирки, що кваліфіковані як підозра на обструкцію мисково-сечоводного сегменту зліва. За даними загальних аналізів крові та сечі відхилень від норми не виявлено. Бактеріальний засів сечі негативний. За даними УЗО в 3-х місячному віці розміри правої нирки та її збирально'і системи відповідають віковій нормі; зліва діагностовано пієлокалікоектазію з розширенням нирково'і миски до 2,3см, ниркових чашечок до 1,0см. У той же час рівень Індексу резистентності внутріш-ньониркових артерій становив 0,69, що дозволило продовжувати подальше ведення хворого консервативним шляхом. При контрольному УЗО в 2-річному віці встановлено суттєву регресію пієлокалікоектазії зліва: розмір ниркової миски становив 1,3см, ниркові чашечки зменшились до 0,7см, товщина паренхіми нирки складає 0,9-,0см. Індекс резистентності варіює від 0,67 на верхньому та нижньому сегментах нирки до 0,70 - в середньому. На пщставі отриманих даних встановлено клінічний діагноз: функціональна обструкція мисковосечоводного сегменту зліва та визначена тактика подальшого консервативного моніторингу пієлокалікоектазії. Застосування запропонованого способу показало, що рівень активності ргалактозидази у сечі із сечового міхура становив 22,44, а рівень активності N-ацетил- р -Dглюкозамінідази - 10,91мкмоль/год/ммоль креатиніну, тобто у цього пацієнта мало місце підвищення у сечі тільки одного з досліджуваних ферментів, а саме (3-галактозидази, що вказує на помірно виражене пошкодження тубулярногс нефротелію хворої нирки та відповідно на помірно виражене порушення її функціонального стану. Контрольне обстеження через 11 місяців показало, що рівень активності р-галактозидази у сечі із сечового міхура становив 19,75, що є підвищеним, рівень активності N-ацетил- р -D-глюкозамінідази 13,97мкмоль/год/ммоль креатиніну, що є у межах норми. Стале підвищення рівня активності у сечі тільки одного з ферментів, а саме активності р галактозидази, при сталих нормальних величинах 8 рівня активності N-ацетил- р -D-глюкозамінідази, свідчить про помірне порушення функціонального стану нирки, що дало підставу рекомендувати пацієнту продовжувати консервативне лікування, подальше динамічне спостереження та контрольне обстеження через 3 місяці. Приклад 3. Хвора Г., І х. № 319, 1 рік 10 місяців. У дитини пренатальне встановлено наявність правобічної пієлокалікоектазії. При обстеженні в клініці в 6-ти місячному віці ехографічно діагностовано зміни правої нирки, що кваліфіковані як підозра на обструкцію мисково-сечоводного сегменту справа. Загальні аналізи крові та сечі без особливостей. Бактеріальне дослідження сечі без патології. При УЗО в динаміці в 6 місяців, 1 рік і 1 місяць та 1 рік і 10 місяців встановлено повільне прогресування правобічної пієлокалікоектазіі, яке характеризувалося збільшенням розмірів ниркової миски з 1,6см до 1,7 та 2,3см, ниркових чашечок з 0,9 до 1,0 та 1,5см у відповідні терміни обстеження при стабільних показниках товщини паренхіми нирки (0,8см, 1,0 см та 0,9см). Рівень індексу резистентності внутрішньониркових артерій при останньому обстеженні зріс з 0,69 до 0,73. Клінічний діагноз: Правобічний гідронефроз, 1 стадія. Застосування запропонованого способу показало, що активність р -галактозидази сечі є підвищеною до 19,57мкмоль/год/ммопь креатиніну (14,6 - верхня межа нормальних величин) активність Nацетил- р -D-глюкозамінідази сечі знаходиться близько до верхньої межі норми 16,31мкмоль/год/ммоль креатиніну (верхня межа 17,1), що свідчить про помірне порушення проникності канальцевого епітелію проксимального відділу нефрону та відповідно про помірне порушення функціонального стану паренхіми нирки. Контрольне обстеження через 7 місяців показало, що активність р-галактозидази сечі продовжує залишатися підвищеною - 17,3мкмоль/год/ммоль креатиніну, також має місце підвищення активності Nацетил-(3-D-глюкозамінідази сечі до 26,61 мкмоль/год/ммоль креатиніну. Підвищення одночасно обох ферментів у сечі пацієнтки свідчить про імовірність погіршення функціонального стану хворої нирки. Контрольне обстеження через 4,5 місяців показало відсутність позитивної динаміки змін рівнів активності досліджуваних ферментів, активність р -галактозидази сечі залишалася підвищеною - 17,5мкмоль/год/ммоль креатиніну, активність N-ацетил- р -D-глюкозамінІдази сечі також залишалася підвищеною 21,84мкмоль/год/ммоль креатиніну. Таке стале підвищення рівнів активності обох ферментів у сечі цієї пацієнтки свідчить про стійке погіршення функціонального стану правої нирки, зокрема стану канальцевого нефротелію. У зв'язку з цим, а також враховуючи результати ехографічних даних, хворій 16.03.2005 року було проведено відновлюване оперативне лікування з приводу вродженого гідронефрозу справа. Пацієнтці рекомендовано контрольні обстеження через 3 та 6 місяців після операції. З наведених прикладів видно, що у всіх 10736 9 трьох пацієнтів наявність уретеропієлокалікоектазії було встановлено пренатальне та підтверджено в постнатальному періоді. Загальні аналізи крові та сечі дітей - без особливостей, бактеріальний засів сечі у всіх дітей - стерильний. Результати візуалізаціиних методів обстеження (УЗО та сонодопплерографія) свідчать про наявність уретеропієлокалікоектазм", але лише опосередковано характеризують особливості змін функціонального стану паренхіми нирок в динаміці. Тільки застосування способу, що заявляється, дозволяє дати вірогідну оцінку відсутності або наявності порушень функціонального стану канальцевого епітелію нефрону у кожної конкретної дитини та завдяки регулярним спостереженням у динаміці помітити найбільш ранні ознаки дисфункції канальцевого нефротелію, які свідчать про порушення внутрішньо ниркової гемодинаміки, притаманне клінічне значущій обструкції сечоводу, що дає підставу для визначення адекватної та своєчасної тактики подальшого ведення таких хворих: продовжувати спостереження, лікувати консервативно або здійснювати корекцію обструктивного процесу хірургічним шляхом. Суттєві відмінності способу, що заявляється, встановлення меж розподілу між здоровими та хворими дітьми з використанням величин середнього арифметичного ряду та середнього квадратичного відхилення та застосування одночасного визначення рівнів активності двох ферментів, що мають лізосомну локалізацію, але по-різному по Комп'ютерна верстка Д. Дорошенко 10 в'язані зі структурними компонентами цієї органели, у динаміці спостереження - наділяють його перевагами перед вже існуючими способами, зокрема способом, що взятий за прототип, підвищуючи його діагностичні можливості та дозволяючи об'єктивно та цілеспрямовано відбивати у динаміці спостереження навіть незначні зміни стану обструктивної нефропатії у дітей з пренатальне діагностованою уретеропієлокалікоектазією. Таким чином, спосіб оцінки функціонального стану паренхіми нирки у дітей з пренатальне діагностованою уретеропієлокалікоектазією є точним, надійним, безпечним для хворого та має високі діагностичні характеристики: діагностична специфічність способу становить 92%, діагностична чутливість - 86,8%, діагностична інформативність 88,2%. Джерела інформації, прийняті до уваги при експертизі: 1. Urinary levels of the renal tubular enzyme Nacety[-p-D-glucosaminidase in unilateral obstructive uropathy / Carr M.C., Peters C.A., Retik A.B., Mandell J. //J. Urology. - 1994. - Vol. 151, N 2. - P. 442-445. 2. Патент 2075083 РФ, МПК6 G 01 N 33/68. Способ диагностики повреждения эпителия проксимальных канальцев почек у детей при гломерулонефрите /Дивеева А.С., Ишкабулов Д.И., Каримова Н.А.; № 92005076; 10.11.92; Опуб. 10.03.97. Бюл. № 8. - 5 с (прототип). 3. Власов В.В. Эффективность диагностических исследований. - М.: Медицина, 1988. - С.180. Підписне Тираж 26 прим Міністерство освгги і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601