Очні краплі

Реферат: Очні краплі містять природний прополіс, причому як природний прополіс містять водний витяг прополісу та додатково містять полівінілпіролідон, поліетиленгліколь-300 (Макрогол-300) та пропіленгліколь, воду для ін’єкцій. UA 119965 U (12) UA 119965 U UA 119965 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до офтальмології, і може бути використана для лікування широкого кола запальних захворювань очей: бактеріальних, алергічних, інфекційно-алергічних: кон'юнктивітів, блефаритів, кератитів та інших. Збільшення виробництва якості лікарських засобів є одним із важливих умов розвитку фармації в галузі охорони здоров'я та покращення лікарського забезпечення населення України. У зв'язку з цим, проблема створення нових ефективних лікарських препаратів для лікування комбінованих уражень органу зору, травмотоксикохімічної етіології, що складає до 50 % від усіх захворювань на сьогоднішній день є актуальною. Для виконання даної проблеми необхідно подальше ціленаправлене розширення сировинної бази фармацевтичної промисловості, особливо в галузі виробництва ліків природного походження. Пошуком економічно раціональних і доступних сировинних джерел доказана доцільність застосування в технології вітчизняних ліків прополісу – одного із доступних продуктів бджіл, що містить у своєму складі до 50 % фенольних сполук. Лікарські засоби на їх основі для лікування і профілактики глаукоми, травматичних, термічних, хімічних та променевих уражень органів зору до теперішнього часу не були розроблені. По аналізу очної захворюваності розрахункове число запальних захворювань 18 млн. на рік, в тому числі кон'юнктивітів - 12 млн. Хворі з запальними захворюваннями очей становлять 4060 % амбулаторного прийому окуліста. Досить частою формою є поєднані бактеріальноалергічні кон'юнктивіти і блефарокон'юнктивіти. Вони мають цілорічне завзяте рецидивуючий перебіг. У цих випадках застосування антибіотиків нерідко не робить лікувального ефекту і може призводити до розвитку хронічних, наполегливих лікарських блефарокон'юнктивітів. Широко відомі сульфаніламідні препарати для лікування інфекційних захворювань очей, наприклад кон'юнктивіти, блефарити, кератити та інші. Відомі очні краплі, виконані у вигляді 1030 % водного розчину лікарського препарату Сульфацил натрію [М.Д. Машковский "Лекарственные препараты". – М.: "Медицина", 1985, т. 2, с.281-282.; RU №2245138 C1, A61K 31/04, 2005 г.]. Відомий протизапалювальний, антимікробний і регенеруючий засіб "Пропомікс" [пат. UA №1738, A61K 35/00, 25.10.1994, бюл. № 3], предметом є застосування 0,5-0,6 % розчину поліфенольного гідрофільного комплексу сполук з прополісу як протизапального, антимікробного і регенеруючого засобу в офтальмології. Для отримання основи крапель - порошкоподібної субстанції (фенольного гідрофільного препарату прополісу) потрібне застосування (ЛЗР) легкозаймистої рідини (оцтово-етиловий ефір - етилацетат і петролейний ефір - "прекурсори"), а це дуже суворий кількісний облік, який може тягнути за собою кримінальну відповідальність, також для його отримання використовують нестандартне устаткування. Відомі очні краплі [см. Наказ Міністерства охорони здоров'я СРСР N 96, 3.04.91, М., розділ 4, с. 52-61], що містять розчинник у вигляді води очищеної і активну речовину. Як активна речовина може бути використаний левоміцетин, сульфацил натрію і ін. Недоліком цих крапель є недостатньо ефективний вплив крапель на процеси загоєння пошкодженої рогівки. Це подовжує процес лікування, вимагає більше часу для рубцювання тканин, причому якість рубцювання не завжди задовільна. Відомо, що багато хімічних сполук з антивірусною активністю проявляють побічну дію у вигляді високої токсичності, тератогенності та імунодепресивних властивостей. У зв'язку з цим важливим напрямом наукових досліджень є виявлення антивірусної дії у препаратів, отриманих з сировини природного походження Існують краплі для очей [пат.UA №97076, A61F 9/00, A61K 31/045, A61P 27/02, від 25.02.2015, бюл. № 4/2015], що містять розчинник у вигляді води очищеної і активну речовину, а саме природний прополіс. В основу корисної моделі покладено задачу удосконалення крапель для очей, в яких за рахунок оптимального підбору компонентів буде отримано засіб, що має широкий спектр фармакологічної дії без прояву побічної дії і призначеного для забезпечення протизапальної, розсмоктуючої, антисептичної дії, сприяння ніжному рубцюванню тканин рогівки ока. для лікування травма-токсико-хімічних уражень очей. Поставлена задача вирішується таким чином, що розроблені очні краплі що містять природний прополіс, згідно з корисною моделлю, як природний прополіс містять водний витяг прополісу та додатково містять полівінілпіролідон, поліетиленгліколю-300 (Макроголу-300) та пропіленгліколь, воду для ін'єкцій при наступному співвідношенні компонентів, мас. %: водний витяг прополісу 0,1-0,7 1 UA 119965 U 5 10 15 20 полівінілпіролідон 0,3-1,0 поліетиленгліколь-300 (макрогол-300) 0,2-1,0 пропіленгліколь 0,1-1,0 вода для ін'єкцій решта. Згідно з корисною моделлю, водний витяг прополісу використовують у співвідношенні сировини до екстрагенту 1:10. Основними діючими сполуками прополісу є дійсно похідні γ-пірону, фенолкарбонові кислоти, оксикумарини, тритерпенові та смолобальзамічні сполуки та ін. Склад прополісу це рослинні смоли (в середньому 55 %); бальзами, які містять у вигляді складних сумішей ефірні масла (8 %), дубильні речовини (8 %), ароматичні альдегіди, фенолокислоти; віск (22 %); квітковий пилок (5-11 %); механічні домішки. В ньому великий набір мінеральних елементів, містяться вітаміни та інші речовини. До групи біоактивних сполук належать флавоноїди з їх антибактеріальними властивостями. З прополісу виготовляють спиртові настої, спиртові емульсії, прополісне молоко, прополісне вершкове масло, ефірний екстракт тощо. Прополіс має сильну антимікробну і стимулюючу дію. Водна витяжка прополісу (СПЦ-СР-95, версія: 02). Виробник: ТОВ "Фармацевтичнас компанія "Здоров'я", м. Харків. Мутно-опалесціююча рідина темно-сірого кольору з зеленуваткоричневим відтінком та запахом прополісу. Як зв'язувальну речовину беруть повідон (полівінілпіролідон (ПВП) (Povidonum) (Povidone) (ФС 42-1194-78, ДФУ 2.0, Том 2, с. 543-547). H CH N CH2 H O n 25 30 35 Брутто-формула: C6nH9n+2NnOn [90003-39-8]. α-Гідро-ω-гідрополі[1-(2-оксопіролідин-1-іл)етилен]. Складається з лінійних полімерів 1етенілпіролідин-2-ону. Вміст: не менше 11,5 % і не більше 12,8 % азоту (N; А.м. 14,01), у перерахунку на безводну речовину. Порошок або пластівці білого або жовтаво-білого кольору. Гігроскопічний. Легко розчинний у воді Р, етанолі (96 %) Р і метанолі Р, дуже мало розчинний в ацетоні Р. рН (2.2.3) 0,2 % водного розчину – від 3,0 до 5,0. Альдегіди – не більше 0,05 % (500 ppm), у перерахунку на ацетальдегід. Пероксиди – не більше 0,04 % (400 ppm), у перерахунку на H2O2. Важкі метали (2.4.8, метод D) – не більше 0,001 % (10 ppm). Вода (2.5.12) – не більше 5,0 %. Сульфатна зола (2.4.14) – не більше 0,1 %. Як розчинники застосовуються поліетиленгліколь-300 (ПЕГ-300) (Макроголи). Макроголи являють собою суміш полімерів із загальною формулою Н-(ОСН2-СН2)n-OH, де n – середня кількість оксіетиленових груп. Прозора, в'язка, безбарвна або майже безбарвна, гігроскопічна рідина. Змішується з водою Р, дуже легко розчинний в ацетоні Р, етанолі (96 %) Р і метиленхлориді Р, практично не розчинний у жирних оліях і мінеральних маслах. Пропіленгліколь (Propylenglycolum) (Propylene Glycol) (ТУ 6-09-2434-81, ВФС 42-1594-86, ДФУ 2.0, Том 2, с. 563-564). H 40 45 50 H3 C OH OH і енантіомер Брутто-формула: С3Н8О2 [57-55-6]. Молекулярна маса: 76,1. (RS)-пропан-1,2-діол. В'язка, прозора, безбарвна рідина. Гігроскопічна. Змішується з водою Р та етанолом (96 %) Р. Використовується як співрозчинник і стабілізатор у сумішах з водою Р, етанолом Р або спиртом бензиловим Р. Технологія виготовлення очних крапель До одержаного водного витягу прополісу (згідно зі Специфікацією СПЦ-СР-95, версія: 02) при інтенсивному перемішуванні послідовно додають пропіленгліколь, поліетиленгліколь-300 (Макрогол-300) та полівінілпіролідон та доводять водою для ін'єкцій до необхідного об'єму. Розчин фільтрують, проводять стерильну фільтрацію і розливають у флакони, які щільно закупорюють гумовою пробкою та алюмінієвим ковпачком під обкатку з кришкою-крапельницею. 2 UA 119965 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Краплі, які отримані за технологією без застосування ЛЗР, це стандартизована, стерильна рідина полівалентної фармакологічної активності, стабільна в процесі зберігання при різних температурних режимах (від 0 °C - до 25 °C) і відповідає всім вимогам ДФУ та GMP. Також краплі по всіх параметрах економічно і з точки зору пожежної безпеки більш доцільні в порівнянні з раніше існуючими. Приклад 1. Мікробіологічні дослідження очних крапель. Для дослідження антибактеріальної активності досліджуваного препарату – очних крапель було використано 4 тест-зразки. Відповідно до рекомендацій ВООЗ для оцінки активності досліджуваного препарату використовували тест-штами Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Basillus subtilis АТСС 6633, Proteus vulgaris ATCC 4636, Candida albicans ATCC 885/653. Приготування мікробної суспензії мікроорганізмів проводили з використанням приладу Densi-La-Meter (виробництва PLIVA-Lachema, Чехія; довжина хвилі 540 нм). Суспензію готували відповідно до інструкції, яка додається до приладу і інформаційного листа про нововведення в системі охорони здоров'я № 163-2006 "Стандартизація приготування мікробних суспензій", м. Київ. Синхронізацію культур проводили з використанням низької 7 температури (4 °C). Мікробне навантаження становило 10 мікробних клітин на 1 мл середовища і встановлювалося за стандартом McFarland. У роботу брали 18-24 годинну культуру мікроорганізмів. Для досліджень використовували агар Мюллера-Хінтона (Дагестанський НВО "Живильні середовища", термін придатності середовища до XI 2014 р). Метод дифузії препарату в агар проводили "колодязями". Визначення активності антибактеріальних препаратів проводили на двох шарах щільного поживного середовища, розлитого в чашки Петрі. У нижньому шарі використовували "голодні" не засіяні середовища (агар-агар, воду, солі). Нижній шар являє собою підкладку висотою 10 мм, на яку строго горизонтально встановлювали 3-6 тонкостінних циліндри із нержавіючої сталі діаметром 8 мм і висотою 10 мм. Навколо циліндрів заливали верхній шар, що складається з живильного агаризованого середовища, розплавленого і охолодженого до 40 °C, в яку вносили відповідний стандарт добової культури тест-мікроба. Попередньо, верхній шар добре перемішували до утворення однорідної маси. Після застигання циліндри стерильним пінцетом витягували, і у лунки, що утворилися, поміщали випробувану речовину з урахуванням його об'єму (0,3 мл). Об'єм середовища для верхнього шару коливався від 14 до 16 мл. Чашки підсушували протягом 30-40 хв. при кімнатній температурі і ставили в термостат на 18-24 години. Дані результатів дослідження антибактеріальної активності досліджуваних зразків представлені в таблиці 1. Як показують дані таблиці 1, усі зразки проявляли антибактеріальні властивості відносно мікроорганізмів роду Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922 і Basillus subtilis АТСС 6633, та слабку активність щодо мікроорганізмів роду Candida aibicans АТСС 653/885. Для проведення випробувань препарату на мікробіологічну чистоту використовували тіогліколеве напіврідке середовище, рідке середовище Сабуро, тверді поживні середовища: живильний агар, середовище Сабуро і по можливості, середовище Чистовича, кров'яний агар на основі живильного агару, середовище Ендо. Таблиця 1 Антибактеріальна активність досліджуваних зразків Мікроорганізми Staphylococcus aureus АТСС 25923 Escherichia coli АТСС 25922 Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 Proteus vulgaris АТСС 4636 Basillus subtilis ATCC 6633 Candida aibicans ATCC 653/885 Діаметри зон затримки росту у мм, число повторів досліду n=3 Зразок 1 Зразок 2 Зразок 3 Зразок 4 15, 16, 15 16, 17, 16 16, 15, 15 15, 16, 16 15, 14, 14 13, 14, 14 13, 13,14 13, 15, 14 ріст ріст ріст ріст ріст 17, 17, 16 ріст 16, 15, 16 ріст 15, 15, 16 ріст 14, 15, 16 12, 13, 13 13, 13,13 14, 13, 14 13, 14, 13 3 UA 119965 U 5 10 Середовища готували відповідно до вимог виробника (кількість порошку на літр, pH середовища, умови автоклавування та ін.). Кожна серія середовища (Дагестанський НВО "Живильні середовища", термін придатності середовища до XI 2014 р), яка використовувалася в експерименті, перевірялася на ростові якості відповідно до нормативних документів. Перед проведенням дослідження на мікробіологічну чистоту проводили випробування на відповідність ростових властивостей живильних середовищ. Живильні середовища інокуювали 2 невеликою кількістю відповідними тест-штамами мікроорганізмів (10-10 ) колонієутворюючих одиниць на мл середовища – КУО/мл). На середовище Сабуро засівали дріжджоподібні гриби роду Candida. На живильний агар – Pseudomonas aeruginosa і Bacillus subtilis, на Чистовича – Staphylococcus aureus, на середовище Ендо – Escherichia coli. Тіоглеколеве середовище витримували в термостаті при температурі 35 °C три доби. Дані представлені в таблиці 2. Таблица 2 Ростові властивості поживних середовищ Тест-штами Staphylococcus aureus АТСС 6538 Escherichia coli АТСС 25922 Bacillus subtilis АТСС 6633 Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 Candida albicans АТСС 885/653 Поживні середовища Чистовича Ендо Умови культивування Тривалість Температура культивування 35 °C, 24-72 години 35 °C, Поживне середовище 35 °C, Поживне середовище 35 °C, Середовище 25 °C, Сабуро Тіогліколеве середовище для 35 °C, Х контролю стерильності Примітка: Х – мікроорганізми не засіювали 15 20 24-72 години 24-72 години Висновок Морфологія колоній та клітин є типовою Морфологія колоній та клітин є типовою Морфологія колоній та клітин є типовою 24-72 години Морфологія колоній та клітин є типовою 24-120 години Морфологія колоній та клітин є типовою 24-72 години Ріст мікроорганізмів відсутній Дані таблиці 2 вказують на те, що усі культури мікроорганізмів відповідали таксономічному позначенню штаму, а морфологія колоній при культивуванні на середовищах і морфологія клітин при мікроскопії була типовою. Тіогліколеве середовище відповідало вимогам на стерильність – зростання мікроорганізмів було відсутнім, середовище залишалось прозорим. Випробування на мікробіологічну чистоту проводили методом прямого посіву на рідкі поживні середовища. Розливали в стерильні пробірки тіогліколеве середовище і рідке середовище Сабуро по 10,0 мл. У кожну з пробірок вносили по 1 мл (1 г) випробуваного препарату. Посіви інкубували протягом 14 днів на тіогліколеве середовище в термостаті при температурі 35 °C, посіви на рідкому середовищі Сабуро при температурі 25 °C. Нейтралізацію антибактеріальних властивостей досліджуваних зразків проводили інактиватором, який включає полісорбат-80 (30 г/л) і лецитин (3 г/л). Дані представлені в таблиці 3. 25 Таблиця 3 Випробування тест-зразків на мікробіологічну чистоту Зразки 1 2 3 4 Середовища та умови культивування Тіогліколеве середовище 14 днів при Рідке середовище Сабуро 14 днів 35 °C при 25 °C Ріст мікроорганізмів Ріст грибів відсутній Ріст мікроорганізмів Ріст грибів відсутній Ріст мікроорганізмів Ріст грибів відсутній Ріст мікроорганізмів Ріст грибів відсутній 4 UA 119965 U 5 10 Як показують дані таблиці 3, після 14 днів інкубації при культивуванні на середовищі Сабуро ріст грибів був відсутнім. На тіогліколевому середовищі при культивуванні зразків препарату реєструвалось зростання мікроорганізмів. Мікроскопія показала наявність грампозитивної спорової палички. Підтвердження було отримано шляхом посіву на диференціальні, поживні середовища. Дані представлені в таблиці 4. Як показують дані таблиці 4, за морфологією колоній та деякими біологічними властивостями, виділені мікроорганізми належать до роду Bacillus Subtillis. На диференціальних середовищах (середовищі Чистовича і середовищі Ендо) за виділенням представників кишкової групи і патогенних стафілококків росту серед інших видів мікроорганізмів не спостерігалося. При дослідженні методом глибокого посіву, який полягав у тому, що препарат додавали у кількості 1,0 г в агар і до поверхневого посіву (1 г) ГС – на агар визначали кількість життєздатних клітин мікроорганізмів і грибів. Дослідження глибокого і поверхневого посіву препарату на чашках Сабуро показали відсутність росту грибів. При культивуванні на живильному агарі був відзначений ріст мікроорганізмів. 15 Таблиця 4 Ідентифікація мікроорганізмів, що виросли на тіогліколевому середовищі Ріст мікроорганізмів на поживних середовищах Ендо Кров'яний агар Сабуро Поживний агар Сухі сірі колонії, з Сухі сірі колонії, з нерівними краями 1 Х Х Х нерівними краями шорсткі, не блискучі, шорсткі, не блискучі гемоліз Сухі сірі колонії, з Сухі сірі колонії, з нерівними краями 2 Х Х Х нерівними краями шорсткі, не блискучі, шорсткі, не блискучі гемоліз Сухі сірі колонії, з Сухі сірі колонії, з нерівними краями 3 Х Х нерівними краями шорсткі, не блискучі, шорсткі, не блискучі гемоліз Сухі сірі колонії, з Сухі сірі колонії, з нерівними краями 4 Х Х нерівними краями шорсткі, не блискучі, шорсткі, не блискучі гемоліз Примітка: Х - ріст мікроорганізмів відсутній. Зразки Чистовича Дані результатів досліджень представлені в табл. 5. Таблиця 5 Дослідження на мікробіологічну чистоту Зразки 1 2 3 4 Кількість мікроорганізмів за десятичним логарифмом ступеня росту при культивуванні на твердих поживних середовищах Метод глибокого посіву Метод поверхневого посіву 1 г препарату (×10) 1 г препарату (×10) Поживний агар Сабуро 25 °C п'ять Поживний агар Сабуро 25 °C п'ять 35 °C 3 діб діб 35 °C 3 діб діб Ріст грибів Ріст грибів 1,7±0,4 1,9±0,8 відсутній відсутній Ріст грибів Ріст грибів 1,8±0,7 1,7±0,5 відсутній відсутній Ріст грибів Ріст грибів 1,5±0,4 1,6±0,4 відсутній відсутній Ріст грибів Ріст грибів 1,7±0,7 1,8±0,7 відсутній відсутній 5 UA 119965 U Як показують дані таблиці 5, ріст грибів був відсутнім при дослідженні усіх 4-х зразків. 3 Кількість мікроорганізмів, що виросли на 1 г препарату не перевищувала 10 КУО/мл, що відповідає вимогам Державної фармакопеї України. 5 Таблиця 6 Ефективність водної витяжки прополісу (водна витяжка) Експозиція Вимоги ДФУ Число мікроорганізмів Число Число Candida бактерій грибів Staphylococcus Pseudomonas albicans V КУО/мл КУО/мл aureus АТСС aeruginosa АТСС Lg Lg 6538 АТСС 9027 885/653 зменшення зменшення 5 5 5 Мікробне 3,5×10 4,5×10 2,2×10 6 6 10 10 навантаження (5,54) (5,66) (5,34) 4 4 4 Первинний 5,3×10 5,2×10 4,9×10 посів Lg (0,82) (0,95) (0,65) 3 3 3 3,1×10 2,3×10 1,5×10 6 годин 2 (2,05) (2,3) (1,17) 2 2 2 0,7×10 1,8×10 2,4×10 24 години 3 (3,7) (3,41) (2,96) 2 2 7 діб НВ 0,2×10 1,1×10 2 0,4×10 14 діб 2 НВ НВ (3,74) 28 діб НЗ НУ НВ НВ НВ *НУ – мікроорганізми не збільшуються; *НВ – мікроорганизми або гриби не виділяються. 10 15 20 25 30 35 Aspergillus niger А ТСС 16404 5 2,5×10 (5,39) 4 5,1×10 (0,69) 4 1,2×10 (1,31) 3 1,5×10 (2,22) 2 0,3×10 2 0,3×10 (3,95) НВ Критерієм оцінки антибактеріальної ефективності консервантів було зменшення числа життєздатних колоній клітин мікроорганізмів за певний період після контамінації. У відповідності з вимогами ДФУ в препаратах – для місцевого застосування логарифм зменшення числа життєздатних колоній бактерій через 6 годин повинен становити не менше 2х, через 24 години – не менше 3-х, у подальшому число життєздатних клітин бактерій не повинно збільшуватися. Логарифми зменшення числа життєздатних клітин грибів за 7 діб має становити не менше 2-х. Ці показники відповідають критерію "А". Відповідно до критерію "В" в препаратах для внутрішньом'язового застосування логарифм кількості життєздатних колоній за 24 доби повинен становити не менше 1-го, в подальшому число життєздатних колоній не повинен збільшуватися. Логарифм зменшення числа життєздатних грибів за 14 діб повинен становити не менше 1 і в подальшому не збільшуватися. Після контамінації мікроорганізмами препарат через певні проміжки часу висівали на агар для визначення числа життєздатних клітин. Відсутність зростання на агарі або не збільшення кількості колоній після 14 днів інкубації вказували на те, що препарат відповідає вимогам ДФУ. Наявність життєздатних клітин мікроорганізмів і грибів на 14 добу дослідження вказують, що препарат не відповідає критеріям "А" або "В" і не відповідає вимогам ДФУ. Як показують дані таблиці 6, після 14-ї доби культивування логарифм числа життєздатних клітин грибів становив 3,74 і 3,95. Клітини Candida albicans АТСС 885/653 і Aspergillus niger АТСС 16404 не виділяються після 28-ї доби культивування. Після 2-х діб культивування логарифм числа колоній мікроорганізмів становив для Staphylococcus aureus АТСС 6538 – 2,05 і Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 – 2,3. На 7-у добу відповідно 3,7 і 3,41. На 14-ту і 28-ту добу інкубації мікроорганізми не реєструвалися. Дослідження даного зразка показали, що він відповідає критерію "А" згідно з вимогами ДФУ. Приклад 2. Вивчення гострої токсичності очних крапель на мишах Гостру токсичність тест-зразка (ТЗ) − очних крапель "Прополіс", вивчали при нашкірному нанесенні та внутрішньоочеревинному введенні. Перед введенням ТЗ мишей позбавляли корму на 4 год. Очні краплі вводили у максимальній дозі VI класу токсичності: внутрішньочеревинно − у дозі 3,1 мл/кг, при нанесенні на шкіру – у дозі 22,6 мл/кг. Доступ тварин до води був вільним, до їжі їх 6 UA 119965 U 5 10 15 допускали лише через 2 години після введення ТЗ. Перед нанесенням ТЗ на шкіру у тварин вистригали ножицями шерсть площею 2×3 см. За тваринами спостерігали протягом 2 тижнів, що дає можливість оцінити токсичну дію речовини на організм експериментальних тварин, як безпосередньо після введення, так й визначити віддалені наслідки передозування. Оцінювали загальний стан тварин (зовнішній вигляд, дихання, слиновиділення, процеси сечовипускання та дефекації). Досліджували динаміку маси тіла, яку визначали на 0 добу (вихідні дані), 3, 7 і 14 добу спостереження. По закінченні тварин виводили з експерименту, проводили макроскопічний огляд внутрішніх органів тварин, зважували їх та розраховували коефіцієнти маси органів (КМ). Як показали проведені дослідження за внутрішньоочеревинного введення ТЗ у дозі 3,1 мл/кг та нашкірного нанесення у дозі 22,6 мл/кг ознак інтоксикації у піддослідних тварин не спостерігали (табл. 7). Тварини всіх експериментальних груп були активними, охайними, мали задовільний апетит, нормально реагували на звукові та світлові подразники, процеси сечовиділення і дефекації були у нормі, порушення дихання та судом не спостерігали. Таблиця 7 Летальність мишей при одноразовому застосуванні досліджуваних речовин, n=6 Групи тварин Доза, мл/кг Шлях введення негативний контроль – Очні краплі 3,1 Внутрішньоочеревинний Очні краплі 22,6 нашкірний Примітка. n – кількість тварин у кожній групі. 20 25 кількість загиблих тварин/загальна кількість тварин у групі – 0/6 0/6 У всіх дослідних тварин шерстний покрив був у нормі. До води та їжі підходили охоче. За фізіологічним станом дослідні тварини не відрізнялися від контрольних. Слизова оболонка ротової порожнини, язик звичайного вигляду. Слизова оболонка природних отворів нормального кольору, виділення відсутні. Регіональні лімфовузли не збільшені. Летальні випадки були відсутні. Результати визначення динаміки маси тіла тварин наведені в таблиці 8. Дані наведені у таблиці 8 свідчать, що в усіх дослідних групах, яким вводили або наносили ТЗ, відбувався позитивний приріст маси тіла. Цей показник не виходив за межі значень групи тварин НК. Таблиця 8 Вплив ТЗ на динаміку маси тіла (г) мишей, n=6 (M±m) Групи тварин Шлях введення Вихідні дані негативний – 22,99±0,76 контроль Очні краплі внутрішньоочеревинний 23,38±1,14 Очні краплі нашкірний 23,49±0,75 Примітка. n – кількість тварин у кожній групі. 30 35 3 доба 7 доба 14 доба 24,27±1,29 25,55±2,54 26,19±2,60 24,62±1,09 25,55±0,87 25,85±1,73 27,61±1,78 26,25±1,67 28,26±1,85 По закінченні терміну спостереження, на 15 добу проводили розтин тварин, яким вводили ТЗ внутрішньоочеревинно. Макроскопічне дослідження при розтині показало, що однократне введення досліджуваного зразка у надмірній дозі не викликало видимих змін органів. Внутрішні органи грудної порожнини були без видимих ознак патологічних змін: серце звичайної конфігурації та нормального розміру, легені блідо-рожеві, без спайок між листками плеври, заповнювали всю плевральну порожнину. Загрудинні лімфовузли не збільшені. В очеревинній порожнині розміщення органів анатомічно правильне, стороннього вмісту не знайдено. Печінка рівномірно червоно-коричневого кольору, капсула не напружена, бічний край часток не заокруглено. Підшлункова залоза блідо-рожево-жовтого кольору, схожа на жирову тканину, без ознак склерозу, жирових некрозів. Селезінка пружна, повнокровна, червоно 7 UA 119965 U вишневого кольору. Капсула нирок легко знімається, на розрізі органу простежуються щільні, зі збереженням рисунку шари. Наднирники без особливостей. Заочеревинні лімфовузли не збільшені. Слизова оболонка залозистого відділу шлунка з характерним рельєфом складок, нормального кольору, без геморагій, набряку та ерозивних ушкоджень. 5 Таблиця 9 Вплив ТЗ на КМ внутрішніх органів (%) мишей самок, яким внутрішньоочеревинно вводили ТЗ у дозі 3,1 мл/кг, n=6, М (Min?Max) Коефіцієнти маси внутрішніх органів, % печінки нирок серця легенів селезінки негативний 4,85 (4,80; 1,50 (1,21; 0,56 1,47 (0,85; 0,55 контроль 4,89) 1,75) (0,48; 0,72) 1,86) (0,39; 0,78) 4,75 1,39 0,52 1,43 0,56 (0,41; Очні краплі (4,47; 5,19) (1,22; 1,87) (0,49; 0,60) (0,99; 1,73) 0,73) Примітка. n – кількість тварин у кожній групі. Групи тварин 10 15 тимусу 0,47 (0,26; 0,59) 0,50 (0,48; 0,51) Результати розрахунку коефіцієнтів маси внутрішніх органів наведені у таблиці 9. Відповідно до отриманих даних, за внутрішньоочеревинного введення ТЗ коефіцієнти маси внутрішніх органів статистично значуще не відрізнялися від значень тварин з групи інтактного контролю, що свідчить про відсутність токсичного впливу досліджуваного ТЗ на загальнотрофічні процеси організму дослідних мишей. Отже, одержані результати показали, що нашкірне нанесення та внутрішньоочеревинне введення досліджуваного ТЗ у надмірних дозах не призводить до загибелі тварин. Отже, відповідно до класифікації речовин за токсичністю очні краплі належать до VI класу токсичності – відносно нешкідливі речовини (табл. 10). Таблиця 10 Ступінь токсичності очних крапель Групи тварин Очні краплі 20 25 30 35 Шлях введення Внутрішньоочеревинний нашкірний Вид/стать тварин ЛД50, мл/кг Миші-самки 3,1 22,6 Клас токсичності Відносно нешкідливі речовини Приклад 3. Дослідження місцевоподразнювальної дії очних крапель при одноразовому нанесенні Дослідження гострої подразнювальної дії досліджуваних крапель на очі проводили на безпородних білих кролях самцях та самицях з масою тіла 2,0-2,5 кг. Загалом було використано 6 тварин. за одну годину до початку інсталяції досліджуваної речовини проводили огляд обох очей дослідних тварин. Досліджувану речовину закапували в око в об'ємі 0,01 мл прямо на оболонку ока тварини. Очі трьох тварин після інсталяції досліджуваного засобу не промивалися, у інших 3 кролів через 20 сек. після інсталяції очі зрошувалися протягом 1 хвилини водою кімнатної температури. Спостереження за станом очей тварин проводили одразу після інсталяції та через 1, 24, 48 та 72 години. У процесі дослідження реєстрували стан ділянки навколо очей, повіки, кон'юнктиву, рогову та райдужну оболонки кожної тварини у вищенаведені терміни. Ступінь виявлених реакцій оцінювали згідно зі шкалою. Інше око кожної тварини слугувало власним контролем. Як показало проведене дослідження, інсталяція очних крапель на око кролів не призводить до місцевоподразнювальної дії. Проте, одразу після інсталяції у тварин спостерігали занепокоєння, прояви дискомфорту, легке почервоніння слизової оболонки ока (спостерігали гіперемію у деяких кров'яних судинах), які швидко зникали (табл. 11). Надмірного збудження, що може вказувати на викликане досліджуваним засобом подразнення, не спостерігали. 8 UA 119965 U Таблиця 11 Реакція рогової та райдужної оболонки ока кролів на однократну інсталяцію ТЗ, бали Групи тварин Очні краплі Очні краплі (зрошування) 5 0 год. 0 0 Термін дослідження 1 год. 24 год. 48 год. 0 0 0 0 0 72 год. 0 0 0 У подальші терміни спостереження ознаки подразнювальної дії очних крапель були відсутні: деталі райдужної оболонки чітко видимі, хемоз, почервоніння слизової оболонки ока та виділення відсутні (табл. 12). Таблиця 12 Реакція слизової оболонки ока кролів на однократну інсталяцію ТЗ, бали Групи тварин Очні краплі Очні краплі (зрошування) 10 15 20 25 30 35 0 год. 1 0 Термін дослідження 1 год. 24 год. 48 год. 0 0 0 0 0 0 72 год. 0 0 Таким чином, результати проведеного дослідження свідчать про відсутність у очних краплях місцевоподразнювальної дії. Приклад 4. Дослідження протизапальної дії очних крапель на моделі гострого термічного запалення у мишей Для визначення протизапальної активності крапель застосовували зручну та легковідтворювальну модель гострого термічного запалення у мишей. Досліди проведені на 18 мишах самцях, масою 18-22 г. Гостре термічне запалення викликали зануренням лапи тварини у гарячу воду (температура 66,5 С) на 4 сек. Досліджуваний ТЗ наносили на пошкоджену лапу одразу після опіку у дозі 0,2 мл./тварину. Дозу ТЗ підбирали емпіричним шляхом таким чином, щоб забезпечити оптимальне зрошування лапи тварини. Через 3 години нанесення ТЗ повторювали. На другу добу тварин виводили з експерименту передозуванням інгаляційного наркозу. На рівні гомілковостопного суглоба відрізали обидві лапи, зважували їх на електронних вагах. Для кожної тварини окремо підраховували різницю між масами пошкодженої і непошкодженої лап (D). Як препарат порівняння використовували відомий засіб "Пантенол", виробництва ПАТ "Фармаком", м. Харків, який застосовували у аналогічному режимі. Протизапальну активність досліджуваних засобів розраховували за формулою (1): де Dд. – різниця між масами пошкодженої і непошкодженої лап у дослідній групі; Dк. – різниця між масами пошкодженої і непошкодженої лап у контрольній групі. Статистичний аналіз отриманих результатів проводили методами варіаційної статистики. Дані представляли у вигляді середнього та мінімального та максимального значень (М (min; max). Відмінності між групами вважали статистично значущими при р