Спосіб діагностики та прогнозування хронічних захворювань слинних залоз

' І 'А " " Є / Ь С ' """" Y,^_ iC МІЖ6 А61В 1(WO G01N3y48 СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ ТА ПРОГНОЗУВАННЯ ХРОНІЧНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ СЛИННИХ ЗАЛОЗ Винахід відноситься до медицини, а саме до стоматології і може бути використований для діагностики та прогнозування хронічних захворювань слинних залоз (калькулезного, паренхиматозного, інтерстиційного сиалоаденітів та синдромів з ураженням слинних залоз). Відомий спосіб діагностики захворювань слинних залоз шляхом проведення імунофлюоресцентного аналізу при якому визначаються фактори неспецифічної імунорезистентності (Г.И.Ронь, М.П.Безуглов, Т.Е.Кукушкина, Сравнительная характеристика факторов неспецифической резистентности при хроническом паренхиматозном паротите и синдроме Шегрена. Стоматология. 1985.Т.64. №1, с.37-39). Для визначення основних показників неспецифічної резистентности у пацієнта беруть кров з ліктьової вени та відділяють сироватку. Загальний титр комплемента визначають по 50% гемолізу, лізоцимну та фагоцитарну активність лейкоцитів - за допомогою тесту з використанням нітросинього тетразолю (НБТ-тест), що характеризує окисну функцію лейкоцитів.Визначають показники основних класів імуноглобулінів методом радиальної дифузї у гелі з використанням моноспаецифічних сироваток. 2 До причин, що перешкоджають отриманню очикуваного результату, слід віднести складність методу, малу доступність, отримані результати не є специфічними для хвороб слинних залоз і можуть змінюватися аналогічно при будь-якій патології, що зв'язана з порушенням імунорезистентності. Відомий спосіб диагностики захворювань слинних залоз, шляхом проведення сцинтіграфії залозна гама камері з використанням радіофармприпарату (РФП) Технецій 99 М у формі пертехнетату. (А.Н.Доцєнко, Л.А.Юдін. Сцинтиграфия в диагностике заболеваний слюнних желез. Медицинская радиология -1991-№3-с.8-1). Методика сцинтиграфії полягає у виконанніц серії сцинтограм у прямій та боковій проекціях на протязі 25-30 хвилин після внутрішньовенного вливання РФП до набору 100 тисяч імпульсів та безперервно після прийому стимулятора слиновиділення у прямій проекції до виявлення найбільшої конценгтрації РФП у слинних залозах після навантаження. По отриманим сцинтиграмам визначають функційну активність слинної паренхими. евакуаторну здатність залози, концентраційну та анатомічнотопографічну характеристику залоз. Цьому способу радіонуклеідної діагностики, властиві слідуючи недоліки пацієнти тривалий час опромінюються, безпосередньо в організм хворого надходять радіоаційний препарат, що тривалий час реадсорбується в тканинах залоз та спричиняє загальний та місцевий ушкоджувальні ефекти. Спосіб не стандартизований, недостатньо розроблена семіотика захворювань, не з відображає загального стану пацієнта, не встановлює чинника хвороби, не дає можливості передчасно виявити хворобу та призначити лікувальні заходи. Найбільш близким до способу, що заявляється, є спосіб діагностики захворювань слинних залоз шляхом морфологічного дослідження біоптатів малих слинних залоз (В.В.Афанасьев, В.И.Виноградов. Морфологическая характеристика малых слюнных желез больных с различными формами хронического паротита и синдрома Шегрена. Стоматология, 1986, №6, с.69-71). Біопсію малої слинної залози проводять за загальноприйнятою методикою. шляхом операції видалення малої слинної залози з внутрішньої поверхні нижньої губи. Біоптати фіксують у 10% розчині нейтрального формаліну, зрізи фарбують гемотоксилинеозином по Ван-Гизону проводять PAS-реакцію. З кожного органу роблять від 4 до 6 зрізів на різному рівні. По характерним змінам у будові досліджувальної тканини роблять висновок про ту чи іншу ваду слинної залози. Однак, перешкоджають отриманню очикуваного результату часті відмови пацієнтів від операції біопсії, сама операція супроводжується введенням знеболюючих препаратів, стресом, необхідністю знімати шви. Цей спосіб не вказує причини виникнення хвороби, не дає можливості ранньої діагностики. В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу діагностики та прогнозування хронічних захворювань слинних залоз шляхом зміни обробки матеріалу біопсії та зміни характеру показників, що визначаються в матеріалі біопсії малої слинної залози, що забезпечує 4 можливість визначення специфічного чинника хвороби на ранній стадії, підвищується діагностична цінність способу, досягається можливість виділення групи ризику призначення патогенетичного лікування. Поставлена задача вирішується тим, що у способі діагностики хронічних захворювань слинних залоз шляхом вивчення біоптатів малих слинних залоз, згідно з винахідом проводять виявлення ділянки ДНК цитомегаловірусу (ЦМВ) шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ШІР). Визначення ділянки ДНК ЦМВ, шляхом ПЛР дає змогу діагнозувати ретровірусну інфекцію. Вірус цитомегалії відноситься до опуртоністичної, персистуючої інфекції. В період клінічної маніфестації його можливо виявити в крові та інших біологічних речовинах. Під час ремісії та без клінічного перебігу ЦМВ вірогідно знайти в тканинах до яких він тропний, тобто в слинних залозах. Безумовно ЦМВ є індуктором аутоімунної патології і спричиняє певні зміни в імунорезистентності та місцевих тканинах. Виникають хронічні запальні та дістрофічні захворювання слинних залоз. З подальшим існуванням персистуючої інфекції, стає більш об'ємним аутоімунне захворювання з ураженням інших органів та систем. Цим можливо пояснити існування синдромів з ураженням слинних залоз. Розвитком імунодефіциту. Наявність ділянок ДНК ЦМВ у хворих на слинні залози підтверджує існування його як чинника хвороби. Визначення ділянки ДНК ЦМВ методом ШІР забезпечує специфічність способу діагностики, надає можливість виявлення хронічних захворювань 5 слинних залоз на ранніх стадіях, що дозволяє підвищити точність діагностики, прогнозувати захворювання та призначати патогенетичне лікування. Спосіб діагностики та прогнозування хронічних захворювань слинних залоз здійснюють таким чином. Загальновідомим методом проводиться ексцизійна біопсія малої слинної залози на внутрішній поверхні нижньої губи. Матеріал переносять у стерильну поліпропіленову пробірку (1.5 мкл) типа "Eppendorf1 зі 100 мкл стерильного фізіологічного розчину. Виділяють ДНК з допомогою стандартного набору реактивів "Цитопол". (НПФ "ЛИТЕХ" НИИ физико-химической медицины МЗ РФ Москва). Метода виділення грунтується на лізуванні біопроби розчином гуанідину, сорбції ДНК на сорбенті, багатьох відмивках та реадсорбції ДНК . Після отримання ДНК проводиться дитекція ділянки ДНК ЦМВ шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ШТР). Остання полягає в тому, що багато разів повторюють цикл синтезу (ампліфікації) специфічної ділянки ДНКмішені в присутності термостабільної дизоксинуклеотидтрифосфатів, відповідного ДНК сільового полімерази, буферу та олігонуклеотидних затравок-праймерів, що визначають кордон ампліфікованої ділянки. Кожен цикл складається з трьох стадій різного температурного режиму. На 1-й стадії, при t 94 С, розділяються ланцюги ДНК . На 2-й стадії при t 56-58 С приєднуються (обпікаються) праймери в комплементних послідовностях до ДНК - мішені. На 3-й стадії, при t 72 С проходить синтез нових ланцюгів ДІЖ шляхом добудови ланцюгів праймерів у напрямку 5 - 3. В 6 кожному циклі подвоюється кількість копій ампліфікованної ділянки, що дозволяє за 25-40 циклів утворити ділянку ДНК , що обмежена парою вибраних праймерів, в кількості достатній для детекції горизонтальним електрофорезом. Ділянки аналізованої ДНК проявляються у вигляді рожево-червоних смуг, що світяться при опроміненні УФ-променем з длиною хвилі 310 нм. В позитивному контрольному зразку для ЦМВ смуга розміром 218 нуклеідних пар. В негативному контрольному зразку-смуга, що відповідає ділянкам геному віруса повинна бути відсутньою. В пробах, що аналізуються відсутністю смуги на рівні відповідного контролю . свідчить про відсутність вірусу в пробі. Наявність смуги, що відповідає електрофоретичній рухливості позитивному контролю, свідчить про наявність ЦМВ. Отримані результати документують фотографуванням гелю з використанням рожевого чи інтерфереційного (594 нм) фільтру. Чутливість аналізу набору "Цитопол" дозволяє детектувати до 10 г ДНК ЦМВ. Приклад 1. Хворий К. 10 р. Поступив у клініку з скаргами на болючий набряк навколо вуха та під нижньою щелепою праворуч, слабкість. Зі слів матері подібний стан син переносить щорічно, 1-2 рази, на протязі 4 років, після перенесеного епідемічного паротиту . Лікування у фахівців давало тимчасовий ефект. Останнє загострення пов'язують з переохолодженням. При загальному огляді хлопчик середнього зросту, підвищеного харчування, розумово розвинений згідно з віком. Шкіра та опорно-рушійний апарат без видимої патології. Місцево: Асиметрія обличчя внаслідок набряка ві навколовушній та піднижньощелепній ділянках , шкіра над набряком не змінена. Пальпаторно визначено болісне, щильно-бугристе збільшення правої навколовушної слинної залози та ледь болісне, щільне збільшення правої піднижньощелепної залози. Рухи нижньої щелепи вільні. В ротовій порожнині слизова оболонка червона, набрякша, її вологість зменшена. При зовнішньому масуванні з протоку навколовушної залози - крапля густої непрозорої слини з домішками гною. При масуванні піднижньощелепної залози -секрет не виділяється. За даними сіалометрії кількість слини зменшена. Дані лабораторних досліджень вказують на підвищення ШОЕ, здвиг лейкоцитарної формули вліво. Імунологічне дослідження вказує на пригнічення клітинного ланцюга та високий рівень сенсибілізації. Дані імуноферментативного аналізу до визначення аутоантитіл до вірусів : ЦМВ - позитивно, вірусу паратиту - негативно. Дані дослідження малої слинної залози на присутність ЦМВ свідчать про наявність вірусу. Діагноз: Загострення хронічного правостороннього паренхіматозного сіалоаденіту. Хронічна цитомегаловірусна інфекція. 8 Пацієнта взято на диспансерний облік, призначені обстеження внутрішніх органів та консультації фахівців, призначена патогенетична терапія. Приклад 2. Хвора JL, 55р., звернулась в клініку зі скаргами на збільшення слинних залоз, болісні відчуття, сухість ротової порожнини, біль в очах. З анамнезу страждає багатьма хворобами близька 20 років, лікується у різних фахівців, в дитинстві хворіла епідемічним паротитом, страждає цукровим діабетом, тіреоідитом, панкреатитом, ревматоїдним артритом, гіпертонічною хворобою, залози турбують останні 5 років. При зовнішньому огляді: середнього зросту, завищеного харчування, шкіра бліда, суха, деформація дрібних суглобів на верхніх та нижніх кінцівках. Місцево: Конфігурація обличчя порушена за рахунок збільшення навколовушних та піднижньощелепних ділянок. Колір шкіри не змінений, пальпаторно - збільшення та ущільнення , слабка болісність навколовушних, піднижньощелепних, слинних залоз, більше ліворуч. При рухах нижньої щелепи, "тріск" в скронево-нижнещелепних суглобах. В ротовій порожнині слизова оболонка вкрита білісим нальотом, зволоження знижене, зменшена кількість функціонуючих малих слинних залоз. Багаточисельний карієс, пародонтоз. При зовнішньому масуванні слинних залоз, з протоків - густа непрозора слина. За даними сіалометрії знижена кількість слини. За даними проби Ширмера знижена кількість сльози, більше ліворуч. Паралельне 9 обстеження фахівців інших профелів вказує на наявність у хворої гепатопанкреатиту, аутоімунного тіреоідиту, ангіопатії, мексидеми, енцефалопатії, ревматоїдного артриту, гіпертонічної хвороби. Лабораторні дослідження вказують на підвищення ШОЕ, анемію, різке зниження кількості Тхелперів та Т-супресорів, велику кількість ЦІК, зменшення комплемента. При імуноферментативному обстеженні на наявність аутоантитш до вірусів: ЦМВ різко позитивно, ВП - слабо позитивно. Дані ПЛР на присутність ЦМВ у тканинах малої слинної залози підтверджують наявність вірусу. Діагноз: Хронічний сіалозоаденіит. Синдром Шегрена. Хронічна цитомегаловірусна інфекція. Хвору взято на диспансерний облік, призначено патогенетичне лікування. Приклад 3. Хворий С., 35р. звернувся в клініку хірургічної стоматології з скаргами на набряк під нижньою щелепою зліва, біль, набряк зростає під час їжі, слабкість, підвищення температури тіла. З анамнезу: хворіє 4 доби, подібний стан виникав рік тому, пов'язує з переохолодженням, до лікаря звернувся вперше. При зовнішньому огляді: середнього зросту, нормального харчування, контактний, шкіра та опорно-рушійний апарат без видимої патології. Місцево. Асиметрія обличчя через набряк в правій піднижньощелепній ділянці Пальпується збільшена болюча, ущильнена слинна залоза. Рухи нижньої щелепи обмежені. В ротовій порожнині: в лівій підязичній ділянці слизова 10 оболонка червона, набрякша, збільшений під язичний валик. При зовнішньому масуванні залоз, з протоку - гнійний ексудат з домішками густої слини. В даних лабораторного дослідження анеміяблейкоцитарний здвиг ліворуч, лімфоцитопенія, підвищено ШОЕ. На рентгенограмі в залозі тінь конкременту 3-5мм . Діагноз: Слинокам'яна хвороба. Загострення хронічного лівостороннього калькулещного субмандибуліту. Хворому після антибактеріальної терапії проведена операція екстерпації слинної залози, матеріал досліджено на присутність ЦМВ . За даними дослідження - ЦМВ присутній. Приклад 4. Хворий К. 14 p., звернувся в клітку з скаргами на болісний набряк під нижньою щелепою праворуч. Біль в зубі на нижній щелепі праворуч, що зруйнований близько півроку тому, не лікувався, загальну слабкість підвищення температури тіла до 37,4 градусів. З анамнезу хвороби - набряк з'явився близько 2 діб тому, звернувся до лікаря та направлений на госпіталізацію. З анамнезу життя- одна дитина в родині, від 1 вагітності, ріс та розвивався звичайно, після перенесеного ГРВІ в 4 роки, страждає лімфоаденітом шиї. З гениалогічного анамнезу - батько має в анамнезі перенесений епідемічний паротит, мати страждає хронічним пієлонефритом. и Об'єктивно: Загальний стан середньо тяжкий, температура тіла 37.4°С, у свідомості контактний, млявий, адекватний. При огляді видимої загально соматоичної патології не знайдено. Місцево: Асиметрія обличчя через набряк в правій піднижньо-щелепній ділянці, шкіра над набряком червона, в складку береться, пальпація болісна, щільний збільшений до 2,5 см. лимфовузол зпаяний з оточуючими тканинами. Пальпаторно, на задньо-боковій поверхні шиї праворуч пальпується 2 лимфовузли слабоболісні, рухомі, збільшені до 1,5 см., та 1 лимфофвузол таких же розмірів - у правій пахві. При пальпуванні навколовушних залоз виявлено незначне збільшення об'єму останніх, більше зліва, слиновиділення не порушене. Рухи нижньої щелепи злегка обмежені. В ротовій порожнині: 6 зуб зліва зруйнований на дві третини, перкусія болісна, геперемія слизової оболонки альвеолярнго відростка в межах цього зубу. Рентгенологічно відмічено резорбцію кусткової тканини навколо вирхівок корнів 6 зуба. В клінічному аналізі крові спостерігається здвиг лейкоцитарної формули вліво, підвищення ІПОЕ до 15 мм^год. При досліджені крові на аутоантитіл до вірусів паротиту -слабопозитивна реакція, до вірусу цитомегалії - позитивна. За даними ПЛР на ДНК ЦМВ-реакція позитивна. Діагноз: Загострення хронічного периодонтиту 6 нижнього лівого зуба. Гострий одонтогенний піднижньощелепний правостороншй лімфоаденіт. Лімфоаденопатія на фоні хронічної цитомегаловцрусної інфекції. 12 Хворого госпіталізовано, видалено причинний зуб, проведена дезінтоксикаційна та антибактеріальна терапії. Призначена патогенетича терапія. Хворого взято на диспансерний облік по хронічній цитомегаловірусній інфекції та до групи ризику, щодо виникнення хронічних захворювань слинних залоз. Заявленим способом було обстежено 20 хворих на хронічні сіалоаденінти, з них у 12 знайдено вірус цитомегалії, серед них: 1 хворий на кістозне переродження слинної піднижньощелепної залози, 9 хворих на сіалозоаденіти, 2 хворих на слинокам' яну хворобу .Діагностика та прогнозування хронічних захворювань слинних залоз шляхом визначення ділянки ДНК ЦМВ методом полімеразної ланцюгової реакції, дає змогу виявити чинник хвороби на доклінічному етапі хвороби, провести диференційну діагностику, вилучити групу ризику, запобігти поширенню інфекції, призначити патогенетичне лікування.