Кон’югат між модифікованим суперантигеном і направленою до мішені сполукою

Суперантигены в основном являются белками вирусной или бактериальной природы и способны к одновременному связыванию с антигенами МНС класса II клеток млекопитающего и Vb цепью рецептора Т клетки. Связывание приводит к активации Т-лимфоцитов и лизису клеток, проявляющих МНС класса II. Умеренная степень полиморфизма связывающей части Vb цепи приводит к активации относительно большой части Т-лимфоцитов при контакте с суперантигеном (по сравнению с активацией посредством обычного процессинга антигена). Первоначально понятие суперантигена было связано с различными стафилококковыми энтеротоксинами (SEA, SЕВ, SЕС1, SЕС2 и SEE). Недавно был открыт новый стафилококковый энтеротоксин, названный SЕН (Keyonog et al., J.Exp. Med. 180 (1994) 1675-1683). С ростом интереса были открыты дальнейшие суперантигены. Среди прочих, примерами являются Токсин 1 синдрома токсического шока (ТСТШ-1-TSST-1), отслаивающие (экзофолиирующие) токсины (Exft), которые связаны с синдромом шелушения кожи, стрептококковый пирогенный экзотоксин А, В и С (СПЭ А, В и С), белки вируса опухоли молочной железы мыши (ВОМЖМ-MMTV), М белки стрептококков, энтеротоксин Клостридиума перфрингенс (Clostridia perfringens) (КПЭТ-СРЕТ). В качестве обзора по суперантигенам и их свойствам [см. Kotpin et al., Ad v. Immunol. 54 (1993) 99-166]. В качестве функционального суперантигена рассматривался экзотоксин А Pseudomonas, поскольку имеются данные, свидетельствующие, что данный токсин может быть подвержен внутриклеточной процессии под действием вспомогательных клеток на фрагменты, которые экспрессируются на клеточной поверхности, обладающие способностью связываться с Vb цепью, с последующей активацией Т клеток. [Pseudomonas exotoxin A. Legaord et al., Cell Immunol, 135 (1991) 372-382]. Для терапии различных заболеваний были предложены такие суперантигены с лечебным действием, которое сопровождается активацией иммунной системы [Kalland et al., WO 9104053; Terman et al., WO 9110680; Terman et al., WO 9324136; Newell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (191) 1074-1078]. Совместно с вакцинами было предложено использовать суперантигены, которые мутировали таким образом, чтобы потерять свою TCR связывающую активность [Kарlеr & Маrrасk, WO 9314634]. Мутации суперантигенов были описаны ранее [Kapler & Маrrасk, WO 9314634; Kappler et al, J. Exp. Med. 175 (1992) 387-396; Grossman et ai., J. Immunol. 147 (1991) 3274-3281; Hufnagle et al., Infect. Immun, 59 (1991) 2126-2134]. Ранее нами было предположено использовать для терапии конъюгаты между суперантигеном и антителом для того, чтобы лизировать клетки, которые экспрессируют стр уктуры, относительно которых направлены антитела [Dohlsten еt al., WO 9201470; Lando et al., Cancer Immunol, Immunother. 36 (1993; 223228; Kalland et al., Med. Oncol. Tumor Pharmacother, 10 (1993) 37-47; Zando et al., J.Immunol, 150 (8, часть 2) (1993) 114А (Joint Meeting of the American Association of Immunologists and Clinical Immunology Society, Denver, Colorado, USA, Ma y 21-25 (1993), Lando et al., Proc. Am. Assoc, Cancer Res, Annu. Meet. 33(0) (1992) 339 (Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, San Diego, California, USA, May 20-25 (4992)); Dohlsten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 9287-9291]. Предположительными заболеваниями, предназначенными для лечения являются рак, вирусные инфекции, паразитарные инвазии, аутоиммунные заболевания и другие заболевания, связанные с экспрессией структур на поверхности клеток, специфических для заболевания. Ранее проведенные экспериментальные работы были направлены на конъюгаты, содержащие рекомбинантные SЕА и различные противораковые антитела. Подобные конъюгаты имели несколько сниженную способность связываться с антигеном МНС класса II, сравнимую с таковой у неконъюгированной формы суперантигена. Является ли пониженная способность связывания антигена МНС класса II для достижения оптимального лизиса и оптимального терапевтического эффекта полезной или нет, определено не было. Эксперименты по иммунной терапии с применением SЕВ: химически конъюгированным с опухолевоспецифическим антиидиотипическим антителом были ранее описаны Oсhi et al., (J. Immunol. 151 (1993) 3180-3186). В период проведения расследования приоритета заявки в Шведском патентном бюро, был дополнительно цитирован Buelow et al., (J.Immunol, 148 (1992) 1-6), который описывает слияния между белком А и фрагментами SЕВ, без усиления связывания МНС класса lІ, или использования слияния для уничтожения клеток; и Hartwig et al., (Int. Immunol, 5 (1993) 869-875), который описывает мутацию, влияющую на связывание МНС класса II неслитой формы суперантигена стрептококового эритрогенного токсина А. Первым объектом изобретения является усовершенствование ранее известных конъюгатов суперантиген-антитело в отношении к общей иммунной стимуляции по сравнению с направленной цитотоксичностью. Стимуляция приводит к активации Т-лимфоцитов и зависит от способности суперантигена связываться и с рецептором Т клетки, и с антигеном МНС класса ll. Вторым объектом изобретения является получение конъюгатов между дубликатами с биоспецифическим сродством (например, антителами) и суперантигенами с модифицированным сродством к антигенам МНК класса II. Это, как было теперь показано, улучшает селективность по отношению к суперантиген антитело зависимому цитолизу клетки (SADCC) в клетках, проявляющих антиген (по отношению к которому направлен конъюгат антитела/дубликата биоспецифического сродства) по сравнению с другими клетками, проявляющими антигены МНС класса II. Третьим объектом изобретения является получение конъюгатов, которые могли бы быть использованы в качестве активного начала при лечении млекопитающих, болеющи х раком, аутоиммунными заболеваниями, паразитарными инвазиями, вирусными инфекциями или другими заболеваниями, связанными с клетками, которые экспрессируют на своей поверхности структуры, которые являются специфическими для соответствующего заболевания. Главным аспектом изобретения является конъюгат, включающий а. дубликат с биоспецифическим сродством, который направлен по отношению к структуре, с которой он предназначен связываться в конъюгате, б. пептид, который i. является производным суперантигена, ii. обладает способностью связываться с Vb цепью рецептора Т клети, и iii. обладает модифицированной способностью связываться с антигенами МНС класса II, по сравнению с суперантигеном, производным которого является пептид (дикий тип суперантигена =SA(wt)). Пептид и дубликат по сродству являются ковалентно связанными друг с др угом через мостик (В). Предпочтительные конъюгаты имеют способность активировать и направлять Т-лимфоциты к избирательному лизису клеток, которые на своей поверхности проявляют структуру, по отношению к которой направлен дубликат по сродству. Это означает, что конъюгаты будут вызывать цитолиз в способе, опосредованным SADCC (суперантиген антитело зависимая клеточная цитотоксичность). См. экспериментальную часть ниже и наши предыдущие п убликации, относящиеся к конъюгатам между суперантигенами и антителами [например, Dohlsten et al., WO 9201470]. Конъюгаты по изобретению имеют структур у, которая является аналогичной к конъюгату суперантигена-антитела, описанной в предшествующей области техники [Dohlsten et al., WO 9201470, которая здесь включена в качестве ссылки], т.е., конъюгат соответствует формуле: T-B-SA(m) где, Т представляет дубликат по биоспецифическому сродству, SА(m) представляет модифицированный суперантиген (вышеупомянутый пептид) и В представляет ковалентный мостик, связывающий Т и SA(m) вместе. Т, в принципе, может быть любой структурой, которая связывается посредством биоспецифического сродства. В большинстве важных случаев, Т способен к связыванию с поверхностной структурой клетки, предпочтительно, специфической для заболевания структурой, как дано выше. Структура, относительно которой направлен Т, обычно является отличной от (а) эпитопа Vb цепи, с которым связывается пептид, производный от суперантигена (SА(m) и (б) эпитопа антигена МНС класса II, с которым связывается немодифицированный суперантиген. Дубликат Т по биоспецифическому сродству может первично быть отобран из интерлейкинов (например, интерлейкин-2), гормонов, антител и фрагментов антител, связывающих антиген, факторов роста и т.п. См., например, Woodworth, Preclinical and Clinical Development of Cytokine Toxines (доклиническая и клиническая разработка цитокинных токсинов), представленная на конференции "Molecuiar Approaches to Cancer Immunotherapy", Ashvill, ноябрь 7-11, 1993. Связывание полипептидов с константным доменом иммуноглобулинов (например, Протеины A, G и L), лектинами, стрептавидином, биотином и т.п., находилось в порядке очередности, представляющем меньшее значение. В порядке очередности, было предпочтительным, чтобы Т являлся антителом или фрагментом антитела, связывающим антиген (включая Fab, F(ab)2, Fv , антитело с одной цепью и т.п.), с конкретным усилением активного фрагмента антитела (такого как Fab) у антител, направленных относительно, так называемых, С242 эпитопов [Lindholm etal, WO 9301303] или по отношению к другим раковоспецифическим эпитопам. В случае, когда Т является антителом, это первично моноклональное или смесь определенного количества моноклональных (например, 2, 3, 4, 5 или больше) антител. Т может быть поликлональным антителом, в случае, если использование является нетерапевтическим. Необязательно, для Т иметь полипептидную структур у. Модифицированный суперантиген SА(m) является первично мутированным антигеном, но может также потенциально быть химически модифицированным суперантигеном, включая фрагменты суперантигенов, сохраняющих способность связываться с Vb цепью рецептора Т клетки. Выражение "мутированный суперантиген" означает, что природная способность суперантигена связываться с антигенами МНС класса II была модифицирована на геномном уровне путем замены, вставки или удаления одной или нескольких аминокислот из природного суперантигена. Фрагменты суперантигена, полученные путем мутаций по удалению части полной аминокислотной последовательности, и фрагменты, полученные путем ферментативного или химического расщепления суперантигена, могут быть использованы эквивалентно в химических конъюгатах по изобретению. Модифицированный суперантаген SА(m) может включать одну или несколько аминокислотных последовательностей, которые являются производными от различных суперантигенов и, которые могли быть мутированными, например, комбинации предпочтительных суперантигенов, упомянуты х вы ше. Модифицированный суперантиген SA(m), как таковой, может проявлять пониженную иммуногенность и токсичность, по сравнению с нативным суперантигеном. Другие группы/соединения, которые способны к перекрестной реакции с Vb -цепью рецептора Т клетки, могут также потенциально быть использованы эквивалентно с мутированным суперантигеном (SA(m)), как дано выше. Подобные группы/соединения могут быть не полипептидной структуры. В конце года приоритета большинство интересующих продуктов-кандидатов по изобретению, включали мутированные формы суперантигенов, имеющих множественные участки связывания МНС класса II, и/или способность к координатной связи с Zn2+, например, SEA, SED, SEE и SЕН. Т, также как и SА(m), может быть получен при помощи рекомбинантного способа. Мостик В может быть выбран, как ранее было описано (Dohlsten et al., WO 9201470), а именно, будет предпочтительно гидрофильным и проявлять одну или несколько структур(у), выбранных из амида, тиоэфира, эфира, дисульфида и т.п. В случае если мостик имеет незамещенные неразорванные углеводородные цепи, они предпочтительно не имеют ароматических колец, таких как фенил. Наиболее важными мостиками являются те, которые получены при помощи рекомбинантного способа, т.е., когда конъюгация имеет место на геномном уровне. В подобных случаях являются предпочтительными олигопептидные мостики, содержащие остатки гидрофильных аминокислот, такие как Gln, Sеr, Gly, Glu и Arg. Мо гут быть включены также Pro и His. В течение года приоритета было решено, что предпочтительным мостиком является пептид, включающий три аминокислотных остатка (GlyGlyPro) . Конъюгат по изобретению может включать один или несколько модифицированных суперантигенов на дубликат по биоспецифическому сродству, и наоборот. Это означает, что Т в выше указанной формуле, может содержать один или несколько модифицированных суперантигенов в добавление к биоспецифическому дубликату. По аналогии, SА(m) может содержать один или несколько Т дубликатов по биоспецифическому сродству. Дубликат по сродству Т и SА(m) может также с включать другие структуры. Количество модифицированных суперантигенов на дубликат по сродству составляет, предпочтительно, один или два. Синтез новых конъюгатов по изобретению может быть проведен, в принципе, согласно двум главным путям: 1. рекомбинантным способом и 2. химическим присоединением Т к SА(m). Способы хорошо известны для обычного, квалифицированного в данной области работника и включают большое количество вариантов. Из этого следует, что изобретение относится первично к искусственным конъюгатам, то есть, конъюгатам, которые не обнаруживаются в природе. Химическое сшивание модифицированного суперантигена с дубликатом Т биоспецифического сродства часто применяет функциональные группы (например, первичные аминогруппы или карбоксигруппы), которые имеются во многих положениях каждого соединения. Из этого следует, что конечный продукт будет содержать смесь конъюгатов молекул, различающихся по отношению к положению, по которому произошло сшивание. Для рекомбинантных конъюгатов (слитых белков), полученные конъюгированные субстанции будут единообразными по отношению к положению сшивания. Или концевой амин модифицированного суперантигена пришивается к карбокси концу дубликата по биоспецифическому сродству, или наоборот. Для подобного слияния для антител, таких как интактные антитела и фрагменты связывания антигена (Fab, FV и т.п.), может быть использована либо легкая, либо тяжелая цепь. В настоящее время предпочтительны рекомбинантные конъюгаты, с предпочтением для Fab фрагментов и пришиванием амино конца модифицированного суперантигена к первому константному домену тяжелой цепи антитела (СНІ), без включения аналогов, сшивающи хся с легкой цепью или с VH VL доменами, которые также могут дать достаточно хорошие результаты. Существует два различных способа получения больших количеств суперантигенов (включая модифицированные и слитые формы) на E.coIi: внутриклеточная продукция и секреция. Последний способ предпочтителен для конъюгатов по изобретению, поскольку он предполагает очистку правильно уложенного белка из периплазмы и из культуральной среды. Внутриклеточная продукция приводит к сложному способу очистки и часто требует повторное укладывание белка in vitro (для того, чтобы получать белок с правильной третичной структурой). Вышеуказанное не исключает, что, возможно, получить активные конъюгаты также и в други х клетках хозяевах, например, эукариотических клетках, таких как дрожжи или клетки млекопитающих. Получение мутированных суперантигенов и отбор мутантов, имеющих модифицированную способность связываться (сродство) к антигену МНС класса II, может быть проведено в соответствии с известными способами [см. Kappler et al., J.Exp. Med, 165 (1992) 387-396]. См. также нашу экспериментальную часть. Способность конъюгата связываться с Vb цепью рецептора Т клетки, со структурой-мишенью и вызывать лизис клетки-мишени зависит, в частности, от пептида (SA(m)), который является производным от суперантигена, дубликата (Т) по биоспецифическому сродству и стр уктуры и длинны мостика (В). Квалифицированный работник способен оптимизировать конъюгаты по изобретению в отношении способности связываться и способности вызывать лизис путем изучения взаимоотношения между структурой и эффектом с помощью той модели, которая описана в соответствии с предыдущим знанием по конъюгатам суперантигена и антитела [см. вышеприведенные публикации]. См также экспериментальную часть ниже. Первоначально предполагалось, что путем модификации способности связывать антиген МНС класса II, соотношение IC5O (SA(wt)):IC5O(SA(m)) составляет