Кон’югат між суперантигеном дикого типу, який був модифікований, та частиною молекули, що відшукує мішень

1 Кон'югат між суперантигеном дикого типу, який був модифікований, та частиною молекули, що відшукує мішень, який відрізняється тим, що зазначений модифікований суперантиген містить ково містить мутацію, яка зменшує його здатність зв'язуватися з МНС-антигенами класу II порівняно також з вказаним суперантигеном дикого типу 2 Кон'югат за п 1, який відрізняється тим, що зазначений перший суперантиген дикого типу є стафілококовим ентеротоксином A (SEA) 3 Кон'югат за п 1, який відрізняється тим, що зазначений перший суперантиген дикого типу є стафілококовим ентеротоксином Е (SEE) 4 Кон'югат за п 2, який відрізняється тим, що другий суперантиген дикого типу є стафілококовим ентеротоксином Е (SEE) 5 Кон'югат за п 3, який відрізняється тим, що другий суперантиген дикого типу є стафілококовим ентеротоксином A (SEA) 6 Кон'югат за п 4, який відрізняється тим, що зазначений район І є районом А, що складається з амінокислотних залишків 20-27 амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ Ю №8 ser Glu Lys Ser 3.5 >$2Ь Leu ?rg Gin сайті та визначає зв'язування з V ^ -ланцюгом TCR і активацію Т-клітин, зазначеного першого суперантигену замінені амінокислотними залишками з ВІДПОВІДНИХ положень у другому суперантигені дикого типу таким чином, що зазначений модифікований суперантиген має покращену здатність індуціювати проліферацію та цитотоксичність Т-клітин порівняно з першим суперантигеном дикого типу і має зменшену серореактивність порівняно з другим суперантигеном дикого типу, і модифікований суперантиген додат lie lie Trr GU Asn to Lys Glu lie Asn Glu Lys Lau Gin Arg 20 Asn Л a Туг ЗО Туг Tyr Asn Glu Glu Ser Asp Asp Asp Leu Lys за Cir Pne Leu 4 5 Asn SO Thr Lea Leu Phs Lys 55 сїу Phe Fhs Tnr Gly SQ His Pro Trp Tyr Jsn 65 Asp Leu Leu Val Asp 70 Lau Gly Ssr Lys ?sp 75 Ala Thr Asn Lys Tyr во Lya Су Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gin cys 1? Giy Gly Ti-r ro Asts Lys Thr Ala 105 Cys Met Tyr j Gly \al Tfr La Arg Leij Thr 120 Glu Lys Lys Val 125 Tro 130 lie Asp Gly Lys Cln 135 Pro lie Asn Le-i Thr Lys О Ala 01 амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, яка відрізняється від амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ першого суперантигену дикого типу тим, що один або декілька амінокислотних залишків в районі І, який знаходиться у TCR (рецептор Т-клітин) - зв'язуючому Glu 5 Val Pro He А5Э L; з Glu Val ISO Thr Vsl С;г Сїч Val Leu 135 1 (О 46772 4 ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID №8 pns 160 Gly 185 Val Ser Tyr Asp Phe Pne Gin Aso ? Is Gin Cly Gin Asp 315 Ssr Gil. Asn 13 Кон'югат за п 5, який відрізняється тим, що зазначений район І є районом Н, що складається з амінокислотних залишків 200-207 амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID №8 His Sar LEU Gly His 225 7 Кон'югат за п 4, який відрізняється тим, що зазначений район І є районом С, що складається з амінокислотних залишків 60-62 амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ Ю №8 8 Кон'югат за п 4, який відрізняться тим, що зазначений район І є районом F, що складається з амінокислотних залишків 160-176 амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID №8 9 Кон'югат за п 4, який відрізняється тим, що зазначений район І є районом Н, що складається з амінокислотних залишків 200-207 амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID №8 10 Кон'югат за п 5, який відрізняється тим, що зазначений район І є районом А, що складається з амінокислотних залишків 20-27 амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID №8 11 Кон'югат за п 5, який відрязняється тим, що зазначений район І є районом С, що складається з амінокислотних залишків 60-62 амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID №8 12 Кон'югат за п 5, який відрізняється тим, що зазначений район І є районом F, що складається з амінокислотних залишків 160-176 амінокислотної Дана заявка претендує на пріоритет на підставі Шведської патентної заявки №9601245-5, яка була зареєстрована 29 березня 1996 року, та на підставі Заявки США 08/695692, яка була зареєстрована 12 серпня 1996 року, які включені в якості посилання Даний винахід відноситься до функціонально активних модифікованих суперантигенів, які є суперантигенами дикого типу (SA І), в яких один або декілька амінокислотних залишків замінені зі збереженням при цьому функції суперантигену У випадку, коли один або декілька замінених залишків (або їх консервативний залишок) зустрічаються у ВІДПОВІДНИХ положеннях в іншому суперантигені дикого типу (SA II), модифікований суперантиген називають химерою (інколи гібридом) Таким чином, химерні суперантигени будуть вміщувати часткові послідовності/райони, що відбуваються, принаймні, з двох різних суперантигенів дикого типу Під терміном "ВІДПОВІДНІ" мають на увазі, що залишки, часткові ПОСЛІДОВНОСТІ та райони, що замінюють один одного, мають функціонально одне й те ж положення у суперантигенах І та II, так 14 Кон'югат за п 10, який відрізняється тим, що в ньому проведені такі амінокислотні заміни R20G, N21T, S24G і R27K, де позиції визначені в амінокислотній ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID №8 15 Кон'югат за п 14, який відрізняється тим, що додатково містить мутацію у положенні 227 як визначено у амінокислотній ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID №8 16 Кон'югат за п 15, який відрізняється тим, що зазначена мутація являє собою D227A 17 Кон'югат за будь-яким з пунктів 1-16, який відрізняється тим, що зазначена частина молекули, що відшукує мішень, вибирається з групи, яка складається з активного щодо зв'язування антигена фрагмента антитіла зв'язуючий антиген антитіла, одноланцюгового антитіла, Fab, F(ab)21 Fv 18 Кон'югат за будь-яким з пунктів 1-17 , який відрізняється тим, що використовується для лікування захворювання ссавця шляхом активації його імунної системи 19 Кон'югат за п 18, який відрізняється тим, що захворювання зв'язано з клітинами, експресуючими структуру-мішень поверхні, яка зв'язується з суперантигеном в епітопі, що структурно відрізняється від епітопа, що зв'язується з TCR з наступною активацією Т-клітин 20 Кон'югат за п 19, який відрізняється тим, що захворювання вибрано з групи, яка складається з ракових захворювань, вірусних інфекцій, паразитарних інвазій і аутоімунних захворювань що заміна призводить до химерної форми, яка здатна функціонувати як суперантиген Термінологію "прищеплений/щеплення/щеплена частина (трансплантат)" використовують у зв'язку з частинами повної ПОСЛІДОВНОСТІ суперантигену II, які замінюють ВІДПО ВІДНІ частини суперантигену І, навіть якщо замінена тільки одна єдина амінокислота До модифікованих/химерних суперантигенів відносяться також функціональні суперантигени, модифіковані іншими шляхами, наприклад, модифіковані заміною амінокислот на ділянках, інших, ніж ті, що відносяться до даного винаходу, кон'юговані з частиною молекули, що відшукує мішень, у тому числі також злиті форми, коли ця частина молекули є поліпептидом/білком Порядок проведення цих модифікацій може змінюватися (див нижче) Суперантигени ВІДПОВІДНО ДО найпершого визначення (приблизно 1988 - 1993), суперантигени являють собою бактеріальні або вірусні білки, здатні зв'язуватися з антигенами головного комплексу пстосумісності класу II (МНС class II) без попере 46772 для повного відтворення SEE-подібноі активності днього внутрішньоклітинного процесингу та актиSEA, що містить SEE-щеплення, щодо Vp8 був вувати Т-клітки шляхом зв'язування з варіабельнеобхідний фрагмент, що містить 70 N-кшцевих ною областю р-ланцюга (Vp) Т-клітинного рецепамінокислотних залишків з SEE Цей фрагмент тору (TCR) Це зв'язування призводить до містить частини SEE-подібного сайту зв'язування рестриктрованої сімейством Vp активації щодо а-ланцюга МНС класу II, та химерні молекули великої частини/субпопуляцм Т-кліток до лізису SEA/SEE, що мітять цю частину з SEE, інгібували експресуючих МНС II клітин (суперантигензв'язування SEA з DR1 МНС класу II SEE-подібним залежному клітинно-опосередкованому цитолізу = чином SDCC) Добре відомими суперантигенами дикого типу, Нещодавно були описані химери SEA/SEE, ВІДПОВІДНО до цього визначення, є стафілококові утворені обміном районів, що беруть участь у зв'яентеротоксини (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SED, SEE, зуванні TCD Vp (Lamphaer et al , J Immunol 156 SEH) Подальшими прикладами є токсин 1 Синд(March 15, 1996) 2178 - 2135) Злитий білок суперому Токсичного Шоку (TSST-1, також стафілокорантиген SEE/Fab-антитіло, в якому домени SEE, кового походження), Токсини Ексфоліації (Exft), що беруть участь у взаємодії з Т-клітинами, були Стрептококові Пірогенні Екзотоксини А, В і С (SPE замінені ВІДПОВІДНИМИ негомолопчними доменами А, В і С), білки мишачого вірусу молочної залози SEA, обговорювалися на ABRF 96 Biomolecular (MMTV), Стрептококові білки М, Ентеротоксин Techniques, Holyday Inn Golden Gateway, San Clostndiul perfnngens (СРЕТ), суперантигени Francisco, California March 30 - April 2, 1996 (Bjork Mycoplasma arthritis і т д Огляд суперантигенів та et al , M45) їх властивостей даний Kotzm et al , 1993 Передумови винаходу - Терапевтичне викориНа самому початку 90-х років було виявлено, стання суперанттигенів що активація та наступний лізис клітин можуть Для терапії були запропоновані некон'юговані відбуватися незалежним від МНС класу II чином у суперантигени з лікувальною дією, що переважно випадку, коли суперантиген кон'югований з частиздійснюється через загальну активацію імунної ною молекули, що впізнає мішень, здатною зв'язусистеми (Kalland et al , WO 9104053, Terman et al , ватися з структурою клітинної поверхні (Dohlsten et WO 9110680 та WO 9324136, Newalletal 1991) al WO 9201470 та Abrahmsen et al WO 9601650) Також пропонувалося використання модифіПід час інкубування клітин-мішеней (що несе струкованих суперантигенів, кон'югованих з частинами ктуру-мішень для частини молекули, що відшукує молекули, що відшукують мішень (Dohl sten et al , мішень) та ефекторних клітин (Т-клітин) з кон'югаWO 9201470, Abrahmseh et al WO 9601650, що тами, клітини-мішені стають лізируваними (супевключені тут у якості посилання) Це робило можрантиген-антитіло-залежний клітинноливим більш широке терапевтичне використання активації Т-клітин через Vp Кон'югати, досліджуопосередкований цитоліз = SADCC) без необхідвані до теперішнього часу, мали знижену спорідності експересм класу II Тому концепція суперанненість з класом II, що, в свою чергу, призводило тигену наших днів, що використовується у контексдо зниження важкої системної токсичності, звиті даного винаходу, якщо немає інших вказівок, чайно зв'язаної з суперантигенами дикого типу включає в себе будь-яку сполуку (переважно поліпептидної структури), яка здатна зв'язуватися зі Terman et al (WO 9110680 та WO 9324136) у структурою клітинної поверхні (структуроюдодаткових рекомендаціях пропонував терапію мішенню) та з одним або декількома ланцюгами раку з застосуванням модифікованих суперантиполіморфних TCR, зокрема, з ланцюгом Vp, з акгенів та фрагментів суперантигенів тивуванням тим самим субпопуляцм Т-клітин, ексKappler et al (WO 9314634) запропонували випресуючих специфічний ланцюг TCR, що бере користовувати некон'юговані суперантигени (SEB), участь у цьому зв'язуванні Потім Т-клітини стають мутовані для елімінації їх здатності Vp-зв'язування цитотоксичними щодо клітин, які несуть цю клітинМНС Класу II (у контексті вакцин та для нейтраліну структуру (структуру-мішень, клітин-мішеней) зації токсичних ефектів суперантигенів) Звичайно активована субпопуляція Т-клітин склаAbrahmsen et al (WO 9601650) запропонували дає приблизно 1 - 20% від загального числа Ттерапію раку кон'югованими суперантигенами, що клітин індивідуума мають модифіковану, переважно зменшену, здатність зв'язуватися з антигенами Класу II МодифіПередумови винаходу - Структурні та функцікації включали одиночні мутації, а також конструкональні дослідження, що використовують мутовані цію химер між різними суперантигенами та химерні суперантигени Раніше були описані химерні суперантигени, у Проблеми, які повинні бути вирішені даним тому числі форми з точковими мутаціями (Kuppler винаходом et al,, WO 9314364, Kappleretal, 1992, Grossman et Сироватки популяцій людини звичайно містять al 1991, Huihagle et al , 1991, Hartwig et al 1993, високі титри антитіл проти суперантигенів НаприFraser et al 1993, Molhck et al 1993, Irwm et al клад, для стафілококових суперантигенів ВІДНОСНІ 1992, Hudson et al 1193, і Blanco et al 1990) титри Molhck et al і Hudson et al показують на основі TSST-1>SEB>SEC1>SE3>SEC2>SEA>SED>SEE досліджень химер, що Vp-специфічність SEA і SEE Ці ВІДНОСНІ титри говорять про проблеми імуоснована на визначених амінокислотних послідовногенності та про проблеми з нейтралізуючими ностях, присутніх у карбоксикінцевому районі (тобантитілами у випадку, коли SE вводяться парентето амінокислотних залишках 200, 206 і 207) Крім рально На основі лише цих проблем, SEE повиVp-специфічності, в основному залежний від цього нен був би бути переважним стафілококовим сурайону, Molhck et al змогли також показати, що перантигеном Але, в ході досліджень зі злитими 8 46772 білками ми виявили, що здатність Т-клітинної неПерший аспект даного винаходу являє собою залежної від МНСС класу II цитотоксичності, супеспосіб лікування захворювання ссавця шляхом рантиген-антіло-залежної цитотоксичності активації його імунної системи за рахунок введення терапевтичне ефективної (імуноактивуючої) (SADCC) кон'югатів SEE є слабкою Титри антитіл КІЛЬКОСТІ модифікованого, переважно, химерного до SE (антитіл-SE) також вказують на те, що може суперантигену Переважним ссавцем є людина бути вигідно модифікувати суперантиген "високого Захворювання, про які йде мова, в основному потитра", щоб він був більш подібний до суперантив'язані з клітинами, експресуючими на їх поверхні гену "низького тигра" структуру-мішень, що зв'язується з суперантигеЦІЛІ даного винаходу ном У більшості випадків ця структура-мішень Першою метою є покращення раніше відомих відрізняється від eniTonyTCR, що звичайно зв'язусуперантигенів щодо зниження їх імуногенності та ється з суперантигенами Зв'язування зі структуреакції з нейтралізуючими антитілами рою-мішенню робить можливими також зв'язуванДругою метою є забезпечення суперантигенів ня TCR і активацію Т-клітин Ілюстративними з меншими побічними діями при використанні їх в прикладами є антигени МНС класу II та ІНШІ струкякості лікарського засобу тури клітинної поверхні, які можуть експресуватися Третьою метою є забезпечення покращених на клітинах, пов'язаних з ходом захворювань Ілюсуперантигенів, які можуть бути використані в якостративними захворюваннями є недоброякісні пусті активного початку в лікуванні ссавців, що потехлини, що включають ракові пухлини будь-якого рпають від ракових пухлин, аутоімунних захворютипу (такі, як карцинома, саркома, меланома, лімвань, інвазій паразитами, вірусних інфекцій або фома і т д ), вірусні інфекції, паразитарні інвазії та інших захворювань, пов'язаних з клітинами, які аутоімунні захворювання Рак, який може бути експресують на їх поверхні антигени МНС класу II підданий лікуванню, може бути локалізований у і/або структури, які є специфічними для ВІДПОВІДободочній кишці, молочній залозі, шийці матки, НОГО захворювання і зв'язуються з частиною, що нирці, шлунку, тонкій кишці, дванадцятиперстовій впізнає мішень, включених у суперантиген кишці, простаті, яйці, шкірі, легені, печінці, підшлуВідкриття, яке привело до даного винаходу нковій залозі, скелеті і т д , утому числі також меАналіз гомології послідовностей SEA та SEE тастазування у різних місцерозташуваннях Актив(Фіг 2) виявив, що неідентичні амінокислотні залиний інгредієнт даного винаходу придатний також шки сконцентровані у 8 різних районах Поза цими для форм ракових захворювань, резистентних до 8 районами, що складають до 34% ПОСЛІДОВНОСТІ, багатьох лікарських засобів Клітини, що експреідентичність двох SE становить 97%, причому засують структуру-мішень, можуть також бути клітиміни консервативних амінокислот відповідальні за нами, які деяким чином контролюють або регулюрешту відмінностей Чотири з цих районів структують розвиток захворювання, що піддається рно близькі до двох сайтів зв'язування МНС класу лікуванню II (В А А 3 7 - 5 0 , D 71 -78, Е 136- 149 та G 189195) та, мабуть, не взаємодіють з TCR Додаткові Характерною особливістю цього способу є те, чотири райони (А АА 20 - 27, С 60 - 62, F 161 що у ньому використовують модифікований супе176 та Н 200 - 207) розташовані на КІНЦІ молекули, рантиген, в яких один або декілька амінокислотних поблизу можливого сайту зв'язування TCR, який, залишків у районі (районі І), що забезпечує зв'язуяк вважають, знаходився у канавці між двома субвання з субпопуляцією Т-клітин через поліморфдоменами Шляхом щеплення індивідуальних раний ланцюг TCR, зокрема TCR Vp, у суперантигені йонів (заміни амінокислотних залишків, які відріздикого типу (SA І), заміни ВІДПОВІДНИМ амінокислоняються) ми тепер винайшли, що властивість SEAтним залишком, що зберігає активність модифікокон'югатів індуціювати цитотоксичну реакцію ВІДваного таким чином суперантигену Переважні на ПОВІДІ, а також посилювати проліферативну реакданий час варіанти відносяться до химерного суцію ВІДПОВІДІ у відсутності МНС класу II, обумовлеперантигену, в якому один або декілька амінокисна одним районом у домені зв'язування TCR SEA лотних залишків у районі (районі І) першого супеЦей Район (А) може переноситися у SEE та сильрантигену дикого типу були замінені ВІДПОВІДНИМИ но впливати на активність у відсутності Класу II, одним або декількома амінокислотними залишкахоча має обмежений вплив на Vp-специфічність ми у відповідному районі (районі II) другого супесуперантигену (Фіг 6, Таблиця 2) Мабуть, всі рарантигену дикого типу (SA II) Райони І та II розрізйони (А, С, F та Н) беруть участь, прямо або опоняються по амінокислотним послідовностям середковано, у взаємодії з TCR, що проявляється Суперантигени І та II були вибрані таким чином, у зміненій стимулюючій дії на мишині Т-клітинні що райони І і II можуть заміняти один одного без пбридоми (Таблиця 2) знищення функції суперантигенів У цьому зв'язку треба вважати фактом, що деякий район І може Внаслідок аналогічного способу дії зрозуміло, бути окремо нездатним до заміни на ВІДПОВІДНИЙ що подібне структурне розділення цих TCR Vpрайон другого суперантигену дикого типу, хоча при зв'язуючих властивостей відноситься також до заміні разом з іншими районами, що визначають суперантигенів, аналогічних SEA та SEE Те ж сазв'язування TCR та активацію Т-кліток, результаме можна сказати і щодо інших типів суперантигетом є функціонально активний суперантиген Ранів, у яких зв'язуючи структури організовані інакйони, що розглядаються, звичайно містять менше ше Наше відкриття дозволило нам намітити у 20 залишків, зокрема, для суперантигенів, аналогізагальних рисах конструювання химерних суперачних SEA Таким чином, амінокислотний залишок, нтигенів, потенційно дуже цінних у якості терапевщо заміняє, відрізняється від залишку, що замінятичних засобів ється, та, як повинно бути зрозуміло, включає таВинахід 46772 кож консервативні замши та замши інших амінокислот, що призводять до функціонально активних модифікованих суперантигенів, які роблять можливими зв'язування з TCR Vp та активацію субполяцм Т-клітин Це означає, що модифіковані у ВІДПОВІДНОСТІ з даним винаходом суперантигени у широкому розумінні включають будь-який модифікований суперантиген, в якому одна або декілька амінокислот у вищезгаданих районах були функціонально замінені Термін "консервативна заміна" відноситься до заміни амінокислотного залишку ХІМІЧНО подібним залишком, наприклад, гідрофобного залишку іншим гідрофобним залишком, зарядженого залишку іншим, але однаково зарядженим залишком і т д В якості суперантигенів І, II і т д до моменту заяви про пріоритет переважними були стафілококові ентеротоксини, зокрема, ентеротоксини, які координують цинк, тобто SEA, SEE, SED і, можливо, також SEH Райони, що розглядаються, можуть мати будьяку з вищезгаданих функцій (див розділ з назвою "Відкриття, яке призвело до даного винаходу" та Експериментальну частину) 1 Сильний вплив на активність суперантигену як таку і обмежену дію на TCR-специфічність, зокрема, на Vp-специфічність Для суперантигенів SEA-типу це означає район А (положення амінокислот 20 - 27) 2 Глибокий вплив на специфічність щодо зв'язування з поліморфними ланцюгами TCR, такими як Vp-ланцюг Для суперантигенів SEA-типу це означає район С (положення суперантигенів амінокислот 60 - 62), F (положення амінокислот 110 126) та Н (положення амінокислот 200 - 207) Для SEA-подібних суперантигенів це означає одну або декілька замш (стосовно щеплення з SEA в SEE, SEE/A-химерам) Район A R20G, N21T, S24G, R27K Район С G60D, P62S Район F H111R, H114Q, G115Y, F117Y, G118N, S124V, G126D Район Н D200G, P206S, D207N У момент заявления пріоритету було переважно проводити всі заміни для кожного району Для інших суперантигенів могли б також проводитися аналогічні заміни між ВІДПОВІДНИМИ положеннями/районами У типовому випадку можна було б починати з одного першого суперантигену, подібного SEE та SED, і потім заміняти один або декілька його унікальних Vp-зв'язуючих районів ВІДПОВІДНИМ районом (районами) другого суперантигену (наприклад, SEA), причому перший та другий суперантигени переважно вибирають таким чином, що титр антитіл у нормальних сироватках людини для першого суперантигену нижче, ніж для другого суперантигену Для химер SEA та SEE найкращі способи відповідають химерам SEE/A-A, SEE/A-AH, SEA/EBDEG з абсолютною перевагою для SEE/A-A Див Експериментальну частину та фігури Разом з районами А, С, F і Н можуть бути також замінені амінокислотні залишки в інших частинах Одним типом обміну є обмін для зменшення здатності зв'язування класу II, оскільки ця власти 10 вість пов'язана зі звичайними побічними ефектами, що зустрічаються при терапії з використанням суперантигенів (загальною імунною активацією з супутнім системним вивільненням фактору некрозу пухлин (TNF) та штерферона-у) Для таких суперантигенів, як SEA, SED і SEE, положення, які важливі для здатності координувати іони цинку, можуть бути переважно змінені, тобто, наприклад, положення 225 та 227 в мутації Н225А SEA та, особливо, D227A, мають позитивний вплив на зменшення токсичних побічних ефектів (див Abrahmsen etal WO 09601650 і Fraser et al 1993) Інші заміни можуть бути виконані по всій молекулі, якщо вони не порушують функції суперантигену, наприклад, консервативні заміни, зокрема, поза районами, що беруть участь у зв'язуванні з класом II і TCR Зміни у ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК ДЛЯ ЗМІНИ зв'язування МНС класу II або будь-яка інша зміна на рівні ДНК може бути виконана або перед змшенням у районах забезпечення зв'язування з TCR, або після змшення Ці ІНШІ ТИПИ модифікації можуть бути з тим же успіхом введені перед заміною амінокислот у Районі І Таким чином, у контексті даного винаходу концепція використання "суперантигену дикого типу" на початку модифікації ВІДПОВІДНО до формули винаходу первинно відноситься до амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ ДИКОГО типу у районі І, поза яким можуть мати місце попередні модифікації Конструювання химерних та мутованих суперантигенів можна проводити у ВІДПОВІДНОСТІ ЗІ способами, добре відомими у цій області Переключення від району, специфічного для одного суперантигену, до ВІДПОВІДНОГО району у другому суперантигені здійснюють на геномному рівні, і воно може виконуватись заміною всієї ПОСЛІДОВНОСТІ або точковими мутаціями тих специфічних основ, які потрібні для одержання у результаті бажаної амінокислотної ПОСЛІДОВНОСТІ ДИВ , наприклад, експериментальну частину і також цитовані вище посилання попереднього рівня знань Термін "мутація" включає заміну, вбудовування або видалення одного або декількох амінокислотних залишків шляхом модифікації ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК, кодуючої білок, який повинен бути мутований Суперантиген для використання у способі даного винаходу може бути некон'югованим суперантигеном, модифікованим, як описано вище, тобто модифікованим суперантигеном, який не має специфічно приєднаної частини молекули, що впізнає мішень, але має явну здатність зв'язуватися як з антигенами МНС класу II, так і з субпопуляцією Тклітин через TCR Більш переважно, модифікований суперантиген, переважно, химерний еуперантиген, кон'югований з частиною молекули, що впізнає мішень В останньому випадку переважними варіантами є "гібриди" (злиття) між частиною, що впізнає мішень, і модифікованим суперантигеном Ці кон'югати як такі є новими та становлять собою окремий аспект даного винаходу Структури кон'югатів даного винаходу аналогічні відомим раніше кон'югатам антитіло/суперантиген (Dohlsten et al WO 9201470, Abrahmsen et al, WO 09601650, обидві публікації включені в якості посилання), тобто кон'югати часто підпорядковуються формулі 11 46772 12 T-B-SA(m) мішень частини Т з модифікованим, переважно химерним, суперантигеном (SA(m)), описаним виде Т позначає частину молекули, що відшукує ще Ці способи добре ВІДОМІ дослідникам зі звимішень, SA(m) є модифікованим, переважно химечайною кваліфікацією та включають у себе велику рним, суперантигеном, описаним вище, і В є коваКІЛЬКІСТЬ варіантів лентним містковим зв'язком, що поєднує Т і SA(m) разом Т може у принципі містити додаткові супеХімічне зв'язування модифікованого некон'юрантигенні частини молекули (SA(m), a SA(m) догованого суперантигену з частиною Т, що відшукує датково частини молекули, що упинають мішень, мішень, часто використовують функціональні грухоча у переважних кон'югатах є тільки одна частипи (наприклад, первинні аміногрупи або карбоксина, що упізнає мішень, і одна частина, що є модигрупи), які присутні у багатьох положеннях у цих фікованим антигеном, як описано вище сполуках 3 цього випливає, що кінцевий продукт буде містити суміш молекул кон'югату, що відрізТ може бути у принципі будь-якою структурою, няється по положенням зв'язування, а також гетеяка здатна зв'язуватися зі структурою поверхні ро-та гомокон'югати клітини, переважно, специфічною для захворювання структурою Структура, проти якої спрямоДля рекомбінантних кон'югатів (злитих білків) ваний Т, звичайно відрізняється від (а) епітопу Vpодержаний матеріал кон'югата буде однорідним ланцюга, з яким зв'язується SA(m), і (б) епітопів щодо положення зв'язування Або аміно-кінець МНС класу N6 з якими зв'язуються суперантигени химерного суперантигену буде зв'язаний з карбокЧастину, що упізнає мішень, первинно вибирають си-кінцем частини, що упізнає мішень, або навпасеред штерлейкінів (наприклад, інтерлейкш-2), ки Для антитіл, таких як інтактні антитіла та антигормонів, антитіл, у тому числі, антигензв'язуючих гензв'язуючі фрагменти (Fab, Fv, одноланцюгові фрагментів антитіл, факторів росту і т д Див , антитіла і т д), для злиття можуть бути викориснаприклад, Woodworth, Preclimcal and Clinical тані або легкий ланцюг, або тяжкий ланцюг У даdevelopment of Cytokme toxins, presented at the ний час переважні рекомбінантні кон'югати, найconference "Molecular approaches to cancer більш переважно, Fab-фрагменти, та зв'язування Immunotherapy", Ashville, North Carolina, November аміно-кінця химерного суперантигену з першим 7 - 1 1 , 1993) константним доменом тяжкого ланцюга антитіла (СНІ), без виключення аналогічного зв'язування з На момент заявления пріоритету було перелегким ланцюгом або з доменами VH і VL, яке таважно, щоб Т був антитілом (повнорозмірним анкож може дати дуже добрі результати титілом, Fab, F(ab)2, Fv, одноланцюговим антитілом і будь-яким іншим антигензв'язуючим Основна клітка-хазяїн для широкомасштабнофрагментом антитіла), з особливою перевагою го рекомбінантного одержання модифікованих активних фрагментів антитіл (таких як Fab), спрясуперантигенів даного винаходу (як злитих форм, мованих на так званий епітоп С242 (Lmdholm et al , так і некон'югованих форм) є Е соїі Цей хазяїн WO 9301303), або більш переважно, на зв'язуючий забезпечує у принципі два шляхи внутрішньокліепітоп для антитіла 5Т4, специфічного для раку тинне продуцювання та секрецію Останній варіант легенів (Stern et al , WO 8907947) Але це не виє переважним, оскільки він забезпечує очищення ключає того, що ІНШІ специфічні для раку антитіла правильно укладених білків з періплазми та з можуть функціонувати так же добре або навіть культурного середовища Вищесказане не виклюкраще Термін "антитіло" включає як моноклоначає того, що можна одержувати активні кон'югати льні, так і політональні варіанти, переважно, мотакож і в інших клітинах-хазяїнах, наприклад, у ноклональні препарати еукарютичних клітинах, таких як дріжджі або клітини ссавців Т може бути також спрямований на унікальні структури на більш або менш здорових клітинах, Фармацевтичні композиції, доза та шляхи ввеякі регулюють або контролюють розвиток захводення рювання Третім аспектом даного винаходу є фармацевтичні композиції, що містять модифіковані, переМістковий зв'язок В може бути вибраний, як важно химерні, суперантигени даного винаходу, описано раніше (Dohlsten et al , WO 9201470, і описані вище (як кон'юговані, так і некон'юговані Abrahmsen et al , WO 9601650), тобто В переважно форми) Композиції, що розглядаються, ВІДОМІ у є гідрофільним та виявляє одну або декілька струданій області, за виключенням того, що тепер вони ктур, вибраних з аміда, тюефіра, дисульфіда і т д містять суперантиген даного винаходу Так, ці Найбільш відомими містковими зв'язками є зв'язки, композиції можуть бути у формі люфілізованого, одержані рекомбінантними способами, тобто кон'що складається з часток матеріалу, стерильно югування у цьому випадку має місце на геномному асептично приготовленого розчину, таблетки, амрівні У таких випадках переважні олігопептидні пули і т д Можуть бути присутні носи, такі як вода містки, що містять гідрофільні амінокислотні зали(переважно забуферена до фізіологічно прийнятшки, такі як Gin, Ser, Gly, Glu, Pro, His та Arg Осоної величини рН, наприклад, за допомогою PBS бливо переважними В є пептидні містки, що скла(забуференого фосфатом фізіологічного розчина, даються з 1 - 10 амінокислотних залишків, з ЗФР)) або інший твердий або рідкий матеріал У абсолютною перевагою для 3 - 7 амінокислотних загальних рисах, ці композиції готують з викорисзалишків Типовим містком є трипептид GlyGlyPro, танням кон'югату, змішаного, зв'язаного або іншим SEQ ID N1 чином комбінованого з одним або декількома воОдержання нових кон'югатів даного винаходу дорозчинними або нерозчинними у воді водними може проводитися у принципі у ВІДПОВІДНОСТІ з або неводними носіями (або розчиненого в них), двома головними шляхами реакцій 1 Рекомбінанякщо необхідно, разом з придатними добавками та тні способи та 2 Хімічне зв'язування упізнаючої 13 46772 14 ад'ювантами Обов'язковим є те, що носи та умови ген може бути антигеном дикого типу, химерою не повинні здійснювати негативної дії на активабо варіантом з точковою мутацією (та їх комбінаність модифікованого суперантигену ціями), описаними вище або Dohlsten et al , WO 9201470 і Abrahmsen et al , WO 9601650 Цей асЗвичайно суперантиген даного винаходу попект винаходу включає також фармацевтичні комвинен продаватися та вводитися у заздалегідь позиції, описані вище, але які містять препарат розподілених дозах, кожна з яких містить ефектиантитіл, описаних у даному аспекті винаходу, завну КІЛЬКІСТЬ кон'югату, яка на основі наведеного мість химерного суперантигену тут результату повинна знаходитися у діапазоні Юнг - 50мг, наприклад, у діапазоні Юнг - 1мг або у У момент заявления пріоритету було перевадіапазоні Юмкг - 50мг Точна доза буде варіювати жно використовувати фрагмент Fab антитіла 5Т4 від випадку до випадку в залежності від ваги та (Stern et al , WO 8907947) у сполученні з химерою віку пацієнта, шляхів введення, типу захворюванSEE/A-A з мутацією D227A Переважний фрагмент ня, частини молекули, що відшукує мішень, супеFab був мутований в обох ланцюгах у положенні, рантигену, зв'язку (-В-) і т д що забезпечує міжланцюгові дисульфідні зв'язки (Ser замість Cys) Для збільшення виходу злитого Шляхи введення є звичайно застосовуваними з антитілом білка при продуціюванні його у Е соїі у даній області шляхами, тобто вбиваюча клітинимутації також проводили у Vk-ланцюзі при визнамішені ефективна КІЛЬКІСТЬ або терапевтично акчених положеннях, Див, експериментальну частитивна КІЛЬКІСТЬ суперантигену, модифікованого ну ВІДПОВІДНО до винаходу, приводять у контакт з клітинами-мі-шенями Для описаних вище показників МАТЕРІАЛИ ТА СПОСОБИ це більшою частиною означає парентеральне Конструювання химерних генів SEA/SEE введення, таке як ІН'ЄКЦІЯ або інфузія (підшкірна, Конструювання химер SEA/SEE виконували з внутрішньовенна, внутрішньоартеріальна, внутрівикористанням способу на основі полімеразної шньом'язова, внутрішньочеревна) ссавцю, наприланцюгової реакції (ПЛР), перекриваючогося поклад, людині Розглядаємо модифіковані, перевадовження ПОСЛІДОВНОСТІ (Horton et al) ПЛР провожно, химерні, суперантигени можуть вводитися дили з U1Tma (Perkm-Elmer) ВІДПОВІДНО ДО рекомісцево або системно мендацій виробників Продуцюємі ПЛР фрагменти тонували у PCR-scnpt (Stratagene, USA) та секвеПід терміном "вбиваюча мішень ефективна КІнували для перевірки правильності ПОСЛІДОВНОСТІ ЛЬКІСТЬ" розуміють, що ця КІЛЬКІСТЬ є ефективною в ПОТІМ химерні гени суперантигенів субклонували у активації та націлюванні Т-клітин для руйнування експресуючий вектор рКР889 (Abrahmsen et al , клітин-мішеней, 1995), поєднуючи ці конструкції SE з частиною Переважний шлях введення у момент заявлетяжкого ланцюга з фрагментом Fab мишиного мония пріоритету відповідає шляху введення, що ноклонального антитіла С215 Рекомбінантні злиті обговорюється для кон'югатів суперантигенів згідбілки SEA та SEE одержували у вигляді повнорозно Dohlsten et al, WO 9201470 і Abrahmsen et al , мірних поліпептидів у ВІДПОВІДНОСТІ з консенсусною WO 9601650 Це означає 1 - 5-годинну внутрішПОСЛІДОВНІСТЮ для відщеплення сигнального пепньовенну інфузію (переважно 4-годинну) на день тиду (von Heijne, 1986) разом з жарознижуючим засобом (парацетамолом) Введення повинно повторюватися протягом Експресія та очищення білка декількох днів, наприклад, протягом 4 днів, з доШтам UL635 Eschenchia coll K12 використовутриманням безпеки щодо ризику посилення утвовали для експресії злитих білків Fab-SE та мутанрення антитіл, спрямованих проти кон'югату тів SEA, описаних раніше (Abrahmsen et al , 1995) Злиті білки Fab-SE збирали центрифугуванням Суперантигени даного винаходу можуть ввопри 5000д та фракції супернатанту піддавали дитися або в якості основної терапії, або, в переочищенню на Протеїн G-Сефарозі (Pharmacia важних схемах, в якості ад'ювантної (додаткової) Biotech AB, Uppsala, Sweden), як описано раніше терапії у сполученні з хірургією або іншими лікар(Abrahmsen et al, 1995) Чистота аффінно очищеськими засобами них варіантів Fab-SE була > 90% при аналізі з виУ контексті терапії ми виявили, що препарати користанням елекрофорезу у ДСН-ПААГ антитіл, які є чистими щодо нековалентно зв'язаних тяжких та легких ланцюгів антитіл, забезпечуКлітини ють переваги порівняно з препаратами, що містять ЛІНІЮ КЛІТИН В-КЛІТИННОІ лимфоми любини Raji антитіла, в яких ці ланцюги зв'язані разом через та карціноми ободової кишки людини Colo 205 цистинові зв'язки Четвертим аспектом даного викультивували у повному R-середовищі (середовинаходу є терапевтичне використання препарату щі RPMI-1640) з додаванням 10% фетальної теляантитіл, зокрема, препарату Fab, в якому цистеїчої сироватки (Gibco BRL, Life Technologies, Ltd нові залишки, що зв'язують ланцюги разом, були Paisley Scotland), 1мМ глутамша, HyClone Europe, замінені амінокислотою, що не дозволяє утворенLtd Cramlmgton, 5 x 50 5 M р-меркаптоетанолу, ICN ня дисульфідних зв'язків, наприклад, серином Biomedicals INC Costa Mesa CA, 0,1 M Найбільш переважними специфічними антитілами NaHCO3,"Seromed Biochrome, 1 x 10 2 M Hepesдля цього аспекту винаходу були в момент заявбуфера, HyClone Europe, Ltd Cramlmgton, 0,1мг/мл ления пріоритету C242mab (Lindholm et al , WO гентаміцина, Biological Industries Kibbutz Beit 9301302) та 5Т4 mab, як описано у цитованих виHaemek Izrael, 1 x 10 3 M пірувата натрія, HyClone ще посиланнях У переважних варіантах один з Europe, Ltd Cramlmgton) Клітини СНО, трансфіколанцюгів антитіла злитий з суперантигеном, який вані молекулами С215 і CD80 людини, культивуздатний активувати субпопуляцію Т-клітин Vpвали у повному R-середовищі з додаванням специфічним чином, як описано вище Суперанти0,5мг/мл Геніцитину (G418) Gibco BRL, Life 15 46772 16 Technologies, Ltd Paisley Scotland) Мононуклеарні користовували для виявлення цитокшів Погликлітини периферичної крові (РВМ) одержували з нання визначали в Імунорідері (ImmunoReader гепаринізованої крові здорових донорів Клітини NJ2000, InterMed Roskilde, Denmark) при 405 або виділяли центрифугуванням у градієнті ЩІЛЬНОСТІ 450нм через Ficoll-Paque, як описано раніше (Dohlsten et Мутування 5T4Fab al , 1991) Т-лімфоцити людини очищували до гоКонструювання вектору для експресії 5T4Fabмогенності позитивною селекцією з використанням SEA в Е соїі колонок MimMACS у поєднанні з магнітними граКодуючі Fv частини 5Т4 тонували з пбридоми нулами, покритими моноклональними антитілами, 5Т4, одержаної від лікаря Петера Стерна (Stem et специфічними для CD4 і CD8 людини (Miltenyl al , WO 8907947) Більш детально кДНК одержуBiotec GmbH, Germany), ВІДПОВІДНО ДО інструкцій вали з мРНК, райони цілих варіабельних доменів і виробників Реагуючі з SEA і SEE (SEA- і SEEчастини сигнальних послідовностей, а також перреактивні) КЛІТИННІ лінії людини одержували, як ший константний домен тяжкого ланцюга та консописано раніше (Dohlsten et al , 1994) Експресуютантний домен легкого ланцюга ампліфікували за чу TCR Vp22 клітинну ЛІНІЮ ЛЮДИНИ одержували з допомогою ПЛР Олігонуклеотиди первинно стимульованої реагуючої з SEA клітинної 5 CAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC 3(SEQ ID N 2) і 5 ACTAGTCGACATGGATGGAGCTITATCATIyTCTT 3(SEQ ID N 3) лінії за допомогою позитивного відбору з магнітвикористовували для тяжкого ланцюга з одерними гранулами (Dynabeads, Dynal A S , Norway), жанням фрагменту 553п н , тоді, як олігонуклеопокритими моноклональними антитілами, специтиди фічними для TCR Vp22 (Immunotech, France) Зба5 ACTAGTCGACATGGGCITCAAGATGGAGTCACAkwyyCwGG 3(SEQ ID N гачені клітини містили > 95% TCR Vp22+ Т-клітин, 4) і 5 GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA 3(SEQ ID N 5) як визначено проточною цитометрією (дані не навикористовували для легкого ланцюга з одерведені) Мишині Т-клітинні пбрідоми (11ВЗ, 2В4 та жанням фрагменту 724п н для кожного ланцюга 11 40) одержували, як описано (Fleury et al , 1991) секвенували три різних клона та винайшли, що Тест на цитотоксичність вони були ідентичними Фрагменти ДНК, придатні Цитотоксичність вимірювали у стандартному для вбудовування в експресуючий вектор (ref), 51 тесті вивільнення Сг після 4 або 6 годин, як опиодержували у другій стадії ПЛР Для збирання сано раніше (Dohlsten et al , 1991) Клітини Colo205 Fab-експресійноі плазміди варіабельні області 5Т4 або Raji людини використовували в якості клітинзливали з послідовностями, що кодують константні мішеней Ефекторні клітини, SEA- або SEE- реакобласті, з мишиного IgGI/k антитіла С242 mab тивні лінії Т-клітин людини або лінії TCR Vp22+ (Lmdholm et al, WO 9301302) Район, що кодує суклітин людини додавали при відношенні ефектору перантиген, виготовлений з стафілококового ентедо мішені ЗО 1 1Сг-мічені клітини-мішені викориротоксину A(SEA), приєднували після тяжкого ластовували у тестах на цитотоксичність при 2500 нцюга Підтверджена ПОСЛІДОВНІСТЬ ДЛЯ Vkклітин / 200мл повного середовища у лунках мікланцюга каркаса антитіла 5Т4 наведена у резульротитраційного планшету з V-дном Гібриди татах C215Fab-SEA/E додавали при різних концентраці1 Мутагенез 5Т4 ях, як вказано, та вивільнення Сг вимірювали на Сім амінокислотних замш вводили у райони, лічильнику Гейгера Питому цитотоксичність у відщо кодують каркас антитіл Це були PhelOSer, сотках розраховували як 100 х [(експериментальне Thr45Lys, ІІебЗег, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser і вивільнення у імп/хв - фонове вивільнення у Leu78Val Подібним чином, залишки Cys у кожному імп/хв) / (загальне вивільнення у імп/хв - фонове ланцюгу, що беруть участь в утворенні міждоменвивільнення у імп/хв)] ного дісульфідного зв"язку, були замінені залишТести проліферації лімфоцитів ками серину, що призводило до мутації Cys458Ser 5 Для вимірювання проліферації 10 Т-клітину тяжкому ланцюгу та Cys214Ser у легкому ланцюреспондентів людини шкубували при 37°С з 104 гу Ці мутації вводили за допомогою мутагенезу на опроміненими (20000рад) стимулюючими клітинаоснові ПЛР та одержану ПОСЛІДОВНІСТЬ ДНК підтвеми у 200мл повного середовища у 96-луночному рджували секвенуванням мікротитраційному планшеті з U-дном з різними Експресія у ферменті та очищення 5T4Fabкількостями гібридів C215Fab-SEA/E протягом 72 SEA годин Проліферацію оцінювали по включенню Експресійна плазміда містить ген СТІЙКОСТІ ДО [3Н]-тімідину, як описано (Dohlsten et al , 1988) канаміцину та 1acUV5-npoMOTop, який може шдуАналіз шкубованого Fab-SAg продуціювапня цюватися IPTG Злиті білки очищували з освітлеІЛ-2 ного культурального середовища з використанням 5 Клітини МИШИНОІ пбридоми Т - Т (10 ) шкубуПротеїн G-Сефарози та SP-Сефарози (Pharmacia вали у 200мл повного середовища R-середовища Biotec, Uppsala, Sweden) та переводили у цитратз химерними білками C215Fab-SEA/E у присутносний буфер за допомогою Сефадексу G-25 в осноті 2 х 104 стимулюючих клітин Raji Після 48 годин вному, як описано Характеристика за допомогою супернатанта збирали та аналізували на присутелектрофорезу в ДСН-ПААГ, зворотнофазової ність мишиного ІЛ-2 Коротше, вміст цитокша анаВЖХ (ВЖХ у зверненій фазі) та мас-спектрометри лізували з використанням пацюкових mAb проти показала, що очищений злитий білок мав чистоту мишиного цнтокшу в якості зв'язуючих антитіл, 95% та мав правильну молекулярну масу Очищені пацюкові антитіла проти мишиного ІЛ-2, РЕЗУЛЬТАТИ Модифікації суперантигену пацюковий ІЛ-2 були придбані з PharMmgen (San Суперантиген-залежну клітинну цитотоксичDiego, CA) Мічені біотином тАЬпроти цитокша, ність (SDCC)C215Fab/SEA і C215Fab-SEE проти набір Vectastam ABC (Vector Laboratories, CA) виМНС класу ІҐ-клітин Raji аналізували з викорис 17 46772 18 танням SEA- і SEE-реактивних Т-клітин людини в з використанням SEA-реактивних Т-клітин людини якості ефекторних клітинних ЛІНІЙ Недивлячись на в якості ефекторів Величини ЕС50 всіх гібридів різницю у Vp-специфічності між SEA і SEE обидва C215Fab-SE, а також C215Fab-SEAwt та -SEEwt суперантигена виявляли індукцію порівнюваного (wt = дикого типу) знаходяться у межах помилок 12 11 ступеня цитотоксичності з обома ефекторними (наприклад, 10 - 10 М, Фіг 5) Єдиною ВІДМІННІклітинними ЛІНІЯМИ (Фіг 1) Для розрізнення між СТЮ, що детектується, є трохи знижене плато для ефектами надання МНС класу II і прямими діями гібриду C215Fab-SEE/A-AH, що вказує на втрату ТSEA і SEE у впізнанні TCR їх досліджували у тесті клітин 3 іншого боку, у ЄАОСС-експерименті, де суперантиген-антитіло-залежної клітинної цитотокцитотоксичність спрямована на ЛІНІЮ МНС класа II + сичності (SADCC) проти експресуючих С215 клітин /С215 -клітин Соіо205, тільки гібриди C215FabСоіо205 У цьому тесті Fab-частина спрямовує SEE/A-A, C215Fab-SEE/A-AH та C215Fab-SEE/Eзлитий білок до експресуючих С215 клітинBDEG індуцювали цитотоксичність, що порівнюмішеней і призводить до надання злитих молекул ється з цитотоксичністю C215Fab-SEAwt (Фіг 5) SE цитотоксичним Т-клітинам (CTL) незалежно від Гібрид C215Fab-SEE/A-F здатний індуцювати молекул МНС класу II (Dohlsten et al , 1994) Не С215-спрямовану цитотоксичність при більш висо10 дивлячись на > 80% ідентичність амінокислотної ких концентраціях (ECso > 10 М) Хоча гібрид ПОСЛІДОВНОСТІ між SEA і SEE, взаємодія з TCR SEA C215Fab-SEE/A-AH здатний індуцювати С215і SEE виявляє ЯКІСНІ різниці у цьому типі тесту спрямовану цитотоксичність з такою ж ECso, що і Злитий білок C215Fab-SEA зберігає його здатність С215Fab-SEAwt (наприклад, ЕС50 10 13М), абсолюспрямовувати SEA- і SEE-реактивні CTL проти тний рівень цитотоксичності значно зменшується МНС класу ІІ-клітин-мішеней (Фіг 1), тоді як (Фіг 5) Ця ВІДМІННІСТЬ могла б бути наслідком обC215Fab-SEE не може індуціювати цитотоксичмеженої Vp-специфічності C215Fab-SEE/A-AH, ність щодо МНС класу ІІ-клітин-мішеней ні з SEA, хоча здатність індуцювати С215-спрямовану цитоні з SEE-реактивними CTL (Фіг 1) токсичність переважає у відповідаючій субпопуляцм Т-клітин Для подальшого дослідження цієї ідеї Раніше повідомлялося іншими дослідниками, ми приготували \/р22-олігоклональну ЛІНІЮ CTL що ВІДМІННІСТЬ у Vp-специфічності між SEA та SEE людини Vp22 людини аналогічні Vp3 мишей у топервинно зв'язана з ВІДМІННОСТЯМИ у трьох аміному відношенні, що вони являють собою сімейство кислотах у петлі, що передує спіралі а5, а у спіралі Vp, специфічне для SEA та неспецифічне для а5 (Irwm et al , 1992, Hudson et al , 1993, Fraser et SEE, Раніше було показано (Molhck et al , 1993), al , 1993 і Molhck et al , 1993) РІЗНИЦІ ЩОДО взаєщо головний внесок Vp SEA і SEE первинно пов'ямодії з TCR, повідомлені у цьому дослідженні, не заний з ВІДМІННІСТЮ в трьох амінокислотах між SEA зв'язані зі зміненою TCR Vp-специфічністю, оскільі SEE в районі Н (АА 200 - 207) В SDCC-тестах ки здатність C215Fab-SEA індуцювати МНС класа проти МНС класу ІҐ-клітин Raji (мішеней) з викоІІ-незалежну цитотоксичність не обмежується SEAристанням \/р22-олігокл опальної лінії CTL в якості реактивними CTL, але також спостерігається з ефекторів тільки гібриди, що містять район SEA-H, SEE-реактивними CTL здатні давати C215Fab-SEAwt-nofli6Hy реакцію Аналіз гомології ПОСЛІДОВНОСТІ SEA та SEE ВІДПОВІДІ (наприклад, C215Fab-SEE/A-H, C215Fab(Фіг 2) виявляє, що неідентичні амінокислотні заSEE/-AH та C215Fab-SEA/E-BDEG, Фіг 6) Гібрид лишки сконцентровані у восьми різних районах C215Fab-SEA/A-A, який здатний індуціювати повну Поза цих ВІСІМ районів, що складають до 34% ПОSDCC-ВІДПОВІДЬ з усіма популяціями CTL в якості СЛІДОВНОСТІ, ідентичність двох SE становить 97%, ефекторів, у цьому тесті сильно знижений як щодо причому за решту відмінностей ВІДПОВІДНІ консернапівмаксимальної концентрації, так і щодо плато вативні амінокислотні заміни Чотири з негомолоп(Фіг 6) Коли цитотоксичність Vp22 CTL спрямова+ чних районів структурно близькі до двох сайтів на на ЛІНІЮ МНС класу II/С215 -клітин Соіо205, зв'язування МНС класу II (В, D, Е і G), і вони, матільки гібриди, що містять як SEA-A, так і SEA-H буть, не взаємодіють з TCR (ФігЗ) Додаткові чо(наприклад, C215Fab-SEE/A-AH і C215Fab-SEE/Eтири райони (А АА 20 - 27, С 60 - 62, F 161-176 BDEG) райони, здатні індуціювати цитотоксичну та Н 200 - 207) локалізовані на КІНЦІ молекули ВІДПОВІДЬ, що порівнювану з ВІДПОВІДДЮ, ЩО інду(ФігЗ), поблизу сайту зв'язування TCR, розташоцюється С215Fab-SEAwt (Фіг 6) Гібрид, що містить ваного у канавці між двома субдоменами (Kappler тільки район A SEA (C215 Fab-SEE/A-A), індуцює et al , 1992) Для дослідження якісної ВІДМІННОСТІ В більш низький рівень цитотоксичності з порівняльупізнанні TCR між SEA та SEE ми виготовили гібною величиною ЕС50 Це вказує на те, що решта ридні білки щепленням районів з SEA та SEE у активності, що спостерігається з гібридом вигляді химер одного району (SEE/A-A, -С, -F, Н) у C215Fab-SEE/A-AH, у тесті SADCC з популяцією вигляді гібридів двох районів (SEE/a-AH) та щепцілих Т-клітин в якості ефекторів не є наслідком ленням районів, локалізованих поблизу сайтів ВІДПОВІДІ, що індуційованої гібридом, у рестриктузв'язування МНС класу II на SEE у SEA (SEA/Eрованій популяції Т-клітин Більш ймовірним поясBDEG) (Фіг 4) Всі ці химерні SE експресу вал и ся у ненням цього спостереження є те, що здатність вигляді злитих білків з C215Fab для виявлення індуціювати SADCC-від повідь гібридних білків відмінностей щодо їх активності у відсутності МНС C215Fab SE первинко зв'язана з районом SEA-A класа II та з меншим внеском з боку районів SEA-H і -F Немає доказів, що ця якість обмежується тільки Гібридні білки SEA/E, злиті з C215PFabбудь-якою субпопуляцією Т-клітин у поєднаній часттюю, виявляють ВІДМІННІСТЬ у Fab-націлених SEA-SEE-відповідаючій популяції Т-клітин, оскільтестах цитотоксичності ки гібрид C215Fab-SEA здатний індуціювати ту ж SDCC-активність гібридних білків C215FabSEE/A проти МНС класу ІҐ-клітин Raji аналізували 20 19 46772 саму ВІДПОВІДЬ з SEE-реаісгивними CTL, та гібрид тивність (Фіг 8) Подібну Сіркореактивність спостеC215Fab-SEE/A-A здатний повністю відтворювати рігали також проти химери C215Fab-SEE/A Однак ВІДПОВІДЬ, що спостерігається з С215Fab-SEA окремі щеплення району A SEA (C215Fab-SEE/AА) дали C215Fab-SEE-nofli6Hy Сіркореактивність, Гідридні білки SEA/E, злиті з С215Fabщо говорить про те, що за решту сіркореактивності частиною, виявляють ВІДМІННІСТЬ у Fab-націлених проти C215Fab-SEE/A-AH відповідальний район Н тестах проліферації SEA Це вказує на те, що район Н SEA є домінуюРаніше було показано, що очищені спочиваючі чим антигенним епітопом у SEA Сіркореактивність неактивні Т-клітини людини індуцюються щодо поєднаних проб сироваток з інших частин світу проліферації при наданні C215Fab-SEA на лінії + (Японії та СІЛА), а також 14 окремих проб з Швеції МНС класу N/C215/CD80 -miTHH (Lando et al, підтверджує один і той же загальний характер ре1993) Але, здатність C215Fab-SEA індуціювати зультатів (не показано) МНС II-незалежну проліферацію помітно зменшується з C215FabSEE (Таблиця 1) Для дослідженРЕЗУЛЬТАТИ Мутації Fab-частини злитих білня, чи пов'язана ця ВІДМІННІСТЬ В ЯКОСТІ також з ків районом A SEA, як це спостерігали у SADCCЕкспресія конструкцій 5T4FabSEA тестах, ми досліджували проліферативну активБуло виявлено, що рівень продуцювання ність гібридів C215Fab-SE, що надаються або 5T4Fab-SEA у Е соїі у ферменті значно нижче, ніж + + + + CHO-DR1 /CD80 , або СНО-С215 /СВ80 трансфіу інших конструкцій Fab-суперантиген, досліджекованними клітинними ЛІНІЯМИ, на очищених споних у нашій лабораторії Тому були введені два чиваючих Т-клітинах людини При наданні кон'югатипа модифікацій для збільшення рівня продуцю+ + тів Fab-SE на CHO-DR1 /CD80 не було вання По-перше, були введені сім різних точкових відмінностей між різними білками SE (дані не намутацій у каркасну область легкого ланцюга Це ведені) Але, щеплення районів А, С і Н SEA у SEE були PheiOSer, Thr45Lys, Ne63Ser, Tyr67Ser, посилюють проліферативну активність порівняно Phe73l_eu, Тпг77Эегта Leu78Val По-друге, залишC215Fab-SEE Найкращі результати були одержаки цистеїну, що утворюють дисульфідний зв'язок, ні шляхом прищеплення районів А та Н SEA, що що поєднує тяжкий та легкий ланцюги, були замівказує на важливу роль району А, як це спостерінені залишками серину Остання модифікація пригали для МНС класу ІІ-незалежної цитотоксичносзвела до трикратного збільшення, а 7 точкових ті Можливо, що при застосуванні негативної селемутацій призвели до додаткового 12-кратного збікції ВІДМІННОСТІ між Fab-SEA і -SEE були більш льшення рівня продуцювання Крім значного збізначними льшеного рівня продуцювання, видалення дисульфідного зв'язку також призвело до одержання Vp-специфічтсть SE-пбридів більш гомогенного продукту, оскільки виключена Для подальшого дослідження, чи зв'язані гібможливість реакції реакційноздатнихтюлових груп ридні злиті білки C215Fab-SEA/SEE з визначеною з іншими агентами, що містять тіол Vp-специфічністю, ми використовували SEAреактивні мишині Т-клітинні пбридоми, експресуюМодифіковану молекулу 5Т4 перевіряли на чі Vp1, Vp3 і Vp11 3 одержаних даних очевидно, споріднення з її антигеном, а також на біологічну що всі досліджені райони, прямо або опосередкоактивність у SADCC-тестах У цих тестах не змогвано, впливають на взаємодію з TCR При щепли виявити відмінностей між мутантною формою ленні районів С і F SEA в C215Fab-SEE активність та формою дикого типу щодо SEA- і SEE-перехресно реактивної VpМутацію Cys/Ser одержували також у тяжких і пбридоми 11ВЗ знищується Ти ж самі химери, малегких ланцюгах фрагментів Fab декількох інших буть, не впливають або здійснюють незначний моноклональних антитіл Продукти ставали гомовплив на активність Vp3- і VpH-пбридом (2 В4 і генними та повністю зберігали їх здатність зв'язу1140) порівняно з C215Fab-SEE При щепленні вання антигену району A SEA у C215Fab-SEE активність щодо ПОСЛІДОВНІСТЬ району каркасної області антиVp3 (2 В4) збільшується, принаймні, у 10 разів потіла для Vk-ланцюга 5Т4 рівняно з C215Fab-SEE Більш помітно виражені DAVMTQTPTFLLVSAGDRVTI TCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPTLL ISY50 TSSRYAGVPDRFIGSGYGTDFTFTISTLQAEDLAVYFCQQDYNSPPTFGG100 ефекти спостерігаються з тою ж клітинною ЛІНІЄЮ GTKLEIK(SEQ ID NO 6) при щепленні району Н SEA у C215Fab-SEE Цей Підкреслені ПОСЛІДОВНОСТІ є CDR Положення, більш сильний ефект щодо впливу району Н SEA виділені більш жирним шрифтом, були мутовані на Vp-специфічність відзначався також у більш PheiOSer, Thr45Lys, Ne63Ser, НебЗТпг, Tyr67Ser, ранніх дослідженнях (Molhck et al , 1993) Однак, та Phe73Leu, Thr77Ser і Leu78Val ж сама химера (C215Fab-SEE/A-H), мабуть, зменТаблиця 1 шує активність щодо SEA/SEE-перехресно реактивних Vp1- і VpH-пбридом (І1ВЗ і 11 40) у 10 раз Проліферація (ЕСбо(пМ)) На завершення, можна відзначити, що взаємодія з C215Fab-SEAwt 2,2 SEA з TCR, мабуть, включає в себе всі варіабельні C215Fab-SEEwt 6,9 райони А, С, F і Н SEA-SEE C215Fab-SEE/A-A 0,9 Сіркореактивність C215Fab-SEE/A-C 2,8 Сіркореактивність у пробах сироваток людини C215Fab-SEE/A-F 5,7 щодо химерних SE досліджували як у поєднаних C215Fab-SEE/A-H 1,0 пробах у різних частин світу, так і в індивідуальних C215Fab-SEE/A-AH 0,3 пробах сироваток Шляхом щеплення обох районів C215Fab-SEA/E-BDEG 1,6 А і Н SEA у SEE ми одержали проміжну Сіркореак 21 22 46772 Таблиця 2 HB3(MuVp1) C215Fab-SEA C215Fab-SEE C215Fab-SEE/A-A C215Fab-SEE/A-C C215Fab-SEE/A-F C215Fab-SEE/A-H C215Fab-SEE/A-AH 2 B4(MuVp3) 11 40(MuVp11) EC50(HM) EC50(HM) EC50(HM) 10 10 10 3 > 1000 > 1000 >300 > 1000 >300 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 100 10 3 3 0,3 0,3 Підписи ДО фігур Фіг 1 МНС класу ІІ-залежна та -незалежна цитотоксичність з SEE-1 SEA-CTL людини МНС класу ІІ-залежна клітинна цитотоксичність (А і В) і С215-залежна клітинна цитотоксичність (С і D) з молекулами C215Fab-SEA (•) та C215Fab-SEE (•) в якості ефекторних молекул Цитотоксичність аналізували у стандартному 4годинному тесті вивільнення 51Сг з використанням SEE-реактивноі лінії Т-клітин людини (А і С) та SEA-реактивноі лінії Т-клітин людини (В і D) Клітинними лініями-мішенями були МНС класу ІҐклітин Raji (А і В) та МНС класу II/С215+-клітин Colo205 (C і D) Представлені дані з окремих тестів, які представляють два (А і С) - п'ять (В і D) незалежних експериментів Фіг 2 Аналіз гомології первинної структури SEA і SEE Варіабельні райони SEA/SEE поблизу сайту зв'язування TCR (А, С, F і Н) та варіабельні райони поблизу двох сайтів зв'язування МНС класу II Фіг 3 ЕСКІЗ моделі SEA Модель (Molscnpt model, Krauhs, 1991) кристала SEA (Schad et al , 1995) Варіабельні райони SEA/SEE поблизу сайта зв'язування TCR (A, C, F і H) та варіабельні райони поблизу двох сайтів зв'язування МНС класу II Іон цинку у вигляді круглого шарика Фіг 4 Схематичне представлення химерних молекул SE Відрізки ПОСЛІДОВНОСТІ SEA знижені Варіабельні райони SEA/SEE позначені А, В, С, D, F, G і Н Фіг 5 МНС класу ІІ-залежна та -незалежна цитотоксичність з SEA-CTL людини (А) МНС класу ІІ-залежна клітинна цитотоксичність і (В) С215-залежна клітинна цитотоксичність C21SFab-SEE/A-A (•), C215Fab-SEE/A-C (Л), C215Fab-SEE/A-F (0), C215Fab-SEE/A-H (•), C215Fab-SEE/A-AH (Д) і C215Fab-SEA/E-BDEG (О) Цитотоксичність аналізували у стандартному 4-годинному тесті вивільнення 51Сг з використанням SEA- реактивної лінії Т-клітин людини Клітинними лініями-мішенями були МНС класу ІҐ-клітин Raji (А) та МНС класу II/С215+-клітин Соіо205 (В) Представлені дані з окремих тестів, які представляють п'ять незалежних експериментів Фіг 6 МНС класу ІІ-залежна та -незалежна цитотоксичність з Vp+CTL людини (А) МНС класу ІІ-залежна клітинна цитотоксичність і (В) С215-залежна клітинна цитотоксичність C215Fab-SEA (•), C215Fab-SEE (•), C215FabSEE/A-A (•), C215Fab-SEE/A-C (•), C215FabSEE/A-F (0), C215Fab-SEE/A-H (•), C215Fab 10 SEE/A-AH (Д) і C215Fab-SEA/E-BDEG (О) в якості ефекторних молекул Цитотоксичність аналізували 51 у стандартному 4-годинному тесті вивільнення Сг з використанням \/р22-відібраноі SEA-реактивноі лінії Т-клітин людини Клітинними ЛІНІЯМИмішенями були МНС класу ІҐ-клітин Raji (А) та МНС класу ІІ/С215+-клітин Соіо205 (В) Представлені дані з окремих тестів, які представляють два незалежних експерименти Фіг 7 МНС класу ІІ-залежна та -незалежна проліферація (не наведена у пріоритетних заявках) Дія гібридів Fab-SE на МНС класу ІІ-залежну (А) та -незалежну (В) проліферацію Т-клітин Очищені Т-клітини людини стимулювали протягом 96 годин C215Fab-SEA (•), C215Fab-SEE (•), C215Fab-SEE/A-A (•), C215Fab-SEE/A-C (Л), C215Fab-SEE/A-F (0), C215Fab-SEE/A-H (•), C215Fab-SEE/A-AH (Д) і C215Fab-SEA/E-BDEG (O) представленими на МНС класу ІҐ/С215 СНОDR4/C215 - трансфектантах (А) та МНС класу II /C215+-CHO-CD80/C215 - трансфектантах (В) Після 72 годин клітини імпульсно-мітили [ЗН]ТІМІДИНОМ протягом 24 годин і включену мітку вимірювали та представляли у вигляді напівмаксимальної концентрації (ECso) Представлені дані з окремих тестів, які представляють два незалежних експерименти Фіг 8 Сіркореактивність у пулу Ід людини Пул з > 5000 сироваток зі здорових донорів у Південній Європі проти злитих білків Серійно розведеному Ід людини давали взаємодіяти протягом 1 години при кімнатній температурі з C215FabSEAwt, C215Fab-SEEwt, C215Fab-SEE/A-A, C215Fab-SEE/A-H і C215Fab-SEE/A-AH, (мобілізованими на мікротитраційних планшетах при концентрації 1нг/лунку Корекцію на зв'язування з сироватковими білками робили відніманням ODвеличини для C215Fab у кожній точці Кожна точка являє собою середнє з двох повторностей (двох проб) Подальші деталі див у Матеріалах і способах Таблиця 1 Очищені Т-клітини людини стимулювали протягом 96 годин ВІДПОВІДНИМИ C242FabSE, представленими на МНС класу ІІ-негативних СНО-СО80/С215-трансфектантах Після 72 годин клітини імпульсно-мітили 3Н-ТІМІДИНОМ протягом 24 годин і включену мітку вимірювали та представляли у вигляді напівмаксимальної концентрації (ЕС50) Таблиця 2 Мишині Т-клітинні пбридоми стимулювали протягом 48 годин або химерним Fabкон'югованим суперантигеном Активність вимірю 23 46772 вали у вигляді продуцювання ІЛ-2 і представляли у вигляді напівмаксимальної концентрації (ECso) Робота протягом року пріоритету У спробі зведення до мінімуму токсичності злитого білка (суперантиген-антитіло) C215FabSEE/A-A химеру SEE/A-A мутували у сайтах зв'язування Класу II, як описано у WO 9601650 і зливали з C215Fab Були одержані конструкції С215Fab-SEE/A-A-D227A, C215Fab-SEE/A-AF47A/D227A, С215Fab-SEE/A-A-H187A/D227A, С215Fab-SEE/A-A-W130A/D227A, C215Fab-SEE/AA-D70A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-N50S/D227A, C215Fab-SEE/A-A-N50S/D70A/D227A, C215FabSEE/A-A-F47Y/D227A осп С215Fab-SEE/A-AD70R/D227A Всі злиті білки досліджували на здатність індуціювати проліферацію РВМС людини для ідентифікації мутантів, що мають знижену активність порівняно з C215Fab-SEE/A-A-D227A Знижену проліферативну активність спостерігали для С215Fab-SEE/A-A-F47A/D227A, C215FabSEE/A-A-F47Y/D227A, осп С215Fab-SEE/A-AD70R/D227A Деякі з химерних злитих білків досліджували також на титр антитіл у нормальній сироватці людини (C215Fab-SEE/A-A-D227A, C215FabSEE/A-A-D70A/D227A і С215Fab-SEE/A-AD70R/D227A) Проводили порівняння з C215FabSEA-D227A і C215Fab-SEE-D227A Відносно C215Fab-SEA-D227A, титр був набагато нижче для кожної дослідженої химери Відносно C215FabSEE-D227A, титр був трохи вище для кожної химери Це означає заміни у положеннях, що відповідають одній або декільком, переважно двом, з положень 47, 50, 70, 130, 187, 227, згідно нумерації ySEQ ID №7 і 8 у Фіг 2 Оскільки багато різних варіантів та змін можуть бути зроблені в об'ємі описаної тут концепції винаходу, та оскільки можуть бути зроблені модифікації в описаних тут детально варіантах ВІДПОВІДНО до передбачених вимог закону до формули винаходу, повинно бути зрозуміло, що описані тут деталі повинні розглядатись як ілюстративні, а не як обмежувальні СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 24 ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ Ш И З (t) ХАРАКТЕРИСТИКИ (B) ТИП куюіеіновакнсяота (C) ШЖКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ ояик (D) ТОПОЛОГІЯ митна (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ ACTAQTCGAC ІЯ SEQ ID № З A IXKiATGOAG СТЇТАТС Mi V ГС Г і ЩФОРМАЩЯ ДЛЯ SEQ ID 16 4 (і) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА. 41 пн (B) ТИП нуклеїнова кислоти (C) КІЛЬКІСТЬ ЛАШДОГІВ один (D) ТОПОЛОГІЯ лшШна (а) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ Ш № 4 ACTAGTCGAC m 4TGGGCITCA AGATGGAQTC ACAKWYYCWG G ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ SEQ ID № 5 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ (A) ДОВЖИНА 34 п в (B) ТИП нуклеїнова кислота (C) КІЛЬКІСТЬ ЛАНЦЮГІВ одна (D) ТОПОЛОГІЯ лінійка