Послаблений штам mycoplasma gallisepticum

Реферат: Винахід належить до послабленого штаму бактерій М. gallisepticum, що виявляє зменшену експресію білка MGA_0621 та має депозитарний номер АТСС РТА-8485. Також винахід належить до вакцини та способу вакцинації, що полягають у застосуванні послабленого штаму бактерій М. gallisepticum. UA 98506 C2 (12) UA 98506 C2 UA 98506 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0001] Заявлений винахід стосується мікробіології та імунології. Більш конкретно, винахід стосується нових вакцин проти бактеріальних патогенів. [0002] Мікоплазми є невеликими прокаріотними організмами (0,2-0,3 мкм), що належать до класу Mollicutes, чиїм членам бракує стінок клітин та які мають невеликий розмір генома. Mollicutes охоплюють принаймні 100 видів мікоплазм. Види мікоплазм є спричинювальними агентами кількох хвороб у людини та тварин, а також у рослин. M. gallisepticum, наприклад, відповідає за значні стани хвороб у домашньої птиці. M. gallisepticum асоціюється з гострою респіраторною хворобою у курей та індиків та може також спричинювати вищу респіраторну хворобу у пернатої дичини. На додаток, M. gallisepticum виявлено як причину кон'юнктивіту у домашніх зябликів у Північній Америці. [0003] Ефективною стратегією для профілактики та лікування хвороб, спричинених інфекцією M. gallisepticum, є вакцинація живими послабленими штамами бактерій M. gallisepticum. Переваги живих послаблених вакцин, загалом, охоплюють усі доречні імуногенні детермінанти інфекційного агенту у його природній формі стосовно імунної системи хазяїна, та необхідність у відносно невеликій кількості імунізувального агенту внаслідок здатності агенту розмножуватися у вакцинованому хазяїні. [0004] Штами живих послаблених вакцин часто створюють серійним пасируванням вірулентного штаму багато разів у середовищах. Хоча штами живих послаблених вакцин проти M. gallisepticum отримані серійним пасируванням, такі штами загалом погано охарактеризовані на молекулярному рівні. Припускають, що послаблені штами, зроблені серійним пасируванням, мають накопичені мутації, які надають мікроорганізмам меншої вірулентності, але ще здатні до реплікації. Стосовно послаблених штамів M. gallisepticum, однак, результати мутацій, що призводять до послаблення (наприклад, ідентичності білків, чия картина експресії змінена у послабленому штамі), є звичайно невідомими. [0005] Відповідно, існує необхідність у нових живих послаблених бактеріях M. gallisepticum, що охарактеризовані на протеомічному рівні та є безпечними та ефективними у композиціях вакцин. [0006] Заявлений винахід частково базується на несподіваному відкритті, що бактерії M. gallisepticum, що виявляють зменшену експресію поліпептиду, що має амінокислотну послідовність SEQ ID N0:1 є безпечними та ефективними при застосуванні як вакцини проти інфекції M. gallisepticum у птиць. Поліпептид SEQ ID NO: 1 є також позначеним як "MGA_0621," та має NCBI № NP_852784. [0007] Відповідно, заявлений винахід стосується живих послаблених бактерій M. gallisepticum, що виявляють зменшену експресію MGA_0621, відносно природного M. gallisepticum. У конкретному необмежувальному зразковому втіленні винахід стосується живого послабленого штаму M. gallisepticum, що виявляє зменшену експресію MGA_0621, та крім того виявляє зменшену експресію одного або більше білків, вибраних з групи: піруват дегідрогеназа, фосфопіруват гідратаза, 2-дезоксирибоза-5-фосфат альдолаза, та рибосомальний білок L35, відносно природних бактерій M. gallisepticum. Згідно з конкретними втіленнями заявленого винаходу, живі послаблені бактерії M. gallisepticum винаходу є охарактеризованими протеомічним аналізом як такі, що мають зменшену експресію одного або більше з вищезгаданих білків. В одному зразковому втіленні заявленого винаходу, живим послабленим штамом M. gallisepticum є штам, що виявляє зменшену експресію вибраного з групи: MGA_0621, піруват дегідрогеназа, фосфопіруват гідратаза, 2-дезоксирибоза-5-фосфат альдолаза, та рибосомальний білок L35, відносно природних бактерій M. gallisepticum, цей штам було депоновано у American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, у червні 19, 2007, та позначено № РТА-8485. Цей штам є альтернативно позначено тут як "штам M. gallisepticum MGx+47," або "MG-P48". [0008] Заявлений винахід також стосується композицій вакцин, що містять живі послаблені бактерії M. gallisepticum винаходу, а також способів вакцинування тварини проти інфекції M. gallisepticum. [0009] На додаток, заявлений винахід стосується способів створення та/або ідентифікування послаблених клонів M. gallisepticum. Згідно з цим аспектом винаходу, способи полягають у піддаванні первісної популяції бактерій M. gallisepticum послаблювальним умовам, дослідження індивідуальних клонів стосовно зменшеної експресії MGA_0621, відносно природного M. gallisepticum, та тестування клонів на вірулентність. Клони M. gallisepticum, отримані способами цього аспекту винаходу повинні виявляти зменшену експресію MGA_0621, та можуть як варіант виявляти зменшену експресію одного або більше додаткових білків, вибраних з групи: піруват дегідрогеназа, фосфопіруват гідратаза, 2-дезоксирибоза-5-фосфат альдолаза, та рибосомальний білок L35. Переважно, штами, що виявляють зменшену експресію принаймні 1 UA 98506 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одного з вищезгаданих білків також виявляють зменшену вірулентність відносно природної бактерії M. gallisepticum. [0010] Фіг. 1 є фотографією двовимірного (2-D) поліакриламідного гелю, що представляє плями білку послабленого штаму M. gallisepticum MGx+47. Заокруглені плями під номерами 19, 49, 74, 108, 114, 127, 147, 166, 175 та 225 відповідають білкам, що є ап-регульованими у MGx+47 відносно природного штаму R-980. Заокруглені плями під номерами 40, 68, 98, 99, 130, 136 та 217 відповідають білкам, що є даун-регульованими у MGx+47 відносно природного штаму R-980. [0011] Заявлений винахід стосується живих послаблених бактерій M. gallisepticum, що є придатними для застосування у композиціях вакцин. Бактерії M. gallisepticum заявленого винаходу виявляють зменшену експресію білку, позначеного як MGA_0621. У конкретних втіленнях, бактерії M. gallisepticum винаходу крім того виявляють зменшену експресію одного або більше додаткових білків, вибраних з групи: піруват дегідрогеназа, фосфопіруват гідратаза, 2-дезоксирибоза-5-фосфат альдолаза, та рибосомальний білок L35, відносно експресії цих білків у природній бактерії M. gallisepticum тих же видів. [0012] MGA_0621 є ідентифікованим під № NCBINP_852784 і має нижченаведену амінокислотну послідовність зі 162 амінокислот: MTRTMKNKKAKKKERRFTDLSADLDEEVEKIDPEYEDFKEIKIEKNKDNQVIDKNDPF FYSESFEEARIQLIKDKKVEVKKEEEKVQETTVKNKISEAKKEEAKDVYIDSSLEIASQEPLt KGMHFYTNSRIIRKVRECAKNKGLSISRLITMILDKSIKEE. (SEQ ID NO:1). ЗМЕНШЕНА ЕКСПРЕСІЯ БІЛКІВ M. GALLISEPTICUM [0013] Спеціаліст здатний визначити звичайними способами молекулярної біології, чи виявляє послаблена бактерія M. gallisepticum зменшену експресію одного або більше білків, що є звичайно експресованими у клітинах природної бактерії M. gallisepticum. Визначення, чи виявляє послаблена бактерія зменшену експресію певного білку (наприклад, MGA_0621, піруват дегідрогеназа, фосфопіруват гідратаза, 2-дезоксирибоза-5-фосфат альдолаза, рибосомальний білок L35, тощо), відносно природної бактерії, можна досягти кількома відомими способами. Зразкові способи охоплюють, наприклад, кількісні способи на базі антитіл, як-то Вестерн-блотування, радіоімунодослідження (RIA), та імуносорбентні дослідження на зв'язаних ферментах (ELISA), в якій застосовують антитіло яке визначає та зв'язується з потрібним білком. На додаток, оскільки рівні інформаційної PHK (ІРНК) загалом свідчать про кількість білку, кодованого нею, кількісні способи на базі нуклеїнових кислот можна також застосовувати для визначення, чи виявляє послаблена бактерія M. gallisepticum зменшену експресію одного або більше білків. Наприклад, способи кількісної зворотно-транскриптазної/полімеразної ланцюгової реакції (RT-PCR) можна застосовувати для виміру кількості ІРНК, що відповідає певного потрібного білку. Ряд кількісних способів на базі нуклеїнових кислот є добре відомими. [0014] Нижченаведене є необмежувальним зразковим способом, що можна застосовувати для визначення, чи виявляє послаблена бактерія M. gallisepticum зменшену експресію білку, якто, наприклад, MGA_0621. [0015] Спершу, популяцію послаблених клітин M. gallisepticum та популяцію природних клітин M. gallisepticum вирощують по суті в ідентичних умовах по суті у тому ж культиваційному середовищі. Далі, дві популяції клітин піддають руйнуванню. Зруйновані клітини (або їх фракції з вмістом білку) піддають, паралельно, електрофорезу на поліакриламідному гелі SDS (SDSPAGE) та тоді Вестерн-блотуванню з антитілами, котрі приєднуються до білку M. gallisepticum MGA_0621 (такі антитіла можна отримувати стандартними способами, що є добре відомими). Мічене вторинне антитіло тоді застосовують для вимірного сигналу, що є пропорційним кількості білку від клітин. Якщо кількість сигналу, виявленого послабленим штамом M. gallisepticum, є меншою ніж кількість сигналу, виявленого природним штамом M. gallisepticum, тоді можна вважати, що послаблений штам виявляє зменшену експресію MGA_0621 відносно природного штаму. Варіації цього зразкового способу, а також альтернативи відомі спеціалістам. [0016] Заявлений винахід стосується послаблених бактерій M. gallisepticum, що виявляють будь-який ступінь зменшення експресії білку (наприклад, MGA_0621, піруват дегідрогеназа, фосфопіруват гідратаза, 2-дезоксирибоза-5-фосфат альдолаза, рибосомальний білок L35, тощо) порівняно з експресією білку з природного штаму. У конкретних втіленнях, послаблена бактерія виявляє принаймні приблизно на 5 % меншу експресію білку відносно природної бактерії. Як приклад, якщо дана кількість природного штаму M. gallisepticum виявляє 100 одиниць експресії певного білку, а та ж кількість кандидатного послабленого штаму M. gallisepticum виявляє 95 одиниць експресії білку, тоді вважають, що послаблений штам виявляє на 5 % меншу експресію білку відносно природної бактерії (додаткові приклади для розрахунку "проценту меншої експресії" є представленими тут в іншому місці). В інших конкретних 2 UA 98506 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 втіленнях послаблена бактерія виявляє принаймні приблизно на 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % меншу експресію білку відносно природної бактерії M. gallisepticum. B інших втіленнях послаблений штам M. gallisepticum не виявляє експресії (тобто, 100 % меншу експресію) білку відносно природної бактерії M. gallisepticum. [0017] У певних зразкових втіленнях заявленого винаходу, послаблені бактерії виявляють принаймні на 5 % меншу експресію MGA_0621, та як варіант принаймні на 5 % меншу експресію одного або більше білків, вибраних з групи: піруват дегідрогеназа, фосфопіруват гідратаза, 2дезоксирибоза-5-фосфат альдолаза, та рибосомальний білок L35, відносно природної бактерії M. gallisepticum. [0018] Як застосовувано тут, "процент меншої експресії" певного білку, виявлений послабленим штамом M. gallisepticum відносно природного штаму, розраховують за нижченаведеною формулою: (А - В) / А х 100; де А = відносний рівень експресії білку у природному штамі M. gallisepticum; та В = відносний рівень експреси білку у послабленому штамі. Для ілюстрації, якщо природний штам M. gallisepticum виявляв 0,2500 одиниць експресії білку ѕ», а послаблений штам M. gallisepticum виявляв 0,1850 одиниць експресії білку "Y", тоді послаблений штам виявляє [(0,2500-0,1850) / 0,2500 х 100] = 26 % меншу експресію білку "Y" відносно природного штаму. Таблиця 5 у прикладі 3 тут стосується додаткових ілюстративних прикладів проценту меншої експресії, розраховуваного для зразкового послабленого штаму M. gallisepticum відносно природного штаму M. gallisepticum. КОМПОЗИЦІЇ ВАКЦИН [0019] Заявлений винахід також стосується композицій вакцин, що містять живі послаблені бактерії M. gallisepticum винаходу та фармацевтично прийнятний носій. Як застосовувано тут, вираз "жива послаблена бактерія M. gallisepticum винаходу" охоплює будь-яку живу послаблену бактерію M. gallisepticum, що описано та/або заявлено тут в іншому місці. Фармацевтично прийнятним носієм може бути, наприклад, вода, стабілізатор, консервант, культиваційне середовище або буфер. Композиції вакцин, що містять послаблені бактерії M. gallisepticum винаходу, можна отримати у формі суспензії або у ліофілізованій формі або, альтернативно, у замороженій формі. При заморожуванні гліцерин або інші подібні агенти можна додавати для посилення стабільності при заморожуванні. СПОСОБИ ВАКЦИНУВАННЯ ТВАРИН Заявлений винахід також стосується способів вакцинування тварини проти інфекції M. gallisepticum. Способи згідно з цим аспектом винаходу полягають у застосуванні до тварини імунологічно ефективної кількості композиції вакцини, що містить живу послаблену бактерію M. gallisepticum винаходу. Як застосовувано тут, вираз "жива послаблена бактерія M. gallisepticum винаходу" охоплює будь-яку живу послаблену бактерію M. gallisepticum, що описано та/або заявлено тут в іншому місці. Вираз "імунологічно ефективна кількість" означає кількість композиції вакцини, потрібну для вироблення захисних рівнів антитіл у тварини при вакцинації. Композицію вакцини можна застосовувати до тварини будь-яким відомим чином, як-то пероральний, інтраназальний, трансмукозальний, місцевий, трансдермальний та парентеральний (наприклад, внутрішньовенний, інтраперитонеальний, інтрадермальний, підшкірний або внутрішньом'язовий). Застосування можна також досягти за допомогою безголкових пристроїв. Застосування можна досягти комбінацією шляхів, наприклад, спершу парентеральним шляхом, а далі трансмукозальним шляхом, тощо [0020] Тваринами, до котрих застосовують послаблений штам M. gallisepticum, є переважно птиці, наприклад, кури або індики. Де тваринами є птиці, композиції вакцин винаходу можна застосовувати так, щоб композиції негайно або з часом входили у контакт з мембранами респіраторної слизової птиць. Таким чином, композиції вакцин можна застосовувати до птиць, наприклад, інтраназально, перорально, та/або інтраокулярно. Композиції вакцин для застосування до птиць можна формувати як описано вище та/або у формі придатній для застосування розпилюванням, у тому числі аерозоль (для інтраназального застосування) або у воду для пиття (для перорального застосування). [0021] Композиції вакцин заявленого винаходу, що застосовують розпилюванням або як аерозоль, можна формувати уведенням живих послаблених бактерій M. gallisepticum у невеликі частинки рідини. Частинки можуть мати початковий розмір крапель приблизно 10-100 мкм. Такі частинки можна створювати, наприклад, звичайними пристроями для розпилювання та генераторами аерозолю, у тому числі наявними у продажу генераторами спрею для ранцевого спрею, інкубаторного спрею та розпилюваного спрею. СПОСОБИ СТВОРЕННЯ ПОСЛАБЛЕНИХ КЛОНІВ M. GALLISEPTICUM 3 UA 98506 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0022] [0023] У ще одному аспекті заявленого винаходу, винахід стосується способів ідентифікування та/або створення послаблених клонів M. gallisepticum. Способи згідно з цим аспектом винаходу полягають у піддаванні первісної популяції бактерій M. gallisepticum послаблювальним умовам, таким чином створюючи гадано послаблену бактеріальну популяцію. Далі, індивідуальні клони гадано послабленої бактеріальної популяції досліджують стосовно зменшеної експресії MGA_0621, відносно природної бактерії M. gallisepticum. Клони, що є ідентифікованими як такі, що мають зменшену експресію MGA_0621, тоді тестують на вірулентність. Клони, що виявляють зменшену експресію MGA_0621 та зменшену вірулентність відносно природної бактерії M. gallisepticum є ідентифікованими як послаблені клони M. gallisepticum. [0024] Згідно з цим аспектом винаходу, "первісною популяцією бактерій M. gallisepticum" може бути будь-яка кількість бактерій M. gallisepticum. Бактерії, у конкретних втіленнях є природними бактеріями. Альтернативно, бактерії можуть містити одну або більше мутацій. Переважно, однак, бактерії у первісній популяції є клонально ідентичними або по суті клонально ідентичними; ці бактерії переважно усі походять з одної батьківської клітини бактерії M. gallisepticum та/або мають ідентичні або по суті ідентичні генотипові та/або фенотипові характеристики. [0025] Як застосовувано тут, термін "послаблювальні умови" означає умову або комбінацію умов, що мають потенціал для уведення одної або більше генетичних змін (наприклад, нуклеотидних мутацій) у геном бактерії M. gallisepticum. Зразкові, необмежувальні послаблювальні умови охоплюють, наприклад, пасирування бактерій у культурі, трансформування бактерій вставним у геном генетичним елементом, як-то транспозон (наприклад, транспозон, що випадково входить у геном M. gallisepticum), піддаючи бактерії дії одного або більше мутагенів (наприклад, хімічних мутагенів або УФ), тощо. Коли бактеріальні клітини послаблюють пасируванням in vitro, клітини можна пасирувати будь-як число разів, наприклад, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12,13,14,15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, або більше разів in vitro. [0026] Первісна популяція клітин M. gallisepticum після піддавання дії послаблювальних умов є позначеною тут як гадано послаблена бактеріальна популяція. Індивідуальні клони гадано послабленої бактеріальної популяції можна отримувати стандартними мікробіологічними способами, охоплюючи, наприклад, серійне розбавлення клітин вирощування індивідуальних клітин на прийнятних середовищах на пластинах. Після отримання індивідуальні клони гадано послабленої бактеріальної популяції досліджують стосовно зменшеної експресії MGA_0621 та/або одного або більше додаткових визначених білків. Способи визначення, чи виявляє послаблена бактерія M. gallisepticum зменшену експресію одного або більше білків, що є звичайно експресованими у клітинах природної бактерії M. gallisepticum описані тут в іншому місці. Зразкові способи охоплюють, наприклад, способи на базі RT-PCR, Вестерн-блотування, тощо. Індивідуальні клони, що є ідентифікованими як такі, що мають зменшену експресію MGA_0621 можна тестувати на вірулентність застосуванням клонів до тварин, що є схильними до інфекції природною (непослабленою) бактерією. Як застосовувано тут, "тваринами, що є схильними до інфекції природною бактерією M. gallisepticum" є тварини, що виявляють принаймні один клінічний симптом після контрольного зараження природною бактерією M, gallisepticum. Такі симптоми є відомими спеціалістам. Наприклад, у випадку гадано послабленого штаму M. gallisepticum, що виявляє зменшену експресію, наприклад, MGA_0621, штам можна застосовувати, наприклад, до курей та індиків (котрі є звичайно схильними до інфекції природною M. gallisepticum). Клінічні симптоми інфекції M. gallispeticum домашньої птиці охоплюють, наприклад, гострі респіраторні симптоми, перикардит, перигепатит, сакуліт, потовщення трахей, зменшений приріст маси, втрата вій, анормальні бокалоподібні клітини, розтягнення капілярів, збільшене число лімфоцитів, клітин плазми та/або гетерофілів, та у деяких випадках зменшене вироблення яєць. Таким чином, якщо гадано послаблений штам M. gallisepticum, при застосуванні до курей або індиків, дає менші та/або менш суворі симптоми при порівнянні з курками або індиками, що інфіковані природним штамом M. gallisepticum, тоді гадано послаблений штам M. gallisepticum, як вважають, має "зменшену вірулентність". Будьякий ступінь зменшення симптомів ідентифікуватиме гадано послаблений штам як такий, що має зменшену вірулентність. У конкретних втіленнях, гадано послаблений штам повинен бути авірулентним. [0027] Згідно із заявленим винаходом, клон M. gallisepticum, що виявляє зменшену експресію MGA_0621 (та/або одного або більше додаткових визначених білків), та виявляє зменшену вірулентність відносно природної бактерії M. gallisepticum, є послабленим клоном M. 4 UA 98506 C2 5 10 15 20 25 30 gallisepticum. Зразковий живий послаблений клон M. gallisepticum заявленого винаходу, що виявляє зменшену експресію MGA_0621 (разом зі зменшеною експресією вибраного з групи: піруват дегідрогеназа, фосфопіруват гідратаза, 2-дезоксирибоза-5-фосфат альдолаза, та рибосомальний білок L35), є штамом MGx+47. MGx+47 депоновано у American Type Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, у червні 19, 2007 та має номер РТА-8485. [0028] Нижченаведені приклади є ілюстративними, але не обмежують спосіб та композиції заявленого винаходу. Інші придатні модифікації та адаптації різних умов та параметри, звичайно наявні у молекулярній біології та хімії, як зрозуміло спеціалістам, є у рамках винаходу. ПРИКЛАДИ ПРИКЛАД 1 СТВОРЕННЯ ЖИВОГО ПОСЛАБЛЕНОГО ШТАМУ M. GALUSEPTICUM [0029]Новий живий послаблений штам M. gallisepticum було створено пасируванням природного штаму M. gallisepticum R980 багато разів in vitro. Зокрема, 0,1 мл засівного матеріалу природного штаму M. gallisepticum R-980 інокулювали у 20 мл модифікованого середовища Фрея (Frey et al., Am. J. Vet Res. 29:2163-2171 (1968) (також позначено тут як "культиваційне середовище MG"). Природні клітини вирощували, доки колір середовища не змінювався до ярко-жовтого. Ярко-жовту культуру було далі застосовувано для реінокулювання свіжого культиваційного середовища MG як описано вище. Культуру пасирували загалом 47 разів таким чином. Утворений штам тестували стосовно послаблення вакцинуванням групи птиць з наступним контрольним зараженням, застосовуючи природну M. gallisepticum. Усі птиці були вбиті через два тижні після контрольного зараження та спостерігали пов'язані з мікоплазмами патології. Багатократно пасирований штам (х+47) забезпечував захист проти клінічних ознак, асоційованих з інфекцією M. gallisepticum. Цей послаблений штам M. gallisepticum, позначений як MGx+47, було депоновано у American Type Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, у червні 19, 2007 та має номер РТА-8485. ПРИКЛАД 2 ОЦІНКА БЕЗПЕЧНОСТІ ТА ЕФЕКТИВНОСТІ ЖИВОЇ ПОСЛАБЛЕНОЇ ВАКЦИНИ M. GALLISEPTICUM У КУРЕЙ [0030] [0031] У цьому при кладі безпечність та ефективність нового штаму вакцини Mycoplasma MGx+47, отриманого у прикладі 1, визначали у курей. [0032] 71 білих курей легорн SPF поділяли на 7 груп таким чином: Таблиця 1: План дослідження Група 1 2 3 4a 4b 4c 5 35 40 # Курей 11 10 11 10 11 9 9 Вакцинованих Ні Так Так Так Так Так Hi Контрольно заражених Так Ні Так Hi Hi Hi Hi [0033] Курей у групах 2, 3, 4а, 4b та 4с вакцинували послабленим штамом MGx+47 при 3,62 7 ч 10 CCU/мл/птицю, застосовуваним грубим спреем при 4 тижнях віку. Курей у групах 1 та 3 контрольно заражали інтратрахеально (IT) при 7 тижнях віку 0,5 мл штаму M. gallisepticum R при 5 7,74 ч 10 CCU/мл. Аутопсію проводили на курках груп 1, 2, 3 та 5 при 9 тижнях віку, та аутопсію проводили на курках груп 4а, 4B та 4с на 7, 14 та 21 добу після вакцинації (DPV), відповідно. Курей оцінювали стосовно середнього приросту маси, перикардиту, перигепатиту, сакуліту та трахеїту. Результати зведені у таблиці 2. 5 UA 98506 C2 6 UA 98506 C2 5 10 ПОЯСНЕННЯ ДО ТАБЛИЦЬ БЕЗПЕЧНОСТІ ТА ЕФЕКТИВНОСТІ (ТАБЛИЦІ 3 ТА 4): Усі "вакциновані" птиці були вакциновані грубим спреем штамом вакцини MGx+47 при 3,62 ч 7 10 CCU/мл/птицю; Усі "контрольно заражені" птиці були контрольно заражені інтратрахеально (IT) 0,5 мл 5 штаму M. gallisepticum R при 7,74 ч 10 CCU/мл Момент часу (у таблиці 3: Таблиця безпечності) = число діб після вакцинації, коли курей досліджували, виражений як # діб після вакцинації (DPV). Вії: "N" = нормальні вії;"—" = втрата вій; Бокалоподібні клітини/М ("—" = нормальні бокалоподібні клітини;"+" = слиз на респіраторній поверхні); 7 UA 98506 C2 5 10 15 20 25 30 Розтягнення капілярів ("—" = нема розтягнення або запалення; "+" = помірне розтягнення капілярів або запалення; "++" = суворе розтягнення капілярів або запалення); LC/PC = Лімфоцити та клітини плазми ("—" = нема; "+" = кілька; "++++" = багато); PMN = Гетерофіли ("—" = нема;"+" = кілька;"++++" = багато); [0034] Аналіз гістології групи 2 курей (вакцинованих, але контрольно незаражених) був по суті подібним до аналізу групи 5 курей (невакцинованих, контрольно незаражених), демонструючи безпечність нового створеного штаму вакцини MGx+47. (Дивись, наприклад, таблицю 2 вище). [0035] Стосовно ефективності, група 3 курей (вакцинованих та контрольно незаражених) показала зменшений сакуліт у порівнянні з групою 1 курей (невакцинованих та контрольно незаражених). (Дивись, наприклад, таблиці 2 та 4). На додаток, як ілюстровано у таблиці 4, група 3 курей виявляла менші гістологічні ознаки інфекції M. gallisepticum стосовно вій, бокалоподібних клітин, розтягнення капілярів, лімфоцитів та клітин плазми (LC/PC), гетерофілів (PMN) та товщини трахей. (Дивись таблицю 4). [0036] Таким чином, цей приклад демонструє, що MGx+47 є безпечним та ефективним живим послабленим штамом вакцини M. gallisepticum. ПРИКЛАД 3 ПРОТЕОМІЧНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ХАРАКТЕРИСТИК ШТАМУ ВАКЦИНИ M. GALLISEPTICUM Для більш точного визначення штаму вакцини MGx+47 (дивись приклади 1 та 2) на молекулярному рівні, проводили протеомічний аналіз цього штаму. [0037] У цьому прикладі загальний білок виділяли з природного штаму M. gallisepticum R-980 та з нового ідентифікованого штаму вакцини MGx+47. Білки від кожного штаму розділяли дворозмірним електрофорезом на поліакриламідному гелі з комп'ютеризованим аналізом гельвідображення. (Дивись Фіг. 1). Ідентифікували плями білку, що були диференційно експресованими у штамі вакцини. Плями білку, що були відсутніми або були експресованими при значно нижчих рівнях у штамі вакцини порівняно з природним штамом, були вирізаними з гелю. [0038] 5 плям ідентифікували, які були експресованими при значно нижчих рівнях у штамі вакцини MGx+47 порівняно з природною M. gallisepticum. Кожну з цих плями білку було вирізано з гелю та ферментативно розкладено. Мас-спектри, ідентифіковані для кожної плями білку порівнювали з базою даних мас пептидів для ідентифікування білків та відповідних генів, що їх кодують. Результати цього аналізу зведені у таблиці нижче: 8 UA 98506 C2 5 10 15 20 25 30 [0039] [0040] Зменшення експресії продуктів генів можна також виражати у термінах "кратності зменшення експресії". Наприклад, у таблиці 5, штам MGx+47, як може бути вказано, виявляє 2,2, 3,9, 1,7, 4,5 та 5,4 кратно зменшену експресію acoA, eno, deoC, прті, та MGA_0621, відповідно, відносно природної MG. [0041] Як показано у таблиці 5, ідентифікували 5 продуктів генів, що мали значно зменшену експресію у живому послабленому штамі вакцини MGx+47 при порівнянні з природним штамом R-980: AcoA, Eno, DeoC, Rmpl, та MGA_0621 (гіпотетичний білок, ідентифікований номером NCBI NP_852784). Найбільше зменшення експресії спостерігали для MGA_0621. Таким чином, ,мутації або умови росту, котрі спричинюють зменшення експресії MGA_0621, ймовірно призводять до послаблення M. gallisepticum. Даун-регулювання MGA_0621, тому є ефективною стратегією створення послаблених штамів M. gallisepticum. [0042] Хоча заявлений винахід описано для ілюстрації, заявлений винахід не є обмеженим конкретними розкритими втіленнями, але охоплює усі зміни та модифікації, що є у рамках винаходу, як визначено доданою формулою винаходу. [0043] Усі публікації та патенти, згадані у цьому описі є показовими для спеціалістів, до котрих заявлений винахід стосується. Усі публікації та патенти тут уведено як посилання. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Послаблений штам бактерій Мycoplasma gallisepticum, що має депозитарний номер в АТСС РТА-8485, для одержання вакцинної композиції. 2. Вакцинна композиція, що включає послаблений штам бактерій Мycoplasma gallisepticum за пунктом 1 та фармацевтично прийнятний носій. 3. Спосіб вакцинації тварини проти інфекції Мycoplasma gallisepticum, де спосіб включає введення тварині імунологічно ефективної кількості композиції за пунктом 2. 4. Спосіб за пунктом 3, де вказану композицію вводять вказаній тварині безпосередньо ін'єкцією, застосуванням розпилювання або застосуванням води для пиття. 5. Спосіб одержання послабленого штаму Мycoplasma gallisepticum за пунктом 1, де вказаний спосіб включає етапи: 9 UA 98506 C2 5 10 (а) піддання первісної популяції бактерій Мycoplasma gallisepticum дії послаблювальних умов, що передбачають проведення серійного пасирування вказаних бактерій протягом 45-50 пасажів; (b) дослідження за допомогою методів білкового аналізу індивідуальних клонів одержаної на етапі (а) послабленої бактеріальної популяції на зменшену експресію білка, який має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1, у порівнянні із Мycoplasma gallisepticum дикого типу; та (c) тестування клонів, ідентифікованих у (b), як таких, що мають зменшену експресію вказаного білка, на вірулентність, де одержаний послаблений штам бактерій Мycoplasma gallisepticum АТСС РТА-8485 виявляє зменшену експресію вказаного білка та зменшену вірулентність у порівнянні із Мycoplasma gallisepticum. 10 UA 98506 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 11