Спосіб одночасного оцукрювання і ферментації

Реферат: Винахід належить до способу одночасного оцукрювання і ферментації (SSF), що включає культивування повного середовища для ферментації, причому зазначене повне середовище для ферментації містить щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше одну перетворювальну β-ксилозидазу, протягом періоду і за умов, що придатні для одержання продукту ферментації, який є спиртом, де перетворювальна β-ксилозидаза є ферментом сімейства GH43, і повне середовище для ферментації містить більшу кількість перетворювальних β-ксилозидаз, ніж кількість зберігаючих β-ксилозидаз, в розрахунку на моль, в розрахунку на молекулярну вагу або в розрахунку на моль. UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНУ ЗАЯВКУ Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою США № 61/289917, поданої 23 грудня 2010 року, що включена в її повному обсязі за допомогою посилання. 2. ОБЛАСТЬ РОЗКРИТТЯ Дійсне розкриття загалом спрямоване на способи і композиції для поліпшення виходу продукту в реакціях одночасних оцукрювання і ферментації. 3. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Біоконверсія поновлюваної лігноцелюлозної біомаси у цукор, що підлягає ферментації, що далі ферментують для одержання спирту (наприклад, етанолу або "біоетанолу"), який може служити альтернативою рідким паливам, привернула особливу увагу дослідників з 1970-х років, коли трапилася нафтова криза внаслідок скорочення видобутку нафти ОПЕК (Bungay, "Energy: the biomass options". NY: Wiley; 1981; Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996, Enzime Microb. Technol. 18:312-31; Zaldivar et al., 2001, Appl. Microbiol. Biotechnol. 56:17-34; Galbe and Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:618-28). Протягом останніх двадцяти років етанол широко використовувався у якості 10 % сумішки у бензині в США, або як чисте паливо для транспортних засобів у Бразилії. Важливість паливного біоетанолу буде зростати паралельно стрімкому зростанню цін на нафту і поступовому виснаженню її джерел. Припускають, що лігноцелюлозна біомаса стане дешевим поновлюваним ресурсом, що може забезпечувати стабільне виробництво біопалив (наприклад, біоетанолу) у досить великому масштабі, щоб значно покрити зростаючі світові потреби енергії. Лігноцелюлозні матеріали включають, без обмежень, кукурудзяну солому (рослина кукурудзи без зерен і коренів), відходи лісового господарства, такі як тирса і папір, садові відходи з міських твердих відходів, трав'янисті рослини, такі як просо прутоподібне, а також деревні рослини, такі як тополі. Лігноцелюлозна біомаса містить три основних компоненти: геміцелюлозу, целюлозу і лігнін. Геміцелюлоза є аморфним, розгалуженим полімером, що звичайно складається в основному з п'яти цукрів (арабінози, галактози, глюкози, манози і ксилози). Целюлоза є великим лінійним полімером з молекул глюкози, звичайно зв'язаних разом у висококристалічну структуру завдяки водневим зв'язкам між паралельними ланцюгами. Лігнін є складним феніл-пропановим полімером. Біологічна обробка лігноцелюлозної біомаси включає використання целюлаз і геміцелюлаз для вивільнення цукрів з геміцелюлози і целюлози, відповідно, звичайно завдяки реакціям гідролізу. Цукри, що виходять, потім ферментують у біопалива, наприклад, біоетанол, з використанням придатних ферментуючих мікроорганізмів. Глюкоза, що вивільняється при руйнуванні целюлози целюлазами, часто може бути потенційним інгібітором цього класу ферментів. Для скорочення нагромадження глюкози при розщепленні целюлози (або "оцукрювання" в даному документі) можуть додаватися ферментуючі мікроорганізми, аби перетворювати цукри, що виділилися, у біоетанол одночасно з вивільненням цукрів при оцукрюванні. Ця схема називається одночасними оцукрюванням і ферментацією ("SSF"). Звичайно, SSF дає більші/вищі частки, виходи і концентрації виробленого етанолу, ніж схема окремого гідролізу і ферментації ("SHF"), незважаючи на те, що діє за більш низьких температур, ніж ті, що є оптимальними для більшості ферментів, включених до цих процесів ферментації. При цьому, типова SSF-реакція може бути дуже розтягнутою, такою, що триває, наприклад, кілька днів, аби досягти невисоких концентрацій етанолу (див., наприклад, Kadam et al., 2004, Biotechnol. Progr. 20(3):705). Таким чином, на даному рівні техніки існує потреба ідентифікувати способи і композиції, що пов'язані з цим, для поліпшення ефективності SSF-реакцій і збільшення виходу біопалива, такого як біоетанол. 4. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Дійсне розкриття засноване на відкритті того, що присутність певних β-ксилозидаз в реакціях одночасних оцукрювання і ферментації ("SSF") призводить до швидкого нагромадження алкіл-βксилопіранозидних побічних продуктів. Зокрема, виявлено, що окремі β-ксилозидази зі зберігаючим механізмом дії при використанні в SSF-реакціях, можуть приводити до швидкого нагромадження алкіл-β-ксилопіранозидних побічних продуктів, що призводять до зменшення виходу продуктів ферментації. Дійсне розкриття надалі ґрунтується на відкритті того, що наявність деяких інших β-ксилозидаз з перетворювальним механізмом дії в SSF-реакціях може скоротити або мінімізувати нагромадження алкіл-β-ксилопіранозидних побічних продуктів. Як було виявлено, включення β-ксилозидаз з перетворювальним механізмом дії в SSF-реакції підвищує вихід продуктів ферментації. В контексті даного розкриття β-ксилозидаза з перетворювальним механізмом дії також розглядається як "фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю", 1 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "перетворювальна β-ксилозидаза" або "перетворювальний β-ксилозидазний поліпептид". Навпроти, β-ксилозидаза зі зберігаючим механізмом дії також розглядається як "фермент із зберігаючою β-ксилозидазною активністю", "зберігаюча β-ксилозидаза" або "зберігаючий βксилозидазний поліпептид". Таким чином, у даному документі забезпечуються поліпшені способи здійснення SSFреакцій, що спричиняють скорочення кількості зберігаючих β-ксилозидаз. В даному документі також забезпечені поліпшені способи проведення SSF-реакцій, що спричиняють збільшення кількості перетворювальних β-ксилозидаз. В даному документі додатково забезпечені поліпшені способи проведення SSF-реакцій, що спричиняють скорочену кількість зберігаючих βксилозидаз і збільшену кількість перетворювальних β-ксилозидаз. Композиції, що відносяться до вищеописаних поліпшених способів і інших способів, описаних у даному документі, також розглядаються. В певних аспектах дійсний винахід забезпечує SSF-способи, що включають культивування повного середовища для ферментації, при цьому зазначене середовище для ферментації містить щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше один фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю, на час і за умов, сприятливих для утворення продукту ферментації. У даному розкритті один або більш ферментів (або альтернативно й взаємозамінно позначених у даному документі як "щонайменше один фермент") з перетворювальною βксилозидазною активністю може бути присутнім у згаданому повному середовищі для ферментації в кількості, що ефективна для зниження утворення алкіл-β-ксилопіранозиду ("AXP") з коротким ланцюгом (наприклад, метил-β-ксилопіранозиду ("MXP"), етил-β-ксилопіранозиду ("EXP"), пропіл-β-ксилопіранозиду ("PXP") або бутил-β-ксилопіранозиду ("BXP")) у порівнянні з контрольним середовищем для ферментації без згаданого одного або більш ферментів з перетворювальною β-ксилозидазною активністю. Наприклад, такий фермент(и) присутні в кількості, що ефективна для (a) зниження кількості утворення AXP щонайменше на 20 %, щонайменше на 30 %, щонайменше на 40 %, щонайменше на 50 %, щонайменше на 60 %, щонайменше на 70 % або щонайменше на 80 % й/або (b) збільшення виходу (наприклад, щонайменше на 0,1 %, щонайменше на 0,5 %, щонайменше на 0,7 %, щонайменше на 1 %, щонайменше на 2 %, щонайменше на 3 %, щонайменше на 5 %, щонайменше на 7,5 % або щонайменше на 10 %) продукта ферментації (наприклад, спирту, такого як, але без обмеження, метанол, етанол, пропанол, пропан-1,3-диол або бутанол) у порівнянні з контрольним середовищем для ферментації без згаданого одного або більш ферментів з перетворювальною β-ксилозидазною активністю. У певних варіантах здійснення винаходу такий фермент(и) присутній у кількості, що ефективна для зниження кількості утворення AXP до рівня в межах 50 %, у межах 40 %, у межах 30 %, у межах 20 % або в межах 10 % вище рівня AXP за рівноваги реакції в порівнянні з таким контрольного середовища для ферментації без згаданого одного або більш ферментів з перетворювальною β-ксилозидазною активністю. В певних аспектах ферментуючий мікроорганізм здатний продукувати спирт, наприклад, метанол, етанол, пропанол, пропан-1,3-диол або бутанол, із принаймні одного джерела вуглецю, що підлягає ферментації. В певних аспектах ферментуючим мікроорганізмом є бактерія Zymomonas mobilis або гриб, наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб. В певних аспектах щонайменше одна перетворювальна β-ксилозидаза належить до сімейства ферментів GH43. У певних варіантах здійснення винаходу перетворювальну βксилозидазу обирають з поліпептидів Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A або XynB3. Зокрема, поліпептид Fv43D, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:2 або 21350 залишкам SEQ ID NO:2. Поліпептид Pf43A, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:8 або 21-455 залишкам SEQ ID NO:8. Поліпептид Fv43E, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, 2 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:10 або 19-530 залишкам SEQ ID NO:10. Поліпептид Fv43B, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:12 або 17-574 залишкам SEQ ID NO:12. Поліпептид Af43A, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:14 або 15-558 залишкам SEQ ID NO:14. Поліпептид Fo43A, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:24 або 21-348 залишкам SEQ ID NO:24. Поліпептид Gz43A, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:22 або 19-340 залишкам SEQ ID NO:22. Поліпептид XynB3, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:25. В певних аспектах кількість перетворювальних β-ксилозидазних поліпептидів у зазначеному повному середовищі складає щонайменше приблизно 0,2 мг, щонайменше приблизно 0,3 мг, щонайменше приблизно 0,4 мг, щонайменше приблизно 0,5 мг, щонайменше приблизно 0,7 мг, щонайменше приблизно 1 мг, щонайменше приблизно 2 мг або щонайменше приблизно 3 мг на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі, яка також є компонентом повного середовища для ферментації. В інших аспектах кількість перетворювальних β-ксилозидазних поліпептидів складає приблизно 3 мг або менше, приблизно 2 мг або менше, приблизно 1,5 мг або менше, приблизно 1,0 мг або менше, приблизно 0,7 мг або менше, приблизно 0,5 мг або менше, приблизно 0,4 мг або менше, приблизно 0,3 мг або менше або приблизно 0,2 мг або менше на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі. В певних аспектах кількість перетворювальних β-ксилозидазних поліпептидів у зазначеному повному середовищі коливається, наприклад, (a) від 0,4 мг до 10 мг, (b) від 0,5 мг до 2 мг, (c) від 0,4 мг до 5 мг, (d) від 0,5 мг до 1,5 мг, (e) від 1 мг до 2 мг, (f) від 0,3 мг до 3 мг, (g) від 0,2 мг до 5 мг, (h) від 0,3 мг до 5 мг або (і) від 0,3 мг до 10 мг на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі, або кількість знаходиться в межах діапазону, верхню і нижню границю якого кожну незалежно обирають з вищевикладених значень.В певних аспектах кількість перетворювального β-ксилозидазного поліпептида(ів) у зазначеному повному середовищі для ферментації перевищує кількість зберігаючого βксилозидазного поліпептида(ів) у розрахунку на моль, у розрахунку на молекулярну вагу або в розрахунку як на моль, так і на молекулярну вагу. В особливих варіантах здійснення співвідношення перетворювального β-ксилозидазного поліпептида(ів) до зберігаючого βксилозидазного поліпептида(ів) складає щонайменше 2:1, щонайменше 3:1, щонайменше 4:1, щонайменше 5:1, щонайменше 10:1 або щонайменше 50:1 у розрахунку на моль, у розрахунку на молекулярну вагу або в розрахунку як на моль, так і на молекулярну вагу. В особливих варіантах здійснення фермент(и) зі зберігаючою β-ксилозидазною активністю відсутні або не виявляються в повному середовищі для ферментації. У певних варіантах немає визначуваної зберігаючої β-ксилозидазної активності в повному середовищі для ферментації. Згідно з описаними в даному документі способами культивування повного середовища для ферментації проводиться за безперервних, періодичних умов або умов з підживленням. Наприклад, культивування повного середовища для ферментації даного винаходу є безперервною SSF-реакцією, періодичною SSF-реакцією або SSF-реакцією з підживленням. Способи дійсного розкриття в певних аспектах додатково охоплюють утворення повного 3 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 середовища для ферментації перед етапом культивування. Наприклад, повне середовище для ферментації можна утворити комбінуванням (a) щонайменше одного ферментуючого мікроорганізму, (b) щонайменше однієї ксиланвмісної біомаси, (c) щонайменше однієї целюлази, (d) щонайменше однієї геміцелюлази, (e) щонайменше однієї перетворювальної βксилозидази й (f) середовища без одного або декількох компонентів (a)-(e). В певних варіантах здійснення щонайменше одна целюлаза може бути присутня у формі целюлазного препарату. Наприклад, целюлазний препарат може бути препаратом загальної целюлази, що може необов'язково також включати щонайменше одну геміцелюлазу. В особливих варіантах здійснення целюлазний препарат є культуральною рідиною від культури міцеліального гриба, наприклад, культури T. reesei, отриманою з використанням клітин T. reesei. В певних аспектах клітина T. reesei може бути сконструйована таким чином, щоб нативний ген β-ксилозидази був інактивований або вилучений. Необхідно відзначити, що "клітина T. reesei [яка] сконструйована таким чином, щоб нативний ген β-ксилозидази був інактивований або вилучений" включає не тільки вихідну або батьківську клітину, у якій уперше відбулася інактивація, але також потомство цієї клітини, у якому нативний ген β-ксилозидази інактивований або вилучений. В певних аспектах способи дійсного розкриття належать до культивування ферментативного бульйону, що містить щонайменше одну біомасу, яка містить ксилан. В певних аспектах ксиланвмісною біомасою є, наприклад, кукурудзяна солома, багаси, сорго, арундо очеретяний, пеннісетум червоний, міскантус, криптомерія японська, солома пшениці, просо прутоподібне, деревна маса з листяної або хвойної деревини. Наприклад, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином до SSF-реакції у формі суспензії. Наприклад, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином до SSF-реакції у формі твердої речовини. Таким чином, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином до SSF-реакції як у рідкій формі (яка може бути, наприклад, розчином, суспензією або сумішшю твердої речовини і рідини), так і у формі твердої речовини. У певних варіантах здійснення ксиланвмісна біомаса піддана попередній обробці. Після того як SSF-реакція здійсниться, необов'язково до завершення, може відбуватись етап відновлення, при якому відновлюють продукт ферментації (наприклад, етанол, метанол, пропанол, пропан-1,3-диол або бутанол). Дійсне розкриття додатково забезпечує повне середовище для ферментації, що придатне для застосування в дійсних способах, наприклад, як описано вище і далі стосовно целюлазних, геміцелюлазних, β-ксилозидазних компонентів і компонентів ферментуючих мікроорганізмів. Дійсне розкриття також забезпечує клітину T. reesei, що сконструйована таким чином, щоб нативний ген β-ксилозидази був інактивований або вилучений. Клітина T. reesei може бути сконструйована, щоб рекомбінантно експресувати фермент із сімейства GH43, наприклад, фермент, обраний з поліпептидів Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A або XynB3. Наприклад, поліпептид Fv43D має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, по меншій мері 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:2 або 21-350 залишкам SEQ ID NO:2. Поліпептид Pf43A має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:8 або 21-445 залишкам SEQ ID NO:8. Поліпептид Fv43E має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:10 або 19-530 залишкам SEQ ID NO:10. Поліпептид Fv43B має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:12 або 17-574 залишкам SEQ ID NO:12. Поліпептид Af43A має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності 4 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:14 або 15-558 залишкам SEQ ID NO:14. Поліпептид Fo43A має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:24 або 21-348 залишкам SEQ ID NO:24. Поліпептид Gz43A має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:22 або 19-340 залишкам SEQ ID NO:22. Поліпептид XynB3 має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:25. Дійсне розкриття додатково забезпечує способи одержання целюлазних поліпептидів, що включають (a) культивування такої клітини T. reesei, що була описана вище і/або далі в даному документі, за умов, що дозволяють продукування одного або декількох целюлазних поліпептидів і (b) відновлення целюлазних поліпептидів, наприклад, шляхом відновлення культуральної рідини, що містить целюлазні поліпептиди. Дійсне розкриття додатково забезпечує культуральну рідину, що одержана за допомогою клітини T. reesei, і її застосування в реакціях оцукрювання, що включають, наприклад, SSF-реакції. В певних аспектах дійсне розкриття забезпечує композицію повного середовища для ферментації, що містить щонайменше одну перетворювальну β-ксилозидазу, щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і середовище ферментації. Перетворювальною βксилозидазою є, наприклад, фермент сімейства GH43. Перетворювальна β-ксилозидаза може, в певних аспектах, бути обрана з поліпептида Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A або XynB3. Ферментуючим мікроорганізмом є, відповідно, організм, що здатний до ферментації придатного джерела вуглецю, такого як ксиланвмісна біомаса або цукрів, таких як глюкоза, ксилоза, арабіноза, маноза, галактоза або олігосахаридів, прямо або непрямо в необхідний продукт ферментації, що включає, наприклад, метанол ("MeOH"), етанол ("EtOH"), пропанол, пропан-1,3-диол або бутанол. Ферментуючі мікроорганізми можуть бути обрані з гриба, такого як, наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб, бактерії, такої як Zymomonas mobillis або Clostridium thermocellum. Придатні джерела вуглецю або субстрати включають, наприклад, субстрати з ксиланвмісної біомаси, обрані, наприклад, з лігноцелюлозних субстратів або іншої сировини, що містить вуглеводи. Деякі з лігноцелюлозних субстратів можуть, наприклад, включати целюлозу, геміцелюлозу і/або лігнін. Целюлазою є, наприклад, β-глюкозидазний, ендоглюканазний або целобіогідролазний пептид. Ферменти зазначають в даному документі або за їхніми назвами, або за сімействами ферментів, до яких вони належать (наприклад, фермент сімейства GH43 або фермент, класифікований у або за EC 3.2.1.91); при згадуванні за їхніми назвами вони можуть також бути еквівалентно зазначені як “[назва] поліпептид (наприклад, β-глюкозидаза може також взаємозамінно бути зазначена β-глюкозидазний поліпептид). Целюлаза також може бути, наприклад, у формі препарату загальної целюлази. Геміцелюлаза є, наприклад, ксиланазою, βксилозидазою, L-α-арабінофуранозидазою або акцесорним білком. Препарат загальної целюлази може містити один або більше геміцелюлазних пептидів в певних варіантах здійснення. Середовище для ферментації може бути результатом процесу часткового оцукрювання, або середовищем, що містить визначені кількості продуктів оцукрювання. Таку композицію можна відповідно застосовувати в реакції оцукрювання, що включає, наприклад, SSF-реакцію, за умов, що дозволяють одержання продукту(-ів) ферментації, який становить інтерес. В певних аспектах одна або більше целюлаз і/або одна або більше геміцелюлаз виробляються генетично сконструйованим мікроорганізмом, у якому гени, що кодують одну або більше (якщо присутні більше за одну нативну β-ксилозидазу) нативних β-ксилозидаз вилучені або не виявляється нативна β-ксилозидазна активність. В певних варіантах здійснення мікроорганізм, що сконструйований для продукування однієї або кількох целюлаз й/або однієї або кількох геміцелюлаз не містить зберігаючих β-ксилозидаз або не має явної зберігаючої βксилозидазної активності. 5 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких аспектах дійсне розкриття належить до поліпшеного способу проведення SSFреакції на ксиланвмісній біомасі для того, щоб одержати продукт ферментації-біоетанол, де спосіб містить культивування середовища для ферментації, що містить щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, де поліпшення включає застосування ферменту з перетворювальною β-ксилозидазною активністю. У споріднених аспектах дійсне розкриття також забезпечує способи поліпшення продукування алкіл-β-ксилопіранозидов, що, як відомо, є корисними і коштовними у ряді промислових застосувань, у ситуаціях, коли таке продукування є бажаним. Наприклад, алкіл-βксилопіранозид може відповідним чином застосовуватися як хімічна проміжна сполука в синтезі алкіл-глікозидів, що корисні в якості біорозкладних поверхнево-активних речовин і емульгаторів (див., наприклад, K. Schmid & H. Tesmann, 2001, Alkyl Polyglucosides, in Detergency of Specialty Surfactants, Surfactant science series, vol. 98; (F.E. Fried ed.); Marcel Dekker Inc., NY, pp.1-70). Ці компоненти є індукторами самі по собі або їх можна застосовувати для одержання індукторів продукування ксиланази у ряді мікроорганізмів (див., наприклад, M. Marui et al., 1985, Agric. Biol. Chem. 49(12):3399-3407; H. Shinoyama et al., 1988, Agric. Biol. Chem. 52(9): 2197-2202). Різні алкіл-піранозидази, до того ж, можна застосовувати як праймери для хондроітинсульфату і стимулятори біосинтезу протеогліканів (див., наприклад, H. Shinoyama et al., 1988, Agric. Biol. Chem. 52(9): 2197-2202). Включення або збільшену продукцію β-ксилозидаз зі зберігаючим механізмом дії у SSF-реакціях можна застосовувати для збільшення виходу цих придатних алкіл-β-ксилопіранозидів в іншому аспекті даного винаходу. Відповідно, у деяких варіантах здійснення спосіб розкриття містить у собі збільшення кількості зберігаючих β-ксилозидаз. У даному документі наведені також поліпшені способи проведення SSF-реакцій, що спричиняють збільшення кількості зберігаючих β-ксилозидаз. У додатковому прикладі передбачається поліпшений спосіб проведення SSF-реакцій, що спричиняє збільшення кількості зберігаючих β-ксилозидаз, під час зниження кількості перетворювальних β-ксилозидаз. В інших аспектах дійсний винахід забезпечує SSF-способи, що включають культивування повного середовища для ферментації, причому зазначене повне середовище для ферментації містить щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше один фермент із зберігаючою β-ксилозидазною активністю протягом періоду часу і при умовах, що підходять для формування алкіл-β-ксилопіранозиду, такого як, наприклад, метил-βксилопіранозид ("MXP"), етил-β-ксилопіранозид ("EXP"), пропіл-β-ксилопіранозид ("PXP") або бутил-β-ксилопіранозид ("BXP"). В певних аспектах щонайменше один фермент зі зберігаючою β-ксилозидазною активністю може бути присутнім у зазначеному повному середовищі для ферментації в кількості, ефективній для збільшення утворення алкіл-β-ксилопіранозиду ("AXP") з коротким ланцюгом (наприклад, метил-β-ксилопіранозиду ("MXP"), етил-β-ксилопіранозиду ("EXP"), пропіл-βксилопіранозиду ("PXP") або бутил-β-ксилопіранозиду ("BXP")), у порівнянні з контрольним середовищем для ферментації, у якому відсутні або присутні в меншій кількості зазначені ферменти зі зберігаючою β-ксилозидазною активністю. Наприклад, такий фермент(и) присутній у кількості, ефективній для збільшення величини утворення AXP щонайменше на 20 %, щонайменше на 30 %, щонайменше на 40 %, щонайменше на 50 %, щонайменше на 60 %, щонайменше на 70 % або щонайменше на 80 % у порівнянні з контрольним середовищем для ферментації, у якому відсутні або присутні в меншій кількості зазначені один або більше ферментів зі зберігаючою β-ксилозидазною активністю. В певних аспектах ферментуючий мікроорганізм здатний до продукування ряду сполук алкіл-β-ксилопіранозиду ("AXP") з коротким ланцюгом, включаючи, без обмеження, сполуки метил-β-ксилопіранозиду ("MXP"), етил-β-ксилопіранозиду ("EXP"), пропіл-β-ксилопіранозиду ("PXP") або бутил-β-ксилопіранозиду ("BXP"). У деяких аспектах ферментуючим мікроорганізмом є бактерія, така як Zymomonas mobilis, або гриб, такий як дріжджі або міцеліальний гриб. В певних аспектах щонайменше однією зберігаючою β-ксилозидазою є фермент сімейства GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54 або GH116. В певних варіантах здійснення винаходу зберігаюча β-ксилозидаза обрана з поліпептидів XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynВ, XylА або Xyl1. Зокрема, поліпептид XlnD, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % 6 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:40 або залишкам від 18 до 804 SEQ ID NO:40. Поліпептид Fv30A, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO: 42 або залишкам від 20 до 537 SEQ ID NO: 42. Поліпептид Fv30B, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:44 або залишкам від 25 до 485 SEQ ID NO:44. Поліпептид Fv39A, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:46 або залишкам від 20 до 439 SEQ ID NO:46. Поліпептид Fv39B, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:48 або залишкам від 19 до 456 SEQ ID NO:48. Поліпептид XynВ, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:50. XylА, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:52. Поліпептид Xyl1, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:54 або залишкам від 22 до 500 SEQ ID NO:54. В певних аспектах кількість зберегаючих β-ксилозидазних поліпептидів у зазначеному повному середовищі складає щонайменше приблизно 0,2 мг, щонайменше приблизно 0,5 мг, щонайменше приблизно 0,7 мг, щонайменше приблизно 1 мг, щонайменше приблизно 2 мг або щонайменше приблизно 5 мг на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі, що також є компонентом повного середовища для ферментації. В інших аспектах кількість перетворювальних β-ксилозидазних поліпептидів складає приблизно 10 мг або менше, приблизно 5 мг або менше, приблизно 2 мг або менше, приблизно 1 мг або менше, приблизно 0,7 мг або менше, приблизно 0,5 мг або менше або приблизно 0,2 мг або менше на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі. В певних аспектах кількість зберігаючих βксилозидазних поліпептидів у зазначеному повному середовищі знаходиться в діапазоні, наприклад, (a) від 0,2 мг до 10 мг, (b) від 0,2 мг до 5 мг, (c) від 0,5 мг до 5 мг, (d) від 1 мг до 10 мг, (e) від 2 мг до 10 мг, (f) від 0,2 до 5 мг, (g) від 0,2 мг до 2 мг або (h) від 0,5 мг до 10 мг на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі, або кількість у межах діапазону, кожна з верхніх і нижніх меж якого є незалежно обраними з вищенаведених значень. В певних аспектах кількість зберігаючого β-ксилозидазного поліпептиду(ів) у зазначеному повному середовищі для ферментації перевищує кількість перетворювального βксилозидазного поліпептиду(поліпептидів) у розрахунку на моль, у розрахунку на молекулярну вагу або в розрахунку і на моль, і на молекулярну вагу. У конкретних варіантах здійснення співвідношення зберігаючих β-ксилозидазних поліпептидів до перетворювальних βксилозидазних поліпептидів складає щонайменше 2:1, щонайменше 3:1, щонайменше 4:1, щонайменше 5:1, щонайменше 10:1 або щонайменше 50:1 у розрахунку на моль, у розрахунку на молекулярну вагу або в розрахунку і на моль, і на молекулярну вагу. У конкретних варіантах 7 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення ферменти з перетворювальною β-ксилозидазною активністю відсутні або не виявляються в повному середовищі для ферментації. В певних варіантах здійснення перетворювальна β-ксилозидазна активність, яку можна визначити, у повному середовищі для ферментації відсутня. Відповідно до описаного в даному документі способа, культивування повного середовища для ферментації проводять при безперервних, періодичних умовах, умовах з підживленням. Наприклад, культивування повного середовища для ферментації даного винаходу є безперервною SSF-реакцією, періодичною або SSF-реакцією SSF-реакцією з підживленням. Способи даного розкриття в певних аспектах додатково охоплюють утворення повного середовища для ферментації перед етапом культивування. Наприклад, повне середовище для ферментації може бути утворене комбінуванням (a) щонайменше одних ферментуючих мікроорганізмів, (b) щонайменше однієї ксиланвмісної біомаси, (c) щонайменше однієї целюлази, (d) щонайменше однієї геміцелюлази, (e) щонайменше однієї зберігаючої βксилозидази і (f) середовища без одного або більше компонентів (a)-(e). У конкретних варіантах здійснення щонайменше одна целюлаза може бути присутня у формі целюлазного препарату. Наприклад, целюлазний препарат може бути препаратом загальної целюлази, що може також необов'язково включати щонайменше одну геміцелюлазу. У конкретних варіантах здійснення целюлазний препарат є культуральною рідиною культури міцеліального гриба, наприклад, культури T. reesei, отриманої з використанням клітини T. reesei. У певному аспекті клітина T. reesei була сконструйована так, щоб або нативний ген зберігаючої β-ксилозидази надекспресувався, або щоб чужорідний ген зберігаючої β-ксилозидази був введений і експресувався. Необхідно відзначити, що "клітина T. reesei [яка] була сконструйована так, щоб або нативний ген зберігаючої β-ксилозидази надекспресувався, або щоб чужорідний ген зберігаючої β-ксилозидази був введений і експресувався" включає не лише вихідну або батьківську клітину, у якій уперше відбулася інактивація, але також потомство цієї клітини. В певних аспектах способи даного розкриття стосуються культивування ферментативного бульйону, що містить щонайменше одну біомасу, яка містить ксилан. В певних аспектах ксиланвмісною біомасою є, наприклад, кукурудзяна солома, багаса, сорго, арундо очеретяний, пенісетум червоний, міскантус, криптомелія японська, солома пшениці, просо, деревна маса листяної деревини або деревна маса хвойної деревини. Наприклад, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином у SSF-реакцію у формі суспензії. Наприклад, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином у SSF-реакцію у формі твердої речовини. Відповідно, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином у SSF-реакцію як у рідкій формі (якою може бути, наприклад, розчин, суспензія або суміш сухих речовин і рідини), так і у формі твердих речовин. В певних варіантах здійснення винаходу ксиланвмісна біомаса піддана попередній обробці. Після того як пройде SSF-реакція, необов'язково до завершення, може відбуватися етап виділення, при якому виділяють AXP-продукт (наприклад, MXP, EXP, PXP або BXP). Дане розкриття додатково забезпечує повне середовище для ферментації, що підходить для застосування в даних способах, наприклад, як описано вище і далі стосовно целюлазних, геміцелюлазних, β-ксилозидазних компонентів і компонентів ферментуючих мікроорганізмів. Дане розкриття також забезпечує клітину T. reesei, що була сконструйована таким чином, щоб у ній надекспресувався нативний ген зберігаючої β-ксилозидази, або щоб у ній експресувався чужорідний ген зберігаючої β-ксилозидази. Клітина T. reesei може бути сконструйована для того, щоб рекомбінантно експресувати фермент із сімейства GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54 або GH116, наприклад, фермент, обраний з поліпептидів XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA або Xyl1. Наприклад, поліпептид XlnD має, щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:40 або залишкам від 18 до 804 SEQ ID NO:40. Поліпептид Fv30A має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:42 або залишкам від 20 до 537 SEQ ID NO:42. Поліпептид Fv30B має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 8 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:44 або залишкам від 25 до 485 SEQ ID NO:44. Поліпептид Fv39A має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:46 або залишкам від 20 до 439 SEQ ID NO:46. Поліпептид Fv39B має, щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:48 або залишкам від 19 до 456 SEQ ID NO:48. Поліпептид XynB має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:50. Поліпептид XylА має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:52 або залишкам від 19 до 705 SEQ ID NO:52. Поліпептид Xyl1 має щонайменше 65 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 91 %, щонайменше 92 %, щонайменше 93 %, щонайменше 94 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, щонайменше 99 % або 100 % ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає SEQ ID NO:54 або залишкам від 22 до 500 SEQ ID NO:54. Дане розкриття додатково забезпечує способи одержання целюлазних поліпептидів, що включають (a) культивування такої клітини T. reesei, наприклад, як було описано раніше і/чи далі в даному документі, при умовах, що уможливлюють продукування одного або більше целюлазних поліпептидів і (b) виділення целюлазних поліпептидів, наприклад, шляхом виділення культуральної рідини, що містить целюлазні поліпептиди. Дане розкриття додатково забезпечує культуральну рідину, одержану за допомогою клітини T. reesei і її застосування в реакціях оцукрювання, включаючи, наприклад, SSF-реакції. В певних аспектах дане розкриття забезпечує композицію повного середовища для ферментації, що містить щонайменше одну перетворювальну β-ксилозидазу, щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і середовище для ферментації. Зберігаюча βксилозидаза є, наприклад, або нативною зберігаючою β-ксилозидазою, що надекспресується, або чужорідною β-ксилозидазою, яку вводять у відповідну клітину-хазяїна. Зберігаюча βксилозидаза є, наприклад, ферментом сімейства GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54 або GH 116. Зберігаюча β-ксилозидаза може, в певних аспектах, бути обрана з поліпетидів XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA або Xyl1. Ферментуючий мікроорганізм є відповідно здатним до ферментації придатного джерела вуглецю, такого як ксиланвмісна біомаса або цукри, такі як глюкоза, ксилоза, арабіноза, маноза, галактоза або олігосахарид прямо або побічно в необхідний продукт ферментації, що включає, наприклад, метанол, етанол, пропанол, пропан1,3-діол або бутанол. Ферментуючим мікроорганізмом може бути гриб, такий як, наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб, або бактерія, така як Zymomonas mobillis або Clostridium thermocellum. Придатні джерела вуглецю або субстрати можуть бути, наприклад, субстратами на основі ксиланвмісної біомаси, вибраними, наприклад, з лігноцелюлозних субстратів або іншої сировини, утримуючої вуглеводи. Деякі з лігноцелюлозних субстратів можуть, наприклад, включати целюлозу, геміцелюлозу і/чи лігнін. Целюлазою є, наприклад, β-глюкозидаза, ендоглюканаза або целобіогідролазний поліпептид. Целюлаза також може бути, наприклад, у формі препарату загальної целюлази. Геміцелюлазою, наприклад, є ксиланаза, β-глюкозидаза, L-α-арабінофуранозидаза або акцесорний білок. В певних варіантах здійснення препарат загальної целюлази може містити один або більше геміцелюлазних поліпептидів. Середовище для ферментації може бути результатом процесу часткового оцукрювання або середовищем, що містить визначену кількість продуктів оцукрювання. Таку композицію можна, відповідно, застосовувати в реакції оцукрювання, включаючи, наприклад, SSF-реакцію, при 9 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 умовах, що уможливлюють одержання сполук AXP, включаючи, наприклад, MXP, EXP, PXP або BXP. В певних аспектах одна або більше целюлаз і/або одна або більше геміцелюлаз продукуються генетично сконструйованим мікроорганізмом, де ген, що кодує одну або більше (якщо присутні більше ніж одна нативна β-ксилозидаза) нативних β-ксилозидаз, надекспресований, або ген, що кодує чужорідну β-ксилозидазу, введений і/або експресований. В певних варіантах винаходу, мікроорганізм, сконструйований для продукування однієї або більше целюлаз і/або однієї або більше геміцелюлаз, має підвищений прояв зберігаючої βксилозидазної активності в порівнянні з контрольним мікроорганізмом, що не піддавався такому ж генетичному конструюванню. В певних варіантах здійснення мікроорганізм, сконструйований для продукування однієї або декількох целюлаз і/або однієї або декількох геміцелюлаз, не містить перетворювальну β-ксилозидазу або не має перетворювальної β-ксилозидазної активності, яку можна визначити. В певних зв'язаних аспектах дане розкриття відноситься до поліпшеного способу проведення SSF-реакції на ксиланвмісній біомасі, для того, щоб одержати AXP-продукт, де спосіб включає культивування середовища для ферментації, що містить щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, де поліпшення включає застосування целюлазного препарату, отриманого з клітини T. reesei, яка була сконструйована для надекспресії нативного гена β-ксилозидази або для експресії чужорідної β-ксилозидази. У деяких варіантах здійснення нативний ген β-ксилозидази, що надекспресується, або чужорідний ген β-ксилозидази, що експресується, є геном, що кодує зберігаючу β-ксилозидазу. Усі публікації, патенти, патентні заявки, послідовності із GenBank і депозити ATCC, що цитуються в даному документі, даним явно включені за допомогою посилань для всіх цілей. 5. КОРОТКИЙ ЗМІСТ ФІГУР І ТАБЛИЦЬ Таблиця 1: Утворення EXP з рекомбінантної Zymomonas mobilis при SSF-умовах зі стрижня кукурудзяного початка і глюкози/ксилози. Таблиця 2: Утворення EXP за допомогою різних типів субстратів біомаси. Таблиця 3: Динаміки утворення EXP і/чи ксилози (виражені як RI область, пропорційно мг/гл) із ксилобіози (20 мг/гл) у 50 ммоль цитрату натрію, pH 4,7 плюс 0,9 M EtOH при 46ºC у присутності ксиланази Multifect® ("MF, " 560 мкг/мл) і очищеного Fv43D (36 мкг/мл) або Fv3A (54 мкг/мл). Таблиця 4: Праймерні послідовності для побудови делеційної касети bxl1. Таблиця 5: Праймерні послідовності для побудови експресійної касети β-ксилозидази Fv43D F. Verticillioides. Таблиця 6: приводить зведення ідентифікаторів послідовностей для визначених ферментів, застосовуваних у SSF-реакціях. Фігура 1: ВЕРХ-хроматограми зразків, узятих після 48 годин інкубації при 46ºC, ксилози (10 мг/гл) у 50 мМ цитраті натрію, pH 4,6, ксиланазі Multifect® (1,35 мг/гл) і без спирту, з етанолом ("EtOH"), метанолом ("MeOH") або n-пропанолом ("n-PrOH"), кожного в кількості 0,72 M. ВЕРХумови: колонка HPX-87H при 60ºC, 0,60 мл/хв 0,01 N H2SO4, RI індикатор. Фігура 2: Динаміки після появи/формування алкіл-ксилопіранозидів ("AXP") за тих самих умов, що описано в експериментах Фігури 1. Кількості утворених продуктів ферментації виражені як співвідношення зон максимуму продукту в порівнянні з такими ж максимумами ксилози. Фігура 3: ЯМР-спектр, що вказує на присутність етил-β-ксилопіранозиду. Фігура 4: Утворення EXP дріжджами і Zymomonas mobilis дикого типу при SSF-умовах. Фігура 5: Утворення EXP при SSF-умовах із дріжджами з або без додавання Bxl1 T. reesei. Фігура 6: Дозова залежність EXP після додавання Bxl1 T. reesei до ферментного комплексу, отриманого зі штаму №229 T. reesei з вбудованим геном при SSF-умовах з рекомбінантними Zymomonas. Фігура 7: Утворення EXP під час SSF-реакції за допомогою наступних ферментних конфігурацій/сумішей для оцукрювання: Accellerase™ 1500 ("A1500")+ксиланаза Multifect®, Accellerase™ 1500 ("A1500") +XlnА і ферментний комплекс, отриманий зі штаму №229 T. reesei з вбудованим геном, з додаванням геміцелюлази (Fv3A, Fv51A або Bxl1). Фігура 8: Утворення EXP під час SSF-реакції при використанні різних очищених целюлазних ферментів і XynВ3 для оцукрювання. Фігура 9: Утворення EXP під час SSF-реакції при використанні ферментного комплексу, отриманого зі штаму №229 T. reesei з вбудованим геном, у присутності Bxl1 T. reesei або в присутності деяких інших β-ксилозидазних ферментів із сімейства GH43. 10 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 10: Знижене утворення EXP, що спостерігається в результаті додавання Fv43D, при SSF-умовах з рекомбінантними Zymomonas. Фігура 11: Знижене утворення EXP, що спостерігається в результаті додавання Fv43D, при SSF-умовах з рекомбінантними дріжджами. Фігура 12: Знижене утворення EXP, що спостерігається в результаті додавання Fv43D до Accellerase™ 1500+ксиланаза Multifect®, до Accellerase™ 1500+XlnА і до ферментного комплексу, отриманого зі штаму №229 T. reesei з вбудованим геном, при SSF-умовах з рекомбінантними Zymomonas. Фігура 13: Знижене утворення EXP, що спостерігається в результаті додавання Fv43D до очищених целюлазних ферментів і XynВ3. Фігури 14A-14B: Фігура 14A демонструє дозову залежність зниження EXP у результаті додавання Fv43D до ферментної композиції або суміші, отриманої зі штаму №229 T. reesei з вбудованим геном, при SSF-умовах з рекомбінантними Zymomonas. Фігура 14B показує зменшення EXP у результаті додавання Fo43A або Gz43A до ферментного комплексу, отриманого зі штаму №229 T. reesei з вбудованим геном, + Bxl1 T. reesei при SSF-умовах з рекомбінантними Zymomonas. Фігура 15: Динаміка утворення ксилози і EXP (виражена як RI зона, що є пропорційною мг/гл) із ксилобіози (20 мг/гл) у 50 мM цитраті натрію, pH 4,7 плюс 0,9 M етанол при 46ºC у присутності ксиланази Multifect® (560 мкг/мол) і очищеного Fv43D (36 мкг/мл) і Fv3A (54 мкг/мл). Фігура 16: Динаміка утворення ксилози і EXP із ксилобіози (20 мг/гл, ліворуч) або з ксилозних олігомерів (20 мг/гл, праворуч) у 50 мM цитраті натрію, pН 4,7, плюс 0,9 M етанолу при 46ºC у присутності ксиланази Multifect® (560 мкг/мл), Fv43D (36 мкг/мл) або Fv3A (54 мкг/мл). Результати виражені як співвідношення кількості EXP до кількості утвореної ксилози. Фігура 17: Карта плазміди pCR-Blunt II-TOPO, делеції bxl1, hph-lox. Фігура 18: Карта плазміди TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D. Фігури 19A-19B: Фігура 19A: нуклеотидна послідовність Fv43D (SEQ ID NO:1). Фігура 19B: амінокислотна послідовність Fv43D (SEQ ID NO:2). SEQ ID NO:2 є послідовністю незрілого Fv43D. Fv43D має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 20 SEQ ID NO:2 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 21 до 350 SEQ ID NO:2. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури 20A-20B: Фігура 20A: нуклеотидна послідовність Bxl1 (SEQ ID NO:3) T. reesei. Фігура 20B: амінокислотна послідовність Bxl1 (SEQ ID NO:4) T. reesei. Сигнальна послідовність підкреслена. Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури 21A-21B: Фігура 21A: нуклеотидна послідовність Fv3A (SEQ ID NO:5). Фігура 21B: амінокислотна послідовність Fv3A (SEQ ID NO:6). SEQ ID NO:6 є послідовністю незрілого Fv3A. Fv3A має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 23 SEQ ID NO:6 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 24 до 766 SEQ ID NO:6. Прогнозування сигнальної послідовності провели за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури 22A-22B: Фігура 22A: нуклеотидна послідовність Pf43A (SEQ ID NO:7). Фігура 22B: амінокислотна послідовність Pf43A (SEQ ID NO:8). SEQ ID NO:8 є послідовністю незрілого Pf43A. Pf43A має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 20 SEQ ID NO:8 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 21 до 455 SEQ ID NO:8. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом, прогнозовані залишки вуглеводних зв'язуючих модулів ("CBM") виділені заголовними літерами і прогнозований лінкер, що розділяє CD і CBM, виділений курсивом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури 23A-23B: Фігура 23A: нуклеотидна послідовність Fv43E (SEQ ID NO:9). Фігура 23B: амінокислотна послідовність Fv43E (SEQ ID NO:10). SEQ ID NO:10 є послідовністю незрілого Fv43E. Fv43E має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 18 SEQ ID NO:10 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 530 SEQ ID NO:10. 11 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури 24A-24B: Фігура 24A: нуклеотидна послідовність Fv43B (SEQ ID NO:11). Фігура 24B: амінокислотна послідовність Fv43B (SEQ ID NO:12). SEQ ID NO:12 є послідовністю незрілого Fv43B. Fv43B має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 16 SEQ ID NO:12 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 17 до 574 SEQ ID NO:12. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури 25A-25B: Фігура 25A: нуклеотидна послідовність Af43A (SEQ ID NO:13). Фігура 25B: амінокислотна послідовність Af43A (SEQ ID NO:14). SEQ ID NO:14 є послідовністю незрілого Af43A. Af43A не має прогнозованої сигнальної послідовності, що може бути отримана за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури 26A-26B: Фігура 26A: нуклеотидна послідовність Fv51A (SEQ ID NO:15). Фігура 26B: амінокислотна послідовність Fv51A (SEQ ID NO:16). SEQ ID NO:16 є послідовністю незрілого Fv51A. Fv51A має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 19 SEQ ID NO:16 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 20 до 660 SEQ ID NO:16. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Прогнозовані залишки консервативного домену L-αарабінфуранозидази виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури 27A-27B: Фігура 27A: нуклеотидна послідовність Xyn3 T. reesei (SEQ ID NO:17). Фігура 27B: амінокислотна послідовність Xyn3 T. reesei (SEQ ID NO:18). SEQ ID NO:18 є послідовністю незрілого Xyn3 T. reesei. Xyn3 T. reesei має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 16 SEQ ID NO:18 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 17 до 347 SEQ ID NO:18. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури 28A-28B: Фігура 28A: нуклеотидна послідовність XlnА (SEQ ID NO:19). Фігура 28B: амінокислотна послідовність XlnА (SEQ ID NO:20). SEQ ID NO:20 є послідовністю незрілого білка XlnА. XlnА має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 27 SEQ ID NO:20 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 28 до 211 SEQ ID NO:20. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). SEQ ID NO:19 є геномною послідовністю XlnА; залишки ініціюючого і термінуючого кодонів виділені жирним шрифтом на Фігурі 28A, і інтрон A гена XlnА підкреслений на Фігурі 28A. Фігура 29: Фігура 29 демонструє конфігурації “α-" і “β-" аномерів глюкози. Аномери визначають як "α" або "β" на основі взаємозв'язку між стереохімією екзоциклічного атома кисню при аномерному вуглецю і кисню, приєднаних до конфігураційного атома (визначаючи цукор як D або L), що часто є найбільш далеким хіральним центром у кільці. α-аномер є тим, у якому ці два положення мають однакову конфігурацію; вони є протилежними в β-аномері. Таким чином, структура α-D-глюкози має однакову стереохімію й у C1, і в C5, тоді як β-D-глюкоза має протилежну стереохімію в C1 у порівнянні з C5. Фігури 30A-30B: Фігура 30A: нуклеотидна послідовність Gz43A (SEQ ID NO:21). Фігура 30B: амінокислотна послідовність Gz43A (SEQ ID NO:22). SEQ ID NO:22 є послідовністю незрілого Gz43A. Gz43A має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 18 SEQ ID NO:22 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 340 SEQ ID NO:22. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури 31A-31B: Фігура 31A: нуклеотидна послідовність Fo43A (SEQ ID NO:23). Фігура 31B: 12 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотна послідовність Fo43A (SEQ ID NO:24). SEQ ID NO:24 є послідовністю незрілого Fo43A. Fo43A має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 20 SEQ ID NO:24 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 21 до 348 SEQ ID NO:24. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Pfam, SMART або NCBI. Фігури від 32-1 до 32-2: Вирівнювання гідролаз сімейства GH43. Амінокислотні залишки, що є висококонсервативними серед членів сімейства, виділені жирним і підкреслені. Фігура 33: амінокислотна послідовність XynВ3 (SEQ ID NO:25). Фігура 34: амінокислотна послідовність Bgl1 (SEQ ID NO:45) T. reesei. Сигнальна послідовність підкреслена. Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Послідовність, що кодує, описана в Barnett et al., 1991, Bio-Technology 9(6):562-567. Фігури 35A-35B: Фігура 35A: нуклеотидна послідовність XlnD (SEQ ID NO:39). Фігура 35B: амінокислотна послідовність XlnD (SEQ ID NO:40). SEQ ID NO:40 є послідовністю незрілого XlnD. XlnD має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 17 SEQ ID NO:40 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 18 до 804 SEQ ID NO:40. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Фігури 36A-36B: Фігура 36A: нуклеотидна послідовність Fv30A (SEQ ID NO:41). Фігура 36B: амінокислотна послідовність Fv30A (SEQ ID NO:42). SEQ ID NO:42 є послідовністю незрілого Fv30A. Fv30A має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 19 SEQ ID NO:42 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 20 до 537 SEQ ID NO:42. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Фігури 37A-37B: Фігура 37A: нуклеотидна послідовність Fv30B (SEQ ID NO:43). Фігура 37B: амінокислотна послідовність Fv30B (SEQ ID NO:44). SEQ ID NO:44 є послідовністю незрілого Fv30B. Fv30B має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 24 SEQ ID NO:44 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 25 до 485 SEQ ID NO:44. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Фігури 38A-38B: Фігура 38A: нуклеотидна послідовність Fv39A (SEQ ID NO:45). Фігура 38B: амінокислотна послідовність Fv39A (SEQ ID NO:46). SEQ ID NO:46 є послідовністю незрілого Fv39A. Fv39A має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 19 SEQ ID NO:46 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 20 до 439 SEQ ID NO:46. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Фігури 39A-39B: Фігура 39A: нуклеотидна послідовність Fv39B (SEQ ID NO:47). Фігура 39B: амінокислотна послідовність Fv39B (SEQ ID NO:48). SEQ ID NO:48 є послідовністю незрілого Fv39B. Fv39B має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 18 SEQ ID NO:48 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 456 SEQ ID NO:48. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Фігури 40A-40B: Фігура 40A: нуклеотидна послідовність XynВ (SEQ ID NO:49). Фігура 40B: амінокислотна послідовність XynВ (SEQ ID NO:50). XynВ не має прогнозованої сигнальної послідовності, що може бути отримана за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Фігури 41A-41B: Фігура 41A: нуклеотидна послідовність XylА (SEQ ID NO:51). Фігура 41B: амінокислотна послідовність XylА (SEQ ID NO:52). XylА не має прогнозованої сигнальної послідовності, що може бути отримана за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk), але має сигнальну послідовність, прогнозовану за допомогою алгоритму Uniprot (доступний на: http://www.uniprot.org/uniprot), що відповідає залишкам від 1 до 18 SEQ ID NO:52 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 705 SEQ ID NO:52. Фігури 42A-42B: Фігура 42A: нуклеотидна послідовність Xyl1 (SEQ ID NO:53). Фігура 42B: 13 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотна послідовність Xyl1 (SEQ ID NO:54). SEQ ID NO:54 є послідовністю незрілого Xyl1. Xyl1 має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 21 послідовності SEQ ID NO:54 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 22 до 500 SEQ ID NO:54. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму SignalP (доступний на: http://www.cbs.dtu.dk). Фігури 43A-43B: Фігура 43A: Концентрації EXP і етанолу, вимірювані на день 1 у результаті SSF-реакції з використанням штаму bxl1 №229 T. reesei, де в SSF-реакцію було додано 0,5 або 1,5 мг/г ксилану, очищеного Bxl1 T. reesei, або де було додано 1 мг/г ксилану, очищеного Fv43D; Фігура 43B: концентрації EXP і етанолу, вимірювані на день 3 у результаті SSF-реакції з використанням bxl1 №229 T. reesei, де в SSF-реакцію було додано 0,5 або 1,0 мг/г ксилану, очищеного Bxl1 T. reesei, або де був доданий 1 мг/г ксилану, очищеного Fv43D. Умови SSFреакції(реакцій) описані нижче в Прикладі 6. 6. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Значення абревіатур, використовуваних у даному документі, перераховані нижче: "хв." означає хвилина і хвилини; "год." означає годину і години, "дн." означає день(дні), "мкл" означає мікролітр(и), "мл" означає мілілітр(и), "л" означає літр(и), "нм" означає нанометр(и), "мм" означає міліметр(и), "см " означає сантиметр(и), "мкм" означає мікрометр(и), "мМ" означає мілімолярний(мілімолярні), "M" означає молярний(молярні), "ммоль" означає мілімоль(і), "мкмоль" означає мікромоль(і), "г" означає грам(и), "мкг" означає мікрограм(и), "мг" означає міліграм(и), "кг" означає кілограм(и), "об/хв" означає оборотів у хвилину, "об'єм. %" означає об'ємний %, "вага. %" означає ваговий %, і "об/с" означає оборотів у секунду. 6.1. Загальні визначення Крім випадків, згаданих особливо, усі патенти і патентні заявки США, наведені в даному документі, включені за допомогою посилання в їхньому повному обсязі. Більш того, якщо кількість, концентрація, або інша величина, або параметр дані у вигляді діапазону, переважного діапазону або переліку верхніх переважних значень або нижніх переважних значень, це варто розуміти як конкретні розкриття усіх діапазонів або значень протягом безперервного відрізка, утвореного в цих діапазонах. При перерахуванні в даному документі діапазону числових значень, якщо не зазначене інше, мається на увазі діапазон, що включає крайні значення цього діапазону і всі цілі числа і частини в межах діапазону. Не мається на увазі, що обсяг даного винаходу обмежений конкретними значеннями, зазначеними при визначенні діапазону. Як використовується в даному документі однина і множина елемента або компонента даного винаходу маються на увазі як необмежуючі у відношенні числа прикладів (наприклад, випадків) елемента або компонента. У такий спосіб однину варто читати як: включає одне або щонайменше одне, і форма однини елемента і компонента також включає множину, за винятком випадків, де число явно повинно означати єдине. Як використовується в даному документі вираз "що включає" означає наявність заданих ознак, цілих чисел, етапів або компонентів, що зазначені у формулі винаходу, але це не виключає присутності або додавання одного або декількох інших ознак, цілих чисел, етапів, компонентів або їхніх груп. Вираз "що включає", як мається на увазі, включає варіанти здійснення, охоплювані виразом "що містить головним чином" і "складається з". Аналогічно, мається на увазі, що вираз "що містить головним чином" включає варіанти здійснення, охоплювані виразом "складається з". Як використовується в даному документі вираз "приблизно", що модифікує кількість інгредієнта або реагенту або величину параметра даного винаходу, відноситься до варіювання числової величини, що може зустрічатися, наприклад, серед типових вимірювальних процедур і процедур, зв'язаних з переміщенням рідини, використовуваної для виготовлення концентратів або розчинів у реальних умовах роботи, внаслідок неминучих помилок у цих процедурах, внаслідок розходжень при виготовленні, джерела або чистоти інгредієнтів, використовуваних для створення композицій або виконання способів; і т. ін. Вираз "приблизно" також охоплює кількості, що розрізняються внаслідок різних рівноважних умов для композиції, отриманої з конкретної початкової суміші. Незалежно від модифікації виразу "приблизно", формула винаходу включає еквіваленти кількостям, на які вони вказують. Вираз "одночасні оцукрювання і ферментація" або "SSF" відносяться до схеми або процесу реакції, при якій оцукрюють біомасу й отримані в результаті оцукрювання цукри, що підлягають ферментації, використовують за допомогою ферментів і/чи ферментуючих мікроорганізмів для одержання продукту усі за один раз, як правило в тій же реакційній посудині. Вираз "гібридне оцукрювання і ферментація" або "HSF" відноситься до схеми або процесу реакції, при якій оцукрюють біомасу до обмеженого ступеня (неповне або часткове 14 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 оцукрювання), за чим йдуть безперервні оцукрювання і ферментація, що відбуваються одночасно. Вираз "окремі оцукрювання і ферментація", "окремі гідроліз і ферментація" і "SHF" використовуються в даному документі взаємозамінно. Вони стосуються схеми або процесу реакції, при якій оцукрюють або гідролізують біомасу до істотного завершення (наприклад, приблизно 60 % або більшого завершення, приблизно 70 % або більшого завершення, приблизно 80 % або більшого завершення, приблизно 90 % або більшого завершення, або приблизно 95 % або більшого завершення) або до завершення (наприклад, приблизно 99 % або більшого завершення, або приблизно 100 % завершення так, щоб вивільнилися всі цукри, що підлягають ферментації, що можуть бути вивільнені в результаті даної реакції оцукрювання), за яким йде окремий і відмінний етап ферментації, при якому ферментаційні цукри, отримані в результаті етапу оцукрювання або гідролізу, ферментуються з одержанням продукту ферментації. Вираз "цукор, що підлягає ферментації" стосується олігосахаридів і моносахаридів, що можуть використовуватися мікроорганізмом як джерело вуглецю в процесі ферментації. Вираз "часткове оцукрювання" відноситься до обмеженого оцукрювання біомаси, де вивільнені цукри, що підлягають ферментації, менше загальної кількості цукрів, що підлягають ферментації, які можуть бути вивільнені, якщо оцукрювання пройде до завершення. Вираз "целюлозний" відноситься до композиції, що містить целюлозу і додаткові компоненти, що включають, наприклад, геміцелюлозу. Вираз "оцукрювання" відноситься до одержання цукрів, що підлягають ферментації, з полісахаридів або матеріалів, що містять полісахарид. Вираз "біомаса" відноситься до будь-якого целюлозного і геміцелюлозного матеріалу, що містить целюлозу, і необов'язково додатково утримуючому геміцелюлозу, лігнін, крохмаль, олігосахариди і/чи моносахариди. Біомаса також може містити додаткові компоненти, такі як білки і/чи ліпіди. Біомаса може бути отримана з одного джерела, або біомаса може включати суміш, отриману з більш ніж одного джерела. Наприклад, біомаса може включати суміш кукурудзяної соломи і кукурудзяного стебла або суміш трави і листів. Біомаса включає, але без обмежень, біоенергетичні культури, відходи сільського господарства, міські тверді відходи, промислові тверді відходи, відходи паперового виробництва, садові відходи, деревні і лісові відходи. Приклади біомаси включають, без обмежень, кукурудзяну солому, залишки зернових, таких як кукурудзяна лушпайка, кукурудзяна солома, трава, пшениця, солома пшениці, солома ячменю, сіно, рисова солома, просо, паперові відходи, багаса цукрового очерету, сорго, арундо очеретяний, пенісетум червоний, міскантус, криптомелію японську, компоненти, отримані після здрібнювання зерна, пагона, гілок, листів, деревної тирси, тирси, чагарників і кущів, овочів, фруктів, квітів і тваринного гною. Термін "оцукрюючий фермент" стосується ферменту, що може каталізувати перетворення компонента біомаси у цукри, що підлягають ферментації. Частим випадком є те, що фермент є більш ефективним у продукуванні цукрів, що підлягають ферментації, якщо біомаса попередньо оброблена. 6.2. Докладний опис Одержання речовини або продукту ферментації з целюлозних матеріалів звичайно включає три основних етапи. Ці три етапи являють собою (1) попередню обробку або попередній гідроліз, (2) ферментативний гідроліз або оцукрювання та (3) ферментацію, після якої речовина або продукт ферментації можуть бути відновлені. Приведений нижче приклад являє собою процес одержання етанолу, однак буде зрозуміло, що подібні процеси можуть бути використані для одержання інших речовин. Попередня обробка. На етапі попередньої обробки або попереднього гідролізу целюлозний матеріал (що включає, наприклад, лігнінцелюлозний матеріал) нагрівають для зруйнування лігніну і вуглеводної структури, для розчинення більшої частини геміцелюлози і для того, щоб зробити целюлозну фракцію доступною для целюлолітичних ферментів. Етап нагрівання виконують, або при безпосередньому використанні пари, або в суспензії, або суміші, де до матеріалу можуть необов'язково додати каталізатор для прискорення реакцій. Придатні каталізатори включають, наприклад, сильні кислоти, такі як сірчана кислота та SO 2, або сильні основи, такі як гідроксид натрію. Етап попередньої обробки сприяє проникненню ферментів і мікроорганізмів. Целюлозна біомаса може також бути піддана попередній обробці у якості гідротермальної обробки парою (див., наприклад, публікацію патенту США № 2002/0164730). Оцукрювання. На етапі ферментативного гідролізу, також відомому як етап оцукрювання, ферменти, як описано в даному документі, додають у попередньо оброблений матеріал для перетворення целюлозної фракції до глюкози і/або інших цукрів. Етап оцукрювання виконують, 15 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зазвичай, у реакційних апаратах з мішалкою або ферментаторах при регульованих pН, температурі й умовах перемішування. Етап оцукрювання в деяких випадках може тривати до 200 годин. Оцукрювання може проводитися за температур від приблизно 30 °C до приблизно 65 °C, зокрема, приблизно 50 °C та при pН від приблизно 4 до приблизно 5, зокрема, приблизно при pН 4,5. Для одержання глюкози, що може бути метаболізована мікроорганізмом, який ферментує, таким як гриб (наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб) або бактерія (наприклад, Zymomonas mobillis або Clostridium thermocellum), етап ферментативного гідролізу звичайно проходить в присутності β-глюкозидази. Ферментація. На етапі ферментації, цукри, які виділені з целюлозного матеріалу в результаті етапів попередньої обробки і ферментативного гідролізу, ферментуються до етанолу (або інших речовин) ферментуючим мікроорганізмом, таким як гриб (наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб) або бактерія (наприклад, Zymomonas mobillis або Clostridium thermocellum). SSF. Дійсний опис передбачає способи і композиції поліпшення виходу реакцій, у яких відбувається етап ферментації, більш ніж у відмінних або окремих етапах, що йдуть за етапом ферментативного гідролізу, одночасно з етапом ферментативного гідролізу в тій самій посудині, переважно при регульованих pН, температурі й умовах перемішування. У деяких аспектах оцукрювання і ферментацію виконують одночасно в тій самій посудині, і, власне кажучи, вони є одночасним оцукрюванням і ферментацією, або "SSF". Цей процес, як описано в цьому документі, охоплює також процеси, що проводять з використанням "гібридного оцукрювання і ферментації" або конфігурації "HSF". У деяких аспектах SSF-реакцію ініціюють (наприклад, при додаванні ферментуючого мікроорганізму у реакцію оцукрювання, або встановленням сукупності умов для підтримки ферментації), коли не більше 30 %, не більше 25 %, не більше 20 %, не більше 15 %, не більше 10 % або не більше 5 % біомаси оцукрено. Як використовується в цьому документі вираз "SSF" також охоплює спільну ферментацію складних цукрів (Sheehan and Himmel, 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). 6.3. Ферментативний гідроліз Клітинні стінки вищих рослин складаються з різноманіття вуглеводних полімерних (CP) компонентів. Ці CP компоненти взаємодіють ковалентним та нековалентним способом, забезпечуючи структурну цілісність рослин, необхідну для формування твердих клітинних стінок і для опору тургорному тиску. Велика частина CP, знайдених у рослинах, являють собою целюлозу, що формує структурний кістяк рослинних клітинних стінок. При біосинтезі целюлози ланцюги полі-β-1,4-D-глюкози з'єднуються між собою за допомогою водневих зв'язків і гідрофобних взаємодій з формуванням целюлозних мікрофібрил, що згодом з'єднуються між собою, формуючи більш великі фібрили. Целюлозні мікрофібрили почасти нерівномірні і містять ділянки кристалічності, що змінюється. Ступінь кристалічності целюлозних фібрил залежить від того, як щільно упорядковані водневі зв'язки, що розташовуються між будь-якими двома компонентами целюлозних ланцюгів. Ділянки з менш упорядкованими зв'язками, і тому більш доступними глюкозними ланцюгами, названі як аморфні ділянки. Загальна модель перетворення або деполімеризації целюлози в глюкозу включає три ферментативні активності. Ендоглюканази розщеплюють целюлозні ланцюги зсередини з формуванням більш коротких ланцюгів і збільшенням кількості доступних кінців, що потім піддаються дії екзоглюканаз. Екзоглюканази є специфічними для або кінців, що відновлюють, або кінців, що невідновлюють, більш коротких ланцюгів, і здатні до вивільнення целобіози, димеру глюкози. Приклади екзоглюканаз включають, без обмежень, різні целобіогідралази. Целобіоза, що нагромадилася, потім розщеплюється целобіазами з утворенням глюкози. Приклади целобіаз включають, без обмежень, різні β-1,4-глюкозидази. Геміцелюлоза містить ряд різних цукрових мономерів, які, на відміну від таких у целюлозі, містять безводну глюкозу. Наприклад, крім глюкози, цукрові мономери в геміцелюлозі можуть включати ксилозу, манозу, галактозу, рамнозу й арабінозу. Геміцелюлози містять, головним чином, D-пентозні цукри, а також іноді невеликі кількості L-цукрів. Ксилоза є цукровим мономером, що є присутнім у найбільшій кількості, але мануронова кислота та галактуронова кислота також мають тенденцію бути присутніми. Геміцелюлози включають, наприклад, ксилан, глюкуроноксилан, арабіноксилан, глюкоманан і ксилоглюкан. Ферменти і мультиферментні композиції даного розкриття є придатними для оцукрювання геміцелюлозних матеріалів, наприклад, ксилану, арабіноксилану і субстратів, що містять ксилан- або арабіноксилан. Арабіноксилан являє собою полісахарид, що складається з ксилози й арабінози, де L-α – арабінофуранозні залишки приєднані як точки розгалуження до β-(1,4)зв'язаного ксилозного полімерного кістяку. 16 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Через складність більшості джерел біомаси, що можуть містити целюлозу, геміцелюлозу, пектин, лігнін, білки і золу серед інших компонентів, у деяких аспектах ферментні суміші цього розкриття можуть містити ферменти з діапазоном субстратних специфічностей, що діють разом для ефективного розкладання біомаси у цукри, що піддають ферментаціі. Один приклад мультиферментного комплексу для оцукрювання лігноцелюлози включає суміш целобіогідролаз(и), ксиланаз(и), ендоглюканаз(и), β-глюкозидаз(и), β-ксилозидаз(и) і необов'язково різні акцесорні білки. Таким чином, дане розкриття розглядає застосування одного або більше ферментів, що здатні окремо або разом продукувати вуглеводи, що можуть бути застосовані у якості джерел енергії ферментуючим(чими) організмом(ами) у SSF-реакції для одержання продукту ферментації, такого як етанол. У деяких аспектах мультиферментні композиції застосовують у SSF-реакціях для гідролізу вуглеводів або субстратів з вуглевод-утримуючою біомасою для одержання цукрів, що ферментовані в такій же реакції ферментуючими мікроорганізмами. Мультиферментні композиції (що включають продукти переробки, сукупності ферментів або "сумішки") містять суміш (або "сумішку") ферментів, що у деяких аспектах не зустрічаються у природі. Як використовується в даному документі вислів "сумішка" відноситься до: (1) композиції, створеної об'єднанням складових ферментів, або у формі ферментативного бульйону, або у формі частково або цілком ізольованих або очищених поліпептидів; (2) композиції, отриманої за допомогою організму, модифікованого для експресії одного або більше складових ферментів; необов'язково, організм може бути модифікований для видалення одного або більше генів або інактивації одного або більше генних продуктів, де гени, кодують білки, що впливають на гідроліз ксилану, гідроліз геміцелюлози і/або гідроліз целюлози; (3) композиції, створеної комбінуванням складових ферментів одночасно, окремо або послідовно під час SSF-реакції; і (4) суміші ферментів, отриманих in situ, наприклад, під час SSF-реакції; (5) сполучення будь-яких або всіх зазначених вище пунктів (1)-(4). Також необхідно розуміти, що кожний з ферментів, специфічно описаних у даному документі, може бути об'єднаний з будь-яким одним або більше ферментами, описаними в даному документі або з будь-якими іншими доступними і придатними ферментами для одержання мультиферментних композицій. Розкриття не обмежується або не зводиться до специфічних зразкових комбінацій, які описані та приведені у якості прикладів у даному документі. У способах даного розкриття, будь-який (з) фермент(ів), описаний у даному документі, може бути доданий до або під час SSF-реакції, у тому числі під час або після розмноження ферментуючого(их) організму(ів).Ферменти можуть бути додані окремо, як ферментативна сумішка або як ферментативний бульйон і т.д. Ферменти, описані в даному документі, можуть бути виділені або отримані з будь-яких придатних джерел, включаючи, наприклад, бактерії, гриби, дріжджі або ссавців. Вираз "отриманий" означає, що фермент може бути виділений з організму, що природно продукує фермент у якості нативного ферменту або фермент може бути отриманий рекомбінантно в організмі-хазяїні, де рекомбінантно отриманий фермент є або нативним, або чужорідним для організму-хазяїна, має модифіковану амінокислотну послідовність, наприклад, має одну або більше амінокислот, що вилучені, вставлені і/або заміщені, або є ферментом, отриманим у ході процесів перестановки нуклеїнових кислот, відомих у рівні техніки. Наприклад, фермент, отриманій рекомбінантно, може бути ферментом, що є мутантом і/або фрагментом нативної амінокислотної послідовності. Мається на увазі, що вираз "нативний фермент" включає продукт гена в його природному розташуванні в геномі організму, а також включає природні варіанти; мається на увазі, що вираз "чужорідний фермент" включає продукт гена, який природно не зустрічається в організмі-хазяїні, але який уведений в організм-хазяїн перенесенням генів або генною вставкою у ненативний організм, або химерні гени, що включають ферменти, отримані рекомбінантно, наприклад, сайт-специфічним мутагенезом або перестановою. Ферменти в деяких аспектах можуть бути очищеними. Вираз "очищений" як використовується в цьому документі для модифікації речовин, таких як ферменти, білки, поліпептиди, полінуклеотиди та інші компоненти, відноситься до ферментів, вільних або здебільшого вільних від інших компонентів організмів, з яких вони були виділені. У деяких аспектах вираз "очищений" також включає ситуації, де ферменти вільні або здебільшого вільні від компонентів нативних організмів, з яких вони були отримані. Ферменти можуть вважатися "очищеними", але залишатися з'єднаними з або в присутності незначних кількостей інших білків. Вираз "інші білки" як використовується в цьому документі відноситься, зокрема, до інших 17 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферментів. Вираз "очищений" як використовується в цьому документі також відноситься до видалення інших компонентів, зокрема, видалення інших білків і більш конкретно, інших ферментів, що є присутніми у вихідних клітинах ферментів цього розкриття. Таким чином, фермент може бути, наприклад, "у значній мірі чистим поліпептидом", що здебільшого звільнений від інших компонентів. Організм, у якому даний фермент отримують, може бути, наприклад, організмом-хазяїном, що підходить для рекомбінантного одержання ферментів. Наприклад, у значній мірі чистий поліпептид може відноситися до поліпептиду, що присутній на рівні 50 ваг. % або більше, 60 ваг. % або більше, 70 ваг. % або більше, 80 ваг. % або більше, 90 ваг. % або більше, 95 ваг. % або більше,98 % або більше або 99 % або більше у суміші, частиною якої він є. Поліпептид, що здебільшого звільнений від інших компонентів являє собою компонент суміші, що містить менше 40 ваг. %, менше 30 ваг. %, менше 20 ваг. %, менше 10 ваг. %, менше 5 ваг. %, менше 2 ваг. %, або менше 1 ваг. % інших компонентів. 6.3.1. Целюлази Ферментні сумішки даного винаходу можуть містити одну або більше целюлаз. Целюлази є ферментами, котрі гідролізують целюлозу (β-1,4-глюкан або β-D-глюкозидні зв'язки) для утворення глюкози, целобіози, целоолігосахаридів та т.ін. Целюлази звичайно поділяють на три основних класи: ендоглюканази (EC 3.2.1.4) ("EG"), екзоглюканази або целобіогідролази (EC 3.2.1.91) ("CBH") і β-глюкозидази (β -D-глюкозидглюкогідролази; EC 3.2.1.21) ("BG") (Knowles et al., 1987, Trends in Biotechnol. 5(9):255-261, і Schulein, 1988, Methods of Enzymology 160:234-242). Ендоглюканази діють головним чином на аморфні частини волокна целюлози, тоді як целобіогідролази здатні розкладати кристалічну целюлозу. Целюлази для застосування відповідно до способів і композицій цього розкриття, можуть бути отримані, зокрема, з одного або більше наступних організмів: Crinipellis scapella, Macrophomina phaseolina, Myceliophthora thermophila, Sordaria fimicola, Volutella colletotrichoides, Thielavia terrestris, Acremonium sp., Exidia glandulosa, Fomes fomentarius, Spongipellis sp., Rhizophlyctis rosea, Rhizomucor pusillus, Phycomyces niteus, Chaetostylum fresenii, Diplodia gossypina, Ulospora bilgramii, Saccobolus dilutellus, Penicillium verruculosum, Penicillium chrysogenum, Thermomyces verrucosus, Diaporthe syngenesia, Colletotrichum lagenarium, Nigrospora sp., Xylaria hypoxylon, Nectria pinea, Sordaria macrospora, Thielavia thermophila, Chaetomium mororum, Chaetomium virscens, Chaetomium brasiliensis, Chaetomium cunicolorum, Syspastospora boninensis, Cladorrhinum foecundissimum, Scytalidium thermophila, Gliocladium catenulatum, Fusarium oxysporum ssp. lycopersici, Fusarium oxysporum ssp. passiflora, Fusarium solani, Fusarium anguioides, Fusarium poae, Humicola nigrescens, Humicola grisea, Panaeolus retirugis, Trametes sanguinea, Schizophyllum commune, Trichothecium roseum, Microsphaeropsis sp., Acsobolus stictoideus spej., Poronia punctata, Nodulisporum sp., Trichoderma sp. (наприклад, Trichoderma reesei) та Cylindrocarpon sp. У конкретних варіантах здійснення целюлаза, що використовується в композиції цього розкриття, може досягати щонайменше 0,1, щонайменше 0,2, щонайменше 0,3, щонайменше 0,4 або щонайменше 0,5 долі продукту, як визначено аналізом з калькофлуором, як описано в наступному підрозділі. У деяких варіантах здійснення целюлаза, що використовується в композиції цього розкриття, є цільною целюлазою і/або здатною досягати щонайменше 0,1, щонайменше 0,2, щонайменше 0,3, щонайменше 0,4 або щонайменше 0,5 долі продукту, як визначено аналізом з калькофлуором як описано в наступному підрозділі. У деяких варіантах здійснення целюлаза, що використовується в композиції цього розкриття, є цільною целюлазою і/або здатною досягати від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, або від приблизно 0,1 до приблизно 0,4, або від приблизно 0,2 до приблизно 0,4, або від приблизно 0,3 до приблизно 0,4, або від приблизно 0,2 до приблизно 0,5, або від приблизно 0,3 до приблизно 0,5 долі продукту, як визначено аналізом з калькофлуором як описано в наступному підрозділі. 6.3.1.1. Аналіз целюлазної активності при використанні барвника калькофлуор білий Целюлозу, набряклу у фосфорній кислоті (PASC) готують з Avicel PH-101 з використанням придатного протоколу Walseth, 1971, TAPPI 35:228 та Wood, 1971, Biochem. J. 121:353-362. Коротко, у зразковому способі, Avicel розчиняють у концентрованій фосфорній кислоті, потім осаджують, використовуючи холодну деіонізовану воду. Після того, як целюлозу збирають і промивають водою для досягнення нейтрального pН, її розчиняють до 1 % сухої речовини в натрій ацетатному буфері 50 ммоль, при pН 5,0. Усі ферментні розчини готують з натрій ацетатним буфером 50 ммоль, pН 5,0. Целюлазу GC220 (Danisco US Inc., Genencor) розчиняють до 2,5, 5, 10 та 15 мг білка/г PASC, для одержання лінійної калібрувальної кривої. Зразки, котрі необхідно випробувати, розчиняють до падіння в межах калібрувальної кривої, тобто, для одержання відповіді від 0,1 до 0,4 долі продукту. Сто п'ятдесят (150) мкл холодної 1 % PASC додають у кожні 20 мкл ферментного 18 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розчину у відповідній посудині, наприклад, 96-ямкових титраційних мікропланшетах. Планшети закривають і інкубують 2 години при 50 °C, з обертанням при 200 об/хв, в інкубаторі/качалці. Реакції потім гасять, використовуючи 100 мкл 50 мкг/мл калькофлуора в гліцині 100 ммоль, pН 10. Флуоресценцію зчитують з флуоресцентного рідера мікропланшетів при довжині хвилі збудження Ex=365 нм і довжині хвилі випромінювання Em=435 нм. Результат виражають у долях продукту відповідно до рівняння: FP=1-(Fl проби - Fl буфера з целобіозою)/(Fl вихідного ферменту – Fl буфера з целобіозою), де "FP" - доля продукту і "Fl" – одиниці флуоресценції. 6.3.1.2. β-Глюкозидази Ферментні сумішки цього розкриття необов'язково містять одну або більше β-глюкозидаз. Вираз «β-глюкозидаза" як використовується в цьому документі відноситься до β-Dглюкозидглюкогідролаз, що прираховані у або згідно EC 3.2.1.21, і/або до ферменту, який є членом деяких сімейств глікозилгідролаз ("GH"), що включають, без обмежень, GH сімейства 1, 3, 9 або 48. У деяких аспектах вираз відноситься до ферменту, здатного каталізувати гідроліз целобіози для вивільнення β-D-глюкози. β-глюкозидази можуть бути отримані з будь-яких придатних мікроорганізмів. Вони можуть бути виділені або отримані рекомбінантними способами, або отримані з комерційних джерел. Придатні β-глюкозидази можуть, наприклад, бути виділені з таких мікроорганізмів як бактерії або гриби. Наприклад, придатна β-глюкозидаза може бути отримана з міцеліальних грибів. У деяких аспектах придатна β-глюкозидаза може бути отримана з Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gen 173: 287-288), Aspergillus kawachi (Iwashita et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 5546-5553), Aspergillus oryzae (PCT публікація патентної заявки WO 2002/095014), Cellulomonas biazotea (Wong et al., 1998, Gen 207:79-86), Penicillium funiculosum (PCT публікація патентної заявки WO 200478919), Saccharomycopsis fibuligera (Machida et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 54: 3147-3155), Schizosaccharomyces pombe (Wood et al., 2002, Nature 415: 871-880) або Trichoderma reesei. Наприклад, придатні β-глюкозидази з Trichoderma reesei можуть включати β-глюкозидазу 1 (патент США № 6022725), β-глюкозидазу 3 Trichoderma reesei (патент США № 6982159), β-глюкозидазу 4 Trichoderma reesei (патент США № 7045332), β-глюкозидазу 5 Trichoderma reesei (патент США № 7005289), β-глюкозидазу 6 Trichoderma reesei (публікація патентної заявки США 20060258554) або β-глюкозидазу 7 Trichoderma reesei (публікація патентної заявки США 20060258554). У деяких варіантах здійснення винаходу придатні β-глюкозидази можуть бути отримані за допомогою експресії генів, що кодують β-глюкозидази. Наприклад, придатна β-глюкозидаза може бути виділена в позаклітинний простір, наприклад, деякими грампозитивними організмами (такими як Bacillus або Actinomycetes), або еукаріотичним хазяїном (наприклад, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces, або Pichia). Придатні β-глюкозидази також можуть бути отримані з комерційних джерел. Приклади комерційних β-глюкозидазних препаратів, що придатні для використання в способах, композиціях та інших варіантах здійснення даного розкриття, включають, без обмежень, βглюкозидазу Trichoderma reesei в Accellerase™ BG (Danisco US Inc., Genencor); NOVOZYM™ 188 (β-глюкозидаза з Aspergillus niger); β-глюкозидазу Agrobacterium sp. та β-глюкозидазу Thermatoga maritima, доступну від Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co. Wicklow, Ireland.). У деяких аспектах придатна β-глюкозидаза може бути компонентом цільної целюлази, як описано нижче в підрозділі 6.3.1.5. Активність β-глюкозидази може визначатися способами, відомими в даному рівні техніки. Наприклад, може використовуватися аналіз, описаний Chen і співавт., 1992, у Biochimica et Biophysica Acta 121:54-60. У цьому аналізі, одна одиниця pNPG означає 1 мкмоль нітрофенолу, виділеного з пара-нітрофеніл-B-D-глюкопіранозиду за 10 хв при 50 °C (або 122 °F) і pН 4,8. 6.3.1.3. Ендоглюканази Ферментні сумішки цього розкриття необов'язково містять одну або більше ендоглюканаз. Вираз "ендоглюканаза" відноситься до будь-яких поліпептидів, прирахованих до EC 3.2.1.4. У деяких аспектах EG1 Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 63:103-112) і/або EGII T. reesei (Saloheimo et al., 1988, Gene 63:11-21) використовують в способах і композиціях цього розкриття. В інших аспектах ендоглюканаза може бути ендоглюканазою VI T. reesei (див., наприклад, патент США № 7351568), ендоглюканазою VII (див., наприклад, патент США № 7449319) або ендоглюканазою VIII (див., наприклад, патент США № 7049125). У конкретних варіантах здійснення винаходу придатна ендоглюканаза може бути термостабільною ендоглюканазою Thielavia terrestris (Kvesitadaze et al., 1995, Appl. Biochem. Biotechnol. 50:137-143); EGIII Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 19 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 64:555-563), EGIV (Saloheimo et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249:584-591), EG5 (Saloheimo et al., 1994, Mol. Microbiol. 13:219-228), EGVI (публікація патентної заявки США № 20070213249) або EGVII (публікація патентної заявки США № 20090170181); ендоглюканазою Acidothermus cellulolyticus EI (патент США № 5536655); ендоглюканазою V Humicola insolens (EGV) (Protein Data Bank запис 4ENG); ендоглюканазою Staphylotrichum coccosporum (публікація патентної заявки США № 20070111278); ендоглюканазою F1-CMC Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18:5884); ендоглюканазою CMCase-1 Aspergillus kawachii IFO 4308 (Sakamoto et al.,1995, Curr. Genet. 27:435-439); або Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Ген 90:9-14); ендоглюканазою Acremonium thermophilum ALKO4245 (публікація патенту США № 20070148732). Ендоглюканази, придатні для використання в способах і композиціях даного розкриття, можуть бути також описані в, наприклад, PCT публікаціях патентних заявок WO 91/17243, WO 91/17244, WO 91/10732 або патенті США № 6001639. 6.3.1.4. Целобіогідролази Вираз "целобіогідролаза" як використовується в цьому документі відноситься до будь-яких целобіогідролаз, прирахованих до EC 3.2.1.91. Способи і композиції даного розкриття можуть включати відповідно одну або більше целобіогідролаз ("CBH"). У визначених аспектах CBHI Trichoderma reesei (Shoemaker et al., 1983, Bio/Technology 1:691-696) і/або CBHII (Teeri et al., 1983, Bio/Technolgy 1:696-699) використовуються в способах і композиціях даного розкриття. У визначених аспектах придатна CBH може бути CBH1 Agaricus bisporus (Swiss Prot Accession № Q92400); CBH1 Aspergillus aculeatus (Swiss Prot Accesion № O59843); CBHA Aspergillus nidulans (GenBank Accession № AF420019); CBHB Aspergillus nidulans (GenBank Accession № AF420020); CBHA Aspergillus niger (GenBank Accession № AF156268); CBHB Aspergillus niger (GenBank Accession № AF156269); CBH1 Claviceps purpurea (Swiss Prot Accession № O00082); CBH1 Cochliobolus carbonarum (Swiss Prot Accession № Q00328); CBH1 Cryphonectria parasitica (Swiss Prot Accession № Q00548); CBH1 Fusarium oxysporum (Cel7A) (Swiss Prot Accession № P46238); cbh1.2 Humicola grisea (GenBank Accession № U50594); CBH1 Humicola grisea var. thermoidea (GenBank Accession № D63515); CBHI.2 Humicola grisea var. thermoidea (GenBank Accession № AF123441); exo1 Humicola grisea var. thermoidea (GenBank Accession № AB003105); Cel7B Melanocarpus albomyces (GenBank Accession № AJ515705), CBHI Neurospora crassa (GenBank Accession № X77778); CBHI Penicillium funiculosum (Cel7A) (публікація патенту США № 20070148730); CBHI Penicillium janthinellum (GenBank Accession № S56178); CBH Phanerochaete chrysosporium (GenBank Accession № M22220); CBHI-2 Phanerochaete chrysosporium (Cel7D) (GenBank Accession № L22656); Cbh1A Talaromyces emersonii (GenBank Accession № AF439935); CBH1 Trichoderma viride (GenBank Accession № X53931) або V14 Cbh1 Volvariella volvacea (GenBank Accession № AF156693). 6.3.1.5. Загальні целюлази У визначених аспектах ферментні сумішки даного розкриття включають загальну целюлазу. Як використовується в цьому документі "загальна целюлаза" відноситься як до природних, так і до штучних композицій, що містять целюлазу, які включають: (1) ендоглюканазу, що розщеплює внутрішні β-1,4 зв'язки целюлози, які приводять до більш коротких глюкоолігосахаридів, (2) целобіогідролазу, що діє "екзо" способом для вивільнення одиниць целобіози з більш коротких глюкоолігосахаридів; приклади одиниць целобіози включають β-1,4 глюкоза-глюкоза дисахарид і (3) β-глюкозидазу, що каталізує вивільнення глюкозних мономерів з коротких целоолігосахаридів або целобіоз, що є димерами глюкози. "Природна, що містить целюлазу" композиція є такою, котра продукується природним джерелом, що включає один або більше компонентів і активностей целобіогідролазного типу, один або більше компонентів і активностей ендоглюканазного типу й один або більше компонентів і активностей β-глюкозидазного типу, де кожний з цих компонентів або активностей виявлені в співвідношеннях і рівнях, продукованих у природі, неторканій рукою людини. Таким чином, природна композиція, що містить целюлазу, є, приміром, композицією, що одержують за допомогою організму немодифікованого щодо целюлозних ферментів так, що співвідношення або рівні складових ферментів є незміненими в порівнянні з такими, отриманими за допомогою природного організму в природі. "Штучна композиція, що містить целюлазу" відноситься до композиції, отриманої за допомогою: (1) об'єднання складових целюлолітичних ферментів, або у природному, або штучному, тобто зміненому, співвідношенні; або (2) модифікації організму для надекспресії або зниженої експресії одного або більше целюлолітичних ферментів; або (3) модифікації організму таким чином, щоб видалити щонайменше один целюлолітичний фермент. "Штучну" композицію, що містить целюлазу, можна також віднести до композиції, отриманої 20 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 завдяки регулюванню умов культивування для природних організмів так, щоб природні організми вирощувалися при неприродній умові і продукували змінений рівень або співвідношення ферментів. Таким чином, у деяких варіантах здійснення препарат загальної целюлази даного розкриття може мати один або більше EG і/або CBH і/або β-глюкозидаз, вилучених і/або надекспресованих. У даному розкритті препарат загальної целюлази може бути з будь-якого мікроорганізму, здатного гідролізувати целюлозний матеріал. У деяких варіантах здійснення препарат загальної целюлази є загальною целюлазою міцеліального гриба. Наприклад, препарат загальної целюлази може бути з видів Acremonium, Aspergillus, Emericella, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Scytalidium, Thielavia, Tolypocladium або Trichoderma. Препарат загальної целюлази є, наприклад, загальною целюлазою Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger або Aspergillus oryzae. Крім того, препарат загальної целюлази може бути препаратом загальної целюлази Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides або Fusarium venenatum. Препарат загальної целюлази також може бути препаратом загальної целюлази Chrysosporium lucknowense, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Penicillium funiculosum, Scytalidium thermophilum або Thielavia terrestris. Крім того, препарат загальної целюлази може бути препаратом загальної целюлази Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei (наприклад, RL-P37 (Sheir-Neiss G et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1984, 20, pp.46-53), QM9414 (ATCC No. 26921), NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56466, 56767) або Trichoderma viride (наприклад, ATCC 32098 і 32086). Препарат загальної целюлази, зокрема, може бути відповідно препаратом загальної целюлази Rut30Trichoderma reesei, що доступний з Американської колекції типових культур як Trichoderma reesei ATCC 56765. Наприклад, препарат загальної целюлази також може бути відповідно загальною целюлазою Penicillium funiculosum, що доступний з Американської колекції типових культур як Penicillium funiculosum ATCC номер 10446. Препарат загальної целюлази може бути також отриманим з комерційних джерел. Приклади комерційних препаратів целюлази, що підходять для застосування в способах і композиціях даного розкриття, включають, наприклад, CELLUCLAST™, і Cellic™ (Novozymes A/S), і LAMINEX™ BG, IndiAge™ 44L, Primafast™ 100, Primafast™ 200, Spezyme™ CP, Accellerase™ 1000 і Accellerase™ 1500 (Danisco US. Inc., Genencor). Придатні препарати загальної целюлази можна приготувати, використовуючи будь-які способи культивування мікроорганізмів, відомі в даному рівні техніки, головним чином ферментацію, що приводить до експресії ферментів, здатних гідролізувати целюлозний матеріал. Як використовується в цьому документі "ферментація" відноситься до культивування у колбі, що струшується, ферментації у дрібному або великому масштабі, такий як безперервна, періодична ферментація, ферментація з підживленням або у твердому стані в лабораторії або промислових ферментерах, що виконується в придатному середовищі і при умовах, що дозволяють експресувати і/або ізолювати целюлазу і/або ферменти, що цікавлять. Звичайно мікроорганізм культивують у середовищі для клітинних культур, що підходить для одержання ферментів, здатних гідролізувати целюлозний матеріал. Культивування проводиться в придатному живильному середовищі, що містить джерела вуглецю й азоту і неорганічні солі, ізастосуванням способів і варіантів, відомих у даному рівні техніки. Придатне культуральне середовище, діапазон температур та інші умови для росту і одержання целюлази відомі в даному рівні техніки. Як необмежуючий приклад типовий діапазон температур для одержання целюлази за допомогою Trichoderma reesei складає від 24 °C до 28 °C. Препарат загальної целюлази можна використовувати, з тим як його отримують у результаті ферментації, без або з мінімальним відновленням і/або очищенням. Наприклад, як тільки целюлази секретуються в середовищі клітинної культури, середовище клітинної культури, що містить целюлази, може негайно використовуватися. Препарат загальної целюлази може включати нефракціонований вміст матеріалу ферментації, включаючи використане середовище клітинних культур, позаклітинні ферменти і клітини. З іншої сторони, препарат загальної целюлази можна також піддати додатковій обробці в ряді загальноприйнятих етапів, наприклад, осадження, центрифугування, адсорбційна хроматографія, фільтрація і т.ін. Наприклад, препарат загальної целюлази можна концентрувати і потім використовувати без додаткового очищення. Препарат загальної целюлази можна, наприклад, скласти з включенням визначених 21 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хімічних засобів, що зменшують життєздатність клітин або вбивають клітини після ферментації. Клітини можна, наприклад, лізувати або порушувати проникність мембрани із застосуванням способів, відомих у даному рівні техніки. Ендоглюканазну активність препарату загальної целюлази можна визначити, використовуючи карбоксиметилцелюлозу (CMC) як субстрат. Придатний аналіз вимірює продукування кінців, що редукують, вироблених сумішшю ферментів, що діють на CMC, де 1 одиниця є кількістю ферменту, що вивільняє 1 мкмоль продукту/хв. (Ghose, T. K., Pure & Appl. Chem. 1987, 59, pp. 257-268). Загальна целюлаза може являти собою целюлазу, збагачену β-глюкозидазою. Загальна целюлаза, збагачена β-глюкозидазою, звичайно включає β-глюкозидазу і препарат загальної целюлази. Композиції загальної целюлази, збагаченої β-глюкозидазою, можна одержати рекомбінантним способом. Наприклад, такий препарат загальної целюлази можна забезпечити за допомогою експресії β-глюкозидази в мікроорганізмі, здатному продукувати загальну целюлазу. Композиція загальної целюлази, збагаченої β-глюкозидазою, також може, приміром, включати препарат загальної целюлази і β-глюкозидазу. Наприклад, композиція загальної целюлази, збагаченої β-глюкозидазою, може відповідно включати щонайменше 5 ваг. %, 7 ваг. %, 10 ваг. %, 15 ваг. % або 20 ваг. % і до 25 ваг. %, 30 ваг. %, 35 ваг. %, 40 ваг. % або 50 ваг. % β-глюкозидази, виходячи загальної ваги білків у цій сумішці/композиції. У деякихаспектах придатну загальну целюлазу можна одержати з мікроорганізму, що створюють або створили способами генної інженерії для скорочення або виключення зберігаючої активності β-ксилозидази. В інших аспектах придатну загальну целюлазу можна одержати з мікроорганізму, що створюють або створили способами генної інженерії для скорочення або виключення перетворювальної активності β-ксилозидази. У ще додаткових аспектах придатну загальну целюлазу можна одержати з мікроорганізму, що створюють або створили способами генної інженерії не тільки для скорочення або усунення зберігаючої активності β-ксилозидази, але також для підвищення перетворювальної активності βксилозидази. Наприклад, загальну целюлазу можна відповідно одержати з Trichoderma reesei, що сконструйований таким чином, щоб видалити нативний ген bxl1. В іншому прикладі загальну целюлазу можна відповідно одержати з Trichoderma reesei, що сконструйований для рекомбінантної експресії ферменту з перетворювальною активністю β-ксилозидази. У ще одному прикладі загальну целюлазу можна відповідно одержати з Trichoderma reesei, що сконструйований таким чином, щоб видалити його нативний ген bxl1, і щоб він рекомбінантно експресував фермент з перетворювальною активністю β-ксилозидази. Приклади ферментів з перетворювальною активністю β-ксилозидази включають без обмежень Fv43D та інші, описані в дійсному документі в розділі 6.4. Активність β-ксилозидази можна визначати за допомогою виміру рівня гідролізу штучного субстрату p-нітрофеніл-β-ксилопіранозиду. За реакцією гідролізу можна стежити, застосовуючи 1 H-NMR аналіз під час ходу реакції. Аномерний протон залишку, що представляє редукуючий кінець глікозидного зв'язку, має виразне хімічне зрушення, що залежить від його осьової або екваторіальної орієнтації, також як і аномерний протон знову утвореного редукуючого цукру після гідролізу. Мутаротація аномерного протона знову утвореного редукуючого цукру до рівноважної суміші осьової або екваторіальної форм є більш повільною у порівнянні з реакцією 1 гідролізу. Таким чином, H-NMR визначення орієнтації аномерного протона першого утвореного редукуючого кінця у порівнянні з формою, що є присутньою у субстраті, є аналізом механізмів, що зберігають конфігурацію на противагу тим, що інвертують конфігурацію. Експериментальні способи описуються в, наприклад, Pauly et al., 1999, Glycobiology 9:93-100. Альтернативно, рівень гідролізу можна визначати за допомогою розрізнення трансглюкозилазної активності зберігаючих ферментів, що відсутні в перетворювальних ферментах. Приклад такого аналізу показаний на Фігурі 16. Ксилобіоза або ксилозні олігомери в присутності зберігаючого ферменту (наприклад, Multifect® ксиланази або Fv3A) демонструють стрімке зростання відношення EXP/ксилоза до 7-8 разів від рівноважного відношення в присутності EtOH, після якого відношення EXP/ксилоза падає до рівноважного відношення. У випадку перетворювальних ферментів (наприклад, Fv43D), за тих самих умов, EXP/ксилоза зростає монотонно до рівноважного відношення. 6.3.2. Геміцелюлази Велике різноманіття грибів і бактерій здатні ферментативно гідролізувати геміцелюлози. Подібно розкладанню целюлози гідроліз геміцелюлози припускає координовані дії ряду ферментів. Геміцелюлази часто групують у три основні категорії: діючі усередині ферменти, що атакують внутрішні зв'язки усередині полісахаридних ланцюгів; діючі зовні ферменти, що діють поступально або з редукуючого, або з нередукуючого кінця полісахаридного ланцюга і акцесорні 22 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферменти, ацетилестерази і/або естерази, що гідролізують глікозидні зв'язки лігніну. Приклади естераз можуть включати естеразу кумарової кислоти та естеразу ферулової кислоти (Wong et al., 1988, Microbiol. Rev. 52:305-317; Tenkanen and Poutanen, 1992, Significance of esterases in the degradation of xylans, in Xylans and Xylanases, Visser et al., eds., Elsevier, New York, N.Y., pp. 203212; Coughlan and Hazlewood, 1993, Hemicellulose and hemicellulases, Portland, London, UK; Brigham et al., 1996, Hemicellulases: Diversity and applications, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, ed., Taylor & Francis, Washington, D.C., pp. 119-141). Придатні геміцелюлази для застосування з композиціями і/або способами даного розкриття включають, наприклад, ксиланази, арабінофуранозидази, ацетилксиланестерази, глюкуронідази, ендогалактази, мананази, ендо- або екзоарабінази, екзогалактанази та їхні суміші. Приклади діючих усередині геміцелюлаз і допоміжних ферментів включають, без обмежень, ендоарабінаназу, ендоарабіногалактаназу, ендоглюканазу, ендомананазу, ендоксиланазу і фераксанендоксиланазу. Приклади геміцелюлаз, що діють зовні, і допоміжних ферментів включають, без обмежень, α-L-арабінозидазу, β-L-арабінозидазу, α-1,2-Lфукозидазу, α-D-галактозидазу, β-D-галактозидазу, β-D-глюкозидазу, β-D-глюкуронідазу, β-Dманозидазу, β-D-ксилозидазу, екзоглюкозидазу, екзоцелобіогідролазу, екзоманобіогідролазу, екзомананазу, екзоксиланазу, ксилан α-глюкуронідазу і коніферин β-глюкозидазу. Приклади естераз включають, без обмежень, ацетилестерази (ацетилгалактанестеразу, ацетилмананестеразу й ацетилксиланестеразу) і арилестерази (естеразу кумарової кислоти і естеразу ферулової кислоти). У конкретних аспектах геміцелюлаза є діючою зовні геміцелюлазою. Переважно, діюча зовні геміцелюлаза має здатність гідролізувати геміцелюлозу при кислих умовах, наприклад, при або нижче pН 7. У конкретних аспектах геміцелюлазу додають в ефективній кількості. Наприклад, геміцелюлазу додають у мультиферментні сумішки даного розкриття в кількості приблизно 0,001 ваг. % або більше, приблизно 0,002 ваг. % або більше, приблизно 0,0025 ваг. % або більше, приблизно 0,005 ваг. % або більше або приблизно 0,01 ваг. % або більше щодо ваги сухої речовини в повному середовищі для ферментації. В іншому прикладі геміцелюлазу додають у мультиферментні сумішки даного розкриття в кількості від приблизно 0,001 ваг. % до приблизно 5,0 ваг. %, наприклад, від приблизно 0,025 ваг. % до приблизно 4,0 ваг. %, від приблизно 0,005 ваг. % до приблизно 2,0 ваг. % щодо ваги сухої речовини в повному середовищі для ферментації. 6.3.2.1. Ксиланази Ферментні сумішки цього розкриття необов'язково включають одну або більше ксиланаз. Вираз "ксиланаза" як використовується в цьому документі відноситься до будь-якої ксиланази, прирахованої до або згідно EC 3.2.1.8. Придатні ксиланази включають, наприклад, ксиланазу Caldocellum saccharolyticum (Luthi et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56(9):2677-2683), ксиланазу Thermatoga maritima (Winterhalter & Liebel, 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61(5):1810– 1815), ксиланазу Thermatoga Sp. штам FJSS-B.1 (Simpson et al., 1991, Biochem. J. 277, 413-417), ксиланазу Bacillus circulans (Bc) (патент США № 5405769), ксиланазу Aspergillus niger (Kinoshita et al., 1995, J. Ferment. Bioeng. 79(5):422-428); ксиланазу Streptomyces lividans (Shareck et al., 1991, Gene 107:75-82; Morosoli et al., 1986, Biochem. J. 239:587-592; Kluepfel et al., 1990, Biochem. J. 287:45-50); ксиланазу Bacillus subtilis xylanase (Bernier et al., 1983, Gene 26(1):59– 65); ксиланазу Cellulomonas fimi (Clarke et al., 1996, FEMS Microbiol. Lett. 139:27-35), ксиланазу Pseudomonas fluorescens (Gilbert et al., 1988, J. Gen. Microbiol. 134:3239-3247); ксиланазу Clostridium thermocellum (Dominguez et al.,1995, Nat. Struct. Biol. 2(7):569-76); ксиланазу Bacillus pumilus (Nuyens et al., 2001, Appl. Microbiol. Biotech. 56:431-434; Yang et al.,1988, Nucleic Acids Res. 16(14B):7187); ксиланазу Clostridium acetobutylicum P262 (Zappe et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18(8):2179) або ксиланазу Trichoderma harzianum (Rose et al., 1987, J. Mol. Biol. 194(4):755– 756). Ксиланази можна відповідно одержати з ряду джерел, включаючи, наприклад, грибні і бактеріальні організми, такі як Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora, Fusarium, Trichoderma, Humicola, Thermomyces і Bacillus. Конкретні комерційно доступні препарати, що включають ксиланазу(и) можна також використовувати в композиціях і способах даного розкриття; вони включають ксиланазу Multifect®, Laminex® BG, та Spezyme® CP (Danisco US, Genencor), і Celluclast®, і Viscozyme® (Novozymes A/S). У конкретних аспектах ксиланаза не володіє зберігаючою активністю β-ксилозидази і/або перетворювальною активністю β-ксилозидази. Фермент можна протестувати на зберігаючу проти перетворювальної активності, як описано вище в розділі 6.3.1.5. 6.3.2.2. β-Ксилозидази 23 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ферментні сумішки даного розкриття необов'язково включають одну або більше βксилозидаз. Вираз “β-ксилозидаза" як використовується в цьому документі відноситься до будь-якої βксилозидази, прирахованої до або згідно EC 3.2.1.37. Придатні β-ксилозидази включають, наприклад Bxl1 Talaromyces emersonii (Reen et al., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun. 305(3):579-85); а також β-ксилозидази, отримані з Geobacillus stearothermophilus (Shallom et al., 2005, Biochem. 44:387-397); Scytalidium thermophilum (Zanoelo et al., 2004, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:170-176); Trichoderma lignorum (Schmidt, 1988, Methods Enzymol. 160:662-671); Aspergillus awamori (Kurakake et al., 2005, Biochim. Biophys. Acta 1726:272-279); Aspergillus versicolor (Andrade et al., Process Biochem. 39:1931-1938); Streptomyces sp. (Pinphanichakarn et al., 2004, World J. Microbiol. Biotechnol. 20:727-733); Thermotoga maritima (Xue і Shao, 2004, Biotechnol. Lett. 26:1511-1515); Trichoderma sp. SY (Kim et al., 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14:643-645); Aspergillus niger (Oguntimein і Reilly, 1980, Biotechnol. Bioeng. 22:1143-1154) або Penicillium wortmanni (Matsuo et al., 1987, Agric. Biol. Chem. 51:2367-2379). У конкретних аспектах β-ксилозидаза не володіє зберігаючою активністю β-ксилозидази. В інших аспектах β-ксилозидаза володіє перетворювальною активністю β-ксилозидази. У ще додаткових аспектах β-ксилозидаза не володіє зберігаючою активністю β-ксилозидази, але володіє перетворювальною активністю β-ксилозидази. Фермент можна перевірити на зберігаючу проти перетворювальної активності, як описано вище в розділі 6.3.1.5. 6.3.2.3. L-α-арабінофуранозидази Ферментні сумішки даного розкриття необов'язково включають одну або більше L-αарабінофуранозидаз. Як застосовано в даному документі вираз "L-α-арабінофуранозидаза" відноситься до будьякого ферменту, класифікованого в або згідно EC 3.2.1.55. Придатну L-α-арабінофуранозидазу можна одержати, наприклад, з Aspergillus oryzae (Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260); Aspergillus sojae (Oshima et al., 2005, J. Appl. Glycosci. 52:261-265); Bacillus brevis (Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260); Bacillus stearothermophilus (Kim et al., 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14:474-482); Bifidobacterium breve (Shin et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69:7116-7123; Bifidobacterium longum (Margolles et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69:5096-5103); Clostridium thermocellum (Taylor et al., 2006, Biochem. J. 395:31-37); Fusarium oxysporum (Panagiotou et al., 2003, Can. J. Microbiol. 49:639644); Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247260); Geobacillus stearothermophilus T-6 (Shallom et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:43667-43673); Hordeum vulgare (Lee et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:5377-5387); Penicillium chrysogenum (Sakamoto et al., 2003, Biophys. Acta 1621:204-210); Penicillium sp. (Rahman et al., 2003, Can. J. Microbiol. 49:58-64); Pseudomonas cellulosa (Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260); Rhizomucor pusillus (Rahman et al., 2003, Carbohydr. Res. 338:1469-1476); Streptomyces chartreusis (Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260); Streptomyces thermoviolacus (Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260); Thermoanaerobacter ethanolicus (Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260); Thermobacillus xylanilyticus (Numan & Bhosle, 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:247-260); Thermomonospora fusca (Tuncer і Ball, 2003, Folia Microbiol. (Praha) 48:168-172); Thermotoga maritima (Miyazaki, 2005, Extremophiles 9:399-406); Trichoderma sp. SY (Jung et al., 2005, Agric. Chem. Biotechnol. 48:7-10); Aspergillus kawachii (Koseki et al., 2006, Biochim. Biophys. Acta 1760:1458-1464); Fusarium oxysporum f. sp. dianthi (Chacon-Martinez et al., 2004, Physiol. Mol. Plant Pathol. 64:201-208); Thermobacillus xylanilyticus (Debeche et al., 2002, Protein Eng. 15:21-28); Humicola insolens (Sorensen et al., 2007, Biotechnol. Prog. 23:100-107); Meripilus giganteus (Sorensen et al., 2007, Biotechnol. Prog. 23:100-107) або Raphanus sativus (Kotake et al., 2006, J. Exp. Bot. 57:2353-2362). У певних аспектах L-α-арабінофуранозидаза не має зберігаючої β-ксилозидазної активності. В інших аспектах L-α-арабінофуранозидаза має перетворювальну β-ксилозидазну активність. У ще одних аспектах L-α-арабінофуранозидаза не має зберігаючої β-ксилозидазної, але має перетворювальну β-ксилозидазну активність. Фермент можна перевірити на зберігаючу у порівнянні з перетворювальною активністю, як описано в розділі 6.3.1.5 вище. 6.3.3. Акцесорні білки Ряд поліпептидів з активністю, що підсилює целюлолітичну, можна також використовувати разом з вищезгаданими ферментами і/або целюлолітичними білками для подальшого розкладання целюлозного компонента біомаси субстрату (дивися, наприклад, Brigham et al., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, ed.), pp. 119-141, Taylor & Francis, Washington D.C.; Lee, 1997, J. Biotechnol. 56: 1-24). 24 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Оптимальні кількості таких поліпептидів з активністю, що підсилює целюлолітичну, і целюлолітичних білків, залежать від ряду факторів, що включають, без обмеження, специфічну суміш компонентних целюлолітичних білків, целюлозний субстрат, концентрацію целюлозного субстрату, попередню(і) обробку(и) целюлозного субстрату, температуру, час і pH, а також природу ферментуючого організму. Ферментативні сумішки/композиції даного розкриття можуть, наприклад, відповідно додатково включати один або більше акцесорних білків. Приклади акцесорних білків включають, без обмеження, мананази (наприклад, ендомананази, екзомананази і βманнозидази), галактанази (наприклад, ендо- і екзогалактанази), арабінази (наприклад, ендоарабінази і екзоарабінази), лігнінази, амілази, глюкуронідази, протеази, естерази (наприклад, естерази ферулової кислоти, ацетилксиланестерази, естерази кумарової кислоти або пектинметилестерази), ліпази, глюкозидгідролазні поліпептиди сімейства 61, ксилоглюканази, CIP1, CIP2, своленін, експансини і руйнуючі целюлозу білки. Приклади акцесорних білків можуть також включати CIP1-подібні білки, CIP2- подібні білки, дегідрогенази целобіози і пероксидази, що містять марганець. У певних варіантах здійснення білки, що руйнують целюлозу, є зв'язуючими целюлозу модулями. 6.4 Ферменти з перетворювальною β-ксилозидазною активністю Згідно з даним розкриттям фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю застосовують для зменшення утворення AXP (наприклад, EXP) у SSF-реакціях. Таким чином, дане розкриття відноситься в одному аспекті до композиції, що включає щонайменше один перетворювальний β-ксилозидазний поліпептид. В іншому аспекті дане розкриття відноситься до способу одержання бажаного продукту ферментації в SSF-реакції, що включає культивування повного середовища для ферментації, причому зазначене повне середовище для ферментації включає щонайменше один перетворювальний β-ксилозидазний поліпептид. Придатні перетворювальні β-ксилозидазні поліпептиди можна вибрати з таких, що є членами глікозидгідролазної сімейства 43 ("GH43"). Сімейство ферментів GH43 має ряд відомих активностей. Наприклад, сімейство ферментів GH43 може бути такою, що класифікована по EC 3.2.1.55, і може мати L-α-арабінофуранозидазнуактивність. В інших прикладах сімейство ферментів GH43 може бути такою, що классифікована по EC 3.2.1.99, і може мати ендоарабіназну активність. У ще одному прикладі сімейство ферментів GH43 може бути класифікована по EC 3.2.1.145 і може володіти галактан-1,3-α-галактозидазною активністю. В інших прикладах сімейство ферментів GH43 може бути класифікована по EC 3.2.1.37 і може володіти β-ксилозидазною активністю. У той час як сімейство GH43 β-ксилозидаз, таких як описані вище, часто може тільки здійснювати перетворювальний гідроліз, повідомляли, що різні β-ксилозидази із родин GH3, -39, -52 і -54, на відміну, мають зберігаючу активність і здатні здійснювати як реакцію гідролізу, так і реакцію трансглікозилювання. (Smaali et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 73:582-590). Сімейство ферментів GH43 звичайно виявляє п'ятилопатеву β-пропелерну тривимірну конформацію. "Пропелерна" частина структури ґрунтується на п'ятикратній повторності структури у формі "лопаті", що включає чотири скручені β-шари. Каталітична загальна основа, аспартат, каталітична загальна кислота, глютамат і залишок аспартата, що регулює pKa загальної основи, були визначені за кристалічною структурою Cellvibrio japonicus CjArb43A і були підтверджені сайт-специфічним мутагенезом (дивися, Nurizzo et al., 2002, Nat. Struct. Biol. 9(9) 665-8). Каталітичні залишки розподіляються в трьох консервативних блоках, що широко рознесені по всій амінокислотній послідовності (Pons et al., 2004, Proteins: Structure, Function і Bioinformatics 54:424-432). Для β-ксилозидазних ферментів сімейства GH43 прогнозовані каталітичні залишки виділені жирним шрифтом і підкреслені в послідовностях на Фігурі 32. Кристалічна структура ксилозидази Geobacillus stearothermophilus (Brux et al. 2006, J. Mol. Bio. 359:97-109) припускає кілька додаткових залишків, що можуть бути важливими для субстратного зв'язування в цьому ферменті. Як описується в розділі 6.3.1.5 вище перетворювальну β-ксилозидазну активність можна визначати придатними методами. Таким чином, у конкретних аспектах фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю в даному документі є членом сімейства GH43. Наприклад, фермент є поліпептидом Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A або XynB3. Такі поліпептиди описані нижче. 6.4.1. Поліпептиди Fv43D У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю являє собою Fv43D поліпептид. Амінокислотна послідовність Fv43D (SEQ ID NO:2) показана на Фігурі 19B і в першому рядку на Фігурі 32. SEQ ID NO:2 є послідовністю незрілого Fv43D. Fv43D має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 20 послідовності 25 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:2 (підкресленої на Фігурі 19B); відщеплення сигнальної послідовності прогнозується для утворення зрілого білка з послідовністю, що відповідає залишкам від 21 до 350 послідовності SEQ ID NO:2. Прогнозовані залишки консервативних доменів виділені жирним шрифтом на Фігурі 19B. В аналізі, що використовує p-нітрофеніл-β-ксилопіранозид, ксилобіозу або змішані лінійні ксилоолігомери як субстрати, було показано, що Fv43D має β-ксилозидазну активність. Прогнозованими каталітичними залишками є: або D37, або D71; D155 і E251. Як використовується в даному документі "Fv43D поліпептид" відноситься до поліпептиду і/або його варіанту, що включає послідовність із щонайменше 85 %, наприклад, щонайменше 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю послідовностей з щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 або 320 сусідніми амінокислотними залишками від 21 до 350 SEQ ID NO:2. Fv43D поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним Fv43D у залишках D37 або D71; D155 і E251. Fv43D поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше, або всіх дев'яти з Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B і Fv43E, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. Fv43D поліпептид відповідно включає цілком прогнозований консервативний домен нативного Fv43D, як показано на Фігурі 19B. Типовий Fv43D поліпептид даного винаходу включає послідовність із щонайменше 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю зі зрілою Fv43D послідовністю, показаною на Фігурі 19B. Fv43D поліпептид даного винаходу відповідно має β-ксилозидазну активність. У конкретних варіантах здійснення винаходу поліпептид Fv43D даного винаходу має перетворювальну β-ксилозидазну активність. 6.4.2. Поліпептиди Pf43A У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю є поліпептидом Pf43A. Амінокислотна послідовність Pf43A (SEQ ID NO:8) показана на Фігурі 22B і в четвертому рядку Фігури 32. SEQ ID NO:8 є послідовністю незрілого Pf43A. Pf43A має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам з 1 до 20 SEQ ID NO:8 (підкреслені на Фігурі 22B); відщеплення сигнальної послідовності прогнозується для утворення зрілого білка з послідовністю, що відповідає залишкам від 21 до 445 SEQ ID NO:8. Прогнозовані залишки каталітичних доменів виділені жирним шрифтом, прогнозовані залишки доменів зв'язування вуглеводів виділені заголовними буквами а також прогнозовані лінкерні залишки, що розділяють каталітичний домен і домен зв'язування вуглеводів, виділені курсивом на Фігурі 22B. В аналізі, що використовує p-нітрофеніл-β-ксилопіранозид, ксилобіозу або змішані лінійні ксилоолігомери як субстрати було показано, що Pf43A має β-ксилозидазну активність. Прогнозованими каталітичними залишками є: або D32 або D60; D145 і E196. Як використано в даному документі "поліпептид Pf43A" відноситься до поліпептиду і/або його варіанту, що включає послідовність щонайменше з 85 %, наприклад, щонайменше 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю послідовностей з щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 або 400 сусідніми амінокислотними залишками з 21 по 445 SEQ ID NO:8. Pf43A поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним Pf43A у залишках D32 або D60; D145 і E196. Pf43A поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше, або в усіх дев'яти з Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B і Fv43E, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. Pf43A поліпептид відповідно включає цілком прогнозований консервативний домен нативного Pf43A, показаного на Фігурі 22B. Типовий Pf43A поліпептид даного винаходу містить послідовність із щонайменше 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % чи 100 % ідентичністю зі зрілою Pf43A послідовністю, показаною на Фігурі 22B. Pf43A поліпептид даного винаходу відповідно має β-ксилозидазну активність. У конкретних варіантах здійснення Pf43A поліпептид даного винаходу має перетворювальну β-ксилозидазну активність. 6.4.3. Поліпептиди Fv43E У конкретних варіантах здійснення фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю є Fv43E поліпептидом. Амінокислотна послідовність Fv43E (SEQ ID NO:10) показана на Фігурі 23B і в дев'ятому рядку Фігури 32. SEQ ID NO:10 є послідовністю незрілого Fv43E. Fv43E має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам з 1 до 18 SEQ ID NO:10 (підкреслені на Фігурі 23B); відщеплення сигнальної послідовності прогнозується для утворення зрілого білка з послідовністю, що відповідає залишкам з 19 до 530 SEQ ID NO:10. 26 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прогнозовані залишки каталітичних доменів виділені жирним шрифтом на Фігурі 23B. В аналізі, що використовує p-нітрофеніл-β-ксилопіранозид, ксилобіозу або змішані лінійні ксилоолігомери як субстрати, було показано, що Fv43E має β-ксилозидазну активність. Прогнозованими каталітичними залишками є: або D40 або D71; D155 і E242. Як застосовано в даному документі "Fv43E поліпептид" відноситься до поліпептиду і/або його варіанту, що містить послідовність із щонайменше 85 %, наприклад, щонайменше 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю послідовностей з щонайменше, 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 або 500 сусідніми амінокислотними залишками з 19 по 530 SEQ ID NO:10. Fv43E поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним Fv43E у залишках D40 або D71; D155; і E242. Fv43E поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше, або усіх дев'яти з Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B і Fv43E, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. Fv43E поліпептид відповідно включає цілком прогнозований консервативний домен нативного Fv43E, показаний на Фігурі 23B. Типовий Fv43E даного винаходу включає послідовність із щонайменше 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю зі зрілою Fv43E послідовністю, показаною на Фігурі 23B. Fv43E поліпептид даного винаходу відповідно має β-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення Fv43E поліпептид даного винаходу має перетворювальну β-ксилозидазну активність. 6.4.4. Поліпептиди Fv43B У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю є Fv43B поліпептидом. Амінокислотна послідовність Fv43B (SEQ ID NO:12) показана на Фігурі 24B і в шостому рядку Фігури 32. SEQ ID NO:12 є послідовністю незрілого Fv43B. Fv43B має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам з 1 до 16 SEQ ID NO:12 (підкреслені на Фігурі 24B); відщеплення сигнальної послідовності прогнозується для утворення зрілого білка з послідовністю, що відповідає залишкам з 17 по 574 SEQ ID NO:12. Прогнозовані залишки каталітичних доменів виділені жирним шрифтом на Фігурі 24B. В аналізі, що використовує p-нітрофеніл-β-ксилопіранозид і/або p-нітрофеніл-α-L-арабінофуранозид як субстрати, було показано, що Fv43B володіє як β-ксилозидазною, так і L-αарабінофуранозидазною активністю. Було показано, що вивільнення арабінози з розгалужених арабіно-ксилоолігомерів і збільшення вивільнення ксилози з олігомерних сумішей у присутності інших ксилозидазних ферментів. Прогнозованими каталітичними залишками є: або D38 або D68; D151 і E236. Як використовується в даному документі "Fv43B поліпептид" відноситься до поліпептиду і/або його варіанту, що включає послідовність із щонайменше 85 %, наприклад, щонайменше 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю послідовностей з щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 або 550 сусідніми амінокислотними залишками з 17 по 472 SEQ ID NO:12. Fv43B поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним Fv43B у залишках D38 або D68; D151 і E236. Fv43B поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше, або усіх дев'яти з Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B, і Fv43E, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. Fv43B поліпептид відповідно включає цілком прогнозований консервативний домен нативного Fv43B, показаного на Фігурі 24B. Типовий Fv43B поліпептид даного винаходу включає послідовність із щонайменше 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю зі зрілою Fv43B послідовністю, показаною на Фігурі 24B. Fv43B поліпептид даного винаходу відповідно має β-ксилозидазну активності. У певних варіантах здійснення Fv43B поліпептид даного винаходу має перетворювальну β-ксилозидазну активність. 6.4.5. Поліпептиди Af43A У певних варіантах здійснення винаходу фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю є Af43A поліпептидом. Амінокислотна послідовність Af43A (SEQ ID NO:14) показана на Фігурі 25B і в сьомому рядку Фігури 32. SEQ ID NO:14 є послідовністю незрілого Af43A. Прогнозовані залишки консервативних доменів білка виділені жирним шрифтом на Фігурі 25B. В аналізі, що використовує p-нітрофеніл-α-L-арабінофуранозид, і за допомогою вивільнення арабінози при перетворенні ряду олігомерів, отриманих шляхом дії ендоксиланази, було 27 UA 114276 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 показано, що Af43A має L-α-арабінофуранозидазну активність. Прогнозованими каталітичними залишками є: або D26, або D58; D139 і E227. Як використовується в даному документі "Af43A поліпептид" відноситься до поліпептиду і/або його варіанту, що включає послідовність із щонайменше 85 %, наприклад, щонайменше 85 %, наприклад, щонайменше 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю послідовності з щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 або 300 сусідніми амінокислотними залишками SEQ ID NO:14. Af43A поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним Af43A у залишках D26 або D58; D139 і E227. Af43A поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше або усіх дев'яти з Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B і Fv43E, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. Af43A поліпептид відповідно включає цілком прогнозований консервативний домен нативного Af43A, показаного на Фігурі 25B. Типовий Fv43B даного винаходу включає послідовність із щонайменше 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю зі зрілою Af43A послідовністю, показаною на Фігурі 25B. Af43A поліпептид даного винаходу відповідно має β-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення Af43A поліпептид даного винаходу має перетворювальну βксилозидазну активність. 6.4.6. Поліпептиди Fo43A У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю є Fo43A поліпептидом. Амінокислотна послідовність Fo43A (SEQ ID NO:24) показана на Фігурі 31B і в другому рядку Фігури 32. SEQ ID NO:24 є послідовністю незрілого Fo43A. Fo43A має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 17 SEQ ID NO:24 (підкреслені на Фігурі 31B); відщеплення сигнальної послідовності прогнозується для утворення зрілого білка з послідовністю, що відповідає залишкам з 21 до 348 SEQ ID NO:24. Прогнозовані залишки консервативних доменів виділені жирним шрифтом на Фігурі 31B. В аналізі, що використовує p-нітрофеніл-β-ксилопіранозид, ксилобіозу або змішані лінійні ксилоолігомери як субстрати, було показано, що Fo43A має β-ксилозидазну активність. Прогнозованими каталітичними залишками є: або D37, або D72; D159 і E251. Як використовується в даному документі "Fo43A поліпептид" відноситься до поліпептиду і/або його варіанту, що включає послідовність із щонайменше 85 %, наприклад, щонайменше 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю послідовності з щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 або 320 сусідніми амінокислотними залишками з 21 по 348 SEQ ID NO:24. Fo43A поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним Fo43A у залишках D37 або D72; D159 і E251. Fo43A поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % або 99 % амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше або усіх дев'яти з Fv43D, Fo43A, Gz43A, Pf43A, Fv43A, Fv43B, Af43A, Pf43B і Fv43E, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. Fo43A поліпептид відповідно включає цілком прогнозований консервативний домен нативного Fo43A, показаного на Фігурі 31B. Типовий Fo43A поліпептид даного винаходу включає послідовність із щонайменше 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичністю зі зрілою Fo43A послідовністю, показаною на Фігурі 31B. Fo43A поліпептид даного винаходу відповідно має β-ксилозидазну активність. У конкретних варіантах здійснення Fo43A поліпептид даного винаходу має перетворювальну β-ксилозидазну активність. 6.4.7. Поліпептиди Gz43A У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною β-ксилозидазною активністю є поліпептидом Gz43A. Амінокислотна послідовність Gz43A (SEQ ID NO:22) показана на Фігурі 30B і на третьому рядку Фігури 32. SEQ ID NO:22 є послідовністю незрілого Gz43A. Gz43A має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 18 SEQ ID NO:22 (підкреслену на Фігурі 30B); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 340 SEQ ID NO:22. Прогнозовані залишки консервативних доменів виділені напівжирним шрифтом на Фігурі 30B. Було показано, що Gz43A має β-ксилозидазну активність, в аналізі, що використовує p-нітрофеніл-βксилопіранозид, ксилобіозу або змішані лінійні ксилоолігомери як субстрати. Прогнозованими каталітичними залишками є: або D33, або D68; D154; і E243. Як використовується в даному документі "поліпептид Gz43A " відноситься до поліпептиду 28