Спосіб отримання моноклональної лінії рослинних клітин

Реферат: Даний винахід описує спосіб отримання моноклональної лінії рослинних клітин від гетерологічної популяції рослинних клітин, що включає наступні стадії: (a) отримання гетерологічної популяції рослинних клітин; (b) отримання протопластів із вказаної гетерологічної популяції рослинних клітин та ініціацію регенерації клітинної стінки; (c) надання пристрою приймання клітин, який містить фідерний клітинний матеріал на рідкому середовищі; UA 112546 C2 (12) UA 112546 C2 (d) розділення одиничних протопластів шляхом піддавання отриманих протопластів сортуванню флуоресцентно-активованих клітин (FACS); (e) відбір одиничного протопласта і вміщення його у рідке середовище вказаного пристрою приймання клітин, який містить фідерний клітинний матеріал; (f) регенерацію виділеного одиничного протопласта до утворення мікроколонії за допомогою спільного культивування в присутності вказаного матеріалу фідерних клітин; (g) виділення мікроколонії з матеріалу фідерних клітин і культивування мікроколонії до утворення моноклональної лінії рослинних клітин. UA 112546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується галузі біотехнології рослин. Зокрема, даний винахід стосується отримання нативної (дикий тип) або трансгенної моноклональної лінії рослинних клітин з гетерогенної популяції рослинних клітин за допомогою протоково-цитометричного сортингу. Як буде очевидно фахівцеві, даний винахід також включає застосування моноклональної лінії рослинних клітин для регенерації цілих плодоносних рослин. Протягом минулих десятиріч величезні зусилля були присвячені розробці і культивуванню основаних на рослинах систем для накопичення і отримання нативних або гетерологічних білків і вторинних метаболітів. Література надає широку кількість фактологічного матеріалу, який доводить практичну цінність основаних на рослинах систем для отримання великої різноманітності бажаних речовин, які або секретовані в культуральне середовище, або виділені з продукуючих клітин, тканин, органел або навіть цілих рослин або їх частин. Подібно цьому, існує широкий спектр протоколів трансформації, які забезпечують розробку або стабільно, або транзієнтно трансформованого рослинного матеріалу. Однак, все ще існує потреба в надійній, вартісно-ефективній і швидкій технології для отримання високих виходів бажаного продукту з рослинних клітин. Неодноразово повідомлялося, що трансформація популяції рослинних клітин, такої як суспензійна рослинна культура, часто приводить до утворення трансгенних культур, які демонструють клітини з високо гетерогенними (змішаними) і неузгоджуваними рівнями експресії необхідного білка, епігенетично різних клітин, що стосуються суміші в складі первинної гетерогенної популяції клітин. У рамках рекомбінантних клітинних ліній гетерогенність в експресії трансгена демонструє серйозну проблему з точки зору швидкостей продукції. Головна проблема полягає в тому, що високо-продукуючі клони часто є рідкісними подіями в рамках методу трансформації, і розробка гомогенної високопродуктивної клітинної лінії займає багато часу. Тому постійно існуючою технічною задачею є отримання елітної трансгенної події і регенерація з нещодавно транформованої або вже трансгенної культури рослин. Для протокового цитометричного сортингу, такого як, наприклад, пристрій FACS, одиничні сферичні клітини повинні бути отримані із звичайно агрегованої популяції рослинних клітин або культури за допомогою ферментативного розщеплення клітин, щоб виділити протопласти. Для більшості видів рослин, однак, регенерації одиничних протопластів перешкоджає необхідність підтримувати популяцію в певній щільності. Надійний і спосіб, що відтворюється для регенерації одиничної трансгенної клітини/протопласта або для регенерації з неї цілої плодоносної рослини (особливо після протоково-цитометричного сортингу) не був до цього часу описаний. Даний винахід, таким чином, передусім стосується розробки основаної на рослинах системи для отримання високих рівнів бажаних нативних або рекомбінантних продуктів, в якій застосовується нетрансформована або трансгенна моноклональна лінія рослинних клітин, отримана від гетерогенної (змішаної) популяції рослинних клітин, таких як суспензійна культура, і долає проблеми попереднього рівня техніки, зокрема, відносно швидкого розділення і подальшої регенерації одиничних (трансгенних) протопластів до утворення мікроколонії, яка може бути застосована для отримання моноклональної лінії рослинних клітин, яка, переважно, здатна до утворення і накопичення високих кількостей бажаного продукту. Фахівцеві зрозуміло, що даний винахід, крім того, дозволяє створювати цілі плодоносні рослини, відновлені з розробленої моноклональної лінії рослинних клітин. Всупереч багатьом застосовуваним в даний час і розробленим системам, які основані на застосуванні інтактних рослин або щонайменше інтактної і диференційованої рослинної тканини, застосування суспензійних клітин має перевагу в тому, що гомогенний матеріал може бути відтворений в контрольованих, асептичних і закритих умовах. У даний час існують дві основні стратегії отримання рекомбінантних білків в рослинах, а саме, (i) отримання стабільно трансгенних рослин або суспензійних клітинних ліній або (ii) транзієнтна експресія гетерологічного гена(ів) після інфікування рослинних експресійних хазяїнів (рослин, тканин або клітин) бактеріями (наприклад, агробактерією), вірусами (наприклад, вірусом тютюнової мозаїки, картопляним вірусом X/Y, вірусом мозаїки Cowpea і багатьма іншими), або комбінація обох (наприклад, магніфекція), щоб дозволити хазяїну експресувати гетерологічну генетичну інформацію (ДНК або РНК). Альтернативно і, як відомо в галузі техніки, генетична інформація може також бути впроваджена в експресійного рослинного хазяїна за допомогою розроблених механічних способів, таких як, наприклад, електропорація або лазерна перфорація. Хоча даний винахід, переважно, стосується застосування стабільно трансформованого матеріалу рослинних клітин, системи для транзієнтної експресії, що мають перевагу в швидкості (час "від гена до продукту", термін впровадження, аварійне реагування), так само як в 1 UA 112546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можливості досягати рівнів накопичення, які сильно вищі, ніж ті, які можуть, як правило, бути отримані на стабільно трансформованих рослинах або їх частинах, таких як клітини, можуть бути також включені в спосіб згідно з даним винаходом. Згідно з даним винаходом, розроблений спосіб отримання нативної (дикий тип, нетрансформований) або трансгенної моноклональної лінії рослинних клітин з гетерогенної популяції рослинних клітин. Спосіб включає, по-перше, отримання вищезгаданої популяції рослинних клітин, такої як, наприклад, суспензійні клітини рослини, які утворюють вихідний матеріал рослинних клітин, який піддають подальшим крокам, охопленим способом згідно з даним винаходом. Звичайно, цей рослинний клітинний матеріал може легко бути отриманий з, наприклад, гетерогенної суспензійної рослинної культури, яку, переважно, вирощують в контрольованих умовах і/або асептичних. Вихідні клітини можуть бути (стабільно/транзієнтно) трансформованими трансгенними клітинами або клітинами дикого типу (нативні, нетрансформовані), які здатні продукувати і нагромаджувати бажаний продукт. Оскільки в способі згідно з даним винаходом застосовують протоково-цитометричний сортинг, такий наприклад, як технологія FACS для розділення або виділення одиничних, тобто індивідуальних протопластів, вони повинні бути отримані з популяції рослинних клітин так, як приводиться вище, із застосуванням матеріалів і способів, відомих в галузі техніки. Згідно з переважним варіантом здійснення, ці протопласти трансформовані і здатні до (i) продукції флуоресцентного маркерного білка або поліпептиду, (ii) продукції бажаного продукту, і/або (iii) виживання в присутності селектуючої речовини. Переважними сортуючими критеріями для протоково-цитометричного сортингу є зернистість клітини як маркер для, наприклад, якісних характеристик, таких як апоптоз і розмір клітини. Переважні критерії сортингу для FACS можуть бути вибрані з групи, що включає генетичний фон (наприклад, плоїдність, анеуплоїдія), трансгеніка мутантів, продукти генного обміну і флуоресценції (наприклад, автофлуоресценція (хлоропласти, метаболіти), флуоресцентні білки або фермент-опосередкована флуоресценція). Треба розуміти, що застосування селектуючої речовини не є обов'язковим. Таким чином, протопласт необов'язково повинен бути трансформований послідовністю нуклеїнової кислоти, яка надає відповідної стійкості. Після розділення або виділення одиничних (трансформованих) протопластів за допомогою протоково-цитометричного сортингу, такого як, наприклад, FACS, кожний одиничний трансформований протопласт регенерують до утворення мікроколонії (мікрокалюсу) за допомогою спільного культивування в присутності фідерного клітинного матеріалу. Походження вихідної рослини не обмежене, але зводиться до тих ліній, сортів і видів, протопласти яких мають потенціал до регенерації до утворення мікроколонії або мікрокалюсу. Даний винахід, таким чином, застосовний до всіх сортів і видів рослин, для яких протокол регенерації розроблений або буде розроблений в майбутньому. У зв'язку з аспектом даного винаходу відносно подальшої регенерації моноклональної мікроколонії або лінії рослинних клітин в цілі плодоносні рослини, треба розуміти, що цей аспект може бути виконаний з усіма сортами і видами рослин, для яких протокол регенерації розроблений або буде розроблений в майбутньому. Згодом, мікроколонію відділяють або виділяють з фідерного клітинного матеріалу і культивують до утворення моноклональної лінії рослинних клітин. Згідно з переважним варіантом здійснення, наступна стадія, що входить до складу способу за даним винаходом, таким чином, стосується генерації моноклональної тканини моноклонального калюсу за допомогою (i) перенесення мікроколонії або мікрокалюсу на тверде середовище культивування і (ii) культивування мікроколонії або мікрокалюсу в присутності щонайменше однієї селектуючої речовини до утворення трансгенної тканини калюсу, з якої може бути розроблена трансгенна моноклональна лінія рослинних клітин за допомогою перенесення тканини калюсу в рідке середовище культивування. Як буде оцінено фахівцем, мікроколонія може також бути видалена або відділена від матеріалу фідерних клітин механічними способами, такими як, наприклад, відбір клонів. У цьому випадку ніяка селектуюча речовина не є обов'язковою і клітини, що складають мікроколонію, не повинні виявляти стійкість до якої-небудь селектуючої речовини. Згідно з переважним варіантом здійснення, клітини, що складають гетерогенну популяцію рослинних клітин, являють собою нативні (наприклад, дикий тип) або не трансгенні клітини, які, перш ніж бути підданим протоково-цитометричному сортингу, стабільно або транзієнтно трансформуються щонайменше одним вектором експресії, що включає щонайменше одну гетерологічну послідовність нуклеїнової кислоти, функціонально пов'язану з функціональним промотором, в якому, як вище указано щонайменше одна гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти кодує бажаний продукт. Згідно з додатковим варіантом здійснення 2 UA 112546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше один вектор експресії включає щонайменше дві гетерологічні послідовності нуклеїнової кислоти, функціонально пов'язані з (a) функціональним промотором(ами), в якому, як вище указано щонайменше дві гетерологічні послідовності нуклеїнової кислоти кодують флуоресцентний маркерний білок або поліпептид і стійкість проти селектуючої речовини або бажаний продукт. При бажанні клітини можуть додатково включати гетерологічну послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує бажаний продукт, який буде накопичений в трансгенній моноклональній лінії рослинних клітин, як передбачений в даному винаході. Термін "гетерологічний", як застосовано в даному описі, вказує на те, що ген/послідовність нуклеотидів, як розглядаються, впроваджують в рослинні клітини шляхом генної інженерії, тобто шляхом людського втручання. Гетерологічна послідовність нуклеотидів може включати кодуючу послідовність для рекомбінантного білка, що складається з рекомбінантної частини, яка може бути утворена, наприклад, частково білком рослини, який може бути приєднаний до нерослинного білка, який можна назвати гібридним рослинним-нерослинним білком з метою даного винаходу. Альтернативно, рекомбінантний білок може бути таким, який утворений з рекомбінантних частин, які мають нерослинне походження. Гетерологічний ген може посилювати експресію білка, що представляє інтерес, від ендогенного еквівалентного гена, тобто того, який звичайно виконує ту ж саму або подібну функцію, або вставлена послідовність може бути додатковою до ендогенного гена або іншої послідовності. Нуклеїнова кислота, гетерологічна відносно клітини, може бути такою, що не зустрічається природним чином в культивованому типі клітини, сорті або виді. Таким чином, гетерологічна нуклеїнова кислота може включати кодуючу послідовність від, або що походить від специфічного типу організму, такого, як вид рослин або ссавців, наприклад, вид людини, вівці, бика, коня, або свині, вміщену в контекст культивованої клітини, такої як клітина BY2, що походить від тютюну. Додаткова можливість полягає у впровадженні послідовності нуклеїнової кислоти в культивовану клітинумішень, в якій вона або гомолог присутня природним чином, але в якій послідовність нуклеїнової кислоти пов'язана і/або є суміжною з нуклеїновою кислотою, яка не зустрічається природним чином в цій клітині або клітинах такого типу або видах або сортах рослини, такі як функціонально пов'язані з однією або більше регулюючими послідовностями, такими як послідовність промотору, для контролю експресії. Крім того синтетичні (штучні) послідовності нуклеїнової кислоти можуть бути також застосовані. Визначення "вектор" включає, серед іншого, будь-яку плазміду, косміду, бактеріофаг або вірусний вектор в подвійній або одноланцюжковій лінійній або замкненій формі, яка може або не може бути такою, що самопередається або мобілізується, і яка може трансформувати прокаріотичного або еукаріотичного хазяїна і існувати позахромосомним чином (наприклад, автономна реплікована плазміда з точкою початку реплікації). Зокрема, включені шатл-вектори, під якими мається на увазі ДНК вектор, здатний, природним шляхом або за допомогою дизайну, до реплікації в двох різних організмах хазяїнів, які можуть бути вибрані з актиноміцетів і споріднених видів, бактерій і еукаріотичних клітин (наприклад, вищих рослин, мохів, ссавців, дріжджів або грибів). "Вектор експресії" стосується вектора, в якому нуклеїнова кислота знаходиться під контролем, і функціонально пов'язана з відповідним промотором або іншими регуляторними елементами для транскрипції в клітині-хазяїні, такій як мікробна або рослинна клітина. Вектор може бути біфункціональним вектором експресії, який функціонує в численних хазяїнах. У випадку геномної або субгеномної ДНК, він може включати свій власний промотор або інші регуляторні елементи, і у випадку кДНК, він може знаходитися під контролем відповідного промотору або інших регуляторних елементів для експресії в клітині-хазяїні. "Промотор" являє собою послідовність нуклеотидів, від якої може бути ініційована транскрипція ДНК, яка функціонально приєднана по ходу транскрипції (тобто в 3' напрямку на кодуючому ланцюгу дволанцюжкової ДНК). "Функціонально пов'язаний" означає приєднаний як частина тієї ж самої молекули нуклеїнової кислоти, вміщеної і орієнтованої відповідно вимогам, щоб транскрипція була ініційована від промотору. Термін "індуцибельний" в застосуванні до промотору добре розуміється фахівцями в галузі техніки. По суті, експресія під контролем індуцибельного промотору "включається" або зростає у відповідь на прикладений стимул. Характер стимулу варіює між промоторами. Деякі індуцибельні промотори зумовлюють малі або рівні експресії (або відсутність експресії), що не визначаються за відсутності відповідного стимулу. Інші індуцибельні промотори зумовлюють помітну конститутивну експресію за відсутності стимулу. Незалежно від рівня експресії за відсутності стимулу, експресія під будь-яким індуцибельним промотором підвищується в присутності правильного стимулу. 3 UA 112546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід також охоплює застосування різновиду будь-якої з цих послідовностей. Варіантний білок має гомологію з або ідентичний з усіма або частиною послідовностей, розглянутих вище. Для експресії рекомбінантних білків суспензію рекомбінантних агробактерій або вірусів (вектори), що містить генетичну інформацію про білок, що представляє інтерес, застосовують до суспензії рослинних клітин, вказаних вище, способом, відомим в галузі техніки. Вектор заражає рослинні клітини і передає генетичну інформацію. Переважно, матеріал рослинних клітин, який буде трансформований, застосовувати у високій щільності з тільки невеликими кількостями середовища, присутній так, щоб суспензія вектора могла бути застосована тільки шляхом капання або розбризкування. Цей переважний варіант здійснення трансформації має декілька практичних переваг відносно маніпуляції, автоматизації, масштабування, вироблення і видалення відходів. У альтернативі, відомі способи, такі як бомбардування частинками, електропорація і т. п. можуть бути застосовані, як відомо в галузі техніки. Відповідні промотори включають промотор вірусу мозаїки цвітної капусти 35S (CaMV 35S). Промотор може бути вибраний так, щоб він включав один або більше фрагментів послідовності або елементи, що надають пов'язаний з розвитком і/або тканиноспецифічний регуляторний контроль експресії. Як вже указано щонайменше один селектований генетичний маркер, який може бути бажаним для продукції, може бути включений в конструкцію або бути представлений у другій конструкції, такій як ті, що надають селетовані фенотипи, такі як стійкість до антибіотиків або гербіцидів (що включає, але не обмеженим ними, наприклад, канаміцин, гігроміцин, фосфінотрицин, хлорсульфурон, метотрексат, гентаміцин, спектиноміцин, імідазолінони і гліфосат). Альтернативно, клітини рослинної суспензії, застосовані для отримання протопластів, також можуть бути отримані з вже трансгенної гетерогенної суспензійної рослинної культури, що включає трансгенні клітини. (Трансгенну) моноклональну лінію рослинних клітин, отриману згідно з даним винаходом, можна обробляти або культивувати в присутності попередників, стимуляторів, гормонів, стабілізаторів (наприклад, сумісні розчинені речовини), інгібіторів, молекул інтерферуючих РНК/малий інтерферуючих РНК, сигнальних сполук, ферментів (наприклад, пектиназ) і/або еліситорів в доповнення до або замість векторної суспензії, для отримання рекомбінантних білків або метаболітів. Згідно з переважним варіантом здійснення, бажаний продукт вибраний з групи, що складається з гетерологічних білків або поліпептидів (наприклад, препаратів крові, цитокінів, гормонів росту, терапевтичних/діагностичних/промислових ферментів, вакцин, повнорозмірних антитіл або різних похідних антитіл), вторинних метаболітів (наприклад, фенілпропаноїдів, алкалоїдів, терпеноїдів, хінонів або стероїдів) і маркерів для діагнозу або аналізу газоподібних, твердих або рідких (хімічних) сполук і речовин. Гени, що представляють інтерес, включають такі кодовані білки, які самостійно є природними медикаменти, такими як фармацевтичні препарати або ветеринарні продукти. Крім того, гени, що представляють інтерес, також включають будь-який інший рекомбінантний білок, такий як, наприклад, технічні ферменти, токсини або рекомбінантні білки, що надають нових агрономічних вхідних і вихідних ознак. Гетерологічні нуклеїнові кислоти можуть кодувати, серед іншого, гени бактеріального, грибкового, рослинного або нерослинного походження, такі як рекомбінантні білки, як указано вище в даному описі, або тваринного походження. Отримані поліпептиди можуть бути застосовані для отримання поліпептидів, які можуть бути очищені з них для застосування денебудь ще. Білки, які можуть бути отримані в способі за даним винаходом, включають гетеродимери, такі як фолікулостимулюючий гормон гіпофізу, імуноглобуліни, рекомбінантні антитіла і одноланцюжкові антитіла. Крім того, вищезгадані гени можуть бути змінені так, щоб отримати білки із зміненими характеристиками, такими як модифікована структура глікану. Однак, даний винахід також дозволяє застосовувати синтетичні гени, такі як штучні послідовності, які, як такі, не існують в природі. Такі білки включають, але не обмежені ними, білки ретинобластоми, p53, ангіостатин і лептин. Таким же чином, способи за даним винаходом можуть бути застосовані для отримання регуляторних білків ссавців. Інші послідовності, що представляють інтерес, включають білки, гормони, такі як фолікулостимулюючий гормон, фактори росту, цитокіни, сироватковий альбумін, гемоглобін, колаген, тауматин, тауматин-подібні білки, епідермальні фактори росту, такі як фактор росту ендотелію судин і т. д. 4 UA 112546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як буде оцінено фахівцем, даний винахід дозволяє отримувати велику різноманітність білків і поліпептидів, що включають (рекомбінантні) білки фармацевтичної придатність (така як, наприклад, вакцини, антитіла, терапевтичні ферменти, алергени і гіпоалергени, протимікробні пептиди, структурні білки, такі як еластин і колаген для застосування як біологічно сумісні матеріали покриття, вірусоподібні частинки, білкові тіла і т. д.), (рекомбінантні) білки харчової цінності (їжа і харчові добавки), (рекомбінантні) білки для діагностичних застосувань (такі як, наприклад, ферменти, антитіла і сконструйовані антитіла, інші ферментні або флуоресцентні рекомбінантні білки, антигени, які будуть застосовані як позитивний контроль, зв'язувальні ліганди для білкового мікроматричного аналізу), (рекомбінантні) білки технічної придатності (такі як, наприклад, зв'язувальні ліганди для афінних сорбентів, ферменти великого значення, біокаталізатори), і рекомбінантні білки, поліпшуючі агрономічні вхідні або вихідні ознаки. Загалом, гетерологічні нуклеїнові кислоти можуть бути експресовані будь-яким адекватним способом, застосовним в галузі техніки, або вони можуть бути транскрибовані або експресовані таким чином: (i) транзієнтна експресія "голої" ДНК, наприклад, що включає промотор, функціонально пов'язаний з гетерологічною послідовністю, що представляє інтерес, (ii) експресія з вектора експресії, такого як реплікований вектор. Загалом, фахівці в галузі техніки добре уміють створювати вектори і розробляти протоколи для транзієнтної рекомбінантної експресії генів. Відповідні вектори можуть бути вибрані або створені, включаючи відповідні регуляторні послідовності, включаючи послідовності промотору, фрагменти термінатора, послідовності поліаденілування, послідовності енхансера, маркерні гени і інші послідовності з потреби. Для отримання подальшої інформації див., наприклад, Molecular Cloning: а Laboratory Manual: 2-е видання, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press або Current Protocols in Molecular Biology, Друге Видання, Ausubel et al. Edc., John Wiley & Sons, 1992. (iii) експресія з вектора, що не інтегрується. Буде зрозуміло, що ці категорії не є взаємовиключними, оскільки, наприклад, вектор, що не інтегрується, може також бути вектором експресії і т. д. Як буде оцінено фахівцем щонайменше дві гетерологічні послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують флуоресцентний білковий маркер або поліпептид або фермент, продукуючий флуоресцентну молекулу і гетерологічний білок, що представляє інтерес (бажаний продукт), можуть бути представлені або (i) в поліцистронній конфігурації, складеній одиничною касетою експресії на тому ж самому векторі, (ii) в тандемній конфігурації щонайменше з двома різними касетами експресії в тому ж самому векторі, або (iii) щонайменше в двох різних касетах експресії на різних векторах, в яких тандемна конфігурація переважна. Згідно з додатковим аспектом даний винахід, таким чином, також забезпечує спосіб отримання щонайменше одного бажаного продукту, переважно, вибраного з групи, яка складається з гетерологічних білків або поліпептидів, вторинних метаболітів і маркерних генів. Спосіб включає застосування (трансгенної) моноклональної лінії рослинних клітин як розроблено згідно з даним винаходом для отримання і накопичення щонайменше одного бажаного продукту, який згодом отримують або виділяють з продукуючих клітин або з середовища культивування. Таким чином, в одному аспекті даного винаходу розкрите застосування переважно стабільно трансформованої моноклональної лінії рослинних клітин, додатково здатної до виробництва мРНК, що кодує бажаний продукт, такий як гетерологічний необхідний білок, зроблений транскрипцією з впровадженої конструкції нуклеїнової кислоти, включаючи необхідну нуклеотидну послідовність, функціонально пов'язану з промотором. "Впроваджена нуклеїнова кислота" буде, таким чином, включати гетерологічну послідовність нуклеїнової кислоти, як послідовність ДНК, представлену в формі конструкції, яка здатна давати початок виробленню і накопиченню бажаного продукту. Таким чином, в переважному аспекті даного винаходу розкритий спосіб досягнення стабільної експресії гетерологічної нуклеотидної послідовності в моноклональній лінії рослинних клітин, спосіб, який включає стадію стабільного впровадження в клітину-мішень щонайменше першої послідовності нуклеїнової кислоти, що включає гетерологічну нуклеотидну послідовність, що кодує бажаний продукт. У одному варіанті здійснення представлений спосіб отримання щонайменше позаклітинного гетерологічного білка, спосіб, який включає стадії: (i) стабільне впровадження в клітину-мішень, що складає стартову популяцію рослинних клітин, першої нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, яка кодує гетерологічний білок або бажаний продукт; 5 UA 112546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (ii) отримання протопластів з суспензійних клітин, отриманих зі вказаної суспензійної рослинної культури, в якій протопласти додатково трансформовані і здатні до (i) продукції флуоресцентного маркерного білка або поліпептиду і (ii) виживанню в присутності селектуючої речовини; (iii) розділення одиничних трансформованих протопластів шляхом піддавання отримання протопластів дії FACS; (iv) регенерація виділеного одиничного трансформованого протопласта до утворення мікроколонії або мікрокалюсу за допомогою спільного культивування в присутності фідерного клітинного матеріалу; (v) виробництво моноклональної тканини калюсу за допомогою (i) перенесення мікроколонії або мікрокалюсу на тверде середовище культивування і (ii) культивування мікроколонії або мікрокалюсу в присутності щонайменше одного селектуючого засобу до утворення трансгенної тканини калюсу; (vi) розробка трансгенної моноклональної лінії рослинних клітин шляхом перенесення тканини калюсу в рідке середовище культивування; і (vii) ініціація або дозвіл експресії з нуклеїнової кислоти гетерологічного білка або бажаного продукту, за допомогою створення адекватних умов культивування, і (viii) збирання накопиченого гетерологічного білка або бажаного продукту від виробляючих клітин. Виділення може бути здійснене за допомогою повністю рутинних способів, і може мати на увазі або не мати на увазі часткове або повне очищення. Природно, фахівець в галузі техніки, схвалить, що більше ніж один ген може бути застосований в цій або кожній конструкції. Численні вектори (кожний, включаючи одну або більше нуклеотидних послідовностей, що кодують гетерологічний білок вибору) можуть бути впроваджені в клітині-мішені, як приведено в даному описі або в іншому місці. Це може бути корисно для отримання, наприклад, множинних субодиниць, наприклад, ферменту. Флуоресцентний маркерний білок або поліпептид може являти собою будь-який білок, детектований за допомогою флуоресценції, такий як глюкоронідаза, флуоресцентні білки, такі як GFP або DsRed, люцифераза і т. д. Переважно, щоб репортер був неруйнуючим маркером, таким як DsRed або GFP. Згідно з додатковим аспектом, даний винахід описує спосіб ідентифікації і виділення більш високо експресованих локусів вставки за допомогою сортингу клітин, що включає стадії трансформації клітин (наприклад, як описано в Прикладі 1B нижче), наприклад, конструкцією, що містить флуоресцентний білок 1, і ідентифікації і виділення одиничних високовиробляючих флуоресцентний білок 1 клітин за допомогою FACS, включаючи регенерацію в мікроколонію і суспензійну культуру і генний обмін, наприклад, з флуоресцентним білком 2, і ідентифікацію і виділення рідких продуктів генного обміну. Даний винахід буде далі додатково описаний за допомогою наступних не обмежуючих ілюстрацій і прикладів. У світлі цих варіантів інші варіанти здійснення даного винаходу будуть очевидні фахівцям в галузі техніки. Фігура 1 являє собою схематичне зображення, що ілюструє структуру касети експресії, застосованої для отримання трансгенної лінії MTED BY-2, як приведено в даному описі. Зокрема, креслення ілюструє Т-ДНК рослинного вектора експресії pTRAkc:MTED, застосованого для трансформації суспензійних клітин BY-2. LB і RB: ліва і права межа Т-ДНК; Pnos і pAnos: промотор і термінатор гена нопалінової синтази; nptII: кодуюча послідовність гена неоміцин-фосфотрансферази; SAR: послідовності зв'язування з ядерним матриксом; p35SS і pA35S: промотор з дуплікованим енхансером і термінатор гена вірусу мозаїки Цвітної капусти (CaMV) 35S; CHS: 5'-нетрансльована область хальконової синтази з Petroselinum crispum; SP: сигнальний пептид; HC і LC: кодуюча послідовність важкого і легкого ланцюга антитіла M12; TL: 5'-нетрансльована область вірусу гравіювання тютюну (TEV); TP: перехідний пептид; DsRed: кодуюча послідовність червоного флуоресцентного білка з виду Discosoma. Приклади Приклад 1 Швидке отримання елітних моноклональних клітинних ліній після події трансформації А. Клітинна культура тютюну Суспензійну культуру дикого виду з Nicotiana tabacum сорту Bright Yellow (BY-2) підтримували в темряві в стерильних умовах у вигляді 50 мл аліквот в скляних Колбах ЕрленМейера на 100 мл при 26 °C з постійним орбітальним збовтуванням 180 обертів на хвилину. Середовище культивування включало базальне середовище MSMO (pH 5,8), доповнене 6 UA 112546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сахарозою (3 %, в/о) і 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксіацетилової кислоти. Пересівання робили з інтервалами в 7 днів за допомогою перенесення 5 % (о/о) клітин в 50 мл свіжого середовища. Для отримання протопластів суспензійну клітинну культуру пересівали шляхом перенесення 2 % (о/о) в 50 мл свіжого середовища. В. Прискорене отримання трансгенних подій для подальшого сортингу Суспензійні клітини дикого типу BY-2 вирощували як описано в секції A. Одночасно, трансгенну агробактерію Agrobacterium tumefaciens, що містить конструкцію, яка включає декілька касет експресії в одному і тому ж векторі (див. фігуру 1) культивували в поживному середовищі YEB, що містить відповідний антибіотик (0,5 % поживного бульйону, 0,1 % дріжджового екстракту, 0,5 % пептону, 0,5 % сахарози, 2 мМ MgSO4, pH 7,4), на орбітальному шейкері при 160 обертах на хвилину і 27 °C до OD600нм 1. Через три дні після культивування 3 мл диких клітини типу BY-2, 200 нМ ацетосирингону і 150 мкл агробактерій (OD600нм=1) спільно культивували в чашках Петрі в темряві. Після 3 днів спільного культивування при кімнатній температурі BY-2 клітини ресуспендували в 10 мл поживного середовища (для) BY-2, доповненого 200 мг/л цефотаксиму. Клітини переносили в стерильну колбу на 50 мл і промивали двічі шляхом центрифугування (850 g, 5 хвилин), щоб видалити агробактерії. Після ресуспендування осаду клітинної культури культивування трансформованих клітин BY-2 відбувається у струшуваних колбах на 100 мл із застосуванням 20-50 мл поживного середовища BY-2 з додаванням цефотаксиму і відповідної селектуючої речовини (180 обертів на хвилину, 26 °C). Після регенерації потрібної суспензії (об'єм осаджених клітин приблизно 5060 %) клітини можуть бути пересіяні для отримання протопластів (див. секцію С). Цей спосіб вимагає 14-21 днів для отримання трансгенної суспензійної культури, яка може бути застосована для подальшого отримання протопластів (С) і протоково-цитометричного сортингу (D). С. Отримання протопластів і регенерація клітинної оболонки Активно зростаючі клітинні культури застосовували через 3 дні після пересівання для седиментації осаду клітин шляхом центрифугування при 850g протягом 5 хвилин в стерильних конічних пластмасових центрифугальних колбах. Надосадову рідину видаляли, і клітини ресуспендували в 10 мл розчину розщеплення PNT (3,6 г/л базисної суміші солей Kao Michayluk (Duchefa), 0,4 М сахарози, 0,5 мг/л NAA, 1 мг/л BAP) включаючи 1 % (в/о) целюлозу і 0,3 % (в/о) мацерозиму. Клітинно-ферментну суспензію вміщували в 6-сантиметрові чашки Петрі, запечатані ізоляційною стрічкою. Розщеплення проводили протягом ночі (16-18 год.) при 26 °C в темряві з невеликим збовтуванням. Протопласти фільтрували через 100-мкм нейлонову мережу і потім домагалися спливання на поверхню під час центрифугування (104 g протягом 8 хвилин). Осад і середню поверхню розділення видаляли, і протопласти промивали двічі розчином PNT. Протопласти ресуспендували в розчині W5 (154 мМ NaCl, 125 мМ CaCl 2, 5 мМ KCl, 5 мМ глюкози, pH 5,6) і осаджували за допомогою центрифугування при 76 g протягом 2 хв. Протопласти культивували в модифікованому поживному середовищі регенерації 8p2c (див. таблицю 1 нижче; оптимізоване з поживного середовища 8p) після обережної ресуспензії. 5 Звичайно результатом описаної процедури були 7×10 протопластів в мл з середнім процентом життєздатних протопластів 74 %. Протопласти регенерували протягом 3 днів при 26 °C в темряві, щоб ініціювати регенерацію клітинної оболонки. Отримані в результаті протопласти знову просівали через 100-мкм нейлонову мережу і потім переносили в стерильну пробірку введення зразка для FAC сортингу. Одиничні протопласти сортували в окрему ямку 96-ямкового титраційного мікропланшету, що містить нетрансгенні фідерні клітини або протопласти дикого типу (див. секцію D). Протопласти дикого типу BY-2, які застосовували як фідерні протопласти, були пристосовані 3 приблизно до 2×10 клітин/мл поживної середовища 8p2c із застосуванням рахункової камери Fuchs-Rosenthal. П'ятдесят мікролітрів цих протопластів переносили в окрему ямку 96-ямкового титраційного мікропланшета так, щоб приблизно 100 фідерних протопластів дикого типу були перенесені в кожну ямку. Таблиця 1: Композиція поживного середовища 8p2c (pH 5,6) - Базисна суміш солей Kao und Michayluk (Duchefa) - Kao і розчин вітамінів Michayluk (Sigma) 0,02 мг/л р-амінобензойної кислоти 2 мг/л L-аскорбінової кислоти 0,01 мг/л біотину 1 мг/л пантотенату D-кальцію 1 мг/л холінового хлориду 0,4 мг/л фолієвої кислоти 7 UA 112546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 100 мг/л міо-інозитолу 1 мг/л нікотинаміду 1 мг/л піридоксину HCl 0,2 мг/л рибофлавіну 1 мг/л тіаміну HCl 0,01 мг/л вітаміну А 0,02 мг/л вітаміну B12 0,01 мг/л вітаміну D - Органічні кислоти (pH 5,5 з NH4OH) 20 мг/л натрієвої солі піровиноградної кислоти 40 мг/л яблучної кислоти 40 мг/л лимонної кислоти 40 мг/л фумарової кислоти - Цукрові і цукрові спирти 0,25 г/л сахарози 250 мг/л манози 68,4 г/л глюкози 250 мг/л рамнози 250 мг/л фруктози 250 мг/л целобіози 250 мг/л рибози 250 мг/л сорбіту 250 мг/л ксилози 250 мг/л манітолу - Гормони 0,2 мг/л 2-4-дихлорфеноксіоцтової кислоти 0,5 мг/л зеатину 1,0 мг/л NAA - 2 % (о/о) кокосової води - 500 мг/л казамінової кислоти D. Протоковий цитометричний аналіз і сортинг Прилад FACS Vantage (варіант DIVA, BD Bioscience) з 488 нМ/635 нМ аргоновим лазером застосовували для сортингу трансгенних рослинних протопластів. Протокова рідина, фосфатнобуферний сольовий розчин (pH 7,4 PBS), стерилізували за допомогою автоклавування і за допомогою фільтрування через 0,22 мкм фільтр. Перед сортингом пробірки для зразків очищали від залишкового етилового спирту за допомогою промивання протоковою рідиною. Параметри настройки системи/сортингу цитометру вивіряли із застосуванням комерційних стандартних автофлуоресцентних частинок калібрування. Протоковий сортер експлуатували при 488 нм з вихідною потужністю лазера 175 мВт. Перед сортингом електронні сортувальні вікна встановлювали на основі сигналів, отриманих від прямого світлорозсіювача, бічного світлорозсіювача і флуоресценції зразка культури протопластів, щоб визначити популяцію з сильною флуоресценцією. Сигнали відображалися у вигляді точкової діаграми із застосуванням програмного забезпечення DIVA (BD Bioscience). Області для сортингу визначали шляхом створення меж, по-перше, навколо популяції життєздатних протопластів і, по-друге, на основі перших меж, навколо популяції сильно флуоресціюючих протопластів. Сортинг виконували через 200 мкм - протокову канюлю з системним тиском канюлі 4-6 фунт/кв.дюйм, частотою крапель приблизно 7 кГц і швидкістю потоку зразка приблизно 1000 подій/сек. З застосуванням описаних параметрів сортингу досягали ефективності висівання 20 % (тобто 20 % ямок містили інтактні і життєздатні одиничні відсортовані протопласти). Е. Регенерація одиничних сортованих протопластів шляхом спільного культивування з живильними/фідерними протопластами Перед сортингом сильно флуоресціюючих одиничних протопластів кожну ямку 96-ямкового мікропланшета заповнювали 50 мкл стерильного поживного середовища регенерації 8p2c, що містить приблизно 100 протопластів дикого типу BY-2 сорту N. tabacum як фідерні клітини. Одиничні відсортовані трансгенні протопласти аналізували за допомогою інверсної флуоресцентної мікроскопії в різні моменти часу, щоб перевірити відкладення одиничних клітин після процесу сортингу, а також контролювати проліферацію і утворення мікроколонії трансгенних протопластів (через 14-20 днів після сортингу). Культивування сортованих протопластів в 96-ямкових планшетах проводили при 26 °C-27 °C в темряві, чашки закривали стерильною кришкою і запечатували ізоляційною стрічкою. 8 UA 112546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Трансгенні мікроколонії потім переносили на тверде поживне середовище регенерації (0,8 % (в/о) агар-агар), що містить селективний маркерний антибіотик (наприклад, канаміцин). Таким чином, тканина мікрокалюсу, що включає фідерні клітини в ямках, обережно ресуспендували за допомогою піпетування і переносили із застосуванням піпетки з широким кінцем кінчика. Згодом, ямку, а також перенесені мікрокалюси на твердому поживному середовищі регенерації аналізували за допомогою інверсної флуоресцентної мікроскопії, щоб перевірити успішне перенесення трансгенних і флуоресцентних мікроколоній. При перенесенні трансгенні мікрокалюси вирощували протягом 14-20 днів і переносили на свіжу чашку, що містить тверде середовище регенерації, що включає селективний маркер. Тканина калюсу з розміром приблизно 2 см в діаметрі застосовували для отримання суспензійних культур шляхом перенесення клітинного матеріалу в 5 мл поживного середовища культивування (описаного в секції А) в пластмасові колби для культивування тканин на 50 мл. Ці колби культивували як описано в секції А, доки клітинна суспензія не зростала до об'єму осаджених клітин приблизно 50-60 % для перенесення в скляні колби Ерлен-Мейера на 100 мл. Культивування трансгенної моноклональної суспензійної культури здійснювали як описано в секції А. Описана стратегія для фідерних клітин дозволяє регенерацію приблизно 50 % спочатку сортованих інтактних і життєздатних одиничних протопластів (тобто приблизно 10 % одиничних протопластів, сортованих в ямки 96-ямкового мікропланшета, розвинених в мікрокалюс). F. Перевірка успішної елімінації виживання фідерних клітин під час регенерації відсортованих одиничних протопластів Розробили спосіб, який дозволяє надійну регенерацію вибраних за допомогою FACS одиничних протопластів в моноклональні суспензійні культури. Оскільки одиничні протопласти були регенеровані після сортингу, фідерні клітини повинні підтримувати регенерацію і проліферацію сортованих одиничних протопластів. Оскільки фідерні протопласти тимчасово спільно культивують із сортованими флуоресцентними необхідними протопластами, треба обов'язково елімінувати виживання фідерних протопластів під час регенерації моноклональних культур. Досліджували потенційну контамінацію одинично сортованих трансгенних і флуоресцентних клітин BY-2 фідерними протопластами. Трансгенні клітини трансформували конструкцією, що містить касету експресії GFP-KDEL і селективний маркер AHAS (що надає стійкості до імазетапіру). Одиничні BY-2 протопласти, трансформовані цією конструкцією і що включає GFP, сортували в 96-ямкові планшети, що містять протопласти трансгенної клітинної лінії, що містить касету експресії DsRed і селективного маркера nptII (що надає стійкості до канаміцину). У другому експерименті одиничні протопласти BY-2, трансформовані касетою експресії DsRed і селективного маркера nptII, сортували в 96-ямкові планшети, що містять протопласти трансгенної клітинної лінії, продукуючої GFP. Після регенерації отримані в результаті GFP- і DsRed- флуоресцентні культури аналізували відносно їх стійкості до імазетапіру або канаміцину і їх флуоресценції (зелений проти червоного). Тканину калюсу від обох підходів висівали на чашки в селективне поживне середовище, що містить або 1,5 мкМ імазетапіру або 100 мг/л канаміцину. Ріст клітин оцінювали візуально після 14 днів інкубації. Всі протестовані калюси (всього 20) росли виключно на середніх чашках, що містять їх специфічну селективну речовину. Коротше кажучи, трансформований GFP/AHAS калюси росли на імазетапірі, але не на чашках, що містять канаміцин, тоді як трансформовані DsRed/канаміцином калюси росли тільки на канаміцинових чашках. Це спостереження чітко продемонструвало, що регенеровані трансгенні клітинні лінії не були контаміновані відповідною лінією фідерних клітин. Потенційну контамінацію фідерними клітинами додатково оцінювали за допомогою протокового цитометричного аналізу. Регенеровані GFP і DsRed суспензійні культури аналізували відносно їх оптичних властивостей, що виявляються за допомогою флуоресцентних білків GFP або DsRed, відповідно. Це спостереження чітко продемонструвало, що регенеровані трансгенні клітинні лінії не були контаміновані відповідною лінією фідерних клітин. Всі протестовані культури BY-2 виявляли виключно очікуваний тип флуоресценції. Культури, отримані після сортингу клітин, трансформованих GFP, демонстрували тільки зелену флуоресценцію, в той час як культури, продукуючі DsRed, детектували виключно в червоному каналі флуоресценції. У випадку контамінації фідерними клітинами, очікувався б сигнал флуоресценції в обох каналах. Результат цитометричного аналізу підтвердив ефективне видалення фідерних клітин на селективних чашках, як продемонстровано раніше тестом на стійкість. G. Аналіз моноклональних трансгенних суспензійних культур Моноклональні суспензійні культури спочатку аналізували відносно їх процента високо флуоресціюючих клітин. Тому, протопласти отримували так, як описано в секції C. Для протоково-цитометричного визначення частини флуоресціюючих протопластів застосовували 9 UA 112546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прилад FACS Calibur (BD Bioscience). На основі протопластів дикого типу BY-2 встановлювали параметри настройки (наприклад, посилення світла і підсилювачів розсіювання флуоресценції) і зразки вимірювали. Після встановлення меж життєздатної популяції розподіл цієї популяції застосовували в каналі флуоресценції, щоб встановити поріг, який виключав всі другорядні сигнали, викликані за допомогою автофлуоресценції дикого типу. Згідно з цим порогом обчислювали процент флуоресцентних протопластів в межах поліпшених культур протопластів, що походять з одиничного протопласта. Протоковий цитометричний аналіз моноклональних суспензійних культур, продукуючих рекомбінантний білок DsRed, виявив гомогенно розподілені клітини схожої або сильної інтенсивності флуоресценції (вузькі флуоресцентні піки). Результатом підрахунку частини клітин з DsRed флуоресценцією з'явилися проценти, що варіюють між 78-88 % сильно флуоресціюючих клітин. Рівні накопичення рекомбінантного білка можуть бути визначені різними способами (наприклад, імуносорбентного ферментного аналізу (ELISA)). Тому, клітини центрифугували (850 г, 5 хвилин), ресуспендували в 3-об'ємному буфері екстракції (PBS pH 6, 5 мМ 2меркаптоетанол, 5 мМ EDTA, 10 мМ аскорбінової кислоти) і блокували за допомогою обробки ультразвуком. Екстракт відділяли від клітинних залишків шляхом наступної стадії центрифугування (20 хвилин, 16000 г) і застосовували для аналізу. Імунологічний аналіз накопичення антитіла M12 в 5 dpi (точок на дюйм) клітинних екстрактів від суспензійних культур, трансформованих pTRAkc:MTED виявив до 118±20 мкг/г свіжої маси (в 1,5 рази вище, ніж при застосуванні звичайного способу отримання, тобто отримання калюсу і скринінгу). Приклад 2 Отримання моноклональних клітинних ліній з гетерогенної трансгенної суспензійної культури А. Клітинна культура тютюну Трансгенну суспензійну культуру Nicotiana tabacum сорту Bright Yellow (BY-2) MTED#18, продукуючу повнорозмірне антитіло людини IgG1 M12, затримане в ендоплазматичному ретикулумі, і флуоресцентний білок DsRed, націлено вміщений в пластиди, підтримував в темряві в стерильних умовах у вигляді 50 мл аліквот в скляних колбах Ерлен-Мейера на 100 мл при 26 °C з постійним орбітальним збовтуванням 180 обертів на хвилину. Клітини дикого типуBY-2 вирощували в тих же умовах як контроль. Середовище культивування включало основне середовище MSMO з pH 5,8, доповнену сахарозою (3 %, в/о) і 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти. Пересівання робили з інтервалом в 7 днів шляхом перенесення 5 % (о/о) клітин в 50 мл свіжого середовища. Трансгенну суспензійну культуру отримували шляхом агробактеріє-опосередкованої трансформації клітин N. tabacum сорту BY-2 з подальшою селекцією, основаною на антибіотику, і подальшим розділенням трансформованої тканини калюсу. Тканини калюсу скринували згідно з їх продукцією антитіла за допомогою імунологічний аналізів (Dotblot і ELISA), і найкращих кандидатів застосовували для отримання суспензійної культури (= клітинна лінія MTED#18). Продукція специфічного антитіла M12 парентеральної культури MTED#18 становила 13 мг/г свіжої клітинної маси (10 мг/л). Протоковий цитометричний аналіз показав, що трансгенна культура складається з двох субпопуляцій з тільки 24 % життєздатної популяції, що продукує флуоресцентний маркерний білок DsRed. Для отримання протопластів клітинну суспензійну культуру пересівали шляхом перенесення 2 % (о/о) в 50 мл свіжого середовища. В. Отримання протопластів і регенерація клітинної оболонки Див. приклад 1, секція С. 5 Звичайно результатом описаного способу було 5×10 протопластів в мл зі середнім процентним вмістом 62,2 життєздатних трансгенних протопластів. С. Протоковий цитометричний аналіз і сортинг Настройки приладових параметрів і попередні підготовки робили як описано в прикладі 1, секція D. Одиничні сильно флуоресціюючі рослинні протопласти (1-2 % від усіх відсортованих протопластів) сортували в пристрій прийому клітин (тобто планшети мікротитратора) в режимі одиничних клітин. Один протопласт на ямку, відповідно до других критеріїв встановлення меж, відсортовували в 96-ямкові планшети, наповнені 50 мкл стерильного середовища регенерації 8p2c, що містить приблизно 100 протопластів диких типів як фідерів. 96-ямкові планшети закривали стерильною кришкою і запечатували ізоляційною стрічкою. Фактичне число регенерованих протопластів визначали шляхом інверсійної флуоресцентної мікроскопії. Результатом протоково-цитометричного сортингу протопластів в режимі одиничних клітин була ефективність висівання приблизно 20 % ямок, що містять один інтактний і життєздатний протопласт на ямку. 10 UA 112546 C2 D. Регенерація відсортованих протопластів в низькій щільності Регенерацію одиничних сортованих протопластів виконували як описано в прикладі 1 секції Е. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Результатом протоково-цитометричного сортингу високо флуоресціюючих протопластів в режимі одиничних клітин були приблизно 20 % ямок, що містять тільки один відсортований протопласт. 50 % цих одиничних протопластів почали проліферацію і могли бути застосовані для отримання суспензійних культур. Е. Аналіз моноклональних трансгенних суспензійних культур Щоб визначити процент флуоресціюючих протопластів в поліпшених суспензійних культурах, що походять з єдиного протопласта, застосовували протоковий цитометричний аналіз, як описано раніше (експеримент 1, секція D). Рівні накопичення антитіла M12 визначали шляхом імуносорбентного ферментного аналізу (ELISA). Таким чином, суспензійні клітини центрифугували (850 г, 5 хвилин), ресуспендували в 3-об'ємному буфері екстракції (PBS pH 6, 5 мМ 2-меркаптоетанол, 5 мМ ЕДТА, 10 мМ аскорбінової кислоти) і блокували обробкою ультразвуком. Екстракт відділяли від клітинних залишків за допомогою стадії центрифугування (20 хвилин, 16000 г) і застосовували для аналізу. Завдяки вибраним настройкам (захоплення Fc і детекція LC) детектували тільки повністю сформовані антитіла. Після одного раунду FACS моноклональні суспензійні культури продемонстрували значно поліпшені рівнів накопичення обох рекомбінантних білків: 3,7- кратний збагачений процент клітин з DsRed флуоресцією (90 %) і 11-кратне збільшення антитіла M12 (145 мг/г свіжої маси або 9,3-кратне збільшення рівня на мг/л (93 мг/л)), коли порівнювали з парентеральною суспензійною культурою. F. Повторне проведення поліпшення суспензійної культури Щоб додатково збільшити і стабілізувати рекомбінантну продуктивність білка трансгенних моноклональних суспензійних культур можуть бути повторювані стадії B-E. Для отримання протопластів і регенерації застосовували ті ж самі умови сортингу, як описано раніше. Результатом другого раунду сортингу було подальше збільшення накопичення антитіла: 182 мкг/г свіжої маси або 113 мг/л, що є 14-кратним і 11,3-кратним збільшенням в порівнянні з парентеральною культурою. Результатом третього раунду сортингу 2-го покоління найкращим чином продукуючих моноклонів було 3-е покоління моноклональних культур, продукуючих схожі рівні накопичення, які вказують на те, що максимальний рівень був досягнутий. G. Стійкість елітних продукуючих моноклональних культур з точки зору цільового виробництва білка Стійкість отриманих за допомогою FACS моноклональних клітинних ліній досліджували для прикладу для 3 моноклональних ліній. Моноклональні клітинні лінії пересівали в 7-денному циклі (належить, наприклад 1, секція А), в той час як обидва рекомбінантні необхідні білка вимірювали в 2-місячних інтервалах завжди на 5 день після пересівання. Протягом 12-місячного періоду було продемонстровано для 1-ого покоління моноклональних культур, що ці культури все ще продукують високу і стабільну кількість антитіла M12 на грам свіжої маси. Спостерігали тільки невеликі варіації в рівнях антитіла в 2-місячних інтервалах між відбором зразків (викликані варіаціями культивування клітин). Аналіз 2-го покоління моноклонів підтвердив стійкість клітинної лінії за допомогою демонстрації схожих або небагато збільшених рівнів накопичення і рекомбінантних білків і антитіла M12 і DsRed в порівнянні з 1-им поколінням моноклональної культури, з якої вони були отримані. Загалом, проаналізовані моноклональні культури 2-го покоління здаються більш стабільними з точки зору вироблення необхідного білка (менше варіацій в 2-місячних інтервалах між відбором зразків) в порівнянні з 1-им поколінням моноклональних культур. Під час 12-місячного періоду було виявлено, що дві з трьох проаналізованих моноклональних культур були високо стабільними відносно процентного вмісту в них DsRed-флуоресціюючих клітин в загальній чисельності популяції, так само, як накопичення антитіла M12. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 55 1. Спосіб отримання моноклональної лінії рослинних клітин від гетерологічної популяції рослинних клітин, що включає наступні стадії: (a) отримання гетерологічної популяції рослинних клітин; (b) отримання протопластів зі вказаної гетерологічної популяції рослинних клітин та ініціацію регенерації клітинної стінки; 11 UA 112546 C2 5 10 15 (c) надання пристрою приймання клітин, який містить фідерний клітинний матеріал на рідкому середовищі; (d) розділення одиничних протопластів шляхом піддавання отриманих протопластів сортуванню флуоресцентно-активованих клітин (FACS); (e) відбір одиничного протопласта і вміщення його у рідке середовище вказаного пристрою приймання клітин, який містить фідерний клітинний матеріал; (f) регенерацію виділеного одиничного протопласта до утворення мікроколонії за допомогою спільного культивування в присутності вказаного матеріалу фідерних клітин; (g) виділення мікроколонії з матеріалу фідерних клітин і культивування мікроколонії до утворення моноклональної лінії рослинних клітин. 2. Спосіб за пунктом 1, який додатково включає регенерацію моноклональної лінії рослинних клітин, як представлено в стадії (g), в цілі плодоносні рослини. 3. Спосіб за пунктом 1 або 2, в якому протопласти, як представлено в стадії (b), трансформовані і здатні до (i) продукції флуоресцентного маркерного білка або поліпептиду, (ii) вироблення бажаного продукту, і/або (iii) виживання в присутності селектуючої речовини. 4. Спосіб за пунктом 3, в якому бажаний продукт вибраний з групи, яка складається з гетерологічних білків або поліпептидів, вторинних метаболітів і маркерів для діагностичних або аналітичних цілей. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 12