Універсальна вакцина для лікування і профілактики хвороби лайма для застосування у ветеринарії і спосіб її виробництва

Реферат: Винахід належить до універсальної вакцини для лікування і профілактики хвороби Лайма для застосування у ветеринарії, на основі цільноклітинної бактеріальної вакцини або бактеріальних лізатів, або очищених препаратів, причому вакцина включає три найбільш патогенних геновиди Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, кожний з яких містить одночасно обидва імуногенних протективних білки зовнішньої мембрани, OspA і OspC. UA 102081 C2 (12) UA 102081 C2 UA 102081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки Винахід стосується композиції універсальної вакцини для лікування і профілактики хвороби Лайма для застосування у людей і у ветеринарії і способу її виробництва. Сучасний рівень техніки Хвороба Лайма являє собою хронічне інфекційне захворювання, що характеризується множинним ураженням систем органів. Це найбільш поширене переносиме членистоногими захворювання в Європі і Сполучених Штатах. Значущість цього захворювання показана в ряді публікацій в журналах, присвячених інфекційним захворюванням. З цієї точки зору, серед хвороб, за останнє десятиріччя, хвороба Лайма стає відразу за набутим синдромом імунодефіциту, як описано, наприклад, в "The biological and social phenomenon of Lyme disease" (Barbour AG, Fish D, Science. 1993 Jun 11;260(5114):1610-6). Захворювання викликається групою спірохет із загальною назвою Borrelia burgdorferi sensu lato. Ця група мікроорганізмів, головним чином, включає три близькоспоріднених підвиди, тобто Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii. У той час як Borrelia burgdorferi sensu stricto є причиною практично всіх випадків Хвороби Лайма на північноамериканському континенті, в Європі переважають Borrelia garinii і Borrelia afzeli. Серйозні ураження організму-хазяїна ссавця, а також проблеми, пов'язані з діагностикою і лікуванням хвороби Лайма, є істотними стимулами для розробки ефективних вакцин. З іншого боку, існують сумніви відносно розробки вакцин і їх використання, особливо у людини. Основними причинами є відсутність контагіозності захворювання, те, що його досить просто можна лікувати антибіотиками, а клінічні вияви з серйозними наслідками виникають тільки у частини інфікованих пацієнтів. Більше того це захворювання рідко закінчується летальним випадком. Таким чином, побоювання, пов'язане з можливими побічними ефектами нової вакцини, яка, в даних умовах, була б насилу дозволена до застосування, не є несподіванкою, як описано в статті "Experimental immunization against Lyme borreliosis with recombinant Osp proteins: an overview" (Sadziene А, Barbour AG., Infecrion. 1996 Mar-Apr;24(2): 195-202). Перша ветеринарна вакцина проти бореліозу була розроблена для собак в Сполучених Штатах в 1990 році. Ліцензія для неї була одержана в 1992 році, у відповідності зі статтями "Performance of а Borrelia burgdorferi bacterin in borreliosis-endemic areas" (Levy SA, Lissman BA, Ficke див., J Am Vet Med Assoc. 1993 Jun 1;202(11):1834-8) "and Immunization against Lyme Disease?" (Wormser, GP., Ann Intern Med 123,627-629,1995). Цільноклітинну, хімічно інактивовану вакцину застосовують з використанням носія, що містить речовину полімерного ад'юванта. Вакцину застосовують внутрішньом'язово, двічі з інтервалом в дві або три тижні. Підтримуюча доза (ревакцинація) рекомендована через рік. Вакцинація домашніх тварин, особливо собак, рекомендована незалежно від того, чи була тварина інфікована або захворювання якраз на стадії прогресування. Одержання даної вакцини основане на знаннях, одержаних в експериментах на гризунах. Протективний ефект цільноклітинної вакцини уперше описаний у хом'яків. Розробці цільноклітинної вакцини для ветеринарних цілей, головним чином, сприяли простому спосбу одержання і низькій вартості. Однак ця вакцина не була рекомендована для використання у людей через те, що деякі антигенні борелії реагують з антигенами людини, і, таким чином, не можна виключити стимуляцію імунопатологічних процесів, як описано в "Molecular mimicry and Lyme borreliosis: а shared antigenic determinant between Borrelia burgdorferi and human tissue" (Aberer Е et al., Ann Neurol. 1989 Dec; 26(6)732-7) або "Serologic response to the Borrelia burgdorferi flagellin demonstrates an epitope common to а neuroblastoma cell line". (Fikrig et al. 1993, Proc Nat Acad Sci USA. 1993 Jan 1;90(1): 183-7). Одержані дані, що деякі антигенні Borrelia burgdorferi активують пул специфічних Т лімфоцитів, що беруть участь в розвитку артриту у хом'яків, дивись "Involvement of CD4+ Т lymphocytes in induction of severe destructive Lyme arthritis in inbred LSH hamsters" (Lim LC et al., Infect Immun. 1995 Dec; 63(12):4818-25). Кролики виявлялися захищеними від інфекції, якщо перед проведенням експериментального зараження застосовували імунну сироватку, одержану після імунізації тваринних імуногенними білками штаму борелії. Введення імунної сироватки після виникнення інфекції не перешкоджало розвитку мігруючої еритеми і вісцеральних типів вияву інфекції. Аналогічні результати також були одержані для мишей і хом'яків і описані в "Serum-mediated resolution of Lyme arthritis in mice" (Barthold SW et al, Lab. Invest. 1996, Jan;74(1):57-67) або "Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi" (Barthold SW et al., Clin Infect Dis 1997 Jul; 25 Suppl 1:S9-17.) або "Experimental infection of the hamster with Borrelia Burgdorferi" (Johnson RC et al., Ann Acad Sci. 1988;539:258-63). 1 UA 102081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Одержані експериментальні дані підкреслюють можливість розробки безпечної субодиничної вакцини. Основними антигенами-кандидатами такої вакцини є білки зовнішньої мембрани (Osp), позначені як OspA, В, С і D. Особливо ретельно досліджували білок OspA. Протективний ефект даної субодиничної вакцини експериментально підтвердили на мишах, хом'яках і кроликах і описали в статтях "Protection of mice against the Lyme Disease agent by immunizing with recombinant OspA" (Firking Е et al., Science 1990 Oct 26; 250(4980):553-6) і "Longterm protection of mice from Lyme Disease by vaccination with OspA" (Firking Е et al., Infect Immun. 1992 Mar; 60(3):773-7). Лабораторні тести підтвердили, що застосування цього білка в формі очищеного рекомбінантного білка, одержаного шляхом утворення з'єднання з ліпідами, при парентеральному введенні стимулює захисний імунітет і захищає від бореліозної інфекції, внесеної за допомогою ін'єкції або через кліщового переносника інфекції. Також було підтверджено, що заражені кліщі, що присмоктуються до імунізованої тварини, втрачали свою інфективність, як описано в "Safety and immunogenicity of а recombinant outer surface protein А Lyme vaccine" (Keller D et al., JAMA. 1994 Jun 8;271(22): 1764-8) або "Elimination of Borrelia burgdorferi from vector ticks feeding on OspA-immunized mice" (Firking Е et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Jun 15;89(12):5418-21). У випадку відсутності ліпідних частинок, утворення антитіл шляхом стимуляції вимагає ад'ювантного ефекту повного ад'юванта Фрейнда або іншого імунного ад'юванта, як описано в статті "Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA" (Erdile IF et al., Infect Immun. 1993 Jan;61(1):81-90). При цьому відмічено на два можливих ефекти вакцинації: (1) Спірохети інактивовані вже в організмі кліща і, таким чином, запобігається передача інфекції, (2) Спірохети можуть бути швидко інактивовані після попадання в організм хазяїна, безпосередньо перед антигенними варіаціями і зниженням вироблення антигену OspA. Для підтвердження протективного ефекту антигену OspA були одержані дві різні конструкції і склади вакцини: 1. Нативний і очищений рекомбінантний OspA, описаний в "Recombinant outer surface protein А from Borrelia burgdorferi induces antibody protective against spirochetal infection in mice" (Simon MM et al.,. J Infect Dis. 1991 Jul;164(1):123-32). 2. OspA, включений в геном BCG (Calmette, Guerin). OspA експресується ззовні як мембранопов'язаний ліпопротеїну, як випливає з статті "Protective immunity elicited by rBCG viccines" (Stover CK et al., Dev Biol Stand. 1994; 82:163-70). В даній формі OspA досліджували при внутрибрюшинном і интраназальном введенні, як опубліковано в "Systemic and mucosal immunity induced by BCG vector expressing outer-surface protein А of Borrelia burgdorferi" (Langermann S et al., Nature. 1994 Dec 8;372(6506):552-5). При застосуванні в даній формі, специфічні антитіла IgG і IgA вироблялися протягом тривалого часу, що очевидно з статті "Protective immunity elicited by recombinant bacille Calmette-Guerin (BCG) expressing outer surface protein А (OspA) lipoprotein: а candidate Lyme Disease vaccine" (Stover CK et al., J Exp Med. 1993 Jul 1;178(1):197-209). У цей час існує єдиний виробник даної вакцини для застосування у людини в Сполучених Штатах Америки. Вакцина була схвалена управлінням по санітарному нагляду за якістю харчових продуктів і медикаменти (Food and Drug Administration, FDA) 21-го грудня 1998 і описана в дослідженні "Vaccination against Lyme Disease with recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface lipoprotein А with adjuvant. Lyme Disease Vaccine Study Group" (Steere AC et al., N Engl J Med, 1998 Jul 23; 339(4):209-15). Продукт LYMErix проводиться SmithKline Beecham. Згідно з третьою фазою клінічних випробувань, вакцина забезпечує 80-90 % захист, що підтверджено в статті "А vaccine, consisting of recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface protein А to prevent Lyme Disease. Recombinant Outer-Surface protein А Lyme Disease Vaccine Study Consortium" (Sigal LH et al., N Engl J Med. 1998 Jul 23; 339(4):216-22. Erratum in: N Engl J Med 1998 Aug 20; 339(8):571). Хоча вакцина вже набула поширення, через мінімальні відомості про її довготривале застосування, вона знаходиться під постійним контролем. Для досягнення максимальної імунної відповіді, вакцину застосовують ін'єкційно три рази протягом 12-місячного періоду (0, 1, 12). Ефективність вакцини описав, наприклад, Wahlberg, який затверджував, що ефективність вакцини становила 50 % (1 рік) після двох доз рекомбінантного білка OspA, пов'язаного з гідроксидом алюмінію в фосфатному буфері, і 79 % після трьох доз вакцини (20 місяців). Титр антитіл досить швидко знижувався і через два роки досягав рівня першого року вакцинації (50 % ефективність). Дані про повторну імунну відповідь відсутні. Згідно з даними, не дозволене застосування вакцини у дітей у віці до 15 років і у людей, страждаючих аутоімунними захворюваннями, зокрема, артритом. У групі з 5765 вакцинованих людей артрит розвинувся у 2 UA 102081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 двох чоловік з фенотипом HLA-DR4, як опубліковано в статті "Guarded endorsement for Lyme Disease vaccine" (Marwick З, JAMA. 1998 Jun 24;279(24):1937-8). Комерційно доступну вакцину одержують з білка OspA з Borrelia burgdorferi sensu stricto. У зв'язку з тим, що ця бактерія є домінантним інфекційним збудником хвороби Лайма на північноамериканському континенті, вакцина може бути досить ефективною відносно населення США. У Європі, однак, це захворювання, головним чином, викликають наступні три патогенних підвиди, тобто Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii. На Європейському континенті антигенна варіабельність була описана для всіх даних видів. Таким чином, вакцина для застосування у людей і у ветеринарії, одержана тільки з виду Borrelia burgdorferi sensu stricto є непридатною для застосування в Європі. Для розробки ефективної форми вакцини застосовували нові напрями технологій вакцинації. Наприклад, про ефективну ДНК вакцину опубліковано в "Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein А gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promoter" (Simon MM et al., Eur J Immunol. 1996 Dec;26(12):2831-40) або "DNA vaccines expressing а fusion product of outer surface proteins А and З from Borrelia burgdorferi induce protective antibodies suitable for prophylaxis but not for resolution of Lyme Disease" (Wallich R. et al., Infect Immun. 2001 Apr;69(4):2130-6). Іншою можливістю є одержання вакцини з білка OspC, що експресується на поверхні мікроорганізмів, що знаходяться в організмі хазяїна. За даними літератури, гуморальний імунітет проти даного білка носить протективний характер, як описано в "Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein А gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promoter" (Simon MM et al., Eur. J. Immunol. 26, 2831-2840, 1996). OspC є основним мембранним антигеном, що експресується на ранній стадії інфекції. У випадку Borrelia burgdorferi sensu stricto, антигенний OspC є високо варіабельним. Двадцять одна алельна група, відома як A-U, була виявлена для цього антигену за допомогою епідеміологічного аналізу і секвенування генів OspC конкретних штамів і з використанням GeneBank, як описано в "Four clones of Borrelia burgdorferi sensu stricto case invasive infection in humans" (Seinost G et al., Infect. Immun. 67, 3518-3524, 1999). Зовнішній поверхневий антигенний А (OspA) є основним поверхневим антигеном, який Borrelia burgdorferi експресує ззовні, коли знаходиться всередині кліща. У момент, коли кліщ починає смоктати кров ссавця, синтез цього антигену поновлюється, а синтез антигену OspC навпаки посилюється. Таким чином, OspC стає основним антигеном зовнішньої поверхні мембрани на ранній стадії інфекції, який описаний, наприклад, в "Induction of an outer surface protein of Borrelia burgdorferi during tick feeding" (Schwan TG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2909-2913. 1995). Хоч і було показано, що OspC обмежено присутній на поверхні, він є могутнім імуногеном. Імунізація з допомогою OspC захищає від бореліозної інфекції. Однак захист пов'язаний з конкретним алелем OspC, який контролює синтез конкретного білка. Інфекція іншим видом борелії спричиняє захворювання у індивіда, підданого імунізації. Це, природним чином, обмежує використання даного антигену, одержаного тільки з одного геновиду борелії, при одержанні універсальної вакцини. Таким чином, питання про успішну вакцинацію проти хвороби Лайма залишається відкритим. Більше того в Європі це ускладняється існуванням трьох різних геновидів (Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii) і виникненням хвороби Лайма не тільки у людей, але також у різних видів домашніх тварин і худоби. Проблеми, що стосуються цього захворювання у собак і кішок, описані в "Canine borreliosis" (Littman MP, Vet Clin Small Anim 33, 2003, 827-862), а захворюваність коней розглянута в "Equine Abortion Associated with the Borrelia parker i- В. turicatae Tick-Borne Relapsing Fever Spirochete Group" (Walker RL et al., Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40, 4, 1558-1562). Livey et al. спробували подолати ці проблеми одержанням так званої "вакцини-коктейлю". Їх результати опубліковані в "OspC vaccine candidate" (Abstract of the Symposium on the Pathogenesis and Management of Tick-borne Diseases. 1998 Sept. 28-30. Vienna, Austria. 1998). Разом з існуючими проблемами діагностики і лікування хвороби Лайма, а також через неможливість ефективно контролювати і скорочувати поширення векторів борелії, існує екстрена необхідність у вакцині, здатній здійснювати ефективну імунізацію сприйнятливих видів домашніх тварин і худоби, а також людей проти інфекції, що викликається Borrelia burgdorferi sensu lato. Вакцини, створені на основі цільноклітинної бактеріальної вакцини з Borrelia burgdorferi були розроблені для домашніх тварин, як, наприклад, описано в патентних документах US 4721617, US 6316005. Аналогічно, вакцини, що містять OspA, OspC або інші імуногенні білки зовнішньої поверхні, одержані з культур борелії, що культивуються, що виробляються як рекомбінантних білки в різних клітинах-хазяїнах (Е. coli), або одержані синтетично, були розроблені як описано в документах WO 094/25596, WO 96/05313, WO 3 UA 102081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 9749812, US 6716574, US 2004067517, US 6676942, WO 0216422, US 5530103, US 6486130, US 6464985, EP 633028). Однак ці цільноклітинні або субодиничні вакцини не включали захист від повного спектра патогенних борелії всіх геновидів, головним чином, Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii і Borrelia afzelii і інших, в залежності від конкретного випадку. Вакцини завжди проводять з єдиного геновиду - Borrelia burgdorferi sensu stricto. Задачею за даним винаходом є надання нової універсальної вакцини, що містить основні імуногенні білки OspA і OspC в різних комбінаціях з одного двох або, переважно, всіх трьох широко відомих патогенних геновидів, тобто Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii і Borrelia afzelii, або, можливо, інших, яких можна успішно застосовувати без яких-небудь територіальних обмежень. Об'єкт винаходу Згадана вище мета досягається створенням універсальної вакцини для лікування і профілактики хвороби Лайма для використання у людей і у ветеринарії, створеній на основі цільноклітинної бактеріальної вакцини або бактеріальних лізатів або очищених препаратів з щонайменше одного або декількох геновидів борелії, суть чого полягає в тому факті, що кожний геновид борелії, переважно вибраний з групи Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, містить, як мінімум, один імуногенний протективний білок зовнішньої мембрани, або OspA або OspC або одночасно обидва імуногенних протективних білки OspA і OspC, або, можливо, інші імуногенні протективні білки зовнішньої мембрани. Переважний варіант вакцини включає всі три найбільш патогенних геновиди - Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garrinii, кожний з яких містить одночасно обидва імуногенних протективних білки зовнішньої мембрани OspA і OspC. Більше того об'єктом за даним винаходом є те, що імуногенні протективні білки зовнішньої мембрани OspA і OspC включені у вакцину переважно в співвідношенні 1:1, те, що вакцину випускають в ліофілізованій або рідкій формі або застосовують в буферному фізіологічному розчині або з мінеральним або масляним імунологічний ад'ювантом, або, можливо, з іншими імуномоделюючими засобами, і те, що величина pH вакцини знаходиться в діапазоні 4-9. На закінчення, об'єктом за даним винаходом є спосіб виробництва універсальної вакцини для лікування і профілактики хвороби Лайма у людей і застосування у ветеринарії за п. п.1-5, протягом якого кожний виробничий штам борелії, культивують, інактивують і незалежно перевіряють перед складанням суміші, де культура проліферує і відтворюється переважно при 26-35ºС протягом 6-18 діб (кожний етап) для експресії антигену OspA і при 36-38ºС протягом 618 діб (кожний етап) для експресії антигену OspC. Новий ефект представленого винаходу полягає в тому, що специфічні антитіла до OspA і OspC виробляються в організмі підданих вакцинації тварин і людей після застосування вакцини, яка запобігає перенесенню патогенних борелії з кліща в підданий вакцинації організм (антитіла до OspA) і забезпечують загибель борелії незабаром після можливого перенесення патогенних борелії в підданий вакцинації організм (антитіла до OspC) і, можливо, в утворенні інших післявакцинаційних протективних антитіл, це не визначено в деталях, і в стимуляції імунних механізмів. Іншим корисним ефектом є те, що крім загальноприйнятого застосування у дорослих особнів, вакцину можна застосовувати у молодих домашніх тварин (переважно, собак і кішок) і молодої худоби (переважно, коней) у віці від 3 тижнів для індукції активного протективного імунітету проти хвороби Лайма. Аналогічно, вакцину можна застосовувати одночасно з іншими препаратами, лікарськими засобами і вакцинами проти вірусних, бактеріальних, грибкових і інших захворювання у собак, кішок, коней і інших видів тваринних, для яких призначена вакцина. Приклади здійснення Приклад № 1: Даний приклад здійснення демонструє підтвердження протективності універсальної вакцини після імунізації експериментальних кішок, собак і коней проти інфекції, що викликається вірулентний штамами Borrelia burgdorferi sensu lato, однак, ні в одному з випадків не обмежує патентні права, що відносяться до даної патентної заявки. Одержання експериментального зразка вакцини і результати експерименту: A) Культивування виробничих штамів борелії, що експресують антигенний OspA: Під час культивування виробничих штамів борелії, що експресують антигенний OspA, як початкові складові на початковому етапі використали наступні засоби: - середовище BSK-H + кроляча сироватка - середовище BSK-H, повна 4 UA 102081 C2 разом з виробничими штамами Borrelia afzelii, Borrelia garinii і Borrelia burgdorferi sensu stricto згідно з наступною схемою технології виробництва: Приготування середовища для культивування  Виробничі штами  Відтворення  Розмноження окремих штамів Інактивування окремих штамів  Концентрація, очищення антигену  Стабілізація антигену  Завершення створення вакцини і адсорбування на гідроксиді алюмінію  Наповнення, упаковка, заключний контроль  Контроль росту і очищення  Контроль росту і очищення, Визначення кількості, Визначення присутності OspA  Перевірка на інктивування  Визначення відсутності сироватки  Контроль стерильності, визначення і регулювання pH  Контроль стерильності, визначення pH Примітка: кожний штам борелії (Borrelia afzelii, garinii і burgdorferi sensu stricto) культивують, контролюють, інактивують і перевіряють окремо до того як змішують всі штами (включаючи штами, що експресують антигенний OspC). 5 10 15 20 25 30 Власне культивування здійснюють в пластикових або скляних матрацах Ру, призначених для культивування культур борелії. Культуральне середовище BSK збагачують 6 % стерильною кролячою сироваткою, відповідною для культивування борелії, перед самим культивуванням, або можна використати повне середовище BSK-H, що містить 6 % кролячу сироватку. Початковий і робочий виробничі штами підтримують в рідкому азоті при -196ºС. Для відновлення культури, ампулу з культурою дістають з рідкого азоту і розморожують приблизно при 30ºС. Відразу після розмороження культуру пересівають в пробірку з поживним середовищем, нагрітим до приблизно 28ºС в співвідношенні 1+9 (1 частина культури + 9 частин середовища). Кожний штам культивують окремо. Інкубацію здійснюють при 26-35ºС протягом від 6 до 18 діб. При розмноженні культури, за добре зростаючою, життєздатною культурою (коли червоний колір середовища змінюється на жовтий) спостерігають в мікроскоп і в стерильних умовах пересівають в поживне середовище в співвідношенні 1 частину культури + 9 частин е середовища. Культивування проводять при 26-35ºС протягом 6-10 діб. Подальші пасажі добре зростаючих борелії проводять в співвідношенні 1 частину культури: від 10 до 100 частин культуральной е середовища. Число подальших пасажів залежить від кількості борелії, необхідної для одержання вакцини. При одержанні культури для виробництва вакцини, дорослі культури після попередніх культивувань в стерильних умовах використовують як посівну культуру, що застосовується в бульйоні у флаконах об'ємом 1000-мл в співвідношенні 1 частина культури: від 10 до 100 частин культурального середовища. Культивування проводять при 26-35ºС протягом 6-10 діб. Кількість борелії визначають в темному полі мікроскопа за допомогою значень рахункової камери Петрова-Хауссера. У ході процесу, контроль за зростанням культури і чистотою здійснюють макроскопічно, мікроскопічно і спостереженням за культивуванням. Макроскопічне спостереження полягає у візуальному спостереженні за тим, чи змінює відповідна культура червоний колір культурального середовища на жовтий, і чи присутній в середовищі осад. При мікроскопічному спостереженні за темними полями в мікроскопі здійснюють контроль за достатньою рухливістю борелії і наявністю невеликої кількості детриту, без яких-небудь ознак бактеріальної 5 UA 102081 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 контамінації. При спостереженні за культивуванням, 0,5 мл культури борелії, що оцінюються, переносять на попередньо висушений кров'яний агар і проводять культивування при 35-37ºС протягом 48 годин. При оцінці тесту, наявність якого-небудь видимого небажаного бактеріального зростання спричиняє за собою відбраковування культур з бактеріальної контамінацією. Присутність OspA визначають за допомогою електрофорезу білків в ПААГ в присутності ДСН (SDS) після фарбування блакитним Кумассі або імунологічним способом вестернблоттингу з використанням антисироватки проти OspA. В) Культивування виробничих штамів борелії для експресії антигену OspC: Для здійснення культивування використали ті ж самі початкові складові, виробничі штами і схему технології виробництва, що і при виробленні антигену OspA, описаного в А). Аналогічно, власне культивування протікає таким же чином з тією лише різницею, що при відновленні культури, ампулу з культурою, що розморожується пересівають в пробірку з рідким середовищем, нагрітим до приблизно 37ºС в співвідношенні 1+9 (1 частина культури + 9 частин е середовища) і проводять інкубування при 36-38ºС протягом від 6 до 18 діб. Точно так само, розмноження культури проводять аналогічним способом, але з різницею в тому, що культивування проводять при 36-38ºС протягом 6-10 діб. Одержання культури для виробництва вакцини, визначення кількості борелії, контроль за ходом процесу, контроль за зростанням і чистотою культури і визначення присутності OspC проводять таким же чином, як описано в А). C) Належний спосіб одержання остаточного вигляду вакцини: Концентровані, очищені, стійкі і інактивовані бактеріальні штами Borrelia burgdorferi senzu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, для яких доведене вироблення білка зовнішньої мембрани OspA, і концентровані, очищені, стійкі і інактивовані бактеріальні штами Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, для яких доведене вироблення білка зовнішньої мембрани OspC, змішували разом таким чином, що OspA і OspC окремого геновиду борелії були присутнім в однаковому співвідношенні. Далі компонент борелії (90 % об'єми) змішували з гелеподібним гідроксидом алюмінію (10 % об'єми). Після ретельної гомогенізації перевіряли pH і доводили до величини між 7,5 і 8,0. Флакони для зберігання наповнювали вакциною і проводили пробу на стерильність. Далі, флакони для відправки наповнювали вакциною, упаковували і відправляли для остаточної перевірки. D) Результати дрслідження a) Перевірка ефективності у кішок: Шість кішок піддавали вакцинації і ревакцинації за допомогою експериментального зразка вакцини і через 90 діб їх заражали кліщами (Ixodes ricinus), природним чином інфікованими геновидами Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii. Як контроль використали трьох кішок, не підданих вакцинації. Кішок вакцинували підшкірно за допомогою 1 мл вакцини і через 3 тижні таким же чином проводили ревакцинацію. Кров брали перед вакцинацією і ревакцинацією. Надалі кров брали через 1 місяць після ревакцинації. Через три місяці після ревакцинації кішок заражали зібраними природним чином кліщами (Ixodes ricinus), які були природним чином заражені всіма трьома найбільш патогенними геновидами - Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii. Міру інфекованості кліщів перевіряли перед початком експериментального зараження. Після зараження, кожний день всією експериментальною твариною (підданим і не підданим вакцинації, службовців контролем, кішкам) проводили клінічний огляд і реєстрували стан їх здоров'я, включаючи вимірювання температури тіла. Після зараження, кров всіх експериментальних тварин брали для перевірки на 14, 28, 42 і 60 добу. Кров також брали в день зараження, відразу після зараження кліщами. На 7, 28 і 60 доби після зараження, брали зразки шкіри для біопсії в тих місцях, де присвавалися кліщі для того, щоб наново виділити борелії з цих зразків. На 60 доби після зараження всіх експериментальних тварин умертвляли і проводили патологоанатомічний розтин і як зразки брали м'яз, суглобову рідину, лімфатичний вузол, шкіру і гирки для того, щоб наново виділити борелії з цих привертаючих ділянок. Одержані результати представлені в зведених таблицях № 1, 2, 3 і 4. Із одержаних результатів однозначно слідує, що вакцина проти бореліозу, одержана з виробничих штамів Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, що експресували поверхневі білки OspA і OspC, є нешкідливою для кішок і сприяє виробленню у них протективного імунітету проти природної кліщової інфекції всіх трьох найбільш патогенних геновидів Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, і, можливо, внаслідок перехресного імунітету, інших відомих геновидів борелії. 60 6 UA 102081 C2 Таблиця № 1 Схема експерименту зараження – кішки Зразки біологічного матеріалу після зараження/доба 7 14 28 35 42 49 56 60 Кішка № Вакцинація РевакциЗараження нація 1V + + + B K BK K ВКР 2V + + + B K BK K BKP 3V + + + B K BK K ВКР 4V + + + B K BK K ВКР 5V + + + B K BK K ВКР 6V + + + B K BK K ВКР 7KO + B K BK K ВКР 8KO + B K BK K ВКР 9KO + B K BK K ВКР Помітка Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Пояснення: V - вакцинація КО - не піддані вакцинації контролі + - дію виконували - - дію не виконували В - біопсія шкіри К - забір крови P - патологоанатомічний розтин Таблиця № 2 Клінічна оцінка після зараження Кішка № 1V 2V 3V 4V 5V 6V 7KO 8KO 9KO 7 Клінічні зміни після зараження - доба 14 21 28 35 42 49 56 + + + Пояснення: + - наявність клінічних симптомів - - відсутність клінічних симптомів 7 60 + + + Помітка Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд UA 102081 C2 Таблиця № 3 Виявлення борелії в біоптатах шкіри після зараження Кішка № 1V 2V 3V 4V 5V 6V 7KO 8KO 9KO 7 + + + Період збору біоптатів шкіри - доба 28 60 + Помітка Пояснення: + - позитивний результат - - негативний результат Таблиця № 4 Виявлення борелії в органах Кішка № 1V 2V 3V 4V 5V 6V 7KO 8KO 9KO М'яз + + Органи, піддані схильності (розтин на 60 добу) Шкіра Лімфатичний вузол Суглобна рідина Нирка + + + + + + Помітка PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- позит. PA- позит. PA- позит. Пояснення: + - позитивний результат - - негативний результат PA - патологоанатомічний розтин 5 10 15 b) Перевірка ефективності у собак: Шість собак піддавали вакцинації і ревакцинації за допомогою експериментального зразка вакцини і через 90 діб їх заражали кліщами (Ixodes ricinus), природним чином інфікованими геновидами Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii. Як контроль використали трьох собак, не підданих вакцинації. Вакцинацію, ревакцинацію, забір крові, клінічну оцінку, взяття зразків для дослідження і інші маніпуляції проводили так само як в дослідженні для кішок. Одержані результати представлені в зведених таблицях № 5, 6, 7 і 8. Із одержаних результатів однозначно слідує, що вакцина проти бореліозу, одержана з виробничих штамів Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, що експерсують поверхневі білки OspA і OspC, є нешкідливою для собак і сприяє виробленню у них протективного імунітету проти природної кліщової інфекції всіх трьох найбільш патогенних геновидів Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, і, можливо, внаслідок перехресного імунітету, інших відомих геновидів борелії. 8 UA 102081 C2 Таблиця № 5 Схема експерименту зараження – собаки РевакциЗараження нація Зразки біологічного матеріалу після зараження/доба 7 14 28 35 42 49 56 60 Собака № Вакцинація 1V + + + B K BK K ВКР 2V + + + B K BK K BKP 3V + + + B K BK K ВКР 4V + + + B K BK K ВКР 5V + + + B K BK K ВКР 6V + + + B K BK K ВКР 7KO + B K BK K ВКР 8KO + B K BK K ВКР 9KO + B K BK K ВКР Помітка Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Пояснення: V - вакцинація КО - не піддані вакцинації контролі + - дію виконували - - дію не виконували В - біопсія шкіри К - забір крови P - патологоанатомічний розтин Таблиця № 6 Клінічна оцінка після зараження Собака № 1V 2V 3V 4V 5V 6V 7KO 8KO 9KO 7 Клінічні зміни після зараження - доба 14 21 28 35 42 49 56 + + + Пояснення: + - наявність клінічних симптомів - - відсутність клінічних симптомів 9 60 + + + Помітка Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд UA 102081 C2 Таблиця № 7 Виявлені борелії в біоптатах шеіри після зараження Собака № 1V 2V 3V 4V 5V 6V 7KO 8KO 9KO 7 + + + Період збору біоптатів шкіри - доба 28 60 + + Помітка Таблиця № 8 Виявлені борелії в органах Собака № 1V 2V 3V 4V 5V 6V 7KO 8KO 9KO М'яз + + + Органи, піддані схильності (розтин на 60 добу) Шкіра Лімфатичний вузол Суглобна рідина + + + + + Нирка Помітка PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- позит. PA- позит. PA- позит. Пояснення: + - позитивний результат - - негативний результат PA - патологоанатомічний розтин 5 10 15 c) Перевірка ефективності у коней: Шість коней піддавали вакцинації і ревакцинації за допомогою експериментального зразка вакцини і через 90 діб їх заражали кліщами (Ixodes ricinus), природним чином інфікованими геновидами Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii. Як контроль використали трьох коней, не підданих вакцинації. Вакцинацію, ревакцинацію, забір крові, клінічну оцінку, взяття зразків для дослідження і інші маніпуляції проводили так само як в дослідженні для кішок і собак. Одержані результати представлені в зведених таблицях № 9, 10, 11 і 12. З одержаних результатів однозначно слідує, що вакцина проти бореліозу, одержана з виробничих штамів Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, що експресують поверхневі білки OspA і OspC, є нешкідливою для коней і сприяє виробленню у них протективного імунітету проти природної кліщової інфекції всіх трьох найбільш патогенних геновидів Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, і, можливо, внаслідок перехресного імунітету, інших відомих геновидів борелії 10 UA 102081 C2 Таблиця № 9 Схема експерименту зараження – коні Зразки біологічного матеріалу після зараження/доба 7 14 28 35 42 49 56 60 Кінь № Вакцинація Ревакцинація Зараження 1V + + + B K BK K ВКР 2V + + + B K BK K BKP 3V + + + B K BK K ВКР 4V + + + B K BK K ВКР 5V + + + B K BK K ВКР 6V + + + B K BK K ВКР 7KO + B K BK K ВКР 8KO + B K BK K ВКР 9KO + B K BK K ВКР Помітка Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Щоденно в клініці Пояснення: V - вакцинація КО - не піддані вакцинації контролі + - дію виконували - - дію не виконували В - біопсія шкіри К - забір крови P - патологоанатомічний розтин Таблиця № 10 Клінічна оцінка після зараження Кінь № 1V 2V 3V 4V 5V 6V 7KO 8KO 9KO 7 Клінічні зміни після зараження - доба 14 21 28 35 42 49 56 + Пояснення: + - наявність клінічних симптомів - - відсутність клінічних симптомів 11 60 + + + Помітка Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд Щоденний клінічний огляд UA 102081 C2 Таблиця № 11 Виявлення борелії в біоптатах шкіри після зараження Кінь № 7 + + + 1V 2V 3V 4V 5V 6V 7KO 8KO 9KO Період збору біоптатів шкіри - доба 28 60 Помітка Пояснення: + - позитивний результат - - негативний результат Таблиця № 12 Виявлення борелії в органах Кінь № 1V 2V 3V 4V 5V 6V 7KO 8KO 9KO М'яз + Органи, піддані схильності (розтин на 60 добу) Шкіра Лімфатичний вузол Судинна рідина + + + + + + Нирка Помітка PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- негат. PA- позит. PA- позит. PA- позит. Пояснення: + - позитивний результат - - негативний результат PA - патологоанатомічний розтин 5 10 15 Описані приклади одержання вакцини не є єдиним способом здійснення за винаходом, але цільноклітинні бактеріальні вакцини або бактеріальні лізати або очищені сполуки, що містять імуногенні протективні білки, можна застосовувати без жодного впливу на суб'єкт за виноаходом в буферних фізіологічних розчинах або з допомогою мінерального або масляного імунологічного ад'юванту або за допомогою імунологічний комплексів (ISCOM), ліпосом і інших природних або синтетичних імунологічних ад'ювантів. Промислова застосованість Універсальну вакцину для лікування і профілактики хвороби Лайма можна застосовувати як лікарський препарат у людей і у ветеринарії і можна успішно застосовувати внутрішньом'язово, підшкірно, внутрішньошкірно або черезшкірно. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Універсальна вакцина для лікування і профілактики хвороби Лайма для застосування у ветеринарії, на основі цільноклітинної бактеріальної вакцини або бактеріальних лізатів, або очищених препаратів, причому вакцина включає три найбільш патогенних геновиди Borrelia 12 UA 102081 C2 5 10 15 20 burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii і Borrelia garinii, кожний з яких містить одночасно обидва імуногенних протективних білки зовнішньої мембрани, OspA і OspC. 2. Універсальна вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що протективні імуногенні білки зовнішньої мембрани, OspA і OspC, включені у вакцину у співвідношенні 1:1. 3. Універсальна вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що її одержують в ліофілізованій або рідкій формі або застосовують в буферному фізіологічному розчині або з мінеральним або масляним імунологічним ад'ювантом, або, можливо, з іншими імуномодулюючими засобами. 4. Універсальна вакцина за п. 2, яка відрізняється тим, що її одержують в ліофілізованій або рідкій формі або застосовують в буферному фізіологічному розчині або з мінеральним або масляним імунологічним ад'ювантом, або, можливо, з іншими імуномодулюючими засобами. 5. Універсальна вакцина за п. 1, яка відрізняється тим, що величина рН вакцини знаходиться в діапазоні від 4 до 9. 6. Універсальна вакцина за п. 2, яка відрізняється тим, що величина рН вакцини знаходиться в діапазоні від 4 до 9. 7. Універсальна вакцина за п. 3, яка відрізняється тим, що величина рН вакцини знаходиться в діапазоні від 4 до 9. 8. Універсальна вакцина за п. 4, яка відрізняється тим, що величина рН вакцини знаходиться в діапазоні від 4 до 9. 9. Спосіб виробництва універсальної вакцини для лікування і профілактики хвороби Лайма для застосування у ветеринарії за пп. 1-8, який відрізняється тим, що кожний виробничий штам борелії культивують, інактивують і незалежно перевіряють перед складанням суміші, де культура проліферує і відтворюється переважно при 26-35 °C протягом 6-18 діб на кожному етапі для експресії антигену OspA і при 36-38 °C протягом 6-18 діб на кожному етапі для експресії антигену OspC. 25 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 13