Кристалічна форма гідрохлориду 6-гідрокси-3-(4-[2-(піперидин-1-іл)етокси]фенокси)-2-(4-метоксифеніл)бензо[b]тіофену, фармацевтична композиція та спосіб одержання

1. Несольватований безводний кристалічний гідрохлорид 6-гідрокси-3-(4-[2-(піперидин-1іл)етокси]-фенокси)-2-(4-метоксифеніл)бензо [b]тіофену, який має рентгенодифракційну картину, одержану із застосуванням мідного джерела o випромінювання ( CuK ; 154056 A ), що вклю, чає щонайменше один із піків зі значеннями 2 7,3±0,2°, 15,5±0,2° і 17,6±0,2°. C2 2 76124 1 3 76124 4 інгібіторами ацетилхолінестерази (AChE). Крім того, цей винахід стосується фармацевЗастосування рентгенодифракційного дослітичної композиції, яка містить: F-V; один або кілька дження порошку (XRD), термогравіметричного фармацевтичних носіїв, розріджувачів або напованалізу (ТГА), вимірювання протонного магнітного нювачів; і факультативно стабілізаційний агент, резонансу (1Н-ЯМР) та визначення води за Карлом вибраний із групи, до якої входять метіонін, ацетиФішером (КФ) для загального дослідження арзоклцистеїн, цистеїн та гідрохлорид цистеїну; і факусифену, одержаного за методиками, описаними в льтативно естроген, факультативно прогестин, патенті '474, посвідчило, що згаданий матеріал є факультативно інгібітор ароматази, факультативгідратованим, має низький ступінь кристалічності і но аналог LHRH і факультативно інгібітор ацетилмістить у кристалічній гратці леткий органічний холінестерази (AChE). розчинник (етилацетат) у непостійній кількості. Крім того, цей винахід стосується способів заНизькокристалічні та/або аморфні матеріали, стосування F-V для інгібування патологічних стаяк правило, менш бажано застосовувати при вигонів, наприклад, фіброзу матки, ендометриту, протовленні лікарських форм, ніж висококристалічні ліферації клітин гладеньких м'язів аорти, матеріали. Аморфні сполуки мають меншу хімічну рестенозу, раку молочної залози, раку матки, раку та фізичну стабільність, оскільки вони схильні адпростати, доброякісного розростання простати, сорбувати значні кількості води. Наприклад, адсорезорбції кісток, остеопорозу, серцево-судинних рбція води аморфним матеріалом, що знаходиться захворювань, гіперліпідемії, розладів центральної в желатиновій капсулі, може спричинити усадку нервової системи (ЦНС) та хвороби Альцгеймера, або деформацію капсули внаслідок переходу вота застосування F-V для виготовлення лікарського логи з матеріалу капсули до аморфного компонензасобу для інгібування згаданих станів. та. Крім того, аморфні речовини виявляють тендеДалі, цей винахід стосується способів застосунцію до випадання в осад із розчинів, які їх вання F-V для регулювання рівня холінацетилтрамістять. В разі випадання аморфної лікарської нсферази (ChAT) та застосування F-V для виготоречовини з розчину, який використовується для її влення лікарського засобу для вищезгаданого вживання, характеристики розчинності та біодосрегулювання. тупності лікарської речовини можуть зазнати негаЦей винахід стосується також способу одертивних змін. жання F-V, який включає кристалізацію гідрохлоКрім того, як правило, небажаним є виготовриду 6-гідрокси-3-(4-[2-(піперидин-1-іл)етокси]лення фармацевтичних препаратів, які містять фенокси)-2-(4-метоксифеніл)бензо[b]тіофену із значні кількості органічного розчинника (наприкристалізаційного розчинника, вибраного із групи, клад, етилацетату) внаслідок потенціальної токсидо якої входять: метанол або водний метанол, чності розчинника для пацієнта та змін ефективноетанол та ізопропанол; і подальше висушування сті препарату в залежності від розчинника. Далі, з одержаної твердої речовини до постійної маси. точки зору технології виробництва, як правило, Короткий опис рисунків також менш бажано виготовляти некристалічні На Фіг.1 показано типовий графік ТГА для F-V. матеріали, якщо згадана технологія вимагає віддіНа Фіг.2 показано типовий графік ДСК (дифелення готового продукту шляхом фільтрування. ренційної сканувальної калориметрії) для F-V. Таке фільтрування часто значно утруднюється, На Фіг.3 показано типову рентгенодифракційну якщо матеріал, що відділяють, є некристалічним. картину для F-V. Крім того, з технологічної точки зору, як правило, F-V можна одержати шляхом висушування також небажаним є виготовлення лікарських речо(або при температурі навколишнього середовища, вин, що містять значні кількості води (гідратів), або при злегка підвищеній температурі) кристалічоскільки рівень гідратації звичайно певним чином ної твердої речовини, виділеної при температурі залежить від відносної вологості середовища, в навколишнього середовища шляхом кристалізації якому виготовляється та зберігається лікарська арзоксифену (або його будь-якої поліморфної чи речовина. Інакше кажучи, при роботі з гідратами сольватної форми) з метанолу, етанолу або ізопнепостійність ефективності звичайно є більш ропанолу, або з метанольно-водних сумішей. В складною проблемою, ніж при роботі з відповідниразі використання етанолу або ізопропанолу переми безводними формами. вага віддається вмісту води в згаданих розчинниХоча арзоксифен, одержаний за методиками, ках менше ніж 0,2% (розчинники для спектрофоописаними в патенті '474, можна застосовувати як тометрії за класифікацією Американського лікарську речовину, було б дуже бажано й доцільХімічного Товариства, A.C.S.) В разі метанольноно віднайти форму арзоксифену з підвищеним водних сумішей перевага віддається вмісту води ступенем кристалічності, яка не містила б у крисменше ніж 30% (об'ємних). Більша перевага віддаталічній гратці ні води, ні органічного розчинника і ється одержанню F-V шляхом висушування (або яку можна було б відтворювано та ефективно одепри температурі навколишнього середовища, або ржувати у промислових масштабах. при злегка підвищеній температурі) кристалічної Цей винахід стосується несольватованої безтвердої речовини, виділеної шляхом кристалізації водної кристалічної форми гідрохлориду 6з метанольно-водної суміші з об'ємною часткою гідрокси-3-(4-[2-(піперидин-1-іл)етокси]-фенокси)води від 20% до 5%. Найбільша перевага відда2-(4-метоксифеніл)бензо[b]тіофену (F-V), яка має ється одержанню F-V шляхом висушування у варентгенодифракційну картину, одержану з застокуумі при 50-70°С кристалічної твердої речовини, суванням мідного джерела випромінювання, що виділеної шляхом кристалізації арзоксифену (або включає щонайменше один із піків зі значеннями його будь-якої поліморфної чи сольватної форми) з метанольно-водної суміші з об'ємною часткою 2 7,3±0,2, 15,5±0,2, 15,9±0,2 і 17,6±0,2°. 5 76124 6 води 15%. який значно перевищує значення, знайдене для FУ типовому випадку арзоксифен розчиняють у III. метанолі (в кількості приблизно 1г речовини на Ізотерма сорбції/десорбції водяної пари для F20мл розчинника) і факультативно нагрівають із V показала збільшення маси на 0,11% в діапазоні метою сприяння розчиненню вихідного арзоксивідносної вологості 0-95%, що свідчить про стабіфену. Після досягнення розчинення розчин факульність безводної кристалічної форми і незначну льтативно концентрують до вмісту приблизно 1г схильність до адсорбції води або до перетворення розчиненої речовини в 5мл розчинника, наприв гідратну форму арзоксифену. клад, шляхом дистиляції, після чого дають розчину Картина XRD F-V відрізняється гострими пікаповільно охолоджуватися до кімнатної температуми і рівною базовою лінією, що характерно для ри. Після зниження температури до кімнатної розматеріалів високого ступеня кристалічності. Кутові чин факультативно піддають подальшому охолоположення піків на шкалі 2 і відповідні значення дженню (за допомогою бані з льодом або I/I0 для всіх піків з інтенсивностями 10% і більше холодильного пристрою) до температури в межах відносно найвищого піка для F-V представлені в від 0°С до 5°С. Після витримування протягом часу, Таблиці 1. Усі дані в Таблиці 1 подано з точністю достатнього для завершення кристалізації, крисдо ±0,2%. Хоча багатьом інтенсивним рефлексам тали F-V відділяють вакуум-фільтруванням і провідповідають значення кутів дифракції, аналогічні мивають охолодженим (приблизно до 0°С) метазначенням, які вказані для S-II, F-I та F-III, кожна зі нолом, після чого сушать у вакуумі до постійної згаданих форм має відмінну від інших порошкову маси. Перевага віддається висушуванню при злегдифрактограму, що дає можливість надійно розріка підвищеній температурі (приблизно 50°С протязняти S-II, F-I, F-III та F-V. гом 12-48год) при продуванні азотом. При одерМіж порошковими дифрактограмами F-V, зняжанні F-V у промислових масштабах може тими при різних температурах, не виявлено значвиявитися доцільним застосування затравки F-V. них відмінностей у дифракційних картинах до темДо вихідних різновидів арзоксифену, придатператури 125°С, що узгоджується із графіком ДСК, них для виконання описаної вище кристалізації, який посвідчує стабільність кристалічної форми. належать (але ними не обмежені) S-II, F-I, F-III У кристалографії добре відомо, що для даної (сольватовані та нестехіометричні гідратні кристакристалічної форми значення відносної інтенсивлічні форми арзоксифену, описані в заявках на ності дифракційних піків можуть варіювати внасліміжнародні патенти PCT/US00/16332 та док переважної орієнтації, що залежить від певних PCT/US00/16333, відомості з яких включено до чинників, наприклад, морфології та форми кристацього опису за посиланнями), арзоксифен, одерлу. В разі присутності ефектів переважної орієнтажаний за методиками, описаними в патенті '474, ції характеристики інтенсивності піків змінюються, або будь-які суміші згаданих матеріалів. Вихідна проте характерні положення піків даної поліморфформа арзоксифену не має значення, оскільки ної модифікації залишаються незмінними. Дивись, кристалізація з безводного метанолу за методинаприклад, [The United States Pharmacopeia #23, кою, описаною в цьому документі, завжди дає криNational Formulary #18, pp.1843-1844, 1995]. Крім стали F-V. того, в кристалографії також добре відомо, що для Ідентифікація F-V даної кристалічної форми кутові положення піків Для ідентифікації F-V використовувалися диможуть незначно змінюватися. Наприклад, полоференційна сканувальна калориметрія та термогження піків можуть зсуватися під впливом темперавіметричний аналіз (ДСК/ТГА), вимірювання ратури, при якій аналізується зразок, зміни полосорбції та десорбції водяної пари і порошковий ження самого зразка, а також присутності чи рентгенодифракційний аналіз (XRD). ТГА є вимівідсутності внутрішнього стандарту. В даному вирювання спричиненої нагріванням втрати маси падку змінність положення піків в межах ±0,2° на матеріалу як функції температури. Цей метод найшкалі 2 враховує ці потенціальні варіації, але не частіше застосовують для дослідження процесів заважає однозначній ідентифікації F-V. десольватації та для кількісного визначення загаДобре відомим і широко вживаним способом льного вмісту летких компонентів у твердих речопошуку кристалічних форм в літературі є метод винах. ДСК є спосіб, який часто застосовують для Фінка (Fink). В методі Фінка для початкового пошувиявлення поліморфізму сполук, оскільки темпеку використовуються чотири лінії найвищої інтенратури, при яких відбуваються фізичні зміни в масивності, а потім чотири наступні за інтенсивністю теріалі, як правило, є характерними для цього малінії. Згідно з методом Фінка, основаним на показтеріалу. Ізотерми сорбції водяної пари дозволяють никах інтенсивності піків, а також на положеннях визначити ступінь гігроскопічності певного матеріпіків, F-V може бути ідентифікований за присутнісалу та ідентифікувати його негідратні та гідратні тю піків при значеннях 2 7,3±0,2; 15,5±0,2; форми. Нарешті, XRD є спосіб, що характеризує 15,9±0,2; та 17,6±0,2° на дифракційній картині, далекий порядок у кристалічному матеріалі. одержаній з використанням мідного джерела виТиповий графік ТГА F-V показано на Фіг.1. промінювання. Присутність F-V можна додатково Термогравіметричний аналіз F-V показав відсутперевірити за піками зі значеннями 2 17,9±0,2; ність втрати маси, що свідчить про несольватова18,2±0,2; 18,9±0,2; та 21,5±0,2° на дифрактограмі, ний характер виділеної кристалічної форми. Анаодержаній з використанням мідного джерела виліз методом ДСК показав різкий ендотермічний пік промінювання. плавлення при 174-175°С, який видно на Фіг.2, 7 76124 8 Таблиця 1 Кут 2 7,3 9,0 10,0 12,8 14,6 15,5 15,9 Відносна інтенсивність 45 22 10 39 15 50 64 Кут 2 17,6 17,9 18,2 18,9 19,8 21,5 F-V має кілька переваг над відомими формами арзоксифену, описаними в патенті '474, і над формами F-I та F-III, описаними в заявках РСТ, включених до цього опису вищенаведеними посиланнями. У порівнянні з арзоксифеном, одержаним за методиками, розкритими в '474, F-V є більш стабільним при температурі навколишнього середовища і, отже, більш придатним для фармацевтичних розробок, тобто, для розробки дозованих лікарських форм. Крім того, на відміну від форми, розкритої в '474, F-V має високий ступінь кристалічності. Кристалічні матеріали, як правило, є менш гігроскопічними та більш стабільними (наприклад, менш схильними до хімічного розкладу, що сприяє підтриманню відповідної ефективності) у порівнянні з аморфними матеріалами і, таким чином, є більш бажаними формами при виготовленні лікарських форм. Крім того, на відміну від одержаної за методиками, розкритими в '474, форми арзоксифену, яка містить у кристалічній гратці етилацетат і воду, F-V не містить жодної з цих домішок. На відміну від S-II, F-I та F-III, F-V є дійсно безводною формою арзоксифену, яка не виявляє схильності до адсорбції води при змінах відносної вологості. Крім того, кристалічна гратка F-V залишається стабільною аж до своєї температури плавлення. Далі, F-V має приблизно на 10% вищу розчинність у воді у порівнянні з F-III і найвищу термодинамічну стабільність серед відомих форм арзоксифену. Методи ідентифікації Аналіз методом ДСК виконували з застосуванням приладу 2920 (виробник ТА Instruments), обладнаного автоматичним пристроєм подавання проб та охолоджувальним пристроєм із холодильною системою. Пробу вміщували в відбортований алюмінієвий бюкс, закривали кришкою за допомогою обтискних щипців і аналізували, використовуючи порожній бюкс як зразок порівняння. Тепловий потік вимірювали після врівноважування при 30°С. Швидкість нагризання становила 5°С/хв до 300°С. Графік теплового потоку як функції температури інтегрували для ідентифікації будь-яких ендотермічних або екзотермічних явищ. Аналіз методом ТГА виконували з застосуванням приладу 2950 (виробник ТА Instruments), обладнаного автоматичним пристроєм подавання проб. Пробу вміщували в попередньо зважений алюмінієвий бюкс і підвищували температуру від температури навколишнього середовища до 300°С зі швидкістю 10°С/хв. Графік маси (вираженої в процентах) як функції температури інтегрували Відносна інтенсивність 72 83 56 82 27 100 Кут 2 22,6 23,3 24,4 25,8 27,4 28,2 Відносна інтенсивність 19 20 46 38 32 18 для визначення проценту втрати маси. Ізотерми сорбції водяної пари одержували з застосуванням проточного приладу VTI SGA-100. Проби аналізували при 25°С, змінюючи відносну вологість (RH) від 0% до 95% при адсорбції і від 95% до 5% при десорбції. Ізотерми адсорбції та десорбції одержували у формі графіків зміни маси проби (в процентах) від RH (в процентах). Картини дифракції рентгенівського проміння на порошкових пробах одержували з застосуванням порошкового дифрактометра D5000 (виробник Siemens), обладнаного джерелом випромінювання СuK ( =1,54056), який працював при 50кВ і 40мА, та твердотільним Si(Li) детектором Kevex. Сканування зразків виконували в діапазоні значень 2 від 4° до 35° із кроком 0,04° при витримці 2,5с на кожному кроці. Сухі порошки завантажували в виїмки тримачів зразків із верхнім завантаженням і одержували гладку поверхню, застосовуючи скляну ковзну пластину. Картини дифракції рентгенівського проміння на порошкових пробах при змінних температурах одержували з застосуванням порошкового дифрактометра D5000 (виробник Siemens), обладнаного джерелом випромінювання СuK ( =1,54056), який працював при 50кВ і 40мА, та сцинтиляційним детектором і нікелевим фільтром. Порошок завантажували в виїмку тримача зразка з верхнім завантаженням та регулятором температури, і вирівнювали поверхню для дифракції. Сканування зразка виконували в діапазоні значень 2 від 2° до 35° із кроком 0,04° при витримці 2,5с на кожному кроці, починаючи з температури 25°С, після витримування протягом 5хв для врівноваження. Подальші операції сканування виконували при температурах, які підвищували із кроком 25°С до максимального значення 125°С. Подані нижче приклади додатково ілюструють способи одержання F-V. Ці приклади не призначені для обмеження будь-яким чином обсягу згаданих способів і не повинні розглядатися як обмежувальні. Приклади Приклад 1 Кристалізація з метанолу без концентрування Зразок арзоксифену масою 20,00г змішували з 500мл безводного метанолу (ступеня чистоти "для РХВЕ") і нагрівали зі зворотним холодильником до кипіння. Тверда речовина повністю розчинялася, утворюючи однорідний світло-жовтий розчин. Охолоджували розчин до температури нижче точки кипіння і додавали ще 5,00г арзоксифену. Знов 9 76124 10 нагрівали розчин до кипіння для забезпечення тури 0°С. Перемішували суспензію кристалів пророзчинення всієї твердої речовини. Давали розчитягом ночі при 0°С, після чого фільтрували на одну повільно охолоджуватися при перемішуванні. нопластинному фільтрпресі. З метою видалення При температурі 50°С в розчин вносили як затраввсього продукту із кристалізаційного апарата маку кілька міліграмів попередньо одержаної солі Fточний розчин використовували для промивання V. Суспензії кристалів давали охолоджуватися від апарата і знов пропускали промивну рідину через 50°С до 35°С протягом 1,25год. На цей момент прес. Вологий осад промивали у фільтрі 11,3л суміш містила значну кількість білої твердої речометанолу, попередньо охолодженого до 0°С. Осад вини. Суспензію при перемішуванні вміщували в сушили, створюючи в пресі вакуум і забезпечуючи баню з льодом і перемішували ще протягом 3 год. циркуляцію води з температурою 50°С через обоФільтрували суспензію через паперовий фільтр лонку преса. Через приблизно 24год починали "Ватман №1" і промивали білий осад 50мл метаподавати в прес слабкий потік азоту. Загальна нолу, попередньо охолодженого до 0°С. Вологий тривалість сушіння приблизно 36год. Вихід 2,588кг осад сушили у вакуумі при 50°С протягом прибли(86,27%); ступінь чистоти за даними РХВЕ 92,7% зно 48год при продуванні слабким потоком азоту. (в розрахунку на вільну основу), TRS 0,39%. Вихід 15,94г (63,8%). Ступінь чистоти за даними Приклад 4 РХВЕ 89,4% (в розрахунку на вільну основу), загаКристалізація з етанолу льний вміст споріднених речовин (TRS) 0,28%. Етанол високої чистоти (250мл) і арзоксифен Зіставлення маси продукту до і після висушування (10,0г) змішували і нагрівали до кипіння зі зворотпоказало, що вихідний вологий осад містив 65% ним холодильником для забезпечення розчиненрозчинника. ня. Розчину давали охолодитися до температури Приклад 2 навколишнього середовища протягом 3год; в цей Кристалізація з метанолу з концентруванням час утворювався білий кристалічний осад. Тверду Зразок арзоксифену масою 25,00г змішували з речовину відділяли фільтруванням і сушили у ва500мл безводного метанолу (ступеня чистоти "для куумі протягом ночі при 50°С із продуванням слабРХВЕ") і нагрівали зі зворотним холодильником до ким потоком азоту. Вихід 5,50г, т.пл. 173°С (за дакипіння. Тверда речовина повністю розчинялася, ними ДСК). Одержана порошкова утворюючи однорідний світло-жовтий розчин. Цей рентгенодифрактограма цього зразка практично розчин концентрували шляхом видалення 375мл ідентична дифрактограмі F-V, представленій на дистиляту під атмосферним тиском. На цей моФіг.3. мент реакційна суміш являла собою прозорий одПриклад 5 норідний розчин жовтого кольору. Припиняли киКристалізація з ізопропанолу п'ятіння і в розчин вносили як затравку кілька Безводний ізопропанол (250мл) і арзоксифен міліграмів попередньо одержаної солі F-V. Після (10,0г) змішували і нагрівали до кипіння зі зворотвнесення затравки суміші при повільному переміним холодильником для забезпечення розчиненшуванні давали охолодитися до температури наня. Віддаляли джерело тепла і вносили в розчин вколишнього середовища протягом 1год. На прояк затравку кілька міліграмів F-V. Реакційній суміші тязі охолодження утворювалася значна кількість давали охолодитися до температури навколишбілого осаду. Суспензію вміщували в баню з льонього середовища і перемішували протягом ночі; в дом і перемішували ще протягом 3год. Фільтрувацей час утворювався білий осад. Тверду речовину ли суспензію через паперовий фільтр "Ватман відділяли фільтруванням; одержано 12,11г волого№1" і промивали білий осад 50мл метанолу, попего осаду. Пробу цього осаду масою 4,01г сушили редньо охолодженого до 0°С. Вологий осад сушипротягом ночі при 60°С у вакуумі із продуванням ли у вакуумі при 50°С протягом приблизно 48год слабким потоком азоту. Вихід 2,72г, т.пл. 171,5°С при продуванні слабким потоком азоту. Вихід (за даними ДСК). Одержана порошкова рентгено22,44г (89,8%). Ступінь чистоти за даними РХВЕ дифрактограма цього зразка практично ідентична 91,3% (в розрахунку на вільну основу), TRS 0,26%. дифрактограмі F-V, представленій на Фіг.3. Зіставлення маси продукту до і після висушування Приклад 6 показало, що вихідний вологий осад містив 31,5% Одержання з вільної основи арзоксифену розчинника. Арзоксифен - вільну основу (5,07г) суспендуПриклад 3 вали в 65,0мл метанолу. Додавали до реакційної Перекристалізація з метанолу в масштабі 30 суміші розчин 1,41мл концентрованої хлористовогалонів (113л) дневої кислоти в 10,0мл води. Нагрівали реакційну Зразок арзоксифену масою 3,08кг змішували з суміш до 55°С протягом 15хв для забезпечення 60л безводного метанолу (ступеня чистоти "для розчинення. Охолоджували реакційну суміш до РХВЕ") і нагрівали зі зворотним холодильником. 30°С і вносили як затравку 50мг F-V. ОхолоджуваТверда речовина повністю розчинялася, утворююли реакційну суміш до 10°С зі швидкістю 1°С/год і чи однорідний світло-жовтий розчин. Цей розчин перемішували при цій температурі протягом 8год. концентрували шляхом видалення 40л дистиляту Тверду речовину відділяли фільтруванням, пропід атмосферним тиском. На цей момент реакціймивали метанолом, попередньо охолодженим до на суміш являла собою прозорий однорідний роз10°С, і сушили у вакуумі при 50°С протягом ночі чин жовтого кольору. Охолоджували масу для при продуванні слабким потоком азоту. Вихід 4,42г припинення кипіння і при температурі приблизно (87,7%); ступінь чистоти за даними РХВЕ 99,7%; 40°С відкривали люк для перевірки кристалізації. TRS 0,32%. Одержана порошкова рентгенодифраСпостерігали кристали і продовжували охолоктограма цього зразка практично ідентична дифдження зі швидкістю 12°С/год до кінцевої темперарактограмі F-V, представленій на Фіг.3. 11 76124 12 Корисність тому числі, наприклад, госерлін (ZOLADEX ), леуТермін "ефективна кількість" у значенні, вжипролід (LUPRON ) тощо. ваному в цьому описі, означає кількість F-V, здатТермін "інгібітор АСhЕ" у значенні, вживаному ну інгібувати патологічні стани, згадані в описі, або в цьому описі, охоплює сполуки, які інгібують ацеїхні шкідливі впливи. Якщо F-V вживається в комтилхолінестеразу, наприклад, фізостигмінбінації з естрогеном, прогестином, інгібітором саліцилат, такрин-гідрохлорид, донепезилароматази, аналогом LHRH або інгібітором АСhЕ, гідрохлорид тощо. то термін "ефективна кількість" означає також кіТермін "підвищувальне регулювання ChAT" лькість такого агента, здатну спричинити відповідозначає підвищення ензиматичної активності ний очікуваний ефект. ChAT, тобто сприяння перетворенню холіну в ацеТерміни "інгібувальний", "інгібувати" вживатилхолін. Це сприяння може включати підвищення ються в їхньому загальноприйнятому значенні, ефективності та/або швидкості реакції ChAT із хотобто вони стосуються запобігання, протидії, обліном та/або збільшення кількості ChAT, присутмеження, полегшення, покращення, уповільнення, ньої на місці дії. Це збільшення кількості ензиму припинення або зміни на протилежний напрямок може бути зумовлене генним регулюванням або розвитку або тяжкості патологічного стану, згадаіншою синтетичною стадією утворення ензиму ного в описі, або його наслідків. та/або зменшенням інтенсивності деактивації та Терміни "запобіжний", "запобігання", "профіламетаболізму ензиму. ктика", "профілактичний" та "запобігати" вживаВибрані методики досліджень ються в цьому описі як еквівалентні і стосуються Загальна методика підготовки пацюків: Самок зниження імовірності виникнення або розвитку в пацюків лінії Sprague-Dawley у віці 75 днів (діапапацієнта, який вживає F-V, будь-якого з патологічзон маси тіла від 200г до 225г) (якщо не обумовних станів, згаданих в описі, або його наслідків. лене супротивне) одержували від фірми "Чарльз Терміни "естроген-дефіцитний" та "естрогенна Рівер" (Charles River Laboratories, Portage, MI). У недостатність" стосуються стану, який виник припостачальника тварин піддавали або двосторонній родним шляхом або викликаний клінічно, при якооваріектомії (OVX), або хірургічній операції за Шаму організм жінки не може продукувати ендогенні мом (Sham) і надавали для дослідів через тиждень естрогенні гормони в кількості, достатній для підтпісля операції. Після прибуття тварин розміщували римання естроген-залежних функцій, наприклад, в металевих підвісних клітках групами по 3-4 тваменструацій, гомеостазу маси кісток, нейронних рини і забезпечували вільний доступ до корму функцій, стану серцево-судинної системи тощо. (вміст кальцію приблизно 0,5%) та води протягом Такі ситуації естрогенної недостатності виникають тижня. В приміщенні підтримували температуру при менопаузі та внаслідок хірургічної або хімічної 22,2±1,7°С і відносну вологість щонайменше 40%. оваріектомії, в тому числі її функціональних еквіСвітловий режим приміщення: 12год освітлення і валентів, наприклад, терапії з застосуванням інгі12год темряви. біторів ароматази, агоністів або антагоністів Режим дозування та збирання тканин: Після GnRH, ICI 182780 тощо, але не тільки в цих випадоднотижневого періоду акліматизації (тобто, через ках. До хворобливих станів, пов'язаних з естроген2 тижні після OVX) починали щоденно вводити в дефіцитним станом, належать резорбція кісток, організм тварин F-V. 17ос-етинілестрадіол або F-V остеопороз, серцево-судинні захворювання та вводили перорально, якщо не обумовлене інше, у гіперліпідемія, але не тільки ці стани. формі суспензії в 1%-ній карбоксиметилцелюлозі Термін "естроген" у значенні, вживаному в або розчину в 20%-ному циклодекстрині. Дози рецьому описі, охоплює стероїдні сполуки, що мають човин вводили тваринам щоденно протягом 4 днів. естрогенний ефект, наприклад, 17 -естрадіол, Після завершення дозування тварин зважували, естрон, кон'югований естроген (Premarin ), кінсьанестезували сумішшю кетаміну з ксилазином (2:1 за об'ємом) і відбирали пробу крові шляхом серкий естроген, 17 -етинілестрадіол тощо. Серед цевої пункції. Потім тварин умертвляли, викликаюпродуктів на основі естрогену перевага віддається чи асфіксію дією СO2, видаляли матку через розріз продуктам, відомим під назвами Premarin та нопо середній лінії тіла і визначали масу вологої маретилнодрел. тки. 17 -етинілестрадіол одержували від фірми Термін "прогестин" у значенні, вживаному в "Сігма" (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). цьому описі, охоплює сполуки, що мають прогестаСерцево-судинні захворювання/Гіперліпідемія генну активність, наприклад, прогестерон, норетиПроби крові, одержані, як описано вище, залнодрел, нонгестрел, мегестрол-ацетат, норетинлишали для згортання на 2год при кімнатній темдрон тощо. Перевага серед продуктів на основі пературі і одержували сироватку шляхом центрипрогестину віддається норетиндрону. фугування при 3000об/хв протягом 10хв. Термін "інгібітор ароматази" у значенні, вжиХолестерин у плазмі визначали, застосовуючи ваному в цьому описі, охоплює сполуки, здатні високоефективну пробу на холестерин "Берінгер інгібувати ароматазу, наприклад, комерційно досМаннгейм Діагностикс" (Boehringer Mannheim тупні інгібітори, наприклад, аміноглютемід Diagnostics). Коротко кажучи, суть проби полягає в (CYTANDREN ), Анастразол (ARIMIDEX ), Летротому, що холестерин окиснюють в холест-4-ен-3зол (FEMARA ), Форместан (LENATRON ), Ексеон, причому утворюється пероксид водню. Цей местан (AROMASIN ) тощо. пероксид водню потім вводять в реакцію з феноТермін "аналог LHRH" у значенні, вживаному в лом і 4-амінофеназоном у присутності пероксидацьому описі, означає аналог гормону виділення зи; при цьому утворюється n-хінонімінний барвник, лютеїнізуючого гормону, який інгібує секрецію есткількість якого вимірюють спектрофотометричним рогену у жінок в передклімактеричний період, в 13 76124 14 способом на довжині хвилі 500нм. Потім розрахоніх запасів стероїдів. Клітини MCF-7 видаляли зі вують концентрацію холестерину, застосовуючи склянок для зберігання з застосуванням середостандартну криву. Усе дослідження автоматизовавища дисоціації клітин (вільне від Са++ та Mg++ не завдяки використанню системи "Байотек" середовище HBSS (без фенолового червоного), (Biotek Automated Workstation). доповнене 10мМ HEPES і 2мМ ЕДТА). Двічі проПроба на еозинофіл-пероксидазу (ЕРО) ν мивали клітини досліджуваним середовищем і матці встановлювали концентрацію 80000клітин/мл. Матки, одержані, як описано вище, до аналізу Приблизно 100мкл (8000клітин) вміщували в плосна ензим зберігали при 4°С. Потім матки гомогенікодонні лунки для мікрокультур (Costar 3596) і інзували в 50-кратному об'ємі Трис-буферу (рН 8,0), кубували при 37°С в атмосфері 5%-ного СО2 і підякий містив 0,005% Тритон Х-100. Після додавання вищеної вологості протягом 48год для 0,01% пероксиду водню і 10мМ о-фенілендіаміну забезпечення адгезії клітин і врівноважування піс(кінцеві концентрації) в Трис-буфері вимірювали ля переносу. Готували серії розчинів лікарських зростання поглинання на довжині хвилі 450нм речовин та ДМСО як контрольного розріджувача в протягом 1хв. Присутність еозинофілів у матці є досліджуваному середовищі і додавали до мікроознакою естрогенної активності сполуки. На початкультур по 50мкл цих розчинів (по три паралельні ковій, лінійній частині кривої реакції визначали досліди для кожної речовини), а потім по 50мкл максимальну швидкість за 15-секундний інтервал. випробувального середовища до загального об'єМетодика дослідження на інгібування резорбму 200мкл. Після додаткового витримування при ції кісток (остеопорозу) 37°С в атмосфері 5%-ного СО2 і підвищеної волоПісля загальної процедури підготовки тварин, гості мікрокультури обробляли тимідином, міченим описаної вище, пацюкам вводили в організм витритієм (1мкКі/лунку) протягом 4год. Культивуванпробовувані сполуки щоденно протягом 35 днів (по ня припиняли шляхом заморожування при -70°С 6 пацюків у кожній досліджуваній групі) і на 36-й протягом 24год з подальшим відтаванням і збидень умертвляли тварин, викликаючи асфіксію ранням мікрокультур за допомогою напівавтомаСО2. 35-денній період є достатнім для максимальтичного збирача клітин "Скатрон" (Skatron ної втрати густини кісток, яку вимірюють, як описаSemiautomatic Cell Harvester). Радіоактивність но в цьому документі. Після умертвіння матки непроб визначали шляхом рахування сцинтиляцій гайно видаляли, відсікали від сторонніх тканин і рідини з застосуванням лічильника -частинок видаляли з них рідкий вміст перед визначенням типу "Уоллак Бетаплейс" (Wallac BetaPlace). маси у вологому стані з метою підтвердження деІнгібування пухлини молочної залози, індукофіциту естрогену, пов'язаного з повною оваріектованої DMBA мією. Реакцією на оваріектомію звичайно є зменЕстроген-залежні пухлини молочної залози шення маси матки приблизно на 75%. Потім матки одержували на самках пацюків лінії Spragueвміщували в 10%-ний нейтралізований буфером Dawley, придбаних у фірми "Гарлан Індастріз" формалін для подальшого гістологічного дослі(Harlan Industries, Indianapolis, Indiana). У віці придження. близно 55 днів тваринам одноразово вводили пеВирізували праве стегно і генерували та анарорально 20мг 7,12-диметилбенз[а]антрацену лізували їхні рентгенівські зображення в цифровій (DMBA). Приблизно через 6 тижнів після введення формі, застосовуючи програму аналізування зоDMBA молочні залози з тижневими інтервалами браження (зображення ΝΙΗ) при дистальному медосліджували пальпацією для виявлення пухлин. тафізі. Вигляд проксимальної зони великої гомілВ разі виявлення однієї або кількох пухлин вимікової кістки цих тварин також аналізували рювали найбільший та найменший поперечник способом кількісної комп'ютерної томографії. Згідкожної пухлини за допомогою метричного кронцино з описаною вище методикою, піддослідним ркуля, реєстрували результати вимірювання і відтваринам вводили перорально F-V або етинілестбирали тварину для дослідження. Було зроблено радіол (ЕЕ2) в 20%-ному гідроксипропіл- спробу рівномірно розподілити різні розміри пухциклодестрині. F-V корисний також в комбінації з лин між дослідними та контрольними групами тваестрогеном або прогестином. рин так, щоб пухлини середнього розміру еквіваДослідження на проліферацію MCF-7 лентно розподілялися між досліджуваними Клітини аденокарциноми молочної залози групами. Контрольні та дослідні групи в кожному MCF-7 (ATCC НТВ 22) зберігали в MEM (мінімальексперименті включали від 5 до 9 тварин. ному основному середовищі, вільному від феноF-V вводили або шляхом внутрішньоочерелового червоного, виробник - фірма "Сігма"), довинної ін'єкції в 2%-ному гуміарабіку, або перораповненому 10% (об'єм.) сироватки плоду корови льно. Для перорального введення сполуки розчи(FBS), L-глутаміном (2мМ), піруватом натрію няли або суспендували в 0,2мл кукурудзяної олії. (1мМ), HEPES (К-[2-гідроксіетил]піперазин-N'-2Кожний препарат, в тому числі контрольні дози етансульфокислота) (10мМ), замінними амінокисгуміарабіку або кукурудзяної олії, вводили один лотами та бичачим інсуліном (1мкг/мл) (середораз на день кожній піддослідній тварині. Після повище для підтримування в життєздатному стані). чаткового вимірювання пухлини та відбирання За 10 днів до випробування клітини MCF-7 перепіддослідних тварин пухлини вимірювали вищеносили в середовище для підтримування в життєзгаданим методом щотижня. Лікування та обмірюздатному стані, доповнене замість 10% FBS 10% вання тварин тривало 3-5 тижнів, після чого висироватки плоду корови, очищеного активним вузначали кінцеву площу пухлин. Для кожної сполуки гіллям із декстрановим покриттям (DCC-FBS) (доі для контрольних тварин визначали зміну середсліджуване середовище), для видалення внутрішньої площі пухлини. 15 76124 16 Методики випробувань при фіброзі матки вий цикл у всіх тварин. В день проеструсу кожну Тест 1: Жінкам, що страждали на фіброз матки самку піддавали хірургічній операції. Самкам кож(від 3 до 20 осіб) вводили F-V. Кількість введеної ної групи видаляли лівий ріг матки, розсікали на сполуки становила від 0,1мг до 1000мг на день, а дрібні квадратні частинки і ці квадрати закріпляли період застосування становив 3 місяці. Жінок спослабкими швами в різних місцях поблизу кровотостерігали в період застосування F-V і протягом 3 ку брижі. Крім того, самкам групи 2 видаляли яєчмісяців після припинення застосування для виявники. Починаючи з наступного після операції дня, лення впливу F-V на фіброз матки. тварини груп 1 і 2 одержували внутрішньоочереТест 2: Застосовували ту ж методику, що в Тевинні ін'єкції води протягом 14 днів, а тваринам сті 1, але період застосування становив 6 місяців. групи 3 виконували внутрішньоочеревинні ін'єкції Тест 3: Застосовували ту ж методику, що в ТеF-V в кількості 1,0мг на кілограм маси тіла протясті 1, але період вживання становив 1 рік. гом того ж періоду. Після 14-денного оброблення Тест 4: Для індукування лейоміом у статево кожну самку умертвляли, видаляли експлантати зрілих самок морських свинок застосовували довендометрію, надниркові залози, залишки матки та готривалу естрогенну стимуляцію. Тваринам ввояєчники (при їх наявності) і готували з них препадили естрадіол 3-5 разів на тиждень шляхом ін'єкрати для гістологічного дослідження. Яєчники та цій протягом 2-4 місяців або до виникнення надниркові залози зважували. пухлин. Проводили лікування, що включало ввеТест 2: Як піддослідних тварин використовудення F-V або носія, щоденно протягом 3-16 тижвали від двадцяти до тридцяти дорослих самок нів, після чого тварин умертвляли, видаляли матки пацюків лінії CD. Тварин розділяли на дві групи і досліджували їх для виявлення регресії пухлин. однакової чисельності. Просліджували тічковий Тест 5: В очеревинну порожнину та/або в міоцикл у всіх тварин. В день проеструсу кожну самку метрій матки статево зрілих, кастрованих самок піддавали хірургічній операції. Самкам кожної груголих мишей імплантували тканину лейоміом люпи видаляли лівий ріг матки, розсікали на дрібні дини. Для індукування росту імплантованої тканиквадратні частинки і ці квадрати закріпляли слабни вводили екзогенний естроген. В деяких випадкими швами в різних місцях поблизу кровотоку ках виділені клітини пухлин перед імплантацією брижі. Починаючи приблизно з 50-го дня після культивували in vitro. Проводили лікування, що операції, тварини групи 1 одержували внутрішньовключало введення F-V або носія шляхом промиочеревинні ін'єкції води протягом 21 дня, а тваривання шлунка, щоденно протягом 3-16 тижнів, піснам групи 2 виконували внутрішньоочеревинні ля чого тварин умертвляли, видаляли імплантати і ін'єкції F-V в кількості 1,0мг на кілограм маси тіла досліджували їх для виявлення росту або регресії. протягом того ж періоду. Після 21-денного обробПри умертвінні видаляли матки для оцінювання лення кожну самку умертвляли, видаляли експластану цього органу. нтати ендометрію та надниркові залози і зважуваТест 6: Тканини фіброїдних пухлин матки люли. Експлантати вимірювали для виявлення росту. дини виділяли і зберігали in vitro як первинні неПросліджували тічкові цикли. трансформовані культури. Одержані хірургічним Тест 3: Для індукування ендометриту у пацюшляхом зразки протирали через стерильну сітку ків та/або кроликів використовували автотранспабо сито, або відділяли від оточуючої тканини для лантати тканини ендометрію. Самок тварин в реодержання суспензії одного виду клітин. Ці клітини продуктивному віці піддавали двосторонній зберігали в середовищі, яке містило 10% сироватоваріектомії і постачали їм екзогенний естроген, ки та антибіотик. Визначали швидкість росту у забезпечуючи таким чином специфічний і постійприсутності та у відсутності естрогену. Випробовуний рівень гормону. Автогенну тканину ендометрію вали клітини на здатність продукувати компонент імплантували в очеревину 5-150 тварин і постачаС3 комплементу та на реакцію на фактори росту і ли їм естроген для індукування росту експлантогормон росту. Для культур in vitro оцінювали прованої тканини. Лікування сполукою за цим винахоліферативну реакцію після оброблення прогестидом здійснювали шляхом введення в шлунок нами, GnRH, F-V та носієм. Щотижня оцінювали (промивання) щоденно протягом 3-16 тижнів, після рівень рецепторів стероїдних гормонів для визначого імплантати видаляли і вимірювали для виявчення ступеня збереження важливих характерислення росту або регресії. Після умертвіння непотик клітин in vitro. Використовували проби тканин шкоджений ріг матки видаляли для оцінки стану від 5-25 пацієнтів. ендометрію. Тест 7: Здатність F-V інгібувати стимульовану Тест 4: В очеревинну порожнину статево зріестрогенами проліферацію ліній клітин ELT, що є лих, кастрованих самок голих мишей імплантували похідними лейоміом, визначали в основному за уражену тканину з ендометрію людини. Для індуметодикою, описаною Фукс-Янгом та іншими в кування росту імплантованої тканини вводили екроботі "Інгібування стимульованого естрогенами зогенний естроген. В деяких випадках виділені росту лейоміом матки селективними модулятораклітини ендометрію перед імплантацією культивуми рецепторів естрогенів" [Fuchs-Young et al., МоI. вали in vitro. Проводили лікування, що включало Car., 17(3): 151-159, 1996], відомості з якої вклювведення F-V в шлунок шляхом промивання, щочені до цього опису за посиланням. денно протягом 3-16 тижнів, після чого видаляли Методика випробувань при ендометриті імплантати і вимірювали їх для виявлення росту Тест 1: Як піддослідних тварин використовуабо регресії. При умертвінні видаляли матки для вали від двадцяти до тридцяти дорослих самок оцінювання стану неушкодженого ендометрію. пацюків лінії CD. Тварин розподіляли по трьох груТест 5: Тканини ураженого ендометрію людипах однакової чисельності. Просліджували тічкони виділяли і зберігали in vitro як первинні нетран 17 76124 18 сформовані культури. Одержані хірургічним шляфічних груп месенджер-РНК (полі-А+). Реакції лахом зразки протирали через стерильну сітку або нцюгових полімераз (PCR) виконували в суміші, сито, або відділяли від оточуючої тканини для яка складалася з: випадкових 5'-олігонуклеотидів одержання суспензії одного виду клітин. Ці клітини (10 основних пар у довжину; всього 150), реакційзберігали в середовищі, яке містило 10% сироватного буферу, Taq-полімерази та 32PdTCP. ки та антибіотик. Визначали швидкість росту у Після 40 циклів підсилення продукти реакції присутності та у відсутності естрогену. Випробовуфракціонували за розмірами на гелі 6% ТВЕвали клітини на здатність продукувати компонент сечовини, сушили і використовували для експонуС3 комплементу та на реакцію на фактори росту і вання рентгенівської плівки. Одержані зображення гормон росту. Для культур in vitro оцінювали пророзподілу месенджер-РНК для різних груп тварин ліферативну реакцію після оброблення прогестипорівнювали між собою. нами, GnRH, F-V та носієм. Щотижня оцінювали Застосування F-V в комбінації з естрогеном рівень рецепторів стероїдних гормонів для визнаЖінкам в клімактеричному та постклімактеричення ступеня збереження важливих характерисчному періоді часто призначають гормонозаміщутик клітин in vitro. Використовували проби тканин вальну терапію (HRT) для боротьби з негативними від 5-25 пацієнтів. наслідками, пов'язаними з різким зниженням цирРозлади центральної нервової системи (ЦHС), кулюючого ендогенного естрогену, наприклад, для в тому числі хвороба Альцгеймера лікування "припливів". HRT, однак, пов'язана з підвищеним ризиком виникнення деяких форм Естрогени, наприклад, 17 -естрадіол, регулюраку, в тому числі раку матки та молочної залози. ють транскрипцію генів шляхом зв'язування з реДля зниження такого ризику можна застосовувати цепторами естрогенів (ER), які знаходяться в циF-V в комбінації з HRT. топлазмі певних видів клітин. Активація ER Застосування F-V в комбінації з інгібітором лігандами є передумовою для ядерного транспорароматази ту цього комплексу, при цьому зв'язування з посліЗа визначенням, яєчники у жінок в постклімакдовністю консенсусу паліндромної ДНК, яка містеричному періоді не функціонують. Єдиним джетить 13 базових пар (елемент реакції на естроген, релом естрогену в організмі в цьому разі є перетERE) починає побудову транскрипційного апарату, ворення андрогенів, що виділяються кульмінацією якого є активація відповідних генів наднирковими залозами, під впливом ензиму аромішені. Виявлені різноманітні гени, які регулюютьматази, який знаходиться в периферичних тканися естрогенами. До них належать цитоскелетні нах (в тому числі жирових, м'язових і в самій пухпротеїни, нейротрансмітерні ензими біосинтезу та лині молочної залози). Таким чином, лікарські метаболізму, а також інші гормони та нейропептизасоби, які інгібують ароматазу (інгібітори аромади. Елементи ERE виявлено в багатьох естрогентази), знижують рівень естрогену в організмі жінки реактивних генах; до них належать вітелогенін, cв постклімактеричному періоді. Зниження рівня fos, пролактин та лютеїнізуючий гормон. естрогену за допомогою інгібування ароматази є Подібні до ERE послідовності, які мають важважливим варіантом лікування пацієнтів з метасливе значення для центральної нервової системи, татичним раком молочної залози. В процесі терапії виявлено в р75тngr та trkA, які є сигнальними молеінгібітором ароматази недостача циркулюючого кулами для нейротрофінів: фактора росту нервоестрогену може спричинити неочікувані негативні вої тканини (NGF), фактора росту нервової тканипобічні ефекти, наприклад, впливати на рівень ни мозкового походження (BDNGF) та ліпідів у сироватці. Для пригнічення цих негативнейротрофіну- 3. них ефектів можна застосовувати F-V. Показано, що BDNGF, як і NGF, сприяє вижиЗастосування F-V в комбінації з аналогом ванню холінергічних нейронів у культурі тканини. LHRH Припускається, що якщо взаємодії між нейротроБезперервна дія аналога LHRH (гормону вивіфінами та естрогенами мають важливе значення льнення лютеїнізуючого гормону) інгібує секрецію для розвитку та виживання базальних нейронів естрогену у жінок в передклімактеричному періоді переднього мозку (які зазнають дегенерації при внаслідок десенсибілізації гіпофізу, який в такому хворобі Альцгеймера), то клінічні стани, в яких разі втрачає здатність стимулювати секрецію естприсутній дефіцит естрогену (наприклад, в менорогену яєчниками. Клінічним наслідком цього явипаузі), можуть сприяти втраті таких нейронів. ща є "медична оваріектомія", ознаки якої зникають На пацюках, підданих оваріектомії (підготовпісля припинення вживання аналога LHRH. В пролених, як описано вище), проведено описаний цесі терапії аналогом LHRH недостача циркулююнижче дослід для визначення аналогій та/або відчого естрогену може спричинити неочікувані негамінностей між F-V і естрогеном із точки зору вплитивні побічні ефекти, наприклад, впливати на ву на експресію генів у різних областях мозку. Парівень ліпідів у сироватці. Для пригнічення цих цюкам у віці 6 тижнів щоденно вводили шляхом негативних ефектів можна застосовувати F-V. підшкірних ін'єкцій естрадіол-бензоат (0,03мг/кг), Підвищення рівня ацетилхоліну F-V або носій (контроль). Після 5-тижневого оброВідомо, що пацієнти, що страждають на хвоблення тварин умертвляли, видаляли мозки і збиробу Альцгеймера, мають значно знижений рівень рали гіпокампи шляхом мікровідсікання. Гіпокампи холінергічних нейронів у гіпокампі у порівнянні з швидко заморожували в рідкому азоті і зберігали людьми того ж віку, що не страждають на цю хвопри -70°С. Із накопиченої тканини тварин піддосліробу. Виявлено, що поступова втрата цих холінердних і контрольних груп добували всю ДНК і піддагічних нейронів відображає поступову втрату павали її зворотній транскрипції, застосовуючи 3'м'яті та пізнавальної функції у цих пацієнтів. олігонуклеотидний праймер, вибраний для специ 19 76124 20 Вважається, що одною із причин втрати цих ней50мМ NaCl і до якого додатково додано 1мг/мл ронів є втрата або послаблення функції нейротраяєчного альбуміну (TEGO). F-V розводили в TEGO нсмітера, яким є ацетилхолін. до концентрації 20нМ, із цього розчину готували Рівень ацетилхоліну в нейроні визначається, послідовним розведенням три досліджувані розголовним чином, станом рівноваги між його біосичини. Дослідження проводили в круглодонних понтезом та біорозкладом. За синтез ацетилхоліну ліпропіленових мікропланшетах із потрійними павідповідає, головним чином, ензим холінацетилтралельними мікролунками. У кожну лунку рансфераза (ChAT), а за розклад - ацетилхолінесдодавали 35мкл міченого тритієм 17 -естрадіолу тераза (AChE). (0,5нМ, питома активність 60,1Кі/ммоль, постачаЗ метою визначення впливу F-V на рівень льник - фірма "Дюпон-Нью-Інгленд Ньюклір" ChAT був проведений дослід, описаний нижче. (DuPont-New England Nuclear, Boston, MA)) і 35мкл Після підготовки пацюків за описаною вище загаохолодженого розчину випробовуваної конкурентльною методикою 40 тваринам щоденно вводили ної сполуки (0,1нМ-5мкМ) або TEGO, і після інкушляхом підшкірної ін'єкції або перорально (шлябування протягом 5хв при 4°С при струшуванні хом згодовування) F-V в дозі 3мг/кг на день в носії, 70мкл лізату клітин. що містив 10% циклодекстрину; естрадіол-бензоат Планшети інкубували протягом 24год при 4°С, в дозі 0,03мг/кг або 0,3мг/кг на день; або носій (копісля чого додавали в кожну лунку 70мкл покритонтроль). Оброблення тварин тривало 3 дні або 10 го декстраном активного вугілля (DCC) і інтенсивднів. Кожний режим дозування застосовували до но струшували протягом 8хв при 4°С. Потім план20 тварин. Через певні проміжки часу тварин умешети центрифугували при 1500 g протягом 10хв ртвляли і видаляли мозки. Певні частини мозку при 4°С. Збирали надосадову рідину з кожної лунгомогенізували і аналізували. Досліди виконували ки в гнучкий полістироловий мікропланшет для на гомогенізованих пробах гіпокампу та кори лобрахування сцинтиляцій в лічильнику "Майкобета" них часток, активність ChAT визначали за допомофірми "Уоллак" (Wallac Micobeta Model 1450). Рагою проби на біосинтез ацетилхоліну з викорисдіоактивність виражали в кількості розпадів за танням мічених сполук. Цю методику можна хвилину (DPM) із поправкою на ефективність разнайти в роботі Шеппа та інших [Schoepp et al., J. хування (35-40%) і фон. Як додаткові контрольні Neural Transmiss., 78:183-193, 1989], відомості з показники були використані загальний результат якої введено до цього опису за посиланням. рахування і загальний результат + DCC для виЯк і очікувалося, у тварин після оваріектомії значення нижчої границі кількості речовини, екстрівні ChAT знижувалися більш ніж на 50% рагованої DCC (вираженої через кількість сцинти(р