Застосування ціанінових барвників для діагностики проліферативних захворювань

1. Застосування сполуки відповідно до формули (І) (19) (21) a200708556 (22) 05.01.2006 (24) 25.03.2010 (86) PCT/EP2006/000058, 05.01.2006 (31) 05000276.5 (32) 07.01.2005 (33) EP (46) 25.03.2010, Бюл.№ 6, 2010 р. (72) ЛІХА КАЙ, DE, ПЕССЕЛЬ МАРТІН, DE, БАНЕР МАЛЬТЕ, DE, ШІРНЕР МІХАЕЛЬ, DE (73) БАЙЄР ШЕРІНГ ФАРМА АКЦІЄНГЕЗЕЛЬШАФТ, DE (56) WO0016810 A 30.03.2000 NTZIACHRISTOS V ET AL: "CONCURRENT MRI AND DIFFUSE OPTICAL TOMOGRAPHY OF BREAST AFTER INDOCYANINE GREEN ENHANCEMENT" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 97, no. 6, 14 March C2 1 3 89976 4 лежний рак молочної залози, гормононезалежні види раку молочної залози; перехідноклітинні та плоскоклітинні види раку; неврологічні злоякісні новоутворення, включаючи нейробластому, гліоми, астроцитоми, остеосаркому, менінгіому; саркому м'яких тканин; гемангіому та ендокринологічну пухлину, включаючи аденому гіпофіза, феохромоцитому, парагангліому, гематологічні злоякісні новоутворення, включаючи лімфому та лейкемію або метастаз, що розвивається з однієї з вищезгаданих пухлин. 8. Застосування за п. 6, у якому діагностичну сполуку вводять під час скринінгу пухлини або до, або протягом, або після хірургічного втручання. 9. Застосування за п. 5, у якому передраковий стан вибирають із групи, що складається із передракового стану шкіри, особливо актинічного кератозу, шкірного наросту, актинічного хейліту, дьогтьового кератозу, миш'якового кератозу, променевого кератозу, сочевицеподібного дискоїдного дискератозу, бовеноїдного папульозу, злоякісного лентиго (lentigo maligna), склерозуючого лишаю (lichen sclerosus) і червоного лишаю слизової оболонки; передракового стану травного тракту, особливо еритроплакії, лейкоплакії, стравоходу Баретта, синдрому Пламера-Вінсона, стегнової виразки, гіпертрофічної гігантської гастропатії, приграничної карциноми, неопластичного кишкового поліпа, ректального поліпа, «порцелянового» жовчного міхура; передракового стану жіночих статевих органів, особливо протокового раку in situ (CDIS), інтраепітеліальної цервікальної неоплазії (CIN), лейкоплакії, гіперплазії ендометрія (стадія III), дистрофії вульви, інтраепітеліальної неоплазії вульви (VIN), гідатидоподібної родимої плями; передракового стану урогенітального тракту, особливо папіломатозу сечового міхура, еритроплазії Кейра, тестикулярної інтраепітеліальної неоплазії (TIN), лейкоплакії; карциноми in situ (CIS); передракового стану, викликаного хронічним запаленням, особливо піодермії, остеомієліту, конглобатних вугрів, люпозного туберкульозу шкіри та фістули. 10. Застосування за п. 5, у якому метаплазію вибирають із групи, що складається з агногенної мієлоїдної метаплазії, апокринної метаплазії, атипічної метаплазії, аутопаренхіматозної метаплазії, метаплазії сполучних тканин, епітеліальної метаплазії, кишкової метаплазії, метапластичної анемії, метапластичного скостеніння, метапластичних поліпів, мієлоїдної метаплазії, первинної мієлоїдної метаплазії, вторинної мієлоїдної метаплазії, плоскоклітинної метаплазії, плоскоклітинної метаплазії амніона, симптоматичної мієлоїдної метаплазії та регенеративної метаплазії. 11. Застосування за п. 5, у якому дисплазію вибирають із групи, що складається з ізангідротичної ектодермальної дисплазії, антеролицьової дисплазії, асфіктичної дисплазії грудної клітини, атриодигітальної дисплазії, бронхопульмональної дисплазії, церебральної дисплазії, цервікальної дисплазії, хондроектодермальної дисплазії, ключично-черепного дизостозу, вродженої ектодермальної дисплазії, черепно-діафізарної дисплазії, черепно-карпотарзальної дисплазії, черепнометафізарної дисплазії, дентинної дисплазії, діафізарної дисплазії, ектодермальної дисплазії, неповного амелогенезу, енцефалоофтальмічної дисплазії, п'ятково-епіфізарної дисплазії, множинної епіфізарної дисплазії, епіфізарної точкової остеодисплазії, епітеліальної дисплазії, фаціодигітогенітальної дисплазії, родинної фіброзної дисплазії щелеп, родинної білої складчастої дисплазії, фіброзно-м'язової дисплазії, фіброзної остеодисплазії, дисплазії червоного кісткового мозку, спадкової нирково-ретинальної дисплазії, гідротичної ектодермальної дисплазії, гіпогідротичної ектодермальної дисплазії, лімфопенічної дисплазії тимуса, дисплазії молочної залози, щелепно-лицьової остеодисплазії, метафізарної дисплазії, дисплазії Мондіні, моностатичної фіброзної дисплазії, слизово-епітеліальної дисплазії, множинної епіфізарної дисплазії, очно-вушно-вертебральної дисплазії, окулодентодигітальної дисплазії, окуловертебральної остеодисплазії, одонтодисплазії, офтальмо-челепно-лицьової остеодисплазії, періапікальної цементної дисплазії, поліостотичної фіброзної дисплазії, псевдоахондропластичної спондилоепіфізарної дисплазії, дисплазії сітківки, септо-оптичної дисплазії, спондилоепіфізарної дисплазії та ветрикулорадіальної дисплазії. 12. Застосування за п. 5, у якому хворобу очей вибирають із групи, що складається із трахоми, ретролентальної фіброплазії, діабетичної ретинопатії, неоваскулярної глаукоми та вікової дистрофії жовтої плями. 13. Застосування за будь-яким з пунктів 1-12, у якому діагностична композиція додатково містить фармацевтично прийнятну сіль, носій, допоміжну речовину та/або буфер. 14. Застосування за будь-яким з пунктів 1-13, у якому сполука включена в діагностичну композицію в кількості 0,1 мг/кг маси тіла або менше. 15. Діагностичний комплект, що містить сполуку формули (І) за п. 1 або її фармацевтично прийнятну сіль у кількості для приготування діагностичної композиції для введення, що становить менше ніж 0,5 та більше ніж 0,001 мг/кг маси тіла сполуки на діагностичну процедуру, і необов'язково фармацевтично прийнятну сіль, носій, допоміжну речовину та/або буфер. Даний винахід стосується застосування ціанінових барвників, особливо SF64, 5-29, 5-36, та/або 5-41 для діагностики проліферативних захворювань, особливо пухлинних захворювань при вве денні в дозі, що становить менше 0,1мг/кг маси тіла. Рак являє собою другу лідируючу причину смерті серед американського населення та відпо 5 відає за один з кожних чотирьох випадків смерті в Сполучених Штатах. В 2004 році більш ніж 560000 американців або більше 1500 чоловік у день помруть від раку. Понад 18 мільйонів нових випадків раку були діагностовані в період з 1990 року, і приблизно 1,4 мільйони нових випадків будуть діагностовані тільки в 2004 році. Ця оцінка не включає преінвазивний рак або більше 1 мільйону випадків раку шкіри, що не є меланомою, що, як очікується, буде діагностовано цього року. Фінансові витрати на рак величезні. Згідно даних Національного Інституту охорони здоров'я витрати на рак у Сполучених Штатах склали в 2003 році більше 189 мільярдів $. Ця сума включає понад 64 мільярдів $ на безпосередні медичні витрати та більше 125 мільярдів $ внаслідок втрати продуктивності. Кількість нових летальних випадків у результаті захворювання раком могла б бути істотно знижена за допомогою ранньої діагностики ракових утворень. Тому, скринінг раку, особливо скринінг раку молочної залози, шийки матки та колоректального раку могли б значно зменшити кількість смертельних випадків від цих хвороб шляхом їх раннього виявлення, коли вони найкраще піддаються лікуванню. Скринінг раку молочної залози, шийки матки та колоректального раку можуть фактично запобігти розвитку цих видів раку шляхом виявлення передзлоякісних станів, що піддаються лікуванню. В ідеалі методи скринінгу є чутливими і специфічними, можуть бути виконані швидко, неінвазивні, дешеві та асоціюються з відсутністю побічних ефектів або тільки з незначними побічними реакціями. Для скринінгу, наприклад пухлин молочної залози, встановлений у цей час стандарт скринінгу включає рентгенографію тканини молочної залози, процедуру, що також називають мамографією. До інших методів відносяться ядерномагнітно-резонансна томографія, ультрасонографія та термографія. Безумовно, найбільш широко застосовуваний метод скринінгу являє собою рентгенівську мамографію, що має високу специфічність (приблизно 80%), однак, чутливість залежить значною мірою від інтерпретації даних візуалізації радіологом. Просторове розділення мамографії є низьким, і пухлини, які звичайно виявляються, мають розмір 1см або більше. Однак, мамографія асоціювалася зі значним і сукупним ризиком впливу випромінювання, особливо в жінок у передменопаузі, щільність тканини молочної залози в яких більше, і для одержання достатньої чутливості потрібні більш високі дози випромінювання як у випадку жінок похилого віку. Мамографія також критикувалася за посилену маніпуляцію молочної залози протягом процедури, що могла б сприяти дисемінації пухлинних клітин. Магнітно-резонансна томографія (МРТ) все частіше та частіше використовувалася в минулому особливо після виявлення пухлини за допомогою іншого методу. МРТ через своє високе просторове розділення має значно переважаючу чутливість у порівнянні з методами, що базуються на рентгенівському зображенні, такими як мамографія, однак, вона менш специфічна (специфічність у межах від 37% до 97%, і прогностичне значення для жінки без попередньої діагнос 89976 6 тики раку молочної залози становить менше 2%), набагато більш дорога та трудомістка і, таким чином, менше підходить для масового скринінгу пацієнтів. Нещодавно з'явився ще один метод під назвою дифузійна оптичної томографія (ДОТ) у ближній інфрачервоній частині спектру (NIR) як новий спосіб візуалізації з високим потенціалом у різних видах застосування з метою візуалізації в медицині. Ця техніка має можливість давати кількісні знімки власного та домішкового поглинання та розсіювання (Arridge, S.R. (1995) Appl. Opt. 34: 7395-7409 and Gonatas, С.Р. et al. (1995) Phys. Rev Ε. 52: 4361-4365). Ntziachristos, V. et al. (2000) Proc. Nat. Аса. Set U.S.A. 97: 2767-2772) описують застосування індоціанінового зеленого (ICG) для підвищення контрастності при оптичній візуалізації людської молочної залози in vivo. Оптична візуалізації великих органів, таких як молочна залоза, часто здійсненна через низьке поглинання тканини в спектральній області від 700 до 850нм. Фактично, світло досліджувалося з кінця 1920-х років як діагностичний інструмент для раку молочної залози шляхом просвічування. Однак, просвічування мало низьке просторове розділення і надавало невеликі можливості для спектрального кількісного визначення виявлених уражень. Отже, просвічування не досягало достатньої чутливості та специфічності для клінічного використання. Значні вдосконалення математичного моделювання поширення світла в тканині в комбінації з технологічним прогресом зробили на даний момент можливим застосування томографічних принципів для візуалізації за допомогою розсіяного світла. Дифузійна оптична томографія значно поліпшила здатність локалізувати і кількісно визначати структури тканини за допомогою світла. Крім того, спосіб використовує неіонізуюче випромінювання та вимагає відносно не дорогого устаткування, що робить його підходящим для масового скринінгу рака молочної залози або інших ракових утворень, доступних для світла. Флуорохроми, такі як, наприклад, індоціанін (ICG, що є поглиначем і флуорофором в NIR), застосовувалися як контрастні засоби. Для ДОТ, що застосовує FCG як контрастний засіб, повідомлялося, що рак проток молочної залози розміром 1см і більше можуть бути виявлені при концентрації, що становить 0,25 мг/кг маси тіла. Інші флуоресцентні контрастні засоби, які можуть застосовуватися для візуалізації в ближній інфрачервоній частині спектру із застосуванням флуоресцентних контрастних засобів, описані, наприклад, в ЕР 1 113 822 А1 та Kai Licha et al. ((2000) Photochemistry and Photobiology 72: 392398). Для будь-якого способу візуалізації, застосовуваного при повторних скринігах, бажано, щоб він мав якнайменше побічних ефектів. Якщо техніка візуалізації вимагає введення таких речовин, як контрастні засоби, бажано, щоб вводилися тільки невеликі кількості таких речовин з метою уникнення появи потенційно небезпечних побічних ефектів і накопичення препарату, що могло б відбутися при повторному введенні. Таким чином, у попередньому рівні техніки існує потреба в ідентифікації 7 контрастних засобів, які можна вводити в невеликих кількостях та які при цьому будуть забезпечувати бажану специфічність і чутливість для стандартного скринінгу ДОТ. Перш, ніж нижче докладно описати даний винахід, необхідно розуміти, що цей винахід не обмежується певною методологією, протоколами, клітинними лініями, векторами та реактивами, описаними авторами, оскільки вони можуть варіюватися. Необхідно також розуміти, що термінологія, використовувана авторами, призначена тільки для опису конкретних варіантів здійснення, і не обмежує області застосування даного винаходу, що буде обмежуватися тільки відповідно до прикладеної формули винаходу. Якщо не визначено інакше, всі технічні та наукові терміни, використовувані авторами, мають ті ж значення, які звичайно зрозумілі фахівцеві зі звичайними навичками в даній галузі. Переважно, щоб терміни, використовувані авторами, визначалися як описано в "А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH4010 Basel, Switzerland). У цій специфікації та формулі винаходу, яка слідує нижче, якщо контекст не вимагає іншого, слово "включає" і варіації типу "включають" та "що включає", буде мати на увазі включення зазначеного цілого або етапу або групи цілих або етапів, але не виключення якого-небудь іншого цілого або етапу або групи цілого або етапу. У тексті цієї специфікації процитовані кілька документів. Кожний з документів, процитованих авторами вище або нижче (включаючи всі патенти, патентні заявки, наукові публікації, специфікації виробника, інструкції, тощо), тим самим включаються шляхом посиланням у повному обсязі. Ніщо тут не повинно тлумачитися як припущення, що винахід не уповноважений передбачати таке розкриття на підставі попереднього винаходу. Слід зазначити, що як використовується авторами в тексті та у прикладеній формулі винаходу, форми однини включають об'єкти посилання у формі множини, якщо контекст чітко не вказує інше. Таким чином, наприклад, посилання на "реактив" включають один або кілька таких різних реактивів, а посилання на "спосіб" включають посилання на еквівалентні етапи та способи, відомі фахівцям зі звичайними навичками в даній галузі, які могли б бути модифіковані або замінені способами, описані авторами. 89976 8 При встановленій вищеописаній потребі в попередньому рівні техніки було тепер неочікувано виявлено даними винахідниками, що відомі раніше сполуки відповідно до формули (І) 1 7 де L - L - однакові або різні, та кожен окремо являють собою заміщений або незаміщений метан 3 5 або L та L разом формують п'яти- або шестичленне кільце, а L являє собою метан, заміщений алкілом, що має 1-4, наприклад 1, 2, 3, або 4 ато1 2 ми вуглецю, R та R являють собою нижчі алкіли, що мають 1-5, наприклад 1, 2, 3, 4 або 5 атомів вуглецю та заміщені групою сульфонової кислоти, 3 або арил або гетероарил довільно заміщені, R 10 R - однакові або різні, і кожний окремо являють собою атом водню, групу сульфонової кислоти, карбоксильну групу, гідроксильну групу, алкіл(сульфоалкіл)аміногрупу, біс(сульфоалкіл)аміногрупу, сульфоалкоксигрупу, (сульфоалкіл)-сульфонільну групу або (сульфоалкіл)аміносульфонільну групу, а X та Υ - однакові або різні, і кожен окремо являють собою групу формули (II) 11 12 де R та R являють собою незаміщені нижчі алкіли, що мають 1-5, наприклад 1, 2, 3, 4 або 5 атомів вуглецю і їх фармацевтично прийнятні солі, 2+ наприклад, Na, К, Са, Mg тощо. Ці сполуки забезпечують сигнал зі специфічністю та чутливістю, достатньою для рутинного скринінгу на наявність проліферативних захворювань у кількостях на кг маси тіла, які значно нижче кількостей на кг маси тіла, що застосовувалися в попередньому рівні техніки для одержання достатньої специфічності та чутливості. Певні кращі сполуки, які застосовуються в контексті даного винаходу являють собою одну або кілька сполук зі структурою відповідно до формул (III)-(VI) 9 89976 10 ни, що наближаються до розміру 10мм, і має величезне значення для довгострокового виживання діагностованого пацієнта. Пухлини з діаметром 1см або більше вже залучили ендотеліальні клітини у формування нових капілярів, тобто в процес неоваскуляризації, і часто пухлинні клітини вже потрапили в кровоносну або лімфатичну систему. Однак, пухлини з діаметром 3 мм або менше часто не васкуляризовані та зупинили подальший ріст через недостачу живильних речовин. Оскільки васкуляризація пухлини є передумовою для подальшого росту, ці пухлини будуть прогресувати тільки у випадку, якщо вони розів'ють здатність залучати ендотеліальні клітини. Отже, шанси запобігти розвиненню раку в загрозливу життю хворобу набагато вищі, якщо пухлина може бути виявлена вже в розмірі, коли ймовірність поширитися по організму та/або залучити ендотеліальні клітини для формування нових капілярів набагато менше. Відповідно, перший аспект винаходу являє собою застосування сполуки відповідно до формули (І) 1 які також відомі під назвою SF64, 5-29, 5-36 та 541, і які забезпечують сигнал зі специфічністю та чутливістю, достатньою для рутинного скринінгу на наявність проліферативних захворювань у кількостях на кг маси тіла, які значно нижче кількостей на кг маси тіла, що застосовувалися в попередньому рівні техніки для одержання достатньої специфічності та чутливості. Таким чином, сполуки, застосовувані згідно із даним винаходом та, особливо SF64, 5-29, 5-36 та 5-41, на диво можна вводити в дуже маленьких кількостях й, отже, з низьким потенціалом для виникнення токсичних побічних ефектів. Крім того, пухлини, що виявляють при цій низькій концентрації, становлять усього 3мм у діаметрі і, таким чином, значно менше пухлин, які виявлялися раніше за допомогою інших ціанінових барвників, таких як, наприклад, ICG, для якого межею чутливості є пухлини розміром, що становить 1см, тобто порівнянним з рентгенівською мамографією. Здатність виявляти пухлини, розміром всього 3мм, представляє істотне вдосконалення в порівнянні зі здатністю виявляти пухли 7 де L - L - однакові або різні, і кожен окремо являє собою заміщений або незаміщений метин, a 4 L являє собою метан, заміщений алкілом, що має 1 1-4, наприклад 1, 2, 3 або 4 атоми вуглецю, R та 2 R являють собою нижчі алкіли, що мають 1-5, наприклад 1, 2, 3, 4 або 5 атомів вуглецю та замі3 10 щені групою сульфонової кислоти, R - R - однакові або різні, і кожен окремо являє собою атом водню, групу сульфонової кислоти, карбоксильну групу, гідроксильну групу, алкіл(сульфоалкіл)аміногрупу, біс(сульфоалкіл)аміногрупу, сульфоалкоксигрупу, (сульфоалкіл)сульфонільну групу або (сульфоалкіл)аміносульфонільну групу, а X та Υ - однакові або різні, і кожен окремо являє собою групу формули (II) 11 12 де R та R являють собою незаміщений нижчий алкіл, що має 1-5, наприклад 1, 2, 3, 4 або 5 атомів вуглецю і їх фармацевтично прийнятну сіль, для одержання діагностичної композиції для виявлення проліферативного захворювання, причому діагностична композиція включає сполуку у кількості меншій 0,5 і більшій 0,001мг на 1кг маси тіла на 1 застосування для діагностики. Особливо кращі сполуки, які застосовуються в контексті даного винаходу, являють собою одну або кілька сполук зі структурою відповідно до формул (III)-(VI) 11 або їх фармацевтично прийнятні солі, для одержання діагностичної композиції для виявлення проліферативного захворювання, причому діагностична композиція включає сполуку в кількості меншій 0,5 і більшій 0,001мг на 1кг маси тіла на 1 застосування для діагностики. Здатність гідрофільних сполук, застосовуваних згідно із даним винаходом й, особливо, ціанінових барвників SF64, 5-29, 5-36 та 5-41, діяти як контрастний засіб частково визначається концентраціями окси- і діокси-гемоглобіну, насиченістю оксиданту крові, поглинанням контрастного засобу 89976 12 тканиною та органічною концентрацією, однак, можливо збільшити специфічність та/або чутливість сполуки, застосовуваної згідно із даним винаходом та, особливо SF64, 5-29, 5-36 та 5-41, шляхом сполучення її з націленою на мішень сполукою, що специфічно зв'язується зі структурами, які переважно або винятково присутні на проліферуючих клітинах і тканинах або поблизу проліферуючих клітин і тканин. Деякі із цих структур асоційовані безпосередньо із проліферуючою клітиною або асоційовані із клітинами поблизу проліферативної тканини. Згадані вище структури являють собою модифіковані або надекспресовані в проліферуючій клітині структури, такі як, наприклад, рецептори факторів росту, типу рецептору соматостатіну або рецептору епідермального фактору росту (EGFR - epidermal growth factor receptor). До теперішнього часу був ідентифікований цілий ряд таких структур і вони включають, крім інших, рецептори факторів росту, рецептори, сполучені з Gбілком, порові білки, іонні канали, ефлюксні насоси лікарських засобів, додаткові єднальні ділянки для факторів росту, гепарансульфат, пов'язані з мембраною протеази, молекули адгезії, Т-клітинні рецептори та селектини, особливо, EGF, TGF, СЕА, Льюїс Y, CD20, CD33 або CD38. Інші структури, на які можна націлюватися, являють собою Т-клітинні асоційовані з раком антигени, що належать до унікальних генних продуктів мутованих або рекомбінованих клітинних генів, особливо циклінInk4b залежна кіназа 4 (CDK4), p15 , p53, AFP, βRas катенін, каспаза 8, р53, мутації p21 , злитий продукт Bcr-abl, MUM-1 MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, міозин/m, 707-АР, CDC27/m, ETV6/AML, TEL/Amll, Dekcain, LDLR/FUT, Pml-RAR , TEL/AMІ1; раковотестикулярні (PT) антигени, особливо NY-ESO-1, члени MAGE-сімейства (MAGE-ΑΙ, MAGE-A2, MAGE-АЗ, MAGE-A4, MAGE-A6 MAGE-10, MAGE12), В AGE, DAM-6, DAM-10, члени GAGEсімейства (GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8), NA-88A, CAG-3, ПКК-асоційований антиген G250; пухлинні вірусні антигени, особливо, отримані з папіломавірусу людини (HPV) Е6 або Е7 онкопротеїни, EBNA2-6, LMP-1, LMP-2 вірусу Епштейна-Барра; надекспресовані або ткане-специфічні диференційовані антигени, в особливості, gp77, gp100, MART-1/Melan-A, р53, тирозиназа, тирозиназазв'язаний білок (TRP-1 та TPR-2), PSA, PSM, MC1R; значно експресовані антигени, особливо, ART4, CAMEL, СЕА, Сур, HER2/neu, hTERT, hTRT, ICE, Muc1, Muc2, PRAME RU1, RU2, SART-1, SART-2, SART-3 та WT1. 13 Відомо, що проліферуючі клітини в певних пухлинних клітинах продукують здатні поширюватися фактори, які залучають ендотеліальні клітини та стимулюють їх ріст. Тому, пухлини являють собою одну з деяких ділянок в організмі, у якій спостерігається утворення нових кровоносних судин (васкуляризація). Отже, проліферуючий ендотелій пухлини та структури, асоційовані з ним, застосовувалися для специфічного націлювання препаратів до ділянки пухлини. Молекулярні структури, асоційовані з ангіогенезом, розглянуті, наприклад, в WO 96/01653, Alessi P. et al. (2004) і Nanda, H. і Saint-Croix (2004). Клітини, які формують проліферативні тканини, експресують і ангіогенні, і антиангіогенні фактори, які доти, поки інгібітори ангіогенезу протидіють ефекту ангіогенних факторів, приводять до пригнічення ангіогенезу. Як тільки превалює ефект ангіогенних факторів, вони приводять до ініціювання ангіогенезу. Таким чином, обидві структури, тобто активатори та інгібітори ангіогенезу, які залучені в регуляцію ангіогенезу, можуть бути зв'язані націленими на мішень сполуками даного винаходу. Активатори ангіогенезу включають, крім інших, такі молекулярні структури як, наприклад, ED-B фібронектин (ED-BF), ендоглін (CD 105) (Burrows, F.J. et al. (1997) Clin. Cancer Res. 1: 1623-1634), члени VEGF-сімейства, судинний ендотеліальний фактор росту (VEGFR), NRP-1, Ang1, Thie2, PDGF-bb і рецептори, TGF-β1, TGF-β-рецептори, FGF, HGF, MCP 1, інтегранти ( νβ3, νβ5, 5β1), VE-кадхерин, РІСАМ (CD31), ефрини, активатори плазміногену, MMPs PAI-1, NOS, СОХ-2, А733, хемокіни або Id1/Id3. Інгібітори ангіогенезу включають, крім інших, такі молекулярні структури як, наприклад, VGFR-1, Ang2, TSP-1,-2, ангіостатин і близькі фрагменти плазміногену, ендостатин (колаген (XVII-фрагмент), вазостатин, тромбоцитарний фактор IV, ТІМР, інгібітори ММР, РЕХ, МЕТН-1, МЕТН-2, IFN- , -β, - , IP-10, IL-4, IL12, IL-18, пролактин, VEGI, фрагмент SPARC, фрагмент остеопонтину або маспін (Carmeliet, P. and Jain, R.K. (2000) Nature 407: 249-257; Yancopoulos, G.D. et aІ. (2000) Nature 407: 242-248; Bergers, G. and Benjamin, L.E. (2002) Nature Reviews Cancer 3: 401-410; Hendriks, M.J.C. et al. (2002) Nature Reviews Cancer 3: 411-421). У кращому варіанті здійснення націлені на мішень сполуки зв'язуються з ангіогенезспецифичними факторами ED-BF, VEGFR або ендогліном. З них ED-BF являє собою особливо кращу структуру-мішень. ED-BF є з'єднаним варіантом фібронектину, що також називають як онкофетальний фібронектин, що специфічно формується в новостворених капілярних структурах протягом ангіогенезу. Компонент, що зв'язується із цими структурами, являє собою переважно пептид (амінокислотний ланцюг з 2-50 амінокислотними залишками), білок (амінокислотні ланцюги з більш ніж 50 амінокислотними залишками), нуклеїнову кислоту, невелику молекулу або цукор. Нижче в цій специфікації пептиди та білки також звичайно згадуються як поліпептиди. Кращі поліпептиди являють собою ліганди структур, які переважно або винятково експресу 89976 14 ються в проліферуючих клітинах або поблизу проліферуючих клітин, тому що у васкуляризованих або васкуляризуючих структурах, особливо, судинний ендотеліальний фактор росту (VEGF), соматостатин, аналоги соматостатину, бомбезин, аналоги бомбезину, вазоактивний кишковий пептид (VIP - Vasoactive intestinal peptide) та аналоги, нейротензин та аналоги нейротензину, нейропептид Υ та аналоги, і антитіла, включаючи людські, гуманізовані та химерні антитіла; єднальні доменвмісні фрагменти антитіл, наприклад, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb; одноланцюгові антитіла, наприклад, одноланцюгові Fvs (scFvs); і діатіла. Цілий ряд таких антитіл був описаний у літературі та включає для ED-BF: L19 та Е8 (див. Viti F. et al. (1999) Cancer Res. 59:347-352), BP-1 моноклональне антитіло, описане в ЕР 0 344 134 В1, що одержують із гібридоми, що зберігається в European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, UK під номером 88042101 або його химерну або гуманізовану версію, антитіла проти ED-BF зі специфічними послідовностями VL та VH, описаними в WO 97/45544 А1, антитіла проти ED-BF зі специфічними послідовностями VL та VH, описаними в WO 99/5857 А2, антитіла проти ED-BF зі специфічними послідовностями VL та VH, описаними в WO 01/62800 А1 та АР38 та АР39 (Marty С, et al. (2001) Protein Expr. Purif. 21:156-64). Антитіла, специфічні до ED-BF, були розглянуті в Ebbinghaus С, et al. (2004) Curr Pharm Des. 10:1537-49. Всі ці антитіла або їх єднальні фрагменти можуть застосовуватися як ангіогенезспецифічний єднальний компонент в кращому застосуванні даного винаходу. До особливо кращих антитіл відносяться L19, Е8, АР 38 та АР 39 або їх єднальні домен-вмісні фрагменти. Антитіла для VEGF-R включають Бевацизумаб (Авастин (Avastin™), rhumAb-VEGF, розроблений Genentech й Roche), анти-VEGFR-l антитіло mAb 6.12, повністю людські aHTH-VEGFR-2 антитіла ІМС-2С6 й ІМС-1121, повністю людське aHTHVEGFR-3 mAb HF4-3C5 (все від Imclone Systems Inc), і KM 2550 (Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd.), антиVEGFR-l антитіло (Salgaller ML (2003) Current Opinion in Molecular Therapeutics 5(6):657-667). Антитіла для ендогліну включають: SN6h, SN6, SN6a, SN6j, P3D1, P4A4, 44G4, GRE, E-9, CLE-4, RMAC8, PN-E2, MAEND3, TEC4, TECH, All, 8E11. Клон SN6h широко застосовувався для вивчення експресії ендогліну в різних пухлинних об'єктах за допомогою імуногістохімії (Wikstrom P. et al. (2002) The Prostate 51:268-275; Li С. et al. (2003) Br.J. Cancer 88:1424-1431; Saad R.S. et al. (2004) Modern Pathol. 17: 197-203). З тих же антитіл ряду SN6 були описані SN6, SN6a й SN6j (She X. et al. (2004) Int. J. Cancer 108:251-257). Для клонів антитіла P3D1, P4A4, 44G4, GRE, E-9, CLE-4, RMAC8, PN-E2, MAEND3, TEC4, TECH були визначені єднальні антигенні детермінанти ендогліну (Pichuantes S. et al. (1997) Tissue antigens 50:265276). Для деяких із цих антитіл і клону антитіла All вивчалася диференціальна експресія ендогліну на нормальних і пухлинних тканинах людського походження (Duff S. Ε. et al. (2003) FASEB J. 17:984992). WO 02/02614 розкриває додаткові ендоглін 15 специфічні антитіла, наприклад, scFv C4. В одній з останніх публікацій про антитіла проти CD 105 клон 8Е11 досліджувався на його прогностичне значення для метастатичного ризику у пацієнтів з раком молочної залози за допомогою імуногістохімії (Dales J.P. et al. (2004) Br.J. Cancer 90:12161221). Всі ці антитіла або їх єднальні фрагменти можуть застосовуватися як ангіогенезспецифічний єднальний компонент в кращому застосуванні даного винаходу. Крім того, багато антитіл або їх єднальних фрагментів, які специфічно зв'язуються з різними пухлинними клітинами, були описані в попередньому рівні техніки та включають, крім інших, антитіла проти рецепторів, сполучених з G-білком, порових білків, іонних каналів, ефлюксних насосів лікарських засобів, додаткових єднальних ділянок для факторів росту, гепарансульфату, пов'язаних з мембраною протеаз, молекул адгезії, Т-клітинних рецепторів і селектинів, особливо, EGF, TGF, СЕА, Льюїс Y, CD20, CD33 або CD38. Крім того, можуть застосовуватися антитіла або їх єднальні фрагменти, проти Т-клітинних асоційованих з раком антигенів, що належать до унікальних генних продуктів мутованих або рекомбінованих клітинних генів, особливо, таких як циклін-залежна кіназа 4 Ink4b (CDK4), p15 , p53, AFP, β-катенін, каспаза 8, Ras р53, мутації p21 , злитий продукт Bcr-abl, MUM-1 MUM-2, MUM-3, ELF2M, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, RAGE, міозин/m, 707-АР, CDC27/m, ETV6/AML, TEL/Amll, Dekcain, LDLR/FUT, PmlRARa, TEL/AMLI; раково-тестикулярні (PT) антигени, особливо NY-ESO-1, члени MAGE-сімейства (MAGE-ΑΙ, MAGE-A2, MAGE-АЗ, MAGE-A4, MAGEA6 MAGE-10, MAGE-12), BAGE, DAM-6, DAM-10, члени GAGE-сімейства (GAGE-1, GAGE-2, GAGE3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8), NA-88A, CAG-3, ПКК-асоційований антиген G250; пухлинні вірусні антигени, особливо, отримані з папіломавірусу людини (HPV) Е6 або Е7 онкопротеїни, EBNA2-6, LMP-1, LMP-2 вірусу ЕпштейнаБарра; надекспресовані або ткане-специфічні диференційовані антигени, в особливості, gp77, gp100, MART-1/Melan-A, р53, тирозиназа, тирозиназа-зв'язаний білок (TRP-1 та TPR-2), PSA, PSM, MC1R; значно експресовані антигени, особливо, ART4, CAMEL, СЕА, Сур, HER2/neu, hTERT, hTRT, ICE, Muc1, Muc2, PRAME RU1, RU2, SART-1, SART-2, SART-3 та WT1. З рівня техніки відомо, що нуклеїнові кислоти можуть мати специфічні єднальні властивості, таким чином, націлений на мішень компонент може також бути нуклеїновою кислотою. Переважно, такі нуклеїнові кислоти включають ДНК, РНК, аптамери та ПНК, при цьому особливо кращі аптамери. Способи для ідентифікації специфічно єднальних аптамерів відомі в даній області та описані, наприклад, в WO 93/24508 А1, WO 94/08050 А1, WO 95/07364 А1, WO 96/27605 А1 та WO 96/34875 А1. На способи, описані в цих документах тим самим робиться певне посилання, і вони можуть застосовуватися для ідентифікації аптамерів, які специфічно зв'язуються із проліферативною тканиною або із тканиною поблизу проліферативної тканини, такої як недавно сформований та/або проліфера 89976 16 тивний ендотелій. Особливо кращі націлені на мішень сполуки для застосування даного винаходу являють собою ангіогенез-специфічні єднальні аптамери. Кращі аптамери, застосовувані у використанні даного винаходу, специфічно розпізнають ED-BF, ендоглін або VEGFR. З появою високопродуктивного скринінгу молекул з низькою молекулярною масою, тобто не пептидних сполук, не сполук нуклеїнових кислот, з молекулярною масою нижче 1,000г/моль, переважно нижче 500г/моль, стало можливо ідентифікувати маленькі молекули зі специфічними єднальними властивостями. Такі невеликі молекули можуть однаково використовуватися як націлений на мішень компонент в застосуванні даного винаходу. Кращою невеликою молекулою є 2,2дифенілетиламін, що, як було встановлено, специфічно зв'язується з ED-BF (Scheuermann J. (2002) Isolation of binding molecules to the EDB domain of fibronectin, a marker of angiogenesis. Dissertation submitted to Swiss Federal Inst. of Technology, Zurich). Вищеописані націлені на мішень сполуки можуть бути сполучені із сполуками, застосовуваними згідно із даним винаходу, і, особливо, з SF64, 529, 5-36, і/або 5-41, за допомогою прямого або непрямого зв'язку. У цьому контексті термін "прямий зв'язок" означає ковалентний зв'язок із залишком націленої на мішень сполуки, у той час як термін "непрямий зв'язок", використовуваний авторами, означає, що один або кілька додаткових хімічних залишків, які зв'язані ковалентним або нековалентним зв'язком, розташовані між барвником SF64 і націленою на мішень сполукою. Цей один або кілька додаткових хімічних залишків також називають "спейсером". Спейсер може, наприклад, забезпечувати просторовий поділ між націленою на мішень сполукою і барвником SF64. У даній області відомо кілька способів сполучення сполук, застосовуваних згідно із даним винаходом та, особливо, ціанінових барвників SF64, 5-29, 536, і/або 5-41 з націленою на мішень сполукою, як зазначено вище, і вони звичайно включають введення реактивних функціональних груп, які здатні утворювати ковалентні зв'язки, у барвник, синтезуючи барвник у вигляді похідної з реактивними функціональними групами та/або в націлену на мішень сполуку. Такі групи включають, наприклад, тіо-, гідрокси-, аміно- або карбоксигрупи. Для сполук, застосовуваних згідно із даним винаходом та, особливо, для SF64, 5-29, 5-36, та/або 5-41, сполучення може бути здійснене або в індольних групах та/або метильних групах в 3 положенні індольного гетероциклу або в метильній групі, розташованій в середині гептатрієну або може бути здійснене в кожному з карбонових залишків гептатрієну. Крім того, сполучення між націленою на мішень сполукою і сполуками, застосовуваними згідно із даним винаходом, і, особливо SF64, 5-29, 5-36, та/або 5-41, може бути здійснене в алкільних ланцюгах, пов'язаних з азотом індолу. Переважно, націлену на мішень сполуку сполучають із однією з метильних груп в 3 положенні індолу або з 4 метильною групою гептатрієну. 17 89976 18 Термін "ліганд рецепторів" стосується поліпептидів, які специфічно зв'язуються з рецепторами клітинної поверхні, тобто які є природними єднальними партнерами рецептора. Взаємодія між рецептором та його лігандом може мати різні наслідки, з однієї сторони можливо, що ліганд і рецептор просто діють як прив'язь між, наприклад, двома клітинами або, що зв'язування може привести до конформаційної або функціональної зміни рецептору, що у свою чергу може привести, наприклад, до активації ферментативної функції рецептору або асоціації рецептору з новими та/або іншими додатковими компонентами в клітинній мембрані, на додатковій клітинній ділянці або на цитоплазматичній ділянці клітинної мембрани. У цьому контексті ліганди можуть мати агоністичний або антагоністичний ефект на функцію рецептора. Ліганди рецептору в межах значення винаходу являють собою також модифіковані ліганди, які могли б містити додаткові N- або С-термінальні амінокислоти або, у яких амінокислоти були замінені без істотного зниження єднальної активності до рецептору. У цьому контексті зниження на більше ніж 90% вважалося б істотним. Переважно, щоб модифіковані ліганди показували збільшення специфічного зв'язування. До прикладів таких лігандів рецепторів відносяться VEGF, соматостатин і його аналоги, бомбезин та/або аналоги бомбезину, Вазоактивний кишковий пептид (VIP) і аналоги, нейротензин та аналоги нейротензину, Нейропептид Υ і його аналоги. Переважно, щоб сполука відповідно до формули (І) і/або (III)-(VI), зазначених вище, застосовувалася у вигляді натрієвої солі, однак, можливо також застосовувати інші фармацевтичні прийнятні солі на додаток до або замість натрію, тобто заміняючи один або кілька іонів натрію в молекулі одним або декількома фармацевтично прийнятними іншими органічними або неорганічними катіонами, у тому числі іонами інших лужних металів, таких як калій, лужноземельні метали, типу магнію, кальцію тощо, органічними катіонами, типу триетиламонію, трибутиламонію, піридинію тощо, солями амінокислот, типу лізину, аргініну тощо. Особливо краща натрієва сіль сполуки, застосовуваної відповідно до існуючого винаходу, зображена на формулі (VII) Проліферативні захворювання, які можуть бути діагностовані, з використанням зазначеної вище кількості сполуки, застосовуваної згідно із даним винаходом, переважно вибираються із групи, що складається з пухлини, передракового стану, дисплазії, метаплазії, псоріазу, псоріатичного артриту, ревматоїдного артриту, ендометріозу та/або хвороби очей. Переважно діагностуються такі проліферативні захворювання, як пухлини. Пухлини можна надалі розділяти на первинну пухлину або її метастази. Часто клітини, які метастазували, ростуть швидше, демонструють меншу залежність від закріплення, мають більш високу хромосомну плоідію та одержали здатність до виходу із системного струму внаслідок експресії таких протеаз як, наприклад, колагенази, матричні металопротеїнази тощо. Таким чином, переважно діагностувати пухлину до того, як вона метастазувала. У той час як ризик розвитку метастазів первинної пухлини, як правило, підвищується зі збільшенням розміру деяких пухлин, наприклад, меланоми часто метастазують при досягненні розміру всього лише одного або декількох міліметрів, інші пухлини є набагато менш схильними до раннього поширення пухлинних клітин по всьому організму, такі як, наприклад, рак передміхурової залози. Істотна перевага використання даного винаходу полягає в здатності виявляти проліферативні ураження невеликих розмірів, особливо первинних пухлин. Краще, щоб розмір виявленого проліферативного ураження становив менше ніж 10мм, переважно менше ніж 9мм, переважно менше ніж 8мм, переважно менше ніж 7мм, переважно менше ніж 6мм, переважно менше ніж 5мм і найбільш переважно менше ніж 4мм. Переважно пухлина, діагностована відповідно до застосування даного винаходу, являє собою малігному шлунково-кишкового або колоректального тракту, печінки, підшлункової залози, нирки, сечового міхура, щитовидної залози, передміхурової залози, ендометрію, яєчника, яєчок, меланому, дисплазію слизової оболонки ротової порожнини, інвазивний рак ротової порожнини, дрібноклітинний або не дрібноклітинний рак легені; пухлину молочної залози, включаючи гормонозалежний рак молочної залози, гормононезалежні види раку молочної залози; перехідно-клітинні та плоскоклітинні види раку; неврологічні злоякісні новоутворення, включаючи нейробластому, гліоми, астроцитоми, остеосаркому, менінгіому; саркому м'яких тканин; гемангіому та ендокринологічну пухлину, включаючи аденому гіпофізу, феохромоцитому, парагангліому, гематологічні злоякісні новоутворення, включаючи лімфому та лейкемію або метастаз, що розвивається з однієї з вищезгаданих пухлин. До особливо кращих пухлин відносяться пухлини молочної залози, шийки матки, передмі 19 хурової залози, яєчка, у яких орган/тканина, з якого розвилася пухлина, є легко доступним зовні тіла або ендоскопічним шляхом. Передраковий стан, що може виявлятися відповідно до застосування даного винаходу, переважно вибирається із групи, що складається із передракового стану шкіри, особливо, актинічного кератозу, шкірного наросту, актинічного хейліту, дьогтьового кератозу, миш'якового кератозу, променевого кератозу, сочевицеподібного дискоїдного дискератозу, бовеноїдного папулезу, злоякісного лентиго (lentigo maligna), склерозуючого лишаю (lichen sclerosus) і червоного лишаю слизової оболонки; передракового стану травного тракту, особливо, еритроплакії, лейкоплакії, стравоходу Барета, синдрому Пламера-Вінсона, стегнової виразки, гіпертрофічної гігантської гастропатії, прикордонної карциноми, неопластичного кишкового поліпу, ректального поліпу, «порцелянового» жовчного міхура; передракового стану жіночих статевих органів, особливо, протокового раку in situ (CDIS), інтраепітеліальної цервікальної неоплазії (CIN), лейкоплакії, гіперплазії ендометрію (стадія III), дистрофії вульви, інтраепітеліальної неоплазії вульви (VIN), гідатидоподібної родимої плями; передракового стану урогенітального тракту, особливо, папіломатозу сечового міхура, еритроплазії Кейра, тестикулярної інтраепітеліальної неоплазії (TIN), лейкоплакії; карциноми in situ (CIS); передракового стану, викликаного хронічним запаленням, особливо, піодермії, остеомієліту, конглобатних вугрів, люпозного туберкульозу шкіри та фістули. Дисплазія часто являє собою продромальний стан раку, і виявляється, головним чином, в епітелії; вона є формою найбільш безладного не неопластичного клітинного росту, що включає втрату однорідності індивідуальних клітин та архітектурної орієнтації клітин. Диспластичні клітини часто мають патологічно великі, глибоко забарвлені ядра, і показують плеоморфізм. Дисплазія характерно виникає в ділянках наявності хронічного подразнення або запалення. Диспластичні розлади, які можуть бути діагностовані згідно із даним винаходом, включають, крім інших, ангідротичну ектодермальну дисплазію, антеролицьову дисплазію, асфіктичну дисплазію грудної клітини, атриодигітальну дисплазію, бронхопульмональну дисплазію, церебральну дисплазію, цервікальну дисплазію, хондроектодермальну дисплазію, ключичночерепний дизостоз, вроджену ектодермальну дисплазію, черепно-діафїзарну дисплазію, черепнокарпотарзальну дисплазію, черепно-метафізарну дисплазію, дентинну дисплазію, діафізарну дисплазію, ектодермальну дисплазію, недосконалий амелогенез, енцефало-офтальмічну дисплазію, п'ятково-епіфізарну дисплазію, множинну епіфізарну дисплазію, епіфізарну точкову остеодисплазію, епітеліальну дисплазію, фациодигітогенітальну дисплазію, родинну фіброзну дисплазію щелеп, родинну білу складчасту дисплазію, фіброзном'язову дисплазію, фіброзну остеодисплазію, дисплазію червоного кісткового мозку, спадкоємну нирково-ретинальну дисплазію, гідротичну ектодермальну дисплазію, гіпогідротичну ектодер 89976 20 мальну дисплазію, лімфопенічну дисплазію тимусу, дисплазію молочної залози, щелепно-лицьову остеодисплазію, метафізарну дисплазію, дисплазію Мондіні, моностотичну фіброзну дисплазію, слизово-епітеліальну дисплазію, множинну епіфізарну дисплазію, очно-вушно-вертебральну дисплазію, окулодентодигітальну дисплазію, окуловертебральну остеодисплазію, одонтодисплазію, офтальмо-щелепно-лицьову остеодисплазію, періапікальну цементну дисплазію, поліостотичну фіброзну дисплазію, псевдоахондропластичну спондилоепіфізарну дисплазію, дисплазію сітківки, септо-оптичну дисплазію, спондилоепіфізарну дисплазію, і ветрикулорадіальну дисплазію. Метаплазія - це форма контрольованого росту клітини, при якому один тип дорослої або повністю диференційованої клітини заміняє інший тип дорослої клітини. Метапластичні розлади, які виявляються відповідно до застосування даного винаходу, переважно вибираються із групи, що складається з агногенної мієлоїдної метаплазії, апокринної метаплазії, атипічной метаплазії, аутопаренхіматозної метаплазії, метаплазії сполучних тканин, епітеліальної метаплазії, кишкової метаплазії, метапластичної анемії, метапластичного окостеніння, метапластичних поліпів, мієлоїдної метаплазії, первинної мієлоїдної метаплазії, вторинної мієлоїдної метаплазії, плоскоклітинної метаплазії, плоскоклітинної метаплазії амніону, симптоматичної мієлоїдної метаплазії та регенеративної метаплазії. Очна хвороба, яку можна виявити відповідно до застосування даного винаходу, переважно вибирається із групи, що складається із трахоми, ретролентальної фіброплазії, діабетичної ретинопатії, неоваскулярної глаукоми та вікової дистрофії жовтої плями. Ендометріоз - це гінекологічне захворювання, що характеризується проліферацією ендометріальної тканини за межами порожнини матки. Проліферуючі ендометріальні клітини можуть поширюватися по всьому організму, і ендометріальні ураження були виявлені навіть у легені та в інших органах, і в цьому відношенні поширення ендометріальних уражень нагадує поширення мікрометастазів. У кращому варіанті здійснення застосування даного винаходу ендометріальні ураження, наприклад, скупчення ендометріальних клітин, які виявляються, є гематогенними клітинними скупченнями, порожнинними клітинними скупченнями, внутріпросвітними клітинними скупченнями, лімфатичними клітинними скупченнями, місцевими клітинними скупченнями та/або регіональними клітинними скупченнями. Даний винахід може використовуватися для рутинного діагнозу, тобто для скринінгу на відповідно зазначені захворювання. Однак, у ще одному варіанті здійснення застосовуються кон'югати, як тільки хвороба була діагностована за допомогою, наприклад, стандартної рентгенівської процедури, наприклад, мамографії, сканування всього тіла або МРТ. Потім пацієнта обстежують на наявність метастазів та/або невеликої (додаткової) первинної пухлини (пухлин). Таке обстеження може здійснюватися для кращої оцінки ступеня важкості, 21 наприклад, стадії хвороби, або з метою визначення кращих варіантів лікування та/або до, протягом та/або після процедури лікування (наприклад, медикаментозного лікування, променевої терапії або хірургічної операції). При здійсненні до процедури лікування застосування даного винаходу через його високу чутливість дозволяє проводити визначення, наприклад, утворення метастазів біля первинної пухлини, і, таким чином, краще визначення схеми лікування, наприклад, чи показано при раку молочної залози видалення пухлини молочної залози або краще провести мастектомію. Після проведення лікування застосування діагностичної процедури даного винаходу дозволяє оцінити успішність процедури лікування та визначити наступні схеми лікування, наприклад, такі як променева терапія або хіміотерапія. При використанні під час хірургічної процедури можливо, наприклад, виявляти метастази в тканині, наприклад, лімфатичних вузлах, що оточують первинну пухлину. У цьому варіанті здійснення застосування даного винаходу дозволяє більш повно видалити пухлини або метастази під час хірургічної процедури. У ще одному аспекті використання даного винаходу діагностична композиція додатково містить фармацевтичні прийнятні матеріали, такі як, наприклад, фармацевтично прийнятні солі для регуляції осмотичного тиску, буфери, консерванти, носії та/або допоміжні речовини. Переважно, діагностична композиція надається у вигляді апірогенної лікарської форми для парентерального застосування, що може являти собою водний розчин або ліофілізат для приготування розчину для введення. Приготування такої фармацевтичної композиції, з урахуванням рН ізотонічності, стабільності тощо, не виходить за межі навичок у даній області. Діагностичні композиції, застосовувані згідно із даним винаходом, можуть включати фармацевтично прийнятні наповнювачі, такі як, наприклад, розчин натрію хлориду та розчин Рінгера. Для введення людям, композицію можна вводити в аутологічній сироватці або плазмі. У кращому використанні даного винаходу діагностичну сполуку вводять парентерально й, більш переважно, внутрівенно. Після внутрішньовенного введення сполуки (сполук), використовуваної згідно із даним винаходом, і, особливо, SF64, 5-29, 536 та 5-41, через кілька хвилин можна провести візуалізацію in vivo. Однак, візуалізацію можна проводити, за необхідності, через кілька годин або через ще більший період часу після введення пацієнтові сполуки (сполук), використовуваної згідно із даним винаходом, і, особливо, після введення SF64, 5-29, 5-36 та/або 5-41. У більшості випадків достатня кількість дози, що вводять, накопичується в ділянці, що буде візуалізуватися, протягом приблизно 0,1 години. При застосуванні сполуки (сполук), застосовуваної згідно із даним винаходом, і, особливо, SF64, 5-29, 5-36 та/або 5-41, на диво було виявлено, що контрастний засіб надавав можливість візуалізувати пухлини аж до 48 годин після ін'єкції. У цьому полягає додаткова перевага перед попереднім рівнем техніки, тому що дана властивість дозволяє вводити сполуку, 89976 22 застосовувану згідно із даним винаходом за один або кілька днів до застосування ДОТ, наприклад, лікарем пацієнта, що потім дозволяє безпосередньо проводити візуалізацію пацієнта на спеціалізованому пристрої для скринінгу без необхідності вводити барвник у пристрій для скринінгу та дає можливість контрастному засобу розподілитися в день виконання ДОТ. Таким чином, у кращому варіанті здійснення діагностичну сполуку вводять принаймні за 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 або 48 годин до візуалізації. Як підкреслено вище, неочікувано було виявлено, що для забезпечення чутливості та специфічності, необхідної для виявлення проліферативних захворювань, достатні набагато більш низькі кількості ціанінових барвників, застосовуваних згідно із даним винаходом та особливо SF64, 5-29, 5-36 та/або 5-41, ніж за повідомленнями необхідні для інших ціанінових барвників, таких як ICG. Однак, у кращому варіанті здійснення застосування згідно із даним винаходом сполуку відповідно до формули (І) включено в діагностичну композицію в кількості, що становить приблизно 0,4, приблизно 0,3, приблизно 0,2, приблизно 0,1, менше ніж 0,1, приблизно 0,09, приблизно 0,08, приблизно 0,07, приблизно 0,06, приблизно 0,05, приблизно 0,04, приблизно 0,03, приблизно 0,02, і приблизно 0,01мг/кг маси тіла. Отже, кращі діапазони сполуки (сполук), застосовуваної згідно із даним винаходом та, особливо SF64, 5-29, 5-36, та/або 5-41, які будуть вводитися, становлять від 0,4 до 0,001, від 0,2 до 0,001, від 0,1 до 0,001, від менше ніж 0,1 до 0,001, від 0,09 до 0,001, від 0,008 до 0,001, від 0,06 до 0,001, від 0,05 до 0,001 мг на кг маси тіла. Через високу гідрофільність та високу розчинність у воді сполука даного винаходу та, особливо SF64, 5-29, 5-36, та/або 5-41, об'єм ін'єкції пацієнтові може становити всього 1мл, що значно менше ніж у випадку застосовуваних у цей час ін'єкцій, об'ємом, що перевищує 10мл. Тому, у кращому варіанті здійснення застосування згідно із даним винаходом сполука відповідно до формули (І) включена в менше ніж 5мл, переважно менше ніж 4мл, переважно менше ніж 3мл, переважно менше ніж 2мл і ще більш переважно приблизно 1мл діагностичної композиції. Ще один аспект даного винаходу являє собою діагностичний комплект, що містить сполуку(и) формули (І) та/або (III)-(VI) у кількості для приготування діагностичної композиції для введення від менше ніж 0,5 до 0,001мг/кг маси тіла, переважно від 0,4 до 0,001, від 0,2 до 0,001, від 0,1 до 0,001, від менше ніж 0,1 до 0,001, від 0,09 до 0,001, від 0,008 до 0,001, від 0,06 до 0,001, від 0,05 до 0,001мг/кг маси тіла сполуки на діагностичну процедуру та, довільно, фармацевтичну прийнятну сіль, носій, допоміжну речовину та/або буфер, як зазначено вище. Переважно, комплект включає сполуку та довільні додаткові компоненти в ліофілізованій формі. Без подальшого роз'яснення, передбачається, що фахівець, кваліфікований у даній області, використовуючи попередній опис, зможе використати 23 даний винахід у його самому повному обсязі. Виходячи із цього, наступні кращі певні варіанти здійснення повинні розцінюватися тільки як ілюстративні, і ні в якій мірі не обмежуючі даний винахід. Фіг.1: Оптична мамографія після в/в ін'єкції SF64 пацієнтці з інвазивним раком молочної залози в правій молочній залозі. Яскрава пляма обумовлена вираженим сигналом флуоресценції SF64, що після в/він'єкція дійсно накопичився в цьому інвазивному раці молочної залози. Фіг.2: Приклад ex vivo візуалізації експериментальних ендометріозних мікрометастазів через 6 год. після введення речовини. Лівий малюнок показує структуру флуоресцентного барвника, а правий малюнок показує зображення препарату ендометріальної тканини. Зображення включає шкалу, що вказує масштаб у см. Фіг.3: Приклад in vivo візуалізації спонтанних мікроуражень шкіри через 6год. після введення речовини. Малюнок А показує оригінальне зображення, а Малюнок В показує перевернене зображення. Зображення включає шкалу, що вказує масштаб у см. Приклади Оптична мамографія після в/в ін'єкції SF64 пацієнтці з інвазивним раком молочної залози в правій молочній залозі. 89976 24 Доза, що становить 0,1мг SF64/кг маси тіла, була після розчинення ліофілізату 0,9% стандартним фізіологічним розчином, введена внутрівенно через канюлю в передпліччя. Проводили візуалізацію пацієнтки за допомогою лазерного пристрою для оптичної комп'ютерної томографічної мамографії в положенні лежачи з вільно висячою молочною залозою в камері для візуалізації в атмосфері повітря. Було почате нагромадження даних візуалізації. Через 1 годину 10 хвилин після в/в ін'єкції SF64, було виконане відновлення зображення, використовуючи режим флуоресценції, у такий спосіб майже винятково показуючи сигнал флуоресценції SF64. Контрастний барвник дійсно накопичився в цьому інвазивному раці молочної залози, що представлений на зображенні яскравою плямою. Це приводило до вираженого сигналу флуоресценції SF64 на зображенні. Визначення квантового виходу флуоресценції декількох трикарбоціанінових барвників Сполуки 6-4, 5-36, 5-29, 5-41, NIR96009, NIR96005 та ICG (див. Таблицю 1) випробовувалися на їх квантові виходи флуоресценції при концентрації 2мкМ або у воді, або в плазмі. На підставі Таблиці 2 очевидно, що заміна в середині трикарбоціанінового барвника поліпшує квантовий вихід флуоресценції в обох середовищах. 25 89976 26 Таблиця 2 Сполука (#) 6-4 5-36 5-29 5-41 NIR96009 NIR96005 ICG Флуоресцентний Квантовий вихід Квантовий вихід макс. (нм) у плаз- флуоресценції (%) флуоресценції (%) мі у плазмі уводі Сполука з L4 = алкілом заміщеним 787 17 11 787 17 12 813 9,8 8,2 799 19 10 Сполука без алкільного заміщення в L4 786 7,8 5,8 795 7,2 5,6 829 3 1 Примітки * див. Посилання. * див. Посилання. * див. Посилання. * Licha et al., Proceedings of the SPIE Vol.2927 (Bellingham, VA, US), 1996, p.192-198 Візуалізація мікрометастазів у голих мишей з пухлинами Сарап-1 Клітини пухлини Сарап-1 вирощувалися в культурі із субконфлюентним ростом, були трипсинізовані, центрифуговані та повторно суспендовані в PBS. Після забарвлення за допомогою трипану синього та обчислення концентрації клітин, клітинна суспензія була доведена до концентрації 7 3×10 /мл. Клітинну суспензію остудили на льоді до її використання. Трьох самок голих мишей (NMRI6 nude, 24-25г маси тіла) знеболили, і 30мкл (1×10 клітин/тварина) клітинної суспензії інокулювали субкапсульно в підшлункову залозу кожній тварині після черевного розрізу. Кожна тварина одержала 0,05мкмоль/кг маси тіла (0,04мг барвника на кг маси тіла) речовини, що включає ціаніновий барвник, що має структуру, зображену у Фіг.2, що був кон'югований з EB-DF антитілом АР39 (див. Marty С, et al. (2001) Protein Expr. Purif. 21:156-64). Цю речовину ввели внутрівенно в той період часу, коли пальпувався чіткий ріст пухлини (приблизно через 12-14 тижнів після імплантації клітин пухлини). Тварин умертвили через 6 годин після внутрішньовенного введення речовини та мезентерій, що містить мікрометастази візуалізували ex vivo на сигнали флуоресценції, використовуючи посилену камеру CCD. Флуоресценція речовини була порушена шляхом опромінення мезентерію за допомогою променів ближньої інфрачервоної частини спектру з довжиною хвилі 740нм, які були отримані за допомогою лазерного діоду (0,5W потужність). Зображення флуоресценції були збережені в циф ровій формі. Потім, оцінювали розмір мікрометастазів, використовуючи мікроскоп з низьким збільшенням (Stemi 2000-С, Fa. Carl Zeis). Були мані сигнали флуоресценції від мікрометастазу в діапазоні від 0,5 до 2,0мм у діаметрі та від більшого мезентеріального метастазу, і відповідає мікроскопічній оцінці. Ефективність кон'югату барвника зображена на Фіг.2, правий малюнок. Візуалізація in vivo спонтанних мікроуражень шкіри в голих мишей Спонтанні множинні мікроураження шкіри спостерігалися у двох NMRI-голих мишей. Кожна миша одержала 0,05мкмоль/кг маси тіла (0,04мг барвника на кг b.w.) кон'югату барвника-АР39, як зображено на Фіг.2, внутрівенно. Візуалізацію виконували в знеболених мишей через 6 годин після введення речовини. Короткочасну анестезію провели, використовуючи анестезуючий засіб у вигляді інгаляції ізофурану (Isofluran Curamed, Curamed Pharma Gmb, Карлсруе, Німеччина). Флуоресценція речовини була збуджена за допомогою діодного лазера (довжина хвилі збудження 742нм, лазерний діод, 0,5W потужність) і виявлена з використанням посиленої камери CCD. Зображення флуоресценції були збережені в цифровій формі. Потім, оцінювали розмір мікроуражень, використовуючи мікроскоп з низьким збільшенням (Stemi 2000-С, Fa. Carl Zeis). Сигнали флуоресценції були отримані від мікроуражень аж до розміру менше ніж < 1мм. Ефективність кон'югата барвника зображена на Фіг.3, основаній на характерному прикладі. 27 89976 28 29 Комп’ютерна верстка А. Рябко 89976 Підписне 30 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601