Композиція для лікування серцево-судинних захворювань і спосіб лікування серцево-судинних захворювань

1. Композиція для лікування серцево-судинних захворювань, що містить діюче начало на основі калію аспарагінату і магнію аспарагінату і допоміжний компонент, яка відрізняється тим, що діюче начало додатково містить L-аргініну аспарагінат, ді-L-аргініну сукцинат, при наступному співвідношенні компонентів в ньому, мас. %: калію аспарагінат 4-10 магнію аспарагінат 3-9 C2 2 90368 1 3 посередньо на міокард, і непрямої, ефекти яких на серцевий м'яз реалізуються за рахунок позитивного впливу на інші органи і системи. Останніми роками особливо великий інтерес серед лікарських засобів з вираженими кардіопротекторними властивостями викликає амінокислота аргінін. Аргінін є попередником оксиду азоту, який вивільняється з евдотеліоцитів і сприяє розширенню судин. Аргінін володіє антигіпоксичною, мембраностабілізуючою, антигіпертензивною, антиоксидантною і антирадикальною активністю, проявляє гіпохолестеринемічну дію, грає певну роль у нормалізації функціонального стану ендотелію коронарних судин. Аргінін бере участь у синтезі проліну, поліаміну, агматіну, включається в процеси фібриногенолізу, інгібує адгезію лейкоцитів, володіє мембранодеполяризуючою дією. Здатність аргініну активувати процеси енергозабезпечення серцевого м'яза, відновлювати проміжний обмін, і обмін протеїнів у міокарді, є ще одним механізмом його кардіопротективної дії. Аргінін ( -аміно- -гуанідиновалеріанова кислота) - амінокислота, яка є активним і різностороннім клітинним регулятором численних життєво важливих функцій організму, проявляє важливі в критичному стані організму протекторні ефекти. Біологічні властивості, притаманні аргініну, визначає широкий спектр його фармакологічних властивостей і пояснює високу терапевтичну ефективність даної амінокислоти в кардіології, педіатрії, акушерстві та інших галузях медицини при самих різних за етіологією і патогенезом захворюваннях. Різнобічні світові наукові дослідження дозволили визначити механізм і місце дії аргініну як засобу патогенетичної терапії захворювань серця і судин. В основному, в світі загальноприйнятими показаннями до застосування в кардіології лікарських засобів на основі аргініну є: міокардіопатії, хронічна серцева недостатність, артеріальна гіпертензія, у тому числі есенційна вторинна і після трансплантації серця, стенокардія, гіперхолестеринемія, атеросклероз, ішемічна хвороба серця, переміжна кульгавість. Також дуже широко в кардіології застосовуються препарати калію і магнію аспарагінату. Джерело іонів калію і магнію регулює метаболічні процеси, сприяє відновленню електролітного балансу, має антиаритмічну дію. Аспарагінат сприяє проникненню іонів калію та магнію у внутрішньоклітинний простір, стимулює міжклітинний синтез фосфатів. Проте, часто якісний і кількісний склад відомих композицій для лікування серцево-судинних захворювань не дозволяє забезпечити взаємне посилення активності компонентів таких композицій, що у свою чергу не дозволяє достатньою мірою забезпечити високий терапевтичний ефект і комплексний вплив на серцево-судинну систему. Тому актуальним завданням є розробка лікарського засобу, який повною мірою відповідав би сучасним вимогам до лікарських препаратів і забезпечував би широкий спектр дії на серцево-судинну систему. З патенту Японії №4282313 (кл. А61К31/195, А61К31/194, А61К31/198, А61Р9/12, С07С279/14, 90368 4 А61К31/185, А61Р9/00, С07С279/00. Опубл. 07.10.1992) відома фармацевтична композиція, яка містить аргінін або сіль аргініну з неорганічною кислотою (хлористоводнева, сірчана, фосфорна), органічною кислотою (оцтова, молочна, лимонна, винна, малеїнова, фумарова), неорганічною основою, органічною основою (етилендіамін, пропілендіамін). Композицію використовують як гіпотензивний засіб для орального, внутрішньовенного, ректального введення в дозі 20-60г на добу. З патенту України №47601 відома композиція, що включає діючий початок на основі калію аспарагінату і магнію аспарагінату та допоміжний початок. В якості допоміжного початку використовують сорбіт і воду для ін'єкцій. Засіб застосовують при аритміях серця, при порушеннях ритму, які пов'язані з інтоксикацією препаратами наперстянки, при пароксизмах мерехтіння передсердя, в лікуванні коронарної недостатності та гіпокаліємії, яка викликана застосуванням салуретичних засобів. З патенту України №12209 u відома композиція, яка містить L-аргініну гідрохлорид або L-аргінін 0,25-0,55моль і магнію оксид або магнію карбонат, або магнію глюконат, або магнію цитрат, або магнію аспартат 0,15-0,45моль. Препарат застосовують як кардіологічний засіб. Відомий спосіб лікування серцево-судинних захворювань шляхом введення лікарського засобу, описаний у патенті України №18108, при цьому хворим додатково вводять метаболічний комплекс у складі калію і магнію аспарагінату по 0,75г на добу, кальцію гліцерофосфату 0,6г на добу, галаскоробіну 1,5г на добу щодня протягом 12-14 днів. Найбільш близьким аналогом композиції, що заявляється, є композиція для лікування серцевосудинних захворювань, описана в патенті Російської Федерації №2229879, що включає діючий початок на основі калію аспарагінату, магнію аспарагінату і допоміжний початок. Як допоміжний початок використовують сорбіт або ксиліт і воду для ін'єкцій. Композицію застосовують як лікарський засіб, направлений на регулювання метаболічних процесів, які пов'язані з дефіцитом калію і магнію в організмі. До недоліків описаних рішень можна віднести те, що якісний і кількісний склад компонентів діючого початку описаних композицій не дозволяє забезпечити взаємне посилення активності компонентів таких композицій, що у свою чергу не дозволяє достатньою мірою забезпечити високий терапевтичний ефект і комплексний вплив на серцево-судинну систему, понизити або виключити негативні побічні ефекти. В основу винаходу поставлено задачу створення композиції, яка за рахунок підбору якісного і кількісного складу компонентів діючого початку композиції, а також за рахунок регулювання співвідношення кількості компонентів діючого початку композиції, дозволить забезпечити взаємне посилення активності компонентів композиції, дозволить понизити або виключити негативні побічні ефекти, внаслідок чого забезпечити комплексну дію на серцево-судинну систему. Також завданням винаходу є розробка способу лікування серцево-судинних захворювань за 5 допомогою композиції, що володіє властивостями, перерахованими вище. Поставлене завдання вирішується тим, що розроблена композиція для лікування серцевосудинних захворювань, що включає діючий початок на основі калію аспарагінату і магнію аспарагінат і допоміжний початок, при цьому діючий початок додатково містить L-аргініну аспарагінат, ди-Lаргініну сукцинат при наступному співвідношенні компонентів у діючому початку, мас.%: калію аспарагінат 4-10 магнію аспарагінат 3-9 L-аргініну аспарагінат 27-45 ди-L-аргініну сукцинат 18-36. Патогенетично обумовлений підбір діючого початку, який включає такі компоненти композиції, що заявляється, як калію аспарагінат, магнію аспарагінат, L-аргініну аспарагінат, ди-L-apгінінy сукцинат, і визначені експериментальним шляхом оптимальні співвідношення між компонентами діючого початку, в позначених межах забезпечують взаємне посилення їх активності (синергізм), що забезпечує підвищення лікувального ефекту препарату, розширення спектру специфічної активності композиції і зумовлює комплексну дію на серцево-судинну систему. Кількісне співвідношення компонентів діючого початку композиції, що заявляється, обумовлене необхідним рівнем їх специфічної активності. При введенні компонентів діючого початку в кількості меншій, ніж значення, що заявляються, рівень їх вмісту не є достатнім. Застосування калію аспарагінату, магнію аспарагінату, L-аргініну аспарагінату і ди-L-аргініну сукцинату в кількості більшій, ніж вказані значення, що заявляються, не призводить до значного підвищення рівня їх специфічної активності, а також може викликати негативні побічні ефекти, які характерні при передозуванні компонентами діючого початку. Призначення препаратів аргініну кардіологічним хворим є обґрунтованим, оскільки при відповідній патології спостерігається різке зниження ендогенного аргініну, що обумовлене як пригніченням його біосинтезу, так і порушенням мембранного транспорту. Численні наукові дані про наявність у аргініну широкого спектру фармакологічних властивостей послужили підставою для створення на його основі моно- і комбінованих препаратів для кардіології, ангіології, педіатрії та інших перспективних напрямів клінічної медицини. Доцільною є комбінація аргініну з різними амінокислотами та їх похідними. Поєднане застосування в одній лікарській формі аспарагінової кислоти і аргініну у вигляді відповідної солі значно потенціювало фармакологічну ефективність цих амінокислот як кардіозахисних лікарських засобів. Підставою для включення аспарагінової амінокислоти в якості компонента діючого початку в композицію, що заявляється, є її унікальні біологічні і фармакологічні властивості. Відомо, що аспарагінова кислота як донор азоту для реакцій переамінування грає найважливішу роль в білковому обміні, є попередником біосинтезу піримідинових основ й інших біологічно активних сполук в органі 90368 6 змі людини. Являючись глюкопластичною, амінокислота поставляє найважливіші субстрати для процесів енергозабезпечення (піровиноградну і αкетоглутарову кислоти), через перетворення на щавлевооцтову кислоту забезпечує постачання клітинам глюкози. Специфічна властивість даної амінокислоти - переносити іони К+ і Mg2+ у внутрішньоклітинний простір. Крім того, аспарагінова кислота володіє вираженою антигіпоксичною дією. Доцільним є введення в композицію аспарагінової амінокислоти у вигляді калію і магнію аспарагінату, які ефективні при порушеннях ритму серця, пароксизмах мерехтінь передсердя, шлуночковій екстрасистолії при коронарній і серцевій недостатності, явищах перевтоми, інфаркті міокарда й атеросклерозі. Введення в композицію калію і магнію аспарагінату попереджає та усуває електролітний дисбаланс, сприяє проникненню іонів калію і магнію у внутрішньоклітинний простір, сприяє уповільненню проведення збудження в міофібрилах і знижує збудливість міокарда. Дослідження останніх років незаперечно доводять перспективність і доцільність використання аргініну у вигляді солі аргініну сукцинату. Бурштинова кислота (сукцинат, бутандіонова кислота) - один з медіаторів завершального етапу циклу Кребса - володіє здатністю стимулювати енергетичний обмін і окислювально-відновні процеси в організмі. До фармакологічних властивостей бурштинової кислоти відносять її мембраностабілізувальну, антигіпоксичну, протиішемічну, актопротекторну дію, здатність підвищувати резистентність реакцій швидкого метаболічного кластеру мітохондрій до навантаження. Клінічний досвід підтверджує, що завдяки своїм специфічним властивостям препарати на основі бурштинової кислоти нормалізують роботу серцево-судинної системи при серцевій недостатності, ішемічній хворобі серця, порушеннях ритму. Виходячи з вищесказаного використання композиції, що заявляється, яка містить аргінін в комбінації з іншими амінокислотами і їх похідними, в якості кардіо- та ендотелійпротективного лікарського засобу при різних захворюваннях серця і судин є ефективним і патогенетично обгрунтованим. Переважно допоміжний початок композиції, що заявляється, є щонайменше одним компонентом, вибраним з групи: консервант, підсолоджувач, ароматизатор харчовий і вода. Як консервант композиція може містити метилпарагідроксибензоат і пропілпарагідроксибензоат, або сорбінову кислоту, або сорбат калію. В якості підсолоджувача композиція може містити сахаринат натрію або цикламат натрію, або сорбіт, або сахарозу. В якості харчового ароматизатору композиція може містити суницю або малину, або вишню, або банан, або карамель. Проте, залежно від форми випуску композиції, допоміжний початок може містити будь-які прийнятні в тому або іншому випадку компоненти. Доцільним є виконання композиції з різними формами випуску, що забезпечують можливість як парентерального введення композиції, наприклад, у вигляді ін'єкції, крапельниці або іншої фармацевтично прийнятної форми, так і перорального введення, наприклад, у вигляді пігулки, порошку, си 7 ропу або іншої фармацевтично прийнятної композиції, унаслідок чого досягається можливість використання композиції для надання термінової допомоги в різних ситуаціях. Інша задача вирішується тим, що розроблений спосіб лікування серцево-судинних захворювань шляхом введення лікарського засобу, при цьому як лікарський засіб застосовують композицію за п.1. Така реалізація способу лікування серцевосудинних захворювань дозволяє забезпечити ефективну комплексну дію на серцево-судинну систему за рахунок використання композиції для лікування серцево-судинних захворювань, що володіє широким спектром позитивних якостей, описаних вище. Наводимо конкретні приклади здійснення композиції для реалізації способу. Приклад 1. У реактор з водою для ін'єкцій завантажують перемішуючи кислоту L-аспарагінову, магнію оксид і калію гідроксид. Отриманий розчин нагрівають до 100°С, кип'ятять впродовж 10хв. В отриманий розчин при температурі 75-85°С завантажують кислоту L-аспарагінову, L-аргінін, бурштинову кислоту, перемішують. В процесі приготування розчину відбувається реакція утворення солей: калію аспарагінату, магнію аспарагінату, L-аргініну аспарагінату, ди-Lаргініну сукцинату, що являють собою діючий початок. Отриманий розчин охолоджують, доводять водою для ін'єкцій до необхідного об'єму, перемішують, фільтрують і ампулюють. Композиція в даному прикладі має наступне співвідношення компонентів, причому вміст речовин діючого початку зазначений у даному випадку від маси усієї композиції, мас. %, калію аспарагінат 4,17 магнію аспарагінат 3,68 L-аргініну аспарагінат 16,2 ди-L-аргініну сукцинат 13,3 вода для ін'єкцій решта. Приклад 2. У реактор з водою для ін'єкцій завантажують, перемішуючи кислоту L-аспарагінову, магнію оксид і калію гідроксид. Отриманий розчин нагрівають до 100°С, кип'ятять впродовж 10хв., після чого охолоджують до 80-90°С і перемішуючи завантажують консервант. До отриманого розчину при температурі 75-85°С додають кислоту Lаспарагінову, L-аргінін, бурштинову кислоту, перемішують. В процесі приготування розчину відбувається реакція утворення солей: калію аспарагінату, магнію аспарагінату, L-аргініну аспарагінату, ди-Lаргініну сукцинату, що являють собою діючий початок. Після отримання солей в реактор завантажують послідовно підсолоджувач і ароматизатор, перемішують отриману суміш впродовж 15-20хв. Сироп охолоджують, доводять водою очищеною до необхідного об'єму. Композиція в даному прикладі має таке співвідношення компонентів, причому вміст речовин діючого початку зазначений у даному випадку від маси усієї композиції, мас. %: калію аспарагінат 2,13 90368 8 магнію аспарагінат 2,13 L-аргініну аспарагінат 21,54 ди-L-apгінінy сукцинат 18,57 метилпарагідроксибензоат 0,10 пропілпарагідроксибензоат 0,01 натрію сахаринат 0,05 ароматизатор полуниця 0,10 вода очищена решта. У доклінічних фармакологічних і токсикологічних дослідженнях композиції, що заявляється, було проведено вивчення її специфічної фармакологічної активності, гострої токсичності, морфоструктури внутрішніх органів і тканин експериментальних тварин після введення композиції, а також ембріотоксичної, сенсибілізуючої і імунотоксичної дії препарату. 1. Доклінічні фармакологічні дослідження 1.1. Кардіопротективна активність Кардіопротективну активність вивчали на загальноприйнятій в кардіофармакології моделі катехоламінового некрозу міокарда, оцінюючи кардіозахисні ефекти досліджуваних препаратів щодо впливу на активність в крові індикаторних ферментів цілісності міокарда - креатинфосфокінази (КФК) та її ізоферменту - креатинфосфокінази MB (КФК MB), аспартатамінотрансферази (АсАТ) і лактатдегідрогенази (ЛДГ). Визначення активності цих ферментів має велике значення при інфаркті міокарда і моніторингу постінфарктного стану, дозволяючи оцінити об'єм ураження і інтенсивність відновних процесів. Крім того, контролювали динаміку зміни активності сироваткової холінестерази (ХЕ), що давало додаткову інформацію про глибину тканинного розпаду в некротизованих ділянках міокарда. Досліди проводили на щурах самцях масою 196-250г, що містяться у віварії при 20-25°С, вологості не більше 50%, природному світловому режимі «день-ніч», в стандартних індивідуальних клітках, на стандартному харчовому раціоні. В даних та подальших дослідженнях використовували композицію, що містить суміш солей амінокислот під умовною назвою КардіоаргінінЗдоров'я, випущену з можливістю парентерального введення у вигляді розчину ін'єкції, з вибраним оптимальним складом діючих речовин (в 1 ампулі 5мл): 0,85г аргініну аспарагінату, 0,7г діаргініну сукцинату, 0,226г калію аспарагінату і 0,2г магнію аспарагінату, або відповідно 1,21: 1: 0,32 : 0,29. Досліджуваний препарат дозували в 2-х дозах у перерахунку на амінокислотний залишок аргініну (0,36г/кг і 0,9г/кг) і вводили внутрішньочеревинно протягом 4 днів: за 24 години і 1 годину до першої ін'єкції ізадрину, а також через 24 і 48 годин після першої ін'єкції ізадрину. Інтервал між дозами вибраний в логарифмічній залежності з використанням таблиці переважних чисел. Препарат порівняння Мілдронат вводили внутрішньочеревинно в дозі 90мг/кг за тією ж схемою, що і препарат Кардіоаргінін-Здоров'я. Вказана доза Мілдронату розрахована, виходячи з добової терапевтичної дози для людини з використанням коефіцієнта перерахунку кількості лікарського препарату на поверхню тіла. 9 90368 Як видно з табл. 1.1, активність КФК, АсАТ, ЛДГ і ХЕ в крові інтактних щурів складає відповідно 16,0мккат/л, 1,88мкмоль/год мл, 9,4нмоль/мл хв і 22,59мккат/л, що відповідає фізіологічному рівню каталітичної активності даних ферментів в крові щурів. У контрольній групі нелікованих щурів через 510 хвилин після введення ізадрину розвивається гіподинамія: тварини протягом 70-120 хвилин знаходяться в розпластаному положенні на животі, знерухомлені. У крові щурів цієї групи різко зростає активність індикаторних ферментів гострого 10 інфаркту міокарда - КФК (у 7,5 разів), АсАТ (у 2,9 рази) і ЛДГ (у 1,7 рази) порівняно з інтактним контролем. Діагностично значуще підвищення ферментативної активності свідчить про розвиток необоротних процесів некрозу міокарда і резорбції продуктів аутолізу. Активність ХЕ статистично достовірно знижується в 1,3 рази порівняно з нелікованим контролем (ХЕ), що обумовлене утворенням в некротизованих ділянках міокарда продуктів тканинного розпаду, що володіють вираженою антихолінестеразною дією. Таблиця 1.1 Вплив внутрішньочеревинного введення препарату Кардіоаргінін-Здоров'я на активність маркерів цитолізу кардіоміоцитів у крові щурів з катехоламіновим некрозом міокарда Найменування груп, дози, г/кг* Контроль,інтактні Контроль, патологія, неліковані КардіоаргінінЗдоров'я, 0,36 КардіоаргінінЗдоров'я, 0,9 Мілдронат, 0,09 КФК, мккат/л 16,0±2,58 АсАТ, мкмоль/год мл 1,88±0,261 ЛДГ, нмоль/мл хв 9,40±0,862 ХЕ, мккат/л 22,6±1,54 120,4±13,271 5,49±3,6331 15,97±0,7651 16,9±11,091 60,0±10,601,2 (58) 35,4±9,662 (81) 52,4±9,571,2 (65) 3,06±0,5942 (67) 13,06±0,5941,2 (48) 11,02±0,6852 (82) 11,08±0,8372 (81) 20,6±1,342 (65) 22,9+1,0+62 (100) 20,1±1,10 (56) 2,16±0,2532(92) 3,09±0,3182 (66) Примітки: 1. - р 0,05 порівняно з інтактним контролем; 2. 2 - р 0,05 порівняно з нелікованим контролем; 3. У дужках - фармакологічний ефект, %; 4. * - дозування Кардіо-Аргінін-Здоров'я в г/кг в перерахунку на аргінін основа. У групі Кардіоаргінін-Здоров'я в меншій дозі 0,36г/кг активність КФК в крові знижується в 2 рази, АсАТ - в 1,8 рази і ЛДГ - в 1,2 рази при зростанні в 1,2 рази холінестеразної активності крові порівняно з нелікованим контролем. Слід зазначити, що під впливом парентерального введення препарату показники активності АсАТ і ХЕ відновлюються до фізіологічної норми і статистично не відрізнялись від рівня у здорових тварин (табл. 1.1). Сумарний фармакологічний ефект ( ΦΕ) склав 238%. У групі Кардіоаргінін-Здоров'я в більшій дозі 0,9 г/кг, активність КФК знизилася в 3,4 рази, АсАТ в 2,5 рази і ЛДГ - в 1,4 рази, активність ХЕ зросла в 1,4 рази. Як видно з табл. 1.1, підвищення дози Кардіоаргінін-Здоров'я не тільки послаблює, але і повністю попереджає патологічне підвищення активності в крові маркерних ферментів цитолізу кардіоміоцитів, значення яких відновлювалися до фізіологічного рівня інтактного контролю. Спостережувана динаміка змін ферментів крові у тварин, що лікуються Кардіоаргінін-Здоров'я, свідчить про зниження процесів тканинного розпаду в серці щурів в умовах катехоламінового некрозу міокарда. Відновлення активності сироваткової ХЕ також обумовлене зменшенням некротизованих ділянок міокарда і зниженням утворення продуктів розпаду, що володіють вираженою антихолінестеразною дією. Сумарний фармакологічний ефект (ОФЕ) препара ту зростає із збільшенням дози в 1,5 рази в порівнянні з меншою дозою і складає - 355%. При лікуванні Мілдронатом активність КФК зменшилась в 2,3 рази. У цих же тварин фармакологічний ефект відносно АсАТ склав 66%, що в 1,4 рази нижче, ніж відповідний показник для більшої дози Кардіоаргінін-Здоров'я (92%); активність сироваткової ЛДГ хоча і знизилася в 1,4 рази, але статистично значущо відрізнялась від рівня інтактних тварин. У цих же дослідах Мілдронат проявляв лише тенденцію до нормалізації на 19% активності ХЕ в крові відносно нелікованого контролю, поступаючись захисній активності як більшої (0,9г/кг), так і меншої дози (0,36г/кг) препарату Кардіоаргінін-Здоров'я. Сумарний фармакологічний ефект ( ФE) для Мілдронату склав 268%. Результати ферментативних тестів в групі щурів, що отримували препарат порівняння, свідчать, що парентеральне введення Мілдронату виявилося менш ефективним порівняно з більшою дозою (0,9г/кг по аргініну) Кардіоаргінін-Здоров'я, що підтверджує порівняльна оцінка величини умовно ΦΕ, яка при застосуванні комбінованого препарату була в 1,3 рази вище, ніж у Мілдронату. Таким чином, представлені в даному розділі досліджень результати свідчать, що комбінований препарат Кардіоаргінін-Здоров'я в умовах гострого інфаркту міокарда у щурів має значну і дозозале 11 жну кардіопротективну активність. При внутрішньочеревинному введенні Кардіоаргінін-Здоров'я ефективно і дозозалежно знижував активність КФК в 2-3,4 рази, АсАТ в 1,8-2,5 рази і ЛДГ - в 1,2-1,4 рази на тлі нормалізації активності ХЕ до рівня інтактного контролю. Сумарні фармакологічні ефекти розробленого препарату в дозах 0,36г/кг і 0,9г/кг (у перерахунку на аргінін) склав 238% та 355% відповідно. Кардюаргінін-Здоров'я при внутрішньоочеревинному введенні володіє значнішою в порівнянні з Мілдронатом кардіопротективною активністю, особливо відносно таких показників, як активність КФК, АсАТ і ХЕ. 1.2. Вивчення антигіпертензивної активності препарату Кардіоаргінін-Здоров'я у спонтанногіпертензивних щурів Артеріальна гіпертензія є провідним патогенетичним чинником в розвитку ішемічної хвороби серця і атеросклерозу. У зв'язку з цим, наявність антигіпертензивної активності в спектрі властивостей потенційних кардіо- і ендотелійпротективних засобів має найважливіше фармакотерапевтичне значення. Антигіпертензивну активність розробленого комбінованого препарату оцінювали згідно методичним рекомендаціям ГФЦ МОЗ України «Експериментальне вивчення антигіпертензивних засобів». У тих же щурів реєстрували також частоту серцевих скорочень в динаміці. Порівняльне дослідження з препаратом Еналаприл Початковий AT у відібраних для досліду щурів склав 161-163мм рт. ст, будучи на 25% вище за значення цього показника у нормотензивних щурів, що містяться в даний момент у віварії. Це підтверджує, що в експерименті використані гіпертензивні тварини. ЧСС у всіх випробовуваних щурів в середньому склала 390-430уд/хв. Після внутрішньовенного введення Кардіоаргінін-Здоров'я в меншій по аргініну дозі 0,12г/кг через 30 хвилин реєструється достовірне зниження AT в середньому на 23мм рт.ст (-14,2%). Через 1 годину рівень AT утримується достовірно пониженим на 10%. Через 2 години антигіпертензивний ефект препарату слабшає до рівня помітної тенденції (-7,4%) і поступово знижується до 3-ої години спостереження. Кардіоаргінін-Здоров'я в більшій дозі 0,3г/кг через 30хв. достовірно знижує AT на 24мм рт. ст. (-14,1%). Через 1 годину рівень AT відновлюється, але все таки зберігається трохи пониженим на 4,3%. Препарат порівняння Еналаприл не надає антигіпертензивної дії через 30хв. після введення. Через 1 годину після реєструється достовірне зниження AT на 7,4%, що поступається ефекту Кардіоаргінін-Здоров'я в цей же часовий інтервал. Максимальний антигіпертензивний ефект Еналаприлу - зниження AT на 14,8% щодо початкового рівня - спостерігається тільки до 3-ої години спостереження. У обох дозах вивчений зразок КардіоаргінінЗдоров'я і препарат порівняння не впливають на ЧСС. 90368 12 Слід зазначити, внутріпшьоочеревинне введення Кардіоаргінін-Здоров'я SHR-щурам в дозах 0,35г/кг і 0,87г/кг створює антигіпертензивний ефект, рівень і тривалість якого відповідали ефектам Еналаприлу в даному розділі досліджень. Так, після введення суміші в дозі 0,87г/кг вже через 1 годину реєструвалося достовірне зниження AT на 18,5% і його рівень надалі, поступово відновлюючись, утримувався достовірно пониженим на 16,4%-11,2% до 24 години спостереження. Таким чином, отримані результати свідчать, що парентеральне введення спонтанно гіпертензивним щурам Кардіоаргінін-Здоров'я в дозах 0,12г/кг і 0,3г/кг по аргініну викликає істотний і рівновиражений антигіпертензивний ефект. Кількісний рівень антигіпертензивної дії КардіоаргінінЗдоров'я в цих дозах відповідав активності Еналаприлу і складав 14%-14,8%, а при застосуванні Кардіоаргінін-Здоров'я в максимальній дозі співпадав з відповідною активністю Еналаприлу і за своєю тривалістю. В той же час, розроблений препарат вигідно відрізнявся від Еналаприлу, оскільки реалізація його гіпотензивної активності достовірно виявлялася в більш ранні терміни. Комплексний аналіз результатів представлених досліджень показує, що комбінований препарат Кардіоаргінін-Здоров'я при ін'єкційному введенні надає виражену кардіопротективну і помірну, але тривалу антигіпертензивну дію. Поєднання вказаних ефектів є незаперечно цінним в спектрі фармакологічних властивостей кардіологічного лікарського засобу, що планується для надання ургентної кардіологічної допомоги, у відновний період після інфаркту міокарда, або при загрозі серцевих катастроф у хворих з ІХС і ХСН. 1.3. Вивчення адаптогенно-актопротекторної активності препарату Кардіоаргінін-Здоров'я на моделі виснажуючого фізичного навантаження («рухової гіпоксії») у щурів Виходячи з передбачуваних показань до застосування Кардіоаргінін-Здоров'я як метаболічного кардіо- і ендотелійпротективного засобу у кардіологічних хворих, зокрема, в період реабілітації після перенесеного інфаркту і на етапі реконвалесценції для відновлення фізичної дієздатності, досліджували його адаптогенно-актопротекторні ефекти на моделі виснажуючого фізичного навантаження («рухової гіпоксії») у щурів. У групі нелікованого контролю середня тривалість примусового бігу на третбані повністю склала приблизно 807сек, що співпадає з даними літератури про фізіологічний рівень фізичної працездатності здорових щурів, а розрахунковий рівень працездатності склав 199кДж (табл. 1.2). У групі Кардіоаргінін-Здоров'я під впливом внутрішньоочеревинного введення меншої з вивчених доз 0,1г/кг, тривалість бігу зросла до 1215сек, що статистично достовірно в 1,5 рази вище, ніж в нелікованому контролі. Про істотне підвищення працездатності у цих тварин свідчить також підвищення в 1,6 рази показника виконаної роботи (315кДж). 13 90368 14 Таблиця 1.2 Вплив внутрішньошлункового введення препарату Кардіоаргінін-Здоров'я на фізичну працездатність щурів при виснажуючому бігу "до відмови" Найменування груп, доза (г/кг**) Контроль, інтактні Кардіоаргінін-Здоров'я,0,7 Кардіоаргінін-Здоров'я,1,75 n 6 6 6 Час пробігу тварин, сек 807±134,9 1215+97,21 1384±215,61 А*(кДж) 199±18,1 315±14,01 399±15,31 Ефект, % 50,6 71,5 Примітки: 1. 1 -р < 0,05 відносно контролю нелікованого; 2. n - число щурів в групі; 3. А* - показник «Працездатність», розрахований як вказано в пп. 2.3.1; 4. ** - доза в г/кг в перерахунку на аргінін основа У щурів, що отримували КардіоаргінінЗдоров'я в більшій дозі 0,25г/кг, максимальна тривалість бігу зросла до 1384сек при істотному збільшенні розрахункового показника виконаної роботи (399кДж) порівняно з нормою в 2 рази (табл. 1.2). Фармакологічні ефекти препарату Кардіоаргінін-Здоров'я в дозах 0,1г/кг і 0,25г/кг склали відповідно - 50,6% і 71,5%. Таким чином, препарат Кардіоаргінін-Здоров'я в умовах виснажуючого фізичного навантаження («рухової гіпоксії») проявляє характерний для енергодаючих сполук адаптогенно-актопротекторний ефект, прискорюючи процес адаптації в умовах гіпоксії, попереджаючи і знижуючи гостре виснаження із збільшенням об'єму виконаної роботи, про що свідчить збільшення тривалості виснажуючого бігу повністю в 1,5-1,7 рази і статистично достовірне в 1,6-2,0 рази підвищення показника працездатності. Механізм адаптогенно-актопротекторної дії препарату в умовах виснажуючого бігу повністю можна пояснити, ґрунтуючись на сучасних даних про фармакологічні властивості аргініну, аспарагінової та бурштинової кислот, калію і магнію аспарагінату, для яких показана здатність оптимізувати функції кисень-транспортної системи і метаболізму міокарда, зменшувати ступінь ацидозу, нормалізувати процеси вільнорадикального окислення, знижувати ферментемію, покращувати реологічні властивості крові. Перераховані ефекти сприяють поліпшенню функціонального стану міокарда, знижують енергетичний дефіцит при гіпоксіях складного генезу, підвищують адаптованість до фізичного навантаження. Наявність у розробленого кардіо- і ендотелійпротективного препарату КардІоаргінін-Здоров'я адаптогенно-актопротекторних властивостей підтверджує потенційну перспективність його застосування з метою метаболічної корекції порушень енергетичного обміну в ішемізованому міокарді у кардіологічних хворих, зокрема після важких захворювань (інфаркт міокарда, операція на серці). 2. Токсикологічні дослідження 2.1. Вивчення гострої токсичності препарату Кардіоаргінін-Здоров'я Метою даних досліджень є вивчення токсичності композиції під умовною назвою КардіоаргінінЗдоров'я, випущену з можливістю парентерально го введення у вигляді розчину для ін'єкції в гострих дослідах на щурах при внутрішньовенному, внутрішньоочеревинному і внутрішньом'язовому шляхах введення. Внутрішньовенне введення щурам досліджуваного препарату в дозі 5,0мл/кг загибелі тварин не викликало. У щурів відразу після першої ін'єкції препарату відмічалося пригнічення рухової активності, дихання прискорене. Через 20-30 хвилин після введення препарату тварини починали пересуватися по клітці, приймати їжу і пити воду. Після другої ін'єкції у всіх тварин відмічаються ті ж симптоми клінічної інтоксикації. При введенні щурам препарату внутрішньочеревно в дозі 8,0мл/кг спостерігалося прискорене дихання, тварини нерухомі. Через 40-50 хвилин вони починають пересуватися по клітці, умиватися, чистити шерсть. Внутрішньом'язове введення препарату в дозі 19,0мл/кг тварини перенесли спокійно. Після введення Кардіоаргінін-Здоров'я щури були малорухливі, у всіх тварин відмічалося потягування задніх лапок. Через 2-3 години поведінка дослідних тварин не відрізнялася від поведінки інтактних щурів. Протягом подальшого періоду спостережень (протягом 14 діб) загибелі тварин не спостерігалося. Стан шерстного покриву, слизових оболонок, споживання їжі і води, поведінкові реакції щурів, що вижили, відповідали інтактним тваринам. Результати динаміки приросту маси тіла щурів при різних шляхах введення досліджуваного препарату, представлені в таблиці 2.1. При внутрішньом'язовому шляху введення самці щурів достовірно додали в масі тіла, в порівнянні з початковими даними, а внутрішньовенне введення препарату приводило до незначної втрати маси тіла. Внутрішньочеревинне і внутрішньовенне введення препарату самкам щурів також викликало незначне зниження маси тіла, в порівнянні з початковими даними. Кардіоаргінін-Здоров'я при внутрішньом'язовому введенні не здійснював негативного впливу на приріст маси тіла, самки щурів достовірно додали в масі тіла в порівнянні з початковими даними. 15 90368 16 Таблиця 2.1 Динаміка маси тіла щурів при гострій дії препарату Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій Період спостереження Вихідні дані 3 доби 7 діб 14 діб Вихідні дані Здоби 7 діб 14 діб Вихідні дані 3 доби 7 діб 14 діб Маса тіла, г Самці Внутрішньочеревинно, в дозі 8,0мл/кг 268,00±3,39 261,00±6,20 265,00±8,80 276,00±8,80 Внутрішньовенно, в дозі 5,0мл/кг 267,00±3,39 259,00±3,32 257,00±5,61 261,00±5,34 Внутрішньом'язово, в дозі 19,0мл/кг 264,00±1,87 261,67±1,67 268,33±1,67 281,67±1,671 Самки 254,00±1,87 243,00±3,00 241,00±3,321 247,00±4,06 255,00±2,24 247,00±2,00 244,00±4,58 244,00±6,60 246,00±1,87 253,75±2,39 261,25±3,151 271,25±3,151 Примітка: * - p < 0,05 відносно вихідних даних Патоморфологічне дослідження. Патоморфологічне дослідження, проведене через 14 днів після одноразового введення препарату, включало аутопсію, макроскопічне дослідження внутрішніх органів щурів. У місцях ін'єкцій, куди вводили препарат (хвостова вена, очеревина і м'яз стегна) не виявлено ознак таких патологічних процесів як запалення, розлад кровообігу, атрофія, гіпертрофія. Після евтаназії тварини були ретельно обстежені на предмет видимих патологічних ознак. За даними розтину відхилень від норми виявлено не було. Шерсть блискуча, охайна, лімфатичні вузли не збільшені. Видимі слизисті оболонки блискучі, блідо-рожеві, гладкі. Всі макроскопічно досліджені органи (серце, легені, тимус, шлунок, печінка, нирки, надниркові залози, підшлункова залоза, селезінка, статеві залози) мали звичайні розміри, колір і консистенцію. Відносна маса внутрішніх органів щурів, при різних шляхах введення досліджуваного препарату (табл. 2.2), залишалася в межах фізіологічної норми. 17 90368 18 Таблиця 2.2 Коефіцієнти мас внутрішніх органів щурів після гострої дії препарату Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій Органи Самці Самки Внутрішньовенно, в дозі 5,0мл/кг Серце 0,43±0,031 0,37±0,013 Легені 0,86±0,092 0,79±0,048 Печінка 3,00±0,16 3,26±0,09 Селезінка 0,36±0,035 0,43±0,02 0,026±0,0008 0,028±0,001 Нирка: ліва права 0,37±0,026 0,37±0,021 0,33±0,018 0,33±0,017 Яєчко: ліве праве 0,68±0,039 0,68±0,032 Надниркові залози Тимус 0,08±0,008 0,11±0,005 Внутрішньочеревинно, в дозі 8,0мл/кг Серце 0,35±0,008 0,37±0,004 Яегені 0,90±0,085 0,83±0,039 Печінка 3,17±0,111 3,09±0,158 Селезінка 0,34±0,016 0,38±0,023 0,020±0,0020 0,026±0,0008 Нирка: ліва права 0,36±0,021 0,34±0,020 0,35±0,012 0,33±0,017 Яєчко: ліве праве 0,64±0,042 0,62±0,041 Тимус 0,10±0,006 Надниркові залози 0,11±0,007 Внутрішньом'язово, в дозі 19,0мл/кг Серце 0,39±0,005 0,37±0,007 Яегені 0,77±0,012 0,74±0,022 Печінка 3,08±0,083 3,16±0,017 Селезінка 0,36±0,004 0,35±0,010 0,025±0,0004 0,030±0,0006 Нирка: ліва права 0,37±0,010 0,37±0,009 0,36±0,007 0,36±0,010 Яєчко: ліве праве 0,65±0,019 0,65±0,016 Тимус 0,07±0,006 Надниркові залози 0,11±0,006 19 На підставі результатів вивчення гострої токсичності при внутрішньочеревинному (у дозі 8,0мл/кг), внутрішньовенному (у дозі 5,0мл/кг) і внутрішньом'язовому (у дозі 19,0мл/кг) шляхах введення можна зробити наступні висновки, що препарат КардіоаргінінЗдоров'я на рівні випробуваних доз: - не викликає загибелі тварин; - не проявляє видову і статеву чутливість; - не здійснює токсичного впливу на загальний стан, поведінку, споживання їжі і води, масу тіла тварин; - не впливає на абсолютну і відносну масу внутрішніх органів щурів; - не викликає видимих змін внутрішніх органів щурів; - згідно загальноприйнятої класифікації відноситься до практично нетоксичних речовин. 2.2. Дослідження морфоструктури внутрішніх органів і тканин експериментальних тварин. Мікроскопічне дослідження внутрішніх органів щурів Серце. На препаратах міокарда контрольних тварин і тварин після дії препарату виявляються звичайні за товщиною, анастомозуючі між собою м'язові волокна з елементами ендомізію, співвідношення між якими знаходиться в межах норми. Міжпучкові простори невеликі, клітинна насиченість їх у більшості тварин помірна, у частини збільшена (лімфоцити). Ядра кардіоміоцитів в цілому подовжено-овальної форми, нормохромні. Поперечна покресленість міофібрил, що займають всю вільну від ядра саркоплазму кардіоміоцитів, достатньо виразна. Судини помірно повнокровні. Печінка. Малюнок тканини у тварин всіх експериментальних груп звичайний, межі часточок змащені, радіальна спрямованість печінкових пластинок збережена. Міжчасточкові сполучнотканинні прошарки не виражені. Зони портальних трактів не розширені. Гепатоцити з незміненими тинкториальними властивостями містять чітко визначувані 1-2 ядра, частину ядер з невеликою гіперхромією. Ступінь вираженості анізонуклеозу незначна і порівняна у всіх групах. Ядерець переважно 1-2 на ядро. У дослідних тварин практично у всіх мікропрепаратах визначається значне число гепатоцитів, що знаходяться в стані мітотичного ділення (Фіг.2.1). Причому після дії меншої дози препарату число таких клітин більше. В середньому на мікропрепарат в дозі 0,25мл/кг доводиться 4,06 мітозів, в дозі 2,5мл/кг - 3,5. Як відомо, в печінці клітини вступають в мітоз в такій кількості лише в процесі регенерації при пошкодженнях органу. В даному випадку ніяких змін структури органу візуалізовано не було. Мікроциркуляторних порушень не виявлено. 90368 20 Нирки. У тварин всіх груп спостерігається чітке розділення на кору і мозкову речовину. Кіркові ниркові клубочки помірно варіабельні за розмірами, гломерулярна сітка в них має виразний ажурний малюнок. Повнокров'я капілярів, клітинна насиченість і вираженість сечового простору в клубочках дослідних тварин не відрізняється від контролю так само, як і щільність розташування самих клубочків в кірковій речовині. Після введення препарату в дозі 0,25мл/кг стан канальців різних відділів нефрону відповідає нормі (Фіг.2.2). Епітеліоцити кінцевих відділів збірних трубок не змінені. Стан внутрішньоорганних судин не порушений. Після ін'єкцій препарату в дозі 2,5мл/кг відмічено певні зміни. У цитоплазмі епітеліоцитів канальців проксимального і дистальних відділів нефронів визначаються або краплі еозинофільного кольору, характерні для білкової дистрофії, або вже гідропічна дистрофія клітин. Вони збільшені в розмірах, заповнені вакуолью, апікальна їх частина злущена (Фіг.2.3). Селезінка. Капсула, що покриває орган у тварин всіх груп, не потовщена, трабекулярна система не виражена. Межа між білою і червоною пульпою іноді розпливчаста. Біла пульпа в селезінках щурів представлена клітинними структурами округлої, овальної, витягнутої форми, що майже завжди мають чотири виражені зони: періартеріальну, мантійну, маргінальну і гермінативний центр. Центральні артерії розташовані в Т-зонах, як правило, ексцентрично, стінки їх не змінені, просвіт вільний. Візуальне співвідношення площ цих зон, а також співвідношення між червоною і білою пульпою у дослідних щурів порівнянне з контролем. 21 Тимус. На препаратах тимуса всіх щурів видно сформовані часточки різної величини з чітким розділенням на кіркову і мозкову речовину. Ширина субкапсулярної зони, співвідношення шарів, клітинна щільність в них порівнянна у контрольних і дослідних щурів. Кора містить переважно малі і середні лімфоцити з мізерною цитоплазмою. У медуллі визначаються менш щільно розташовані середні і великі тимоцити. Розвиток епітеліоретикулярного компоненту знаходиться на контрольному рівні, тимічні тільця дрібні, нечисленні. Надниркові залози всіх тварин зберігають властиву їм гістоструктуру. Співвідношення між шарами і зонами у дослідних щурів відповідає контрольним показникам, так само, як і вміст ліпідів в клітинах клубочкової і пучкової зон. Клубочкова зона кори містить клітини з невеликими ядрами, в цитоплазмі є включення у вигляді окремих крапель ліпідів. Клітини пучкової зони відрізняються крупнішими розмірами ядер, а цитоплазма їх із-за певного змісту ліпідів має ажурний вигляд. Осередків деліпідизації не визначалося. У сітчастій зоні зустрічаються клітини з гіпо- і гіперхромними ядрами. Мозковий шар без особливостей. Підшлункова залоза. На зрізах всіх щурів видно розділені тонкими перегородками залізисті час 90368 22 точки. Екзокринна частина представлена щільно розташованими ацинусами. Співвідношення між апікальною і базальною частинами панкреоцитів, також як і розташування ядер, що добре визначаються, дозволяє судити про деяку асинхронність в роботі різних груп ацинусів. Ацинуси, панкреоцити яких знаходяться у фазі активного вироблення секрету, знаходяться по сусідству з ділянками в стані спокою. Ендокринний апарат представлений острівцями округло-овальної форми, переважають утворення середніх і крупних розмірів. 2.3 Вивчення ембріотоксичної дії препарату Об'єктом дослідження є композиція під умовною назвою Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій в ампулах по 5мл, серія 10607. Досліди по вивченню ембріотоксичності препарату проводили на нелінійних статевозрілих щурах-самках. Для спаровування використовували 120 щурів-самок масою тіла 180-220г і 24 самця масою тіла 230-250г. Виведення всіх вагітних самок з експерименту проводили на 20-й день вагітності. На розтині реєстрували кількість жовтих тіл в яєчниках, місць імплантації в матці, число живих, мертвих, резорбованих плодів, на підставі чого визначали перед- і післяімплантаційну загибель, загальну ембріональну смертність. Протягом всього експерименту поведінка і стан вагітних самок щурів, що отримували досліджуваний препарат в дозах 0,25мл/кг і 2,5мл/кг з 1 по 19 день вагітності, була в нормі. Тварини охоче поїдали корм, пили воду, додавали в масі тіла, рівнозначно з контрольними тваринами. Аналіз результатів, представлених в таблиці 2.3, показав, що у самок, що отримували препарат в досліджених дозах, загибель ембріонів до імплантації трохи вище за значення контрольної групи (4,40% в контролі, 7,79% і 7,93% в дослідних групах), проте, ці відмінності не носять достовірного характеру. Післяімплантаційна загибель при дії препарату (14,20% і 13,99% відповідно) не відрізняється достовірно від показника контрольної групи самок (9,88%). Показники загальної ембріональної смертності вище за показники самок з контрольної групи (20,93% і 21,06% в дослідних групах, 13,71% - контрольна група), проте, відмінності між групами статистично недостовірні. Введення препарату в обох досліджених дозах в цілому не здійснювало негативного впливу на розвиток плодів. Проте, в групі що отримувала препарат в дозі 0,25мл/кг у однієї самки маса тіла всіх плодів була від 0,92до 1,48г, краніокаудальний розмір плодів від 18 до 26мм. У групі, що отримувала препарат в дозі 2,5мл/кг у 2 самок маса тіла плодів була менше грама (0,68-1,0), краніокаудальний розмір плодів від 17-20мм, а у 4 самок плоди важили від 1,26 до 1,74 г, і краніокаудальний розмір плодів - 19-27 мм. Візуальний огляд не виявив видимих пороків розвитку плодів. Кількість підшкірних геморагій у плодів дослідних і контрольних приплодів порівнянно. 23 90368 24 Таблиця 2.3 Показники, що характеризують ембріолетальність препарату Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій 14 Кардіоаргінін у дозі 0,25мл/кг 14 Кардіоаргінін у дозі 2,5мл/кг 12 10,29±1,68 11,71±1,38 11,64±1,96 9,79±1,48 1,00±1,18 8,79±1,63 2,24±0,31 0,59±0,10 10,86±2,07 0,64±1,01 9,36±3,52 2,18±0,32 0,51±0,07 10,64±1,80 0,55±1,04 10,90±1,92 1,66±0,51 0,48±0,09 0,27±0,05 0,25±0,04 0,25±0,05 31,07±1,85 29,85±2,30 3,16±0,04 4,40 7,79 7,93 9,88 14,20 13,99 13,71 20,93 21,06 Показники Контрольна група Число вагітних самок Число на одну самку: жовтих тіл місць імплантації місць резорбції Живих плодів Маса плодів, г Маса плаценти, г Плацентарно-плодовий коефіцієнт Краніо-каудальний розмір, мм Передімплантаційна гибель, % Післяімплантантаційна гибель, % Загальна ембріональна смертность, % Таким чином, в групі самок, яким препарат вводили в дозі 0,25мл/кг у 8% плодів з 143 обстежених плодів, відзначається гіпотрофія тіла. У другій дослідній групі самок, що отримували препарат в дозі 2,5мл/кг у 53% плодів (загальна кількість плодів 111), також відзначається гіпотрофія тіла плодів, що носить більш виражений характер. 2.4. Вивчення сенсибілізувальної дії препарату Об'єктом дослідження була композиція під умовною назвою Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій. Дослідження виконані на статевозрілих морських свинках самках масою тіла 300-350г. Всього в експерименті використано 24 морські свинки, які розподілені на 3 групи по 8 голів в кожній. Кон'юнктивальна проба Сенсибілізацію морських свинок препаратом Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій проводили, використовуючи дози 0,18мл/кг і 0,90мл/кг. Урахування можливої сенсибілізуючої дії в даному тесті здійснювали на 21-22 добу після початку введення препарату. Було встановлено, що у морських свинок, сенсибілізованих досліджуваним препаратом в дозах 0,18мл/кг і 0,90мл/кг, позитивна реакція не була зареєстрована у жодної тварини як через 15хв., так і через 24год. після інстиляції дозволяючої дози препарату в око. Таблиця 2.4 Результати кон'юнктивальної проби у морських свинок, сенсибілізованих препаратом Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій Експериментальні групи n Доза, мл/кг Контроль Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій 8 8 8 0,18 0,90 Враховуючи відсутність позитивної реакції в провокаційній кон'юнктивальній пробі в групах тварин, сенсибілізованих досліджуваним препаратом в досліджуваних дозах, слід зробити висновок, що препарат Кардіоаргінін-Здоров'я на рівні випробуваних доз не викликає розвиток реакції гіперчутливості негайного типу і реакції гіперчутливості сповільненого типу. Таким чином, результати провокаційного кон'юнктивального тесту свідчать про те, що препарат Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій в обох % тварин з позитивною реакцією через... 15хв. 24год. 0 0 0 0 0 0 вивчених дозах не викликає сенсибілізацію організму морських свинок. Після постановки кон'юнктивальної проби у експериментальних тварин здійснювали забір крові і проводили визначення рівня ЦПС, реакцію непрямої дегрануляції мастоцитов, загальної кількості лейкоцитів і лейкоцитарної формули. Рівень циркулюючих імунних комплексів Розвиток алергічних процесів в організмі нерідко супроводжується зміною кількості імунних комплексів, зокрема циркулюючих в крові. Резуль 25 90368 тати визначення рівня ЩК представлені в таблиці 2.5. Наведені дані вказують на відсутність статистично достовірних відмінностей між показниками у морських свинок, сенсибілізованих досліджуваним препаратом в дозах 0,18мл/кг і 0,90мл/кг, з контрольною групою. 26 Отримані результати свідчать, що композиція під умовною назвою Кардіоаргінін-Здоров'я на рівні випробуваних доз не викликає розвиток алергічних реакцій з домінуючим імунокомплексним механізмом. Таблиця 2.5 Рівень ЦІК в сироватці крові морських свинок, сенсибілізованих препаратом Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій Експериментальні групи n Доза, мл/кг Контроль Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій 8 8 8 0,18 0,90 Непряма реакція дегрануляції мастоцитів Результати, отримані при вивченні алергізувальної дії препарату Кардіоаргінін-Здоров'я в реакції непрямої дегрануляції мастоцитів, свідчать про те, що в дослідних групах препарат не викликав посилення процесу дегрануляції мастоцитів в порівнянні з контролем. У всіх тварин дослідних груп Кількість ЦІК, усл. од. 62,0±4,5 57,6±4,8 63,1±3,8 реакція була негативною (дегранулювало менше 10% мастоцитів). Результати кількісного визначення сенсибілізуючої дії досліджуваного препарату в даному тесті представлені в табл. 2.6. Слід зазначити, що за наслідками алерготесту НРДМ досліджуваний препарат в дозах 0,18мл/кг і 0,90мл/кг не володіє алергенними властивостями. Таблиця 2.6 Результати непрямої реакції дегрануляції мастоцитів сенсибілізованих препаратом Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій Експериментальні групи Контроль Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій n 8 8 8 Отримані результати свідчать, що застосування препарату Кардіоаргінін-Здоров'я на рівні випробуваних доз не індукувало в організмі морських свинок синтез антитіл, які з'єднуючись з антигеном, могли б викликати пошкодження клітин мішеней (в даному випадку тканинних базофілів щурів). Кількість лейкоцитів ілейкограма Розвиток алергічних процесів в організмі може супроводжуватися збільшенням кількості лейкоци Доза, мл/кг 0,18 0,90 Показник НРДМ, % 0,75 ± 0,25 1,25 ± 0,37 1,38 ± 0,35 тів в периферичній крові і зміною їх морфологічного складу. Як випливає з даних, представлених в табл. 2.7, у морських свинок, сенсибілізованих досліджуваним в дозах 0,18мл/кг і 0,90мл/кг, не зареєстровано підвищення кількості лейкоцитів, а також змін в лейкограмі, типових для процесу розвитку сенсибілізації організму. Таблиця 2.7 Кількість лейкоцитів і лейкоформула морських свинок, сенсибілізованих препаратом Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій Показники Кількість лейкоцитів, Г/л Нейтрофіли паличкоядерні,% Нейтрофіли сегменто-ядерні, % Еозинофіли, % Моноцити, % Базофіли, % Лімфоцити, % Контроль 6,5±0,29 0,5±0,27 24,9±2,30 1,5±0,27 5,8±0,53 0,5±0,27 66,9±2,60 Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій доза 0,18мл/кг доза 0,90мл/кг 7,1±0,32 6,9±0,38 0,3±0,16 0,3±0,25 27,9±1,62 26,5±4,16 1,3±0,16 1,1±0,12 6,0±0,32 5,4±0,62 0,5±0,27 0,8±0,31 64,1±1,49 66,0±4,32 27 90368 Слід зазначити, що в процесі постановки алерготестів видимі зміни клінічного стану експериментальних тварин були відсутні. Проведені дослідження показали, що композиція під умовною назвою Кардіоаргінін-Здоров'я не викликає сенсибілізацію організму морських свинок, що виражається негативною реакцією в провокаційній кон'юнктивальній пробі, відсутності статистично достовірних змін в порівнянні з контрольною групою рівня ЦПС, показника НРДМ, а також загальної кількості лейкоцитів і показників лейкоцитарної формули. 2.5. Вивчення імунотоксичності препарату Об'єктом дослідження була композиція під умовною назвою Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій. Дослідження виконані на білих безпородних мишах обох статей масою тіла 18-22г. Оцінку імунотоксичності препарату Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій проводили в 2-х серіях експериментів. У 1-й серії на моделі антитілогенезу досліджували гуморальний імунітет, в 2-й серії клітинний імунітет оцінювали по реакції гіперчутливості сповільненого типу. Вплив на гуморальну ланку імунітету 28 Дослідження впливу лікарських препаратів в експериментальних моделях з використанням мишей, сенсибілізованих еритроцитами барана (ЕБ), дає уявлення про дію препаратів на первинну імунну відповідь при введенні антигену. Найбільш інформативними показниками функціональної активності гуморальної ланки імунітету є визначення титрів антитіл в сироватці крові і числа антитілоутворюючих клітин в селезінці, що утворюються у відповідь на введення антигена ЕБ. Титри сироваткових гемаглютинінів визначали в реакції гемаглютинації (ГА). ГА обумовлена видимим злипанням еритроцитів в результаті реакції антиген-антитіло. За допомогою ГА можна виявляти антитіла до різних антигенів мембрани еритроцитів. Постановка реакції ГА проводилася у ряді двократних послідовних розведень сироватки крові, починаючи з 1:2. Титри антитіл виражали у вигляді логарифмів з основою 2 (log2). Як випливає з даних, представлених в таблиці 2.8, застосування препарату КардіоаргінінЗдоров'я, розчин для ін'єкцій в обох вивчених дозах не здійснює впливу на вираженість синтезу сироваткових гемаглютинінів при первинній імунній відповіді. Таблиця 2.8 Титри гемаглютинінів до ЕБ в крові імунізованих мишей, що отримували препарат Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій Експериментальні групи Контроль Кардіоаргінін-Здоров'я, для ін'єкцій n 10 10 10 розчин Доза, мл/кг 0,2 2,0 Кількісне визначення прямих антитілоутворюючих клітин (АУК) селезінки проводили за допомогою методу локального гемолізу еритроцитів в гелі агарози. Цей метод дозволяє здійснювати кількісні дослідження складного процесу утворення Влімфоцитами антитіл in vivo. Лімфоцити селезінки змішують з густою суспензією індикаторних еритроцитів. При подальшій інкубації плазматичні клітини синтезують антитіла, які дифундують в навколишнє середовище і фіксуються на еритроцитах. У присутності комплементу відбувається лізис червоних кров'яних клітин, утворюються зони гемолізу - світлі крупні плями. В центрі Титри антитіл, log2 (X±sx) 5,20±0,33 5,10±0,46 5,30±0,33 кожної зони гемолізу знаходиться антитілоутворююча клітина (АУК). В цілому число АУК відповідає числу зон гемолізу. Метод локального гемолізу дозволяє виявити і точно визначити кількість АУК у великій популяції лімфоцитів. По числу макроскопічно видимих зон гемолізу еритроцитів навколо окремих АУК підраховують число продуцентів антитіл з розрахунку на цілий орган або на певне фіксоване число клітин. Результати кількісного визначення АУК у мишей при внутрішньочеревинному застосуванні досліджуваного препарату представлені в таблиці 2.9 Таблиця 2.9 Вміст антитілоутворюючих клітин в селезінці імунізованих мишей, що отримували препарат Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій Експериментальні групи n Доза, мл/кг Контроль Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій 10 10 10 0,2 2,0 Отримані дані свідчать про те, що композиція під умовною назвою Кардіоаргінін-Здоров'я, роз Кількість АУК з розрахунку на селезінку (X±sx) 20672±1074 21032+1012 21704±823 чин для ін'єкцій в обох вивчених дозах не викликає статистично достовірних змін кількості АУК в селе 29 90368 зінці мишей у відповідь на імунізацію еритроцитами барана. Таким чином, в результаті проведених досліджень встановлено, що композиція під умовною назвою Кардіоаргінін-Здоров'я на рівні випробуваних доз не здійснює впливу на синтез специфічних антитіл при первинній імунній відповіді і кількість антитілопродуцентів в селезінці мишей у відповідь на імунізацію еритроцитами барана. Вказане свідчить, що досліджуваний препарат в дослідженому діапазоні доз не здійснює негативного впливу на гуморальну ланку імунітету. Вплив на клітинну ланку імунітету Вивчення імунотоксичної дії препарату Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій відносно клітинної ланки імунітету проводилося в модельній 30 системі, що кількісно характеризує дію даного препарату при розвитку реакцій клітинного типу. При цьому була використана реакція гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ). ГСТ є експериментальною моделлю по вивченню продукції сенсибілізованими лімфоцитами медіаторів, що залучають фагоцити до імунної відповіді. Отримані результати, представлені в таблиці 2.10, свідчать про те, що при застосуванні препарату Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій в обох вивчених дозах не спостерігається якихнебудь змін показника ГСТ у порівнянні з контролем. Вказане дозволяє зробити висновок про те, що препарат Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій не робить негативного впливу на клітинну форму реагування. Таблиця 2.10 Вираженість реакції гіперчутливості сповільненого типу у імунізованих мишей, що отримували препарат Кардіоаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій Експериментальні групи Контроль Кардюаргінін-Здоров'я, розчин для ін'єкцій Таким чином, досліджувана композиція під умовною назвою Кардіоаргінін-Здоров'я на рівні випробуваних доз, за наслідками провокаційної проби і імунологічних тестів, не проявляє сенсибілізуючої активності і не володіє алергізувальною дією. Крім того, композиція за рахунок підбору якісного і кількісного складу компонентів діючого початку композиції, а також за рахунок регулювання співвідношення кількості компонентів діючого по Комп’ютерна верстка Л. Купенко Доза, мл/кг 0,2 2,0 n 10 10 10 Індекс реакції, % (X±sx) 9,43±0,55 10,67±1,08 10,20±0,76 чатку композиції, дозволяє забезпечити взаємне посилення активності компонентів композиції, дозволяє понизити або виключити негативні побічні ефекти, внаслідок чого забезпечує комплексну дію на серцево-судинну систему. Також розроблений спосіб лікування серцево-судинних захворювань за допомогою композиції, що має властивості, перераховані вище. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601