Транспортний білок, що застосовується для введення хімічних сполук до нервових клітин

1. Транспортний білок, отриманий модифікацією важкого ланцюга нейротоксину, утвореного Сlostridium botulinum типу А, причому щонайменш одна амінокислота в амінокислотних положеннях 1092-1296 білкових послідовностей ботулінового 2 (19) 1 3 видалені або заміщені, переважно в положеннях 1117/1252, 1117/1253, 1117/1262, 1117/1278, 1117/1279, 1117/1252/1253, особливо переважно Y1117A/F1252Y, Y1117A/H1253K, Y1117A/V1262I, Y1117A/L1278H, Y1117A/G1279N, Y1117C/F1252Y, Y1117C/H1253K, Y1117C/V1262I, Y1117C/L1278H, Y1117C/G1279N, Y1117V/F1252Y, Y1117V/H1253K, Y1117V/V1262I, Y1117V/L1278H, Y1117V/G1279N, Y1117A/F1252Y/H1253K, Y1117C/F1252Y/H1253K та Y1117V/F1252/H1253K. 12. Транспортний білок за п. 4, де амінокислоти 1092-1296 нейротоксину типу A Clostridium botulinum, що містить домен зв'язування з гангліозидом, заміщені наступними послідовностями: нейротоксинового білка типу B Clostridium botulinum, амінокислоти 1079-1291, нейротоксинового білка типу C1 Clostridium botulinum, амінокислоти 1093-1291, нейротоксинового білка типу D Clostridium botulinum, амінокислоти 1080-1276, нейротоксинового білка типу E Clostridium botulinum, амінокислоти 1067-1252, нейротоксинового білка типу E Clostridium butyricum, амінокислоти 1067-1251, нейротоксинового білка типу F Clostridium botulinum, амінокислоти 1085-1278, нейротоксинового білка типу F Clostridium baratii, амінокислоти 1076-1268, нейротоксинового білка типу G Clostridium botulinum, амінокислоти 1087-1297. 13. Транспортний білок за п. 4, де повний фрагмент HС нейротоксину типу A заміщений повним фрагментом Н С одного з інших типів нейротоксину, де переважно повний фрагмент H С BoNT/A (амінокислоти 867-1296) заміщений, зокрема, фрагментом HС BoNT/B (амінокислоти 866-1291). 14. Композиція, що містить транспортний білок за будь-яким з пп. 1-13, та щонайменш одну проміжну молекулу. 15. Композиція за п. 14, де проміжна молекула ковалентно зв'язана пептидним зв'язком, зв'язком складного ефіру, зв'язком простого ефіру, сульфідним зв'язком, дисульфідним зв'язком або зв'язком вуглець-вуглець. 16. Композиція за п. 14, де проміжна молекула включає невелику органічну молекулу, пептид або білок. 17. Композиція за п. 16, де невеликою органічною молекулою є вірусстатик, цитостатик, антибіотик або імуноглобулін. 18. Композиція за п. 16, де білок включає протеазу. 19. Композиція за п. 18, де протеаза включає нейротоксиновий білок типу A, B, C1, D, E, F та G Clostridium botulinum. 20. Композиція за п. 19, яка відрізняється тим, що містить послідовність His-Glu-Leu-Xaa-His-(Xaa)33-35Glu-(Xaa)84-90-Glu-(Xaa)11-Arg-Xaa-Xaa-Tyr, де Xaa може бути будь-якою амінокислотою. 21. Композиція за п. 18, де протеаза містить протеолітично активний фрагмент, що походить від білка типу A, B, С1, D, E, F та G Clostridium botulinum. 22. Композиція за п. 21, яка відрізняється тим, що містить послідовність His-Glu-Leu-Xaa-His-(Xaa)33-35 93359 4 Glu-(Xaa)84-90-Glu-(Xaa)11-Arg-Xaa-Xaa-Tyr, де Xaa може бути будь-якою амінокислотою. 23. Композиція за будь-яким з пп. 19-22, де протеаза розщеплює специфічні субстрати в холінергічних рухових нейронах. 24. Композиція за п. 23, де субстрати вибрані з білків, залучених до вивільнення нейротрансмітерів в периферійних нервах, та з білків, здатних до каталітичної реакції в нервовій клітині. 25. Композиція за п. 24, де протеаза та транспортний білок ковалентно зв'язані амінокислотною послідовністю, яка специфічно розпізнається та розщеплюється ендопептидазою. 26. Композиція за п. 25, де після розщеплення ендопептидазою дисульфідний місток зв'язує протеазу та транспортний білок, що, в свою чергу, приводить до утворення активного голотоксину. 27. Фармацевтична композиція, що містить транспортний білок за будь-яким з пп. 1-13 або композицію за будь-яким з пп. 14-26, а також необов'язково фармацевтично прийнятний наповнювач, розріджувач та/або допоміжну речовину. 28. Фармацевтична композиція за п. 27, що застосовується для лікування розладу або хвороби, для якої показана терапія з ботуліновим нейротоксином. 29. Фармацевтична композиція за п. 28, де розладом або хворобою є одна з наступних: геміспазм лицьового нерва, спастична кривошия, спастичності, дистонії, мігрень, біль, розлади шийного та поперекового відділу хребта, страбізм, гіперсалівація та депресивні хвороби. 30. Косметична композиція, що містить транспортний білок за будь-яким з пп. 1-13 або композицію за будь-яким з пп. 14-26, а також необов'язково фармацевтично прийнятний наповнювач, розріджувач та/або допоміжну речовину. 31. Композиція за п. 30, де косметичними показаннями є рясне потіння та значно виражені лицьові зморшки. 32. Спосіб отримання транспортного білка за будьяким з пп. 1-13 або композиції за будь-яким з пп. 1426 шляхом рекомбінації, де домен зв'язування гангліозиду кодується нуклеїновими кислотами, що містять ендонуклеїнові зони контакту, які фланкують протеазу, та де рестриктивні ендонуклеазні сайти схожі з такими в інших доменах зв'язування гангліозиду нейротоксинів Clostridium botulinum, щоб дозволити їх легке модульне заміщення, зберігаючи подібність амінокислотній послідовності. 33. Спосіб за п. 32, де протеаза кодується нуклеїновими кислотами, що містять рестриктивні ендонуклеазні зони контакту, які фланкують протеазу, та де рестриктивні ендонуклеазні зони контакту схожі, щоб дозволити їх легке модульне заміщення протеазними доменами нейротоксинів Clostridium botulinum, зберігаючи подібність амінокислотній послідовності. 34. Вектор експресії, де вектор включає нуклеїнову кислоту, що кодує транспортний білок за будь-яким з пп. 1-13 або композицію за будь-яким з пп. 14-26. 35. Вектор експресії за п. 34, що експресований у клітині хазяїна. 5 93359 6 36. Вектор експресії за п. 35, де клітиною хазяїна може бути клітина Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris або Bacillus megaterium. Даний винахід стосується транспортного білка, який зв'язується з нейронами, переноситься рецептор-опосередкованим ендоцитозом та переміщається від кислоти, ендосомального компартменту у цитозоль нейронів. Зазначений білок застосовується як транспортний засіб для переміщення інших хімічних речовин (наприклад, протеаз), які фізіологічно не здатні до проникнення у цитозоль нервових клітин крізь плазматичну мембрану. Даний винахід стосується використання транспортного білка для інгібування вивільнення нейротрансмітерів. Нервові клітини вивільняють трансмітерні речовини шляхом екзоцитозу. Злиття мембран внутрішньоклітинних везикул з плазматичною мембраною розглядають як екзоцитоз. Протягом цього процесу вміст везикул одночасно виливається до синаптичної щілини. Злиття двох мембран регулюється кальцієм, що реагує з білком сінаптотагміном. Разом з іншими кофакторами сінаптотагмін регулює статус трьох так званих злитих білків, SNAP-25, синаптобревін 2 та синтаксин 1А. Тоді як синтаксин 1А та синаптобревін 2 розподілені в плазмі та/або мембрані везикули, SNAP-25 тільки злегка зв'язується з плазматичною мембраною. У випадку, коли внутрішньоклітинна концентрація кальцію підвищується, три білка зв'язуються один з одним, обидві мембрани наближаються одна до одної, а потім зливаються разом. У випадку холінергічних нейронів вивільняється ацетил холін, спричиняючи скорочення м'яза, перспірацію та інші холінергічно спровоковані реакції. Вищезгадані злиті білки являють собою молекули-мішені (субстрати) легких ланцюгів клостридіальних нейротоксинів, що утворюються бактерією Clostridium botulinum. Анаеробна, грам-позитивна бактерія Clostridium botulinum утворює сім різних типів білкових нейротоксинів. Останні розглядаються як нейротоксини Botulinus (BoNT/A - BoNT/G). Серед них, зокрема BoNT/A та BoNT/B спричиняють нейропаралітичний розлад у людей та тварин, так званий ботулізм. Спори Clostridium botulinum можна знайти в грунті, але також вони можуть з'явитися в неправильно стерилізованих та закупорених домашніх продуктових консервах, яким приписують багато випадків ботулізму. BoNT/A є найбільш летальним з усіх відомих біологічних речовин. Тільки 5 - 6 пг очищеного BoNT/A складає MLD (мінімальну низьку дозу). Одна одиниця - U (від англійської - Unit, U) BoNT визначають як MLD, що вбиває половину самок мишей Swiss Webster, кожна з яких важить 18-20 г, після внутрішньоочеревинної ін'єкції. Охарактеризовано сім імунологічно різних BoNT. Їх позначають BoNT/A, В, С1, D, Е, F і G та відрізняють за нейтралізацією антитіл специфічних серотипів. Різні серотипи BoNT відрізняються у уражених видів тварин за серйозністю та тривалістю спри чиненого паралічу. Таким чином, відносно паралічу, BoNT/A в 500 разів більш сильний, наприклад, на щурах, ніж BoNT/B. Крім того, виявилось, що BoNT/B не токсичний для приматів при дозі 480 U/кг ваги тіла. Така сама кількість BoNT/A відповідає 12 летальним дозам (LD) цієї речовини на приматах. З іншого боку, тривалість паралічу у мишей після ін'єкції BoNT/A у десять разів довше, ніж після ін'єкції BoNT/E. Нейротоксини BoNT застосовують клінічно для лікування нейром'язових розладів, що характеризуються гіперактивністю скелетних м'язів, спричиненою патологічно надактивними периферичними нервами. BoNT/A схвалений Управлінням по контролю за харчовими продуктами та лікарськими засобами США для лікування блефароспазму, страбізму та геміспазмів лицьового нерву. У порівнянні з BoNT/A інші серотипи BoNT очевидно менш ефективні та проявляють більш коротку тривалість дії. Клінічні дії BoNT/A, введеного периферично внутрішньом'язово, звичайно відмічають протягом тижня. Тривалість супресії симптомів однією окремою внутрішньом'язовою ін'єкцією BoNT/A складає звичайно близько 3 місяців. Клостридіальні нейротоксини специфічно гідролізують різні білки апарату злиття. BoNT/A, С1 та Ε розщеплюють SNAP-25, тоді як BoNT/B, D, F, G, а також нейротоксин правця (TeNT) уражує мембранний білок, асоційований з везикулою, (VAMP) 2, який також називають синаптобревін 2. Крім того BoNT/С1 розщеплює синтаксин 1А. Бактерії Clostndium вивільняють нейротоксини у вигляді одно-ланцюгових поліпептидів, кожен з яких складається з 1251-1315 амінокислот. Після цього ендогенні протеази розщеплюють кожен з цих білків у визначеному положенні на 2 ланцюги (одноланцюговий розрив), ці два ланцюги, однак, залишаються зв'язаними дисульфідним містком. Ці двохланцюгові білки згадуються як голотоксини (див. Shone et al. (1985), Eur J Biochem 151, 75-82). Ці два ланцюги мають різні функції. У той час як менший фрагмент, легкий ланцюг (легкий ланцюг = LC), являє собою Zn2+-залежну ендопротеазу, більша одиниця (важкий ланцюг = НС) являє собою транспортний засіб легкого ланцюга. Обробляючи НС ендопептидазами отримали два 50 кДа фрагмента (див. Gimenez et al. (1993), J Protein Chem 12, 351-363). Аміно-кінцева частина (фрагмент HN) інтегрується з мембранами при низькому значенні рН та дозволяє LC проникати до цитозолю нервової клітини. Карбокси-кінцeва частина (фрагмент НС) зв'язується із складними полісіалогангліозидами, що присутні виключно в мембранах нервових клітин, та з білковими рецепторами, не ідентифікованими до наступного часу (Halpern et al. (1993), Curr Top Microbial Immunol 195, 221-241). Останнє пояснює високу нейроселективність клостридіальних нейротоксинів. Кристалічні структури підтверджують, що BoNT/A позбавляється трьох 7 доменів, що може узгоджуватися з трьома етапами механізму дії (див. Lacy et al. (1998), Nat Struct Biol 5, 898-902). Крім того, ці дані приводять до висновку, що в фрагменті НС існують дві автономні суб-одиниці (суб-домена) по 25 кДа кожна. Перше підтвердження існування двох функціональних суб-доменів зумовлено аміно-кінцевою (HCN) та карбокси-кінцевою частиною (НСС) фрагменту Hc TeNT, який був експресований в рекомбінантній формі та який показав, що домен ΗCC, а не HCN зв'язується з нейронами (див. Herreros et al. (2000), Biochem J 347, 199-204). Сайт зв'язування з рецептором білка сінаптотагміну знайшли в доменах НСС BoNT/B та G, що доказує їх окремі функціональні призначення (див. Rummel et al. (2004), J Biol Chem 279, 30865-70). При фізіологічних умовах НС зв'язується з нейронними гангліозидами, потрапляє в клітину шляхом рецептор-опосередкованого ендоцитозу, та досягає природної везикульної циркуляції через ендосомальний компартмент. В кислотному середовище ранніх ендосом аміно-кінцева частина (HN) HC проникає в мембрану везикули та утворює пору. Кожна речовина (X), зв'язана з НС через дисульфідний місток, буде відщеплюватися від НС внутрішньоклітинними окисно-відновними системами, що відкриває доступ до дисульфідного містка та редукує його. X зрештою з'явиться в цитозолі. У випадку клостридіальних нейротоксинів НС являє собою носій для LC, розщеплюючи його специфічний субстрат в цитозолі на кінцевому етапі. Цикл утворення комплексу та дисоціація злитих білків переривається, та, через це, вивільнення ацетил холіну інгібується. У результаті смугасті м'язи паралізуються, а потові залозі припиняють свою секрецію. Активний період індивідуальних серотипів BoNT відрізняється та залежить від присутності непошкодженого LC в цитозолі. Оскільки усі нейрони мають рецептори для клостридіальних нейротоксинів, то вивільняється не тільки ацетил холін, який може бути зачепленим, але потенційно також вивільняється речовина Р, норадреналін, GABA (гамааміномасляна кислота), гліцин, ендорфін та інші трансмітери та гормони. Переважне блокування холінергічної передачі можна пояснити тим фактом, що НС в периферії потрапляє в нейрон. Центральні синапси захищені гематоенцефалічним бар'єром, який білки не можуть подолати. НС мають високу афінність до периферійних нервових клітин, опосередковану переважно взаємодією із складними полісіалогангліозидами - гліколь ліпідами, що складаються з більш ніж однієї сіалінової кислоти (див. Halpern et al. (1995), Curr Top Microbiol Immunol 195, 221 - 41). У результаті LC, що зв'язуються з ними, досягають клітин тільки цього типу та стають активними тільки в цих клітинах. BoNT/A та В зв'язують кожний лише одну молекулу гангліозида GT1b. Щоб дослідити роль, яку відіграють амінокислоти, що будують зв'язувальний «карман», за даним винаходом створили рекомбінантний фрагмент НС. Дана методика дозволяю замінювати 93359 8 окремі амінокислоти. Таким чином, позитивно заряджені амінокислоти можна замістити негативно зарядженими або нейтральними амінокислотами та навпаки. Невеликі модифікації на поверхні зв'язувального «карману» не викликають ніякого значного ефекту відносно здібності до проходження гангліозидів. Показано, що афінність знижується на більш ніж 99%, якщо, наприклад, амінокислоту в положенні 1266, триптофан, що позначається як W у SXWY-мотиві, замістити аліфатичним залишком, наприклад, лейцином. Однак, спостерігалося також зворотне. Заміщення амінокислот, що поширюються у зв'язувальний «карман», приводить до посилення афінності до гангліозидів. Оскільки конфігурація зв'язувального «карману» має вирішальне значення для афінності НС до гангліозидного рецептора, протеолітична сила асоційованого LC одночасно з афінністю НС до гангліозидного рецептора або підвищується або знижується у відповідності з афінністю. В дослідженні системи ліганд-рецептор залишки специфічних амінокислот, таким чином, охарактеризували за даним винаходом в гангліозидзв'язувальному «кармані» BoNT/A та замістили для підвищення афінності до гангліозидного рецептора, відповідно. Афінність мутованого фрагменту НС визначали у дослідах зв'язування гангліозида та синаптосом. Потім НС, що показує ті самі мутації, приєднали до LC-A, для цієї цілі використовували амінокислотну послідовність, чуттєву до тромбіну. Рекомбінантний білок активували (одноланцюговий розрив) тромбіном та отримали двохланцюгову молекулу, де обидва ланцюги зв'язані одним дисульфідним містком. Активність конструкцій аналізували в синаптосомах мозку щура препарат вивільнення трансмітерів. Ступінь інгібування вивільнення трансмітера розглядали як міру ступеню активності конструкцій. Крім того, силу окремих конструкцій аналізували за допомогою ізольованого нервово-м'язового препарату миші (аналіз куполу діафрагми = HDA), що представляє фізіологічний об'єкт клостридіальних нейротоксинів. Розлади та симптоми, які лікуються за допомогою ТrароХ, супроводжуються фокально підвищеною активністю рухових нейронів та вегетативних нервових клітин. Підвищена активність приводить до болючих судом м'язів, іннервованих цими клітинами, та до надмірної секреції рідини з залозистих клітин. Крім того, через підвищену активність на різних ділянках спостерігаються лицьові складки. Причина полягає у патологічно підвищеному вивільненні ацетил холіну з закінчень периферійних нервів. Якщо TrapoХ вводять в уражений м'яз, то ослаблення уражених м'язів, припинення секреції та розгладження шкіри обличчя відбувається приблизно через 1-3 дні. Це відбувається через інгібування вивільнення ацетил холіну завдяки TrapoХ. Пацієнт фактично позбувається болю, а біль, провокований спазмом м'язів, полегшується та повністю зникає. Вивільнення ацетил холіну інгібується у людей, а також у тварин. Тому для підтвердження ролі BoNT (ботулінового нейротоксину) у випадках отруєння, а також для визначення активності лі 9 карських засобів проти BoNT (Botox, Dysport, Xeomin) звичайно застосовують аналізування тварин. Активність BoNT виражається кількісно через визначення LD50 (летальна доза, яка вбиває 50% організмів) на мишах. В даному контексті це означає дозу, що вбиває 50% тварин однієї аналізованої групи. Очевидно, що крім доз, що не смертельні ні для якої тварини, можна вводити дози, що вбивають 100% тварин з однієї групи. Оскільки отруту вводили систематично (і.р. - інтраперитонеально), велика кількість тварин, таким чином, болісно вмирала від припинення дихання, спричиненого паралічем дихальних м'язів. Щоб уникнути аналізів на тваринах, застосували аналіз куполу діафрагми на мишах. Разом з аналізом LD50 аналізовані миші вмирають від паралічу дихання, спричиненого паралічем дихальних м'язів. Це означає, що дихальний м'яз разом з нервом, що його іннервує (Nervus phrenicus), можна видалити у миші та отруїти in vitro. BoNT зв'яжеться з його рецепторами, потрапить до клітини, буде переміщається та зрештою розщепить його субстрат, після чого м'яз паралізується. Існує чітка кореляція між значенням LD50 та паралічем дихального м'яза. Даний аналіз in vitro насправді представляє спрощену версію аналізу на тваринах (Wohlfarth K, Goeschel H, Frevert J, Dengler R, Bigalke H, Botolinum A toxis: units versus units. Naunyn Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 1997 Mar; 335(3):335-40). Можна припустити, що BoNT, який паралізує діафрагму in vitro, також діє на живу мишу, яку вбивають введеною дозою. Даний метод, що замінює аналіз на тваринах, настільки переконливий, що аналіз куполу діафрагми на мишах буде незабаром прийнятий фармакопеєю країн - членів Євросоюзу як офіційний метод аналізування BoNT. Підвищена ефективність TrapoХ на препараті діафрагми миші, таким чином, припускає підвищену ефективність також і у людей. Нещодавно комплекс BoNT/A застосовували для лікування рухових дистоній, а також для пом'якшення надмірної симпатичної активності (див. Benecke et al. (1995), Akt Neural 22, 209ff) та для пом'якшення болю і мігрені (див. Sycha et al. (2004), J Neural 251,19-30). Даний комплекс складається з нейротоксину, різних гемаглютинінів та нетоксичного негемаглютинінового білку. Комплекс швидко дисоціюється при фізіологічному рН. Утворений нейротоксин є єдиним інгредієнтом комплексу, який терапевтично релевантний та приносить полегшення симптомів. Оскільки основна неврологічна хвороба не виліковується, комплекс необхідно вводити знову з інтервалами 3-4 місяці. В залежності від кількості введеного чужорідного білку у деяких пацієнтів утворюються специфічні до BoNT/A антитіла. Такі пацієнти стають стійкими до нейротоксину. Як тільки клітини, чуттєві до антигену, розпізнають нейротоксин, то утворюються антитіла, релевантні клітини мозку зберігаються протягом років. Через це важно лікувати пацієнта препаратами максимально можливої активності при мінімально можливому дозуванні. Крім того, препарати не повинні містити ніяких додаткових білків бактеріального походження, оскільки вони можуть діяти як імуно-ад'юванти. Такі речовини 93359 10 притягують макрофаги, які розпізнають імуноад'юванти, а також нейротоксини, що представляють їх лімфоцитам, які унаслідок відповідають утворенням імуноглобулінів. Таким чином, для терапії можна використовувати тільки продукти високого ступеню чистоти, що не містять ніяких чужорідних білків. Даний винахід передбачає транспортний білок (Trapo), який здатний подолати вищеописані проблеми методів, відомих в даний час. Переважно передбачається транспортний білок (Trapo), афінність якого до комплексу гангліозидів підвищена, щонайменш, в три рази. "Зв'язування з нервовими клітинами з більш високою афінністю, ніж у нативного нейротоксину". Нативним нейротоксином у даному випадку є переважно нативний нейротоксин С. botulinum. Переважно, нативним нейротоксином у даному контексті є ботуліновий нейротоксин А та/або ботуліновий нейротоксин В та/або ботуліновий нейротоксин G С. botulinum. Ботуліновий нейротоксин готують в рекомбінантній формі з Е. coli, яка, між іншим, містить амінокислотну послідовність, ідентичну нативному ботуліновому нейротоксину, діє фармакологічно ідентичним способом як і нативний ботуліновий нейротоксин та згадується як рекомбінантний ботуліновий нейротоксин дикого типу. Нервові клітини, що згадані у цьому випадку, є холінергічними руховими нейронами. Переважно, транспортний білок специфічно зв'язується з полісіалогангліозидами на поверхні мембрани нервової клітини, такими як, наприклад, GDI a, GD1b або GT1b. Зв'язування переважно визначають in vitro. Особливо переважно, визначення виконують за допомогою аналізу, детально висвітленого в прикладах. Вираз "модифікація важкого ланцюгу нейротоксина, утвореного С. botulinum". Амінокислотна та/або нуклеїновокислотна послідовність важкого ланцюгу (НС) нейротоксину, утвореного С. botulinum, загально доступна з відкритої бази даних, для якої відомі серотипи А-G (також представлені в таблиці 1). Модифікація означає в даному контексті, що, щонайменш, одна амінокислота видалена, додана, вставлена до амінокислотної послідовності, або, щонайменш, одна амінокислота нативного нейротоксину заміщена іншою амінокислотою природного або неприродного походження, та/або одна амінокислота у встановленій амінокислотній послідовності модифікована посттрансляційно. Пост-трансляційні модифікації означають в даному контексті глікозиляції, ацетиляції, ациляції, деамінування, фосфорилізації, ізофенілізації, глікозил фосфатидил інозитолізації та інші модифікації, відомі фахівцям даної галузі. НС нейротоксину, утвореного С. Botulinum, включає три субдомена, тобто аміно-кінцевий домен HN транслокації розміром 50 кДа, розташований за ним 25 кДа домен Нем та 25 кДа домен НСС карбоксил-кінцевого розташування. Разом домени НСN та НСС позначають як фрагмент НС. Відповідні амінокислотні секції відповідних субдоменів індивідуальних серотипів та їх варіації представлені в таблиці 1. 11 Щоб докладно описувати гібридні білки з доменами різних серотипів BoNT, ввели наступну номенклатуру. Вираз scAtAAB означає, наприклад, одноланцюговий нейротоксин (sc), що містить чотири домени LC, HN, HCN та НСС, за своїм походженням кожний домен позначають заголовною 93359 12 буквою відповідного серотипу. Це означає, що scAtAAB походить з LC, HN та HCN, у той час як домен НСС BoNT/A заміщений ΒοΝΤ/Β. Мала буква "t" означає вставлену тромбінову маркерну послідовність між LC та ΗΝ. 13 Даний винахід стосується, зокрема, транспортного білка, отриманого модифікацією НС ней 93359 14 ротоксину, утвореного Clostridium botulinum, причому зазначений білок, специфічно зв'язується з 15 нервовими клітинами з більш високою афінністю, ніж у нативного нейротоксину, та потрапляє у ці клітини шляхом ендоцитозу. Транспортний білок, передбачений даним винаходом, проявляє підвищену специфічну афінність до його домену зв'язування гангліозиду з комплексними полісіалогангліозидами. Підвищення афінності переважно досягається заміщенням або делецією амінокислот. За переважним варіантом здійснення транспортний білок проявляє афінність, яка, щонайменш, на 15% вище, ніж у нативного нейротоксину. Переважно, транспортний білок проявляє афінність, яка, щонайменш, на 50% вище, особливо переважно, щонайменш, на 80% вище та зокрема, щонайменш, на 90% вище, ніж у нативного нейротоксину. За переважним варіантом здійснення модифікація НС відбувається на ділянці фрагмента НС даного нейротоксину. Якщо модифікація включає заміщення, делецію, вставку або додавання, останнє також можна виконати, наприклад, специфічним мутагенезом, причому методи в даному контексті відомі фахівцям даної галузі. Амінокислоти, присутні в наливному нейротоксині, в даному контексті модифіковані амінокислотами природного або неприродного походження. Амінокислоти розподіляються на різні фізико-хімічні групи. Аспартат та глутамат належать до негативно заряджених амінокислот. Гістидин, аргінін та лізин належать до позитивно заряджених амінокислот. Аспаргін, глутамін, серин, треонін, цистеїн та тірозин належать до полярних амінокислот. Гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, метіонін, пролін, фенілаланін та триптофан належать до неполярних амінокислот. Ароматичні бокові групи виявлені серед амінокислот гістидину, фенілаланіну, тірозину та триптофану. Взагалі, преважним є заміщення амінокислоти іншою амінокислотою, що належить до іншої фізико-хімічної групи. За переважним варіантом здійснення даного винаходу транспортним білком є ботуліновий нейротоксин серотипу А-G. У переважному варіанті здійснення даного винаходу транспортний білок є похідним від білкової послідовності нейротоксину типу A Clostridium botulinum (№ бази даних ААА23262 та САА51824). Наступний варіант здійснення даного винаходу стосується транспортного білка, де, щонайменш, одна амінокислота в положеннях 1117, 1202-1204, 1252-1254, 1262-1267, 1270 та 12781279 білкової послідовності нейротоксину типу А Clostridium botulinum (№ бази даних ААА23262 та САА51824) або видалена або заміщена амінокислотою природного або неприродного походження. Наступний варіант здійснення даного винаходу стосується транспортного білка, де амінокислоти в положеннях 1092-1296 білкової послідовності нейротоксину типа A Clostridium botulinwn (№ бази даних ААА23262 та САА51824) - ділянка, що включає домен зв'язування гангліозиду, - заміщена послідовністю 93359 16 нейротоксинового білка типу В Clostridium botulinum (№ бази даних ААА23211), амінокислоти 1079-1291, нейротоксинового білка типу С Clostridium botulinum (№ бази даних САА51313), амінокислоти 1093-1291 нейротоксинового білка D Clostridium botulinum (№ бази даних САА38175), амінокислоти 1080-1276, нейротоксинового білка типу Ε Clostridium botulinum (№ бази даних САА44558), амінокислоти 1067-1252, нейротоксинового білка типу Ε Clostridium butyricum (№ бази даних САА43998), амінокислоти 1067-1251, нейротоксинового білка типу F Clostridium botulinum (№ бази даних САА57358), амінокислоти 1085-1278, нейротоксинового білка типу F Clostridium baratii (№ бази даних САА48329), амінокислоти 1076-1268, нейротоксинового білка типу G Clostridium botulinum (№ бази даних САА52275), амінокислоти 1087-1297. Наступні домени НСС, придатні для взаємозамінності амінокислотними положеннями, наведені в Таблиці 1. Наступний варіант здійснення даного винаходу стосується композиції, що містить транспортний білок за даним винаходом та, щонайменш, одну проміжну молекулу (X). Проміжною молекулою може бути невелика органічна молекула, пептид або білок; переважно ковалентно зв'язаний, наприклад, пептидним, складного ефіру, ефіру, сульфідним, дисульфідним зв'язком або зв'язком вуглець-вуглець. Крім того, проміжна молекула включає усі відомі терапевтично активні речовини. Цитостатики, антибіотики, вірусстатики, але імуноглобуліни є переважними в даному контексті. Щоб краще використати підвищену афінність Trapo, його зв'язали по аміно-кінцю з LC BoNT/A, В, С1, D, Е, F або G через амінокислотну послідовність, яка специфічно розпізнається та розщеплюється протеазним тромбіном, що дає специфічний TrapoХ. Активність зазначеного TrapoХ у порівнянні з нативним BoNT/A була вище, а особливо переважно вище, щонайменш, в 3 рази. Цей новий продукт, який вільний від чужорідних білків, значно знизить стимуляцію імунних систем завдяки більшій чистоті матеріалу та низькому дозуванню. Наступний варіант здійснення даного винаходу стосується транспортного білка, де білок є протеазою, що розщеплює один або декілька білків апарату вивільнення нейротрансмітерів, причому протеаза вибрана з групи нейротоксинів, що містить LC нейротоксинів Clostridium botulinum, зокрема типу А, В, С1, D, Е, F та G, або протеолітично активний фрагмент LC нейротоксинів Clostridium botulinum, зокрема нейротоксин серотипу А, В, С1, D, Е, F та G, причому фрагмент проявляє, щонайменш, 0,01% протеолітичної активності нативної протеази, переважно, щонайменш, 5%, особливо переважно, щонайменш, 17 50%, зокрема, щонайменш, 90%. Переважно транспортний білок та протеаза походять від нейротоксину С. botulinum однакового серотипу, зокрема та переважно домен HN транспортного білку та протеаза походять від нейротоксину С. botulinum серотипу А. Послідовності протеази, як правило, доступні у базах даних, а номери баз даних наведені в таблиці 1. Протеолітичну активність протеаз визначають шляхом кінетичних показників розкладу субстрату (див. Bina et al. (2002), Biochemistry 41(6), 1717-23). LC, характеризуються тим, що містять послідовність His-Glu-Leu-Xaa-His-(Xaa)33-35-Glu(Xaa)8490-Glu-(Xaa)11-Arg-Xaa-Xaa-Tyr, де Хаа може бути будь-якою амінокислотою. Транспортний білок за даним винаходом характеризується тим, що білок та протеаза походять від попередніх груп білків та/або протеаз. За наступним варіантом здійснення даного винаходу передбачається спосіб одержання транспортного білку. У цьому випадку перший етап стосується нуклеїнової кислоти, що кодує транспортний білок. Нуклеїнова кислота, що кодує, може представляти собою в даному контексті РНК, ДНК або їх суміш. Нуклеїнова кислота може, крім того, бути модифікованою, приймаючи до уваги її стійкість до нуклеази, наприклад, вставкою фосфортіоатних зв'язків. Нуклеїнову кислоту можна отримати з вихідної нуклеїнової кислоти, яку отримують, наприклад, клонуванням з геномної або кДНК баз даних. Крім того, нуклеїнову кислоту можна отримати безпосередньо твердофазовим синтезом. Придатні способи відомі фахівцям даної галузі. Якщо виходити з вихідної нуклеїнової кислоти, специфічну модифікацію, наприклад, мутагенезом специфічного положення, можна отримати у результаті, щонайменш, одного додавання, вставки, делеції та/або заміщення на амінокислотному рівні. Потім нуклеїнова кислота оперативно зв'язується з придатним промотором. Придатні промотори для експресії в відомих системах експресії відомі фахівцям даної галузі. Вибір промотору у цьому випадку залежить від систем експресії, що використовують для експресії. Взагалі, переважними є конститутивні промотори, але також можна використовувати індуковані промотори. Конструкція, утворена даним способом, включає, щонайменш, одну частину вектора, зокрема регуляторні елементи, причому вектор, наприклад, вибраний з похідних, аденовірусів, бациловірусів, вірусів коров'ячої віспи, SV40-Bipycie та ретровірусів. Вектор переважно здатний експресувати нуклеїнову кислоту у даній клітині хазяїна. Крім того, даний винахід стосується клітин хазяїна, які містять вектор та придатні для експресування вектору. В даній галузі відомі чисельні системи експресування прокаріот та еукаріот, клітини хазяїна вибирають, наприклад, з прокаріотичних клітин, таких як Е. coli або В. megaterium, з еукаріотичних клітин, таких як S. cerevisiae та P. pastoris. Хоча можна також використовувати вищі еукаріотичні клітини, такі як клітини комах або клітини ссавців, все ж таки переважними є кліти 93359 18 ни хазяїна, такого як С. botulinum, що не має апарату глікозилування. За переважним варіантом здійснення нуклеїнова кислота кодує домен НСС нейротоксину С. botulinum. Ця нуклеїнова кислота містить ендонуклеазні зони контакту, які фланкують нуклеїнову кислотну, що кодують фрагмент НС, ендонуклеазні сайта сумісні з такими в інших фрагментах НС нейротоксинів С. botulinum, що забезпечує їх легке модульне заміщення в гені, який кодує транспортний білок, у той час як зберігається схожість амінокислотної послідовності. Якщо за даним винаходом передбачається композиція, яка крім транспортної системи додатково містить, щонайменш, одну проміжну молекулу, а ця проміжна молекула, пептид або білок, функціоналізована по карбокси-кінцевому цистеїну або меркапто-групі, тоді, аналогічним способом, як описано вище, пептид та/або білок можна утворити рекомбінантно, наприклад, із застосуванням бінарних векторів або різних хазяйських клітин. Якщо для експресії транспортного білка та пептиду або білка застосовуються та сама клітина хазяїна, переважно утворюється in situ міжмолекулярний дисульфідний зв'язок. Для більш ефективного утворення в тій самій клітині хазяїна, нуклеїнова кислота, що кодує пептид або білок, також може бути трансльована з транспортним білком у тієї ж рамці зчитування, так, щоб утворився одноланцюговий поліпептид. У цьому випадку переважно утворюється in situ міжмолекулярний дисульфідний зв'язок. Для простого гідролізу аналогічного існуючого пептиду поперечне зв'язування між транспортним білком та пептидом та/або білком, амінокислотна послідовність вставляється на аміно-кінці транспортного білку, що специфічно розпізнається та відокремлюється протеазним тромбіном або специфічною ендопротеазою клітини хазяїна. Якщо це неможливо, відповідне міжмолекулярне дисульфідне зв'язування після сепаратного очищення транспортного білка та білка, можна здійснити способами окислення, відомими фахівцям даної галузі. Пептид або білок також можна отримати безпосередньо синтезом або конденсацією фрагментів. Відповідні способи відомі фахівцям даної галузі. Транспортний білок та пептид або білок, відповідно, пізніше очищають. Для цього застосовують способи, відомі фахівцям даної галузі, такі як, наприклад, хроматографічні способи або електрофорез. Наступний варіант здійснення даного винаходу стосується фармацевтичної композиції, що включає транспортний білок та необов'язково фармацевтично прийнятний наповнювач, розріджувач та/або допоміжну речовину, та яка придатна для лікування наступних розладів або хвороб: геміспазмів лицьового нерву, спастичної кривошиї, спастичності, дистонії, мігрені, болю, розладів шийного та поперекового відділів хребта, страбізму, гіперсалівації та депресивних хвороб. Фармацевтична композиція придатна для орального, внутрішньовенного, підшкірного, внут 19 рішньом'язового та місцевого введення. Переважним є внутрішньом'язове введення. Дозована одиниця фармацевтичної композиції містить близько 0,1 пг - 1 мг транспортного білку та/або композиції за даним винаходом. Наступний варіант здійснення даного винаходу включає косметичну композицію, що містить транспортний білок та фармацевтичний наповнювач, розріджувач та/або допоміжну речовину, придатну для лікування рясного потіння та надмірно виражених лицьових зморшок. Косметична композиція придатна для орального, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового та місцевого введення. Переважним є внутрішньом'язове введення. Дозована одиниця косметичної композиції містить близько 0,1 пг - 1 мн транспортного білка та/або композиції за даним винаходом. Косметична композиція придатна для лікування рясного потіння та лицьових зморшок. Транспортний білок за даним винаходом можна отримати з використанням придатної клітини хазяїні, такої як, наприклад, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris або Bacillus megaterium, яка збільшує рекомбінантний вектор експресії, причому вектор кодує транспортний білок. Даний винахід ілюстрований графічними матеріалами, де: Фігура 1 показує, що афінність мутованого фрагменту НС BoNT/A до синаптосомних мембранних препаратів з мозку щура у три рази вище, ніж у фрагмента НС BoNT/A дикого типу. Фігура 2 показує зв'язування різних мутантів фрагмента НС BoNT/A до синаптосом мозку щура, афінність фрагменту НС BoNT/A дикого типу приймають за 100% як стандарт. Перша колонка представляє афінності мутантів BoNT/A, зображуючи мутації амінокислоти Y1117, що приводить до підвищення. Друга колонка представляє наступних мутантів BoNT/A. Третя колонка представляє афінності мутантів BoNT/A, що мають подвійні мутації, які посилюють зв'язування з мембранами нервових клітин (синаптосом). Фігура 3 показує підвищену нейротоксичність Y1117А-мутанту BoNT/A у порівнянні BoNT/A дикого типу на ізольованому препараті nervus phrenicus - м'яз діафрагми миші. Фігура 4 зображує зв'язування чотирьох гібридів фрагмента НС BoNT/A НСАВ, НСАС, НСАЕ та НСАТ (Т = нейротоксин правця) в мембранах нервових клітин (синаптосомах), фрагмент НС BoNT/A дикого типу приймають за 100% як стандарт. Фігура 5 показує підвищену нейротоксичність усіх токсинових гібридів, що містять BoNT/A, та фрагменту НС або домену НСС BoNT/B у порівнянні з BoNT/A дикого типу на ізольованому препараті nervus phrenicus - м'яз діафрагми миші. Детально, даний винахід містить транспортний білок (Trapo), утворений за допомогою модифікації НС нейротоксину, що продукує Clostridium botulinum, переважно специфічно зв'язаного з нейронами, що потрапляє усередину клітини шляхом рецептор-опосередкованого ендоцитозу та переміщається від кислотно ендосо 93359 20 мального компартменту у цитозоль нейронів. Цей білок застосовують як транспортні засоби для введення в клітини протеаз та інших речовин, зв'язаних із зазначеними транспортними засобами, не здатних проникати фізіологічно в плазматичну мембрану та досягати цитозолю нервових клітин. Субстратами протеаз є внутрішньоклітинно локалізовані білки та пептиди, що беруть участь у вивільненні трансмітерів. Після розкладання субстратів специфічні функції нейронів блокуються; клітини себе не пошкоджують. Однією з цих функцій є екзоцитоз, що забезпечує вивільнення нейротрансмітерів. Якщо вивільнення трансмітерів інгібується, передача сигналів від клітини до клітини блокується. Наприклад, смугасті м'язи паралізуються, якщо вивільнення ацетил холіну інгібується в точці нейром'язового контакту. Цей ефект можна застосовувати терапевтично, якщо TrapoХ наносити на нервові закінчення спастичних або дистонічних м'язів. Іншими активними речовинами є, наприклад, речовини, що проявляють противірусну дію. В кон'югації з Trapo їх можна застосовувати для лікування вірусних інфекцій нервової системи. Даний винахід також полягає у застосуванні транспортного білку для інгібування вивільнення нейротрансмітерів. Якщо пацієнтів лікують нативними формами BoNT/A та В, ін'єкція цих білків не людського походження, не дивлячись на низьке дозування, спричиняє утворення антитіл, так що лікування потрібно припиняти для запобігання анафілактичного шоку. Застосовуючи речовину з таким самим механізмом дії, яка має більш високу транспортну ефективність ензиматичної активності, дозування можна значно знизити, а антитіла не будуть утворюватись. Ці якості відносяться до транспортного білку, описаного в даному описі. Хоча приклади сформульовані для застосування, придатний спосіб застосування та дозування, взагалі, індивідуально визначаються лікарем. Такі рішення звичайно приймає кожен лікар, досвідчений у даній галузі спеціалізації. Таким чином, спосіб застосування та дозування нейротоксину можна, наприклад, підібрати за даним винаходом, описаним тут, на основі критеріїв, таких як розчинність вибраного нейротоксину або інтенсивність болю, який треба лікувати. Інтервал лікування для нативного BoNT/A та В в даний час складає в середньому три - чотири місяці. Продовження цього інтервалу зменшило б ризик утворення антитіл та дозволило б більш довгий період лікування з BoNT. Збільшення LC у цитозолі поширило б час його розкладу та, таким чином, подовжило тривалість дії. Зазначений транспортний білок проявляє більш високу афінність та норму прийому, ніж нативний НС-А. Наступний приклад лише служить для роз'яснення та не повинен розглядатися як обмеження. Приклади Рекомбінантна експресія генетично інженерного TrapoХ в Е. coli Послідовність ДНК НС BoNT/A ампліфікують у хромосомальну ДНК Clostridium botulinum (№ бази даних ААА23262) шляхом ПЦР (полімеразна 21 ланцюгова реакція). Для цього за допомогою специфічних олігонуклеотидів кодон для амінокислоти тирозину 1117 заміщають триплетом основ, що кодує амінокислотний залишок аланіну. Крім того, 5'-кінець гену доповнюють послідовністю ДНК, що кодує амінокислоти послідовності розпізнавання тромбіну. Цю послідовність ДНК вставляють в бактеріальний вектор експресії. Вставлений ген Trapo у цьому випадку зшитий з олігонуклеотидом на 3'-кінці, що кодує карбоксикінцевий афінний пептид, такий як, наприклад, Strep-day, 6xHN-day або His6-day. Вектор експресії pAR-Trapo, отриманий зазначеним способом, являється стартовою основою для додавання молекул носія, таких як LC BoNT. Послідовність ДНК LC BoNT/A ампліфікують методом ПЦР в хромосомальній послідовності ДНК Clostridium botulinum (№ бази даних ААА23262) та вставляють в вектор експресії pARTrapo у 3'-5' напрямку кодованої послідовності розпізнавання тромбіну. Вектор експресії pARTrapoX, утворений таким чином, трансформують в Е. соIі штам K12, а експресію білка TrapoХ індукують при умовах 2-го рівня біологічної безпеки та згідно правил і інструкцій, виданих для проекту окружним правлінням Ганноверу, реєстраційний номер 501g.40654/3/57/3. Надекспресований TrapoХ виділяють афінно-хроматографічним способом за інструкціями виробника як одно ланцюговий білок з молекулярною масою 150 кДа. Потім білок гідролізують з тромбіном, кон'югованим 93359 22 на сефарозі, що дає чистий білок, два ланцюги якого залишаються зв'язаними дисульфідним містком. У порівнянні з диким типом BoNT/A цей білок проявляє афінність, збільшену на 300%, до ізольованого гангліозиду GT1b, іммобілізованого в мікротитровальних планшетах, та до препаратів синаптосомних мембран мозку щура (Фігура 1). Каталітична активність LC-A не міняється, як показано на in vitro розщепленні рекомбінантного SNAP-25. Ефективність TrapoХ по відношенню до інгібування вивільнення нейротрансмітерів в функціональних синаптосомах мозку щура збільшується на 300% у порівнянні з нативним BoNT/A, отриманим від Clostridium botulinum. В нервовом'язових препаратах миші (HDA) ефективність TrapoХ також збільшилася на 300% у порівнянні з нативним BoNT/A (Фігура 2). Вимірювання зв'язування із синаптосомами мозку щура та нейротоксичності в HDA різних мутантів BoNT/A Зв'язування радіоактивно мічених фрагментів НС з синаптосомами щура виміряють як викладено у Rummel et al., J. Моl. Biol. 326 (2003), 835847. Нейротоксичність мутантів BoNT/A визначали як описано у Habermann et al., Naunyn Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 311 (1980), 3340. Порівняння зв'язування різних мутантів BoNT/A з диким типом показано на наступній таблиці. 23 Мутація окремих визначених амінокислот у гангліозидному зв'язувальному «кармані» BoNT/A приводить до посилення зв'язування з нервовими клітинами. Переважно в положенні 1117 тирозин заміняється аланіном, цистеїном або валіном. Зокрема, заміщення тирозинового залишку в положенні 1117 на аланін приводить до посилення афінності на близько 330%. Наступні мутації окремих амінокислот з гангліозидного зв'язувального «карману» в положенні 1252 та 1253 також приводить до посилення зв'язування. Зокрема, мутація F1252 по тирозину та Н1253 по лізину приводить до посилення афінності на 110% та 50%, відповідно. Крім того, посилення зв'язування з нервовими клітинами очікують при мутаціях в положеннях 1202, 1262, 1270, 1278 та 1279. 93359 24 Крім того, мутантів BoNT/A також аналізують на подвійні мутації, коли, зокрема, мутанти Y1117С/Н1253K та Y1117V/H1253K приводять до посилення зв'язування з синаптосомами (Фігура 2). Крім того, визначили, що посилення зв'язування, особливо мутантів Y1117A BoNT/A, посилює нейротоксичність в аналізі нейротоксичності N. phrenicus (HDA аналіз) (Фігура 3). Визначення зв'язування та нейротоксичності гібрідів НСС BoNT/A Визначення зв'язування та нейротоксичності виконують як описано вище. Результати наведені в наступній таблиці та на Фігурах 4 і 5. 25 Заміщення домену НСС BoNT/A іншими серотипами, зокрема нейротоксином В С. botulinum та нейротоксином С С. botulinum, приводить до посилення зв'язування з нервовими клітинами. Крім того, спостерігають, що заміщення домену НСС фрагменту НС BoNT/A відповідним доменом нейротоксину правця також посилює афінність нервових клітин. Зміни афінності також відбуваються при заміщенні домену НСС в усьому BoNT/A. Фігура 5 показує в даному контексті, що в гібриді scAtAAB посилення афінності має подібний ефект на посилену нейротоксичність. Якщо замість домену НСС замістити весь фрагмент НС scAtAAB, спостерігаються відповідні результати. Зокрема, відмічають підвищення нейротоксичності на близько 350%, коли заміщають домен НСС або фрагмент НС BoNT/A на такі з BoNT/B. Визначення зв'язування мутантів BoNT з гангліозидом GT1b Гангліозид GT1b [NAcNeu3GaI3NAcGal4[NAcNeu8NAcNeu3) Gal4Glc] (Sigma-Aldrich) розчинюють в метанолі та поміщають до високоафінних 96-лункових полістирольних мікротитрувальних планшетів (Corning; 1 мкг GT1b в 100 мкл/лунка) або у випадку конкурентних аналізів до високоафінних мікропланшетів із стрілами типу CS "single fracture" з додаванням 125Ι-ΒoΝΤ (Greiner Bio-ohne; 0,1 мкг GT1b в 100 мкл/лунка). Розчинник випарюють при кімнатній температурі, а лунки тричі промивають буфером, що зв'язує, (10 мМ Tris-HCI, 10 мМ Na2HPO4, 0,5% BSA (альбумін бичачої сироватки), рН 7,2). Потім сайти неспецифічного зв'язу 93359 26 вання блокують інкубацією протягом двох годин в PBS (фізіологічний розчин з фосфатним буфером)/Тwееп (140 мМ NaCl, 7 мМ KСl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ KН2РО4, 0,05% (об'єм/об'єм) Tween 20, рН 7,2), додаючи 3% (вага/об'єм) BSA. Аналіз зв'язування виконують у буфері, що зв'язує, (100 мкл/лунка) протягом 2 годин при кімнатній температурі або з підвищеними кількостями дикого типу, або з визначеними кількостями мутантів. Незв'язаний білок видаляють 3 етапами промивання, кожний по 250 мкл PBS/Tween буферу. Зв'язані фрагменти НС ідентифікують інкубацією із Strep Tactin, кон'югованим із лужною фосфатазою (ST-AP, ІВА GmbH), у буфері, що зв'язує, протягом 2 годин при кімнатній температурі за інструкціями виробника, з р-нітрофеніл фосфатом (1 мг/мл в 100 мМ гліцині, 1 мМ MgCl2, 1 мМ ZnCl2, рН 10,4), який зрештою служить субстратом для лужної фосфатази. Реакцію дефосфориляції зупиняють додаванням 3 Μ розчину NaOH, а екстинкцію визначають при 405 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів Spectra Count (Packard). Конкурентній аналіз виконують за 2 годинний період часу при кімнатній температурі у 100 мкл буферу, що зв'язує, з 700000 імпульсів за хвилину/лунка [1251]-BoNT, різні кількості нативного BoNT або рекомбінантного фрагменту НС. Після інкубації та видалення супернатантів лунки тричі промивають PBS/Tween буфером, сушать та розділяють. Потім визначають кількості зв'язаних радіоактивно мічених BoNT на автоматичному -лічильнику (Wallac 1480 Wizard 3). 27 93359 28 29 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 93359 Підписне 30 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601