Кон’югати піролбензодіазепіну для лікування проліферативних захворювань

Реферат: Описані кон'югати і сполуки для створення кон'югатів, які являють собою PBD-молекули, зв'язані через положення N10, а також застосування зазначених кон'югатів для лікування проліферативних захворювань, включаючи рак. UA 114073 C2 (12) UA 114073 C2 UA 114073 C2 5 10 15 20 Даний винахід відноситься до піролбензодіазепінів (PBD), зокрема піролбензодіазепінів, які містять лабільну захисну групу в положенні N10, яка являє собою лінкер до агента, що зв'язується з клітинами. Рівень Техніки Піролбензодіазепіни Деякі піролбензодіазепіни (PBD) здатні розпізнавати конкретні послідовності ДНК і зв'язуватися з ними, при цьому переважна послідовність являє собою PuGPu. Перший піролбензодіазепіновий (PBD) протипухлинний антибіотик, антраміцин, був відкритий у 1965 р. (Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)). З того часу був описаний ряд природних PBD та було розроблено понад 10 способів синтезу різних їхніх аналогів (Thurston, et al., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994)). Представники зазначеного сімейства включають еббіміцин (abbeymycin) (Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), чікаміцин (chicamycin) (Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (патент Японії 58-180 487; Thurston, et al., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, et al., Тетраhedron, 48, 751-758 (1992)), мазетраміцин (mazethramycin) (Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), неотраміцини (neothramycin) A і B (Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), поротраміцин (porothramycin) (Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), протракарцин (prothracarcin) (Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), сібаноміцин (sibanomicin) (DC-102) (Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)), сібіроміцин (sibiromycin) (Leber, et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)) і томаміцин (tomamycin) (Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)). PBD мають таку загальну структуру: 10 9 11 N 8 A B H 11a 1 N C 7 6 3 O 25 30 35 Вони розрізняються за числом, типом та положенням замісників, як у своїх ароматичних Aкільцях, так і в пірольних C-кільцях, та за ступенем насичення C-кільця. У положенні N10-C11 Bкільця, яке являє собою електрофільний центр, відповідальний за алкілування ДНК, знаходиться або імін (N=C), або карбіноламін (NH-CH(OH)), або метиловий ефір карбіноламіну (NH-CH(OMe)). Усі відомі природні продукти мають (S)-конфігурацію хірального центру C11a, що забезпечує правозакручену "твіст»-форму, якщо дивитися з боку C-кільця в напрямку Aкільця. Це надає їм відповідну тривимірну форму для ізоспіральності з малою борозенкою Bформи ДНК, що призводить до точної відповідності у сайті зв'язування (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). Їх здатність утворювати аддукт у малій борозенці ДНК дозволяє їм перешкоджати процесингу ДНК, забезпечуючи можливість їх застосування як протипухлинних агентів. Автори даного винаходу раніше у WO 2005/085251 описали димерні PBD сполуки, які містять арильні замісники у положенні C2, такі як: N N O O H H N OMe O 40 2 N MeO ZC-207 O MeO OMe Було показано, що зазначені сполуки є високоефективними цитотоксичними агентами. Особливі переваги має піролбензодіазепінова сполука, описана в джерелі Gregson et al. (Chem. Commun. 1999, 797-798) як сполука 1, та в джерелі Gregson et al. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174) як сполука 4a. Зазначена сполука, також відома як SJG 136, показана нижче: 1 UA 114073 C2 N H N O N O H N MeO OMe O SJG-136 Авторами даного винаходу раніше було показано, що PBD сполуку можна використовувати як проліки за допомогою введення в положення N10 захисної групи для азоту, при цьому захисна група здатна віддалятися in vivo (WO 00/12507). Багато із зазначених захисних груп являють собою карбамати і мають, наприклад, наступну структуру: O2N O 5 O 10 15 20 25 30 35 40 45 50 O * де зірочка (*) позначає місце приєднання до атома N10 в PBD. Автори даного винаходу також описали отримання PBD сполук, які містять захисну карбаматну групу при атомі азоту в положенні N10 (WO 2005/023814). Захисні групи здатні видалятися з положення N10 фрагмента PBD з утворенням N10-C11 імінного зв'язку. Описано ряд захисних груп, включаючи групи, які можуть відщеплюватися під дією ферментів. У WO 2007/085930 описано отримання димерних PBD сполук, які містять лінкерні групи для приєднання до агента, що зв'язується з клітинами, такого як антитіло. Лінкер присутній у мостику, що пов'язує мономерні ланки PBD димера. Кон'югати антитіло-лікарський засіб Терапія з використанням антитіл застосовується для спрямованого лікування пацієнтів, які страждають на рак, імунологічні та ангіогенні розлади (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). Застосування кон'югатів антитіло-лікарський засіб (ADC), тобто імунокон'югатів, для місцевої доставки цитотоксичних або цитостатичних агентів, тобто лікарських засобів для знищення або придушення пухлинних клітин при лікуванні раку, забезпечує спрямовану доставку фрагменту лікарського засобу до пухлини та внутрішньоклітинне накопичення в ній, тоді як системне введення зазначених некон'югованих лікарських агентів може призводити до неприйнятних рівнів токсичності стосовно здорових клітин поряд із пухлинними клітинами, які передбачається знищити (Xie et al (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6 (3):281-291; Kovtun et al (2006) Canser Res. 66 (6):3214-3121; Law et al (2006) Canser Res. 66 (4):2328-2337; Wu et al (2005) Nature Biotech. 23 (9):1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15 (9):1087-1103; Payne, G. (2003) Canser Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Canser Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer research 19:605-614). Таким чином, дослідження спрямовані на одержання препаратів з максимальною ефективністю при їхній мінімальній токсичності. Спроби розробки та очищення ADC були зосереджені на селективності моноклональних антитіл (mAb), а також на механізмі дії лікарського засобу, властивостях зв'язування з лікарським засобом, відношенні лікарський засіб/антитіло (навантаження) та вивільнення лікарського засобу (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26 (8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114 (13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO 2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. +19 (7): 299-307; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson et al (2006) Cancer res. 66 (8):1-8; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer res. 11:843-852; Jeffrey et al (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer res. 10:7063-7070). Фрагменти лікарських засобів можуть надавати свою цитотоксичну і цитостатичну дію механізмами, які включають зв'язування тубуліну, зв'язування ДНК або інгібування топоізомерази. Деякі цитотоксичні лікарські засоби схильні інактивуватися або ставати менш активними при кон'югуванні з великими антитілами або білковими рецепторними лігандами. Автори даного винаходу розробили новий підхід до отримання кон'югатів PBD з агентами, що зв'язуються з клітинами, і, зокрема, кон'югатів PBD з антитілами. Короткий опис винаходу Згідно із загальним аспектом даного винаходу запропонований кон'югат, який містить PBD сполуку, приєднану через положення N10 до агента, який зв'язується з клітинами за допомогою лінкера. Лінкер являє собою лабільний лінкер та може являти собою ферментативно-лабільний лінкер. Агент, який зв'язується з клітинами, переважно являє собою антитіло. 2 UA 114073 C2 5 Згідно з одним варіантом реалізації винаходу кон'югат містить агент, що зв'язується з клітинами, з'єднаний зі спейсером, при цьому спейсер з'єднаний із тригером, тригер з'єднаний із лінкером, що саморозщеплюється, а лінкер, що саморозщеплюється, пов'язаний із положенням N10 PBD сполуки. Згідно з першим аспектом даного винаходу запропоновані нові сполуки, які являють собою кон'югати, формули (A): 10 9 R 11 R QR 8 N R H 7 N R R 10 15 20 25 O A та їх солі та сольвати, де: пунктирні лінії позначають необов'язкову наявність подвійного зв'язку між C1 та C2 або C2 та C3; 2 D D R незалежно вибраний із H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R , =C(R )2, O-SO2-R, CO2R та COR і необов'язково додатково вибраний із галогену або дигалогену; D де R незалежно вибраний із R, CO2R, COR, CHO, CO2H й галогену; 6 9 R та R незалежно вибрані з H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 7 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 8 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 10 R являє собою лінкер, з'єднаний із агентом, що зв'язується з клітинами; Q незалежно обраний із O, S та NH; 11 R являє собою H або R, або, якщо Q являє собою O, SO 3M, де M являє собою катіон металу; кожен R і R" незалежно обраний із необов'язково заміщених C 1-12 алкільної, C3-20 гетероциклільної та C5-20 арильної груп, і відносно групи NRR" необов'язково R і R" разом із атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене 4-, 5-, 6- або 7членне гетероциклічне кільце; 6 9 або будь-яка пара суміжних груп із R – R разом утворюють групу -O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2, або зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (A), або один мономер якого має формулу (A), а інший мономер має формулу (B): 9 R 8 N R H 2 7 N R R O 30 35 40 2 R 6 6 R B 7 8 де R , R , R , R і R є такими, як визначено для сполуки формули (A), і групи R або групи R кожного мономеру разом утворюють димерний мостик, який зв'язує мономери і має формулу -XR″-X-; де R″ являє собою C3-12 алкіленову групу, вуглеводневий ланцюг якої може перериватися одним або більше гетероатомами, наприклад, O, S, N(H), NMe і/або ароматичними кільцями, наприклад, бензольним або піридиновим, причому зазначені кільця є необов'язково заміщеними; і кожен X являє собою O, S або N(H); або де зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (A), 10 C причому група R у одному з мономерів являє собою кепуючу групу R або являє собою лінкер, з'єднаний із агентом, що зв'язується з клітинами. Для уникнення невизначеності, агент, що 10 зв'язується з клітинами, являє собою частину групи R . Даний винахід також відноситься до застосування кон'югату для отримання сполуки формули (C) в області-мішені: 2 6 9 7 8 3 UA 114073 C2 9 R 8 N R H 7 N R 2 R 6 R O C та її солі й сольвату, де: пунктирні лінії позначають необов'язкову наявність подвійного зв'язку між C1 і C2 або C2 і C3; 5 10 15 20 25 2 D D R незалежно вибраний із H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R , =C(R )2, O-SO2-R, CO2R і COR й необов'язково додатково вибраний із галогену або дигалогену; D де R незалежно вибраний із R, CO2R, COR, CHO, CO2H й галогену; 6 9 R і R незалежно вибрані з H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 7 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 8 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; R і R" незалежно обрані з необов'язково заміщених C 1-12 алкільної, C3-20 гетероциклільної та C5-20 арильної груп, і відносно групи NRR" необов'язково R і R" разом із атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене 4-, 5-, 6- або 7-членне гетероциклічне кільце; 6 9 або будь-яка пара суміжних груп з R – R разом утворюють групу -O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2; або зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (C), а групи 7 8 R або групи R кожного мономеру разом утворюють димерний мостик, який зв'язує мономери і має формулу -X-R″-X-; де R″ являє собою C3-12 алкіленову групу, вуглеводневий ланцюг якої може перериватися одним або більше гетероатомами, наприклад, O, S, N(H), NMe і/або ароматичними кільцями, наприклад, бензольним або піридиновим, причому зазначені кільця необов'язково містять як замісник NH2; і кожен X являє собою O, S або N(H). Даний винахід також відноситься до застосування кон'югату для отримання сполуки формули (D) в області-мішені: 9 11 R QR H 8 N R H 7 N R 6 R 2 R O D та її солі й сольвату, де: пунктирні лінії позначають необов'язкову наявність подвійного зв'язку між C1 і C2 або C2 і 30 35 40 45 C3; 2 D D R незалежно вибраний із H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R , =C(R )2, O-SO2-R, CO2R та COR і необов'язково додатково вибраний із галогену або дигалогену; D де R незалежно вибраний із R, CO2R, COR, CHO, CO2H і галогену; 6 9 R і R незалежно вибрані з H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 7 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 8 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; Q незалежно обраний із O, S і NH; 11 R являє собою H або R, або, якщо Q являє собою O, SO 3M, де M являє собою катіон металу; кожен R і R" незалежно обраний із необов'язково заміщених C 1-12 алкільної, C3-20 гетероциклільної та C5-20 арильної груп, і відносно групи NRR" необов'язково R і R" разом із атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене 4-, 5-, 6- або 7членне гетероциклічне кільце; 6 9 або будь-яка пара суміжних груп із R – R разом утворюють групу -O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2; 4 UA 114073 C2 5 10 або зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (D), або один мономер якого має формулу (D), а інший мономер має формулу (C); 7 8 і групи R або групи R кожного мономеру разом утворюють димерний мостик, який зв'язує мономери і має формулу -X-R″-X-; де R″ являє собою C3-12 алкіленову групу, вуглеводневий ланцюг якої може перериватися одним або більше гетероатомами, наприклад, O, S, N(H), NMe і/або ароматичними кільцями, наприклад, бензольним або піридиновим, причому зазначені кільця необов'язково містять як замісник NH2; і кожен X являє собою O, S або N(H); де мономерна одиниця формули (C) є такою, як визначено вище. Згідно з даним винаходом також запропоновані сполуки формули (E) для застосування для отримання сполук, які представляють собою кон'югати згідно з даним винаходом: L 9 R 11 R QR 8 N R H 7 N R 2 R 6 R O E та їх солей і сольватів, де: пунктирні лінії позначають необов'язкову наявність подвійного зв'язку між C1 і C2 або C2 і 15 C3; 20 25 30 2 D 2 7 N R R O 35 40 45 D R незалежно вибраний із H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R , =C(R )2, O-SO2-R, CO2R та COR і необов'язково додатково вибраний із галогену або дигалогену; D де R незалежно вибраний із R, CO2R, COR, CHO, CO2H й галогену; 6 9 R і R незалежно вибрані з H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 7 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 8 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; L R являє собою лінкер для з'єднання з агентом, що зв'язується з клітинами; Q незалежно обраний із O, S і NH; 11 R являє собою H або R, або, якщо Q являє собою O, SO 3M, де M являє собою катіон металу; кожен R і R" незалежно обраний із необов'язково заміщеної C 1-12 алкільної, C3-20 гетероциклільної та C5-20 арильної групи, і відносно групи NRR" необов'язково R і R" разом із атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене 4-, 5-, 6- або 7членне гетероциклічне кільце; 6 9 або будь-яка пара суміжних груп із R -R разом утворюють групу -O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2; або зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (E), або один мономер якого має формулу (E), а інший мономер має формулу (B): 9 R 8 N R H 6 R B 7 8 де R , R , R , R і R є такими, як визначено для сполуки формули (A), і групи R або групи R кожного мономеру разом утворюють димерний мостик, який зв'язує мономери і має формулу -XR″-X-; де R″ являє собою C3-12 алкіленову групу, вуглеводневий ланцюг якої може перериватися одним або більше гетероатомами, наприклад, O, S, N(H), NMe і/або ароматичними кільцями, наприклад, бензольним або піридиновим, причому зазначені кільця необов'язково містять як замісник NH2; і кожен X являє собою O, S або N(H); і де зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (E), при L C цьому група R в одному з мономерів являє собою кепуючу групу, R або являє собою лінкер 2 6 9 7 8 5 UA 114073 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 для з'єднання з агентом, що зв'язується з клітинами. Альтернативно, згідно з одним варіантом реалізації винаходу, R″ являє собою C 3-12 алкіленову групу, вуглеводневий ланцюг якої може перериватися одним або більше гетероатомами, наприклад, O, S, N(H), NMe і/або ароматичними кільцями, наприклад, бензольним або піридиновим, причому зазначені кільця необов'язково містять як замісник NH 2. Альтернативно, нові сполуки, які представляють собою кон'югати, можуть бути вибрані зі сполук формули (A), як описано вище, і (A-I), де (A-I) вибрано з (A-A) і (A-B): 10 9 R 11 10 R 9 QR R 11 R 8 QR N R 8 N H R H R3 Y W 7 N R 7 U N R 2 T 6 R V R 6 O R O 1 R A-A A-B та їх солей і сольватів, де: 6 9 10 11 R , R , R , Q, R , R і R" є такими, як визначено для сполуки формули (A); 7 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 8 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 6 9 або будь-яка пара суміжних груп із R -R разом утворюють групу -O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2, 2 1 3 R з будь-яким із R або R разом із атомами вуглецю C-кільця, до яких вони приєднані, утворює необов'язково заміщене бензольне кільце; кожен V і W вибраний із (CH2)n, O, S, NR, CHR і CRR", де n дорівнює 1, 2 або 3, за винятком 1 2 того, що V являє собою C, коли R і R разом із атомами вуглецю С-кільця, до якого вони 3 приєднані, утворюють необов'язково заміщене бензольне кільце, і W являє собою C, коли R і 2 R разом із атомами вуглецю С-кільця, до якого вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене бензольне кільце; T вибраний із CH2, NR, CO, BH, SO та SO2; U вибраний із CH2, NR, O та S; Y являє собою (CH2)n, де n дорівнює 1, 2, 3 або 4; за винятком того, що не всі з T, U та Y являють собою CH 2; або зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (A), кожен мономер якого має формулу (A-I), один мономер якого має формулу (A), а інший мономер має формулу (B), як описано вище, чи (B-I), або один мономер якого має формулу (A-I), а інший мономер має формулу (B) чи (B-I), а (B-I) вибраний із (B-A) та (B-B): 9 9 R R 8 8 N N 3 R R H H R W Y 7 7 N N R U R 2 R V T 6 6 R R O O 1 R B-A B-B де R1, R2, R3, R6, R9, R7 і R8 є такими, як визначено для сполуки формули (A-I), і групи R7 або групи R8 кожного мономеру разом утворюють димерний мостик, який зв'язує мономери і має формулу -X-R″-X-; де R″ являє собою C3-12 алкіленову групу, вуглеводний ланцюг якої може перериватися одним або більше гетероатомами, наприклад, O, S, N(H), NMe і/або ароматичними кільцями, наприклад, бензольним або піридиновим, причому зазначені кільця необов'язково містять в якості замісник NH2; і кожен X являє собою O, S або N(H); і де зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (A-I) і/або 10 C формулу (A), при цьому група R в одному з мономерів являє собою кепуючу групу R або являє собою лінкер, з'єднаний із агентом, що зв'язується з клітинами. Для зручності всі посилання на сполуку A можуть застосовуватися до A-I (і A-A, і A-B) й усі 6 UA 114073 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 посилання на сполуку B можуть застосовуватися до B-I (і B-A, і B-B). Аналогічно, посилання на сполуку C, D і E також відноситься відповідно до (C-I), (D-I) і (E-I). Альтернативно, зазначений кон'югат можна застосовувати для одержання сполуки в області-мішені, де сполука являє собою сполуку формули (C), як описано вище, або (C-I), де (C-I) вибрано з (C-A) і (C-B): 9 9 R R 8 N 8 R N H 3 R H R Y W 7 N 7 R U N R 2 T 6 R V 6 R O R O 1 R C-A C-B та їх солей і сольватів, де: 6 9 R , R , R і R" є такими, як визначено для сполуки формули (C); 7 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 8 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 6 9 або будь-яка пара суміжних груп із R -R разом утворює групу -O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2, 2 1 3 R з будь-яким із R або R разом із атомами вуглецю C-кільця, до яких вони приєднані, утворює необов'язково заміщене бензольне кільце; кожен V та W вибраний із (CH2)n, O, S, NR, CHR і CRR", де n дорівнює 1, 2 або 3, за 1 2 винятком того, що V являє собою C, коли R і R разом із атомами вуглецю С-кільця, до якого вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене бензольне кільце, і W являє собою C, коли 3 2 R та R разом із атомами вуглецю C-кільця, до яких вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене бензольне кільце; T вибраний із CH2, NR, CO, BH, SO та SO2; U вибраний із CH2, NR, O та S; Y являє собою (CH2)n, де n дорівнює 1, 2, 3 або 4; за винятком того, що не всі з T, U та Y являють собою CH 2; або зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (C), кожен мономер якого має формулу (C-I), або один мономер якого має формулу (C), а інший мономер 7 8 має формулу (C-I), а групи R або групи R кожного мономеру разом утворюють димерний мостик, який зв'язує мономери і має формулу -X-R"-X-; де R″ являє собою C3-12 алкіленову групу, вуглеводневий ланцюг якої може перериватися одним або більше гетероатомами, наприклад, O, S, N(H), NMe та/або ароматичними кільцями, наприклад, бензольним або піридиновим, причому зазначені кільця необов'язково містять як замісник NH2; і кожен X являє собою O, S або N(H). Даний винахід також відноситься до застосування кон'югату для отримання сполуки в області-мішені, де зазначена сполука являє собою сполуку формули (D), як описано вище, або формули (D-I); де (D-I) вибрано з (D-A) і (D-B): 9 11 R 9 QR 11 H R 8 QR H N R 8 N H R H R3 Y W 7 N R 7 U N R 2 T 6 R V R 6 O R O 1 R D-A D-B та їх солей і сольватів, де: 6 9 R , R , R і R" є такими, як визначено для сполуки формули (D); 7 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 8 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 6 9 або будь-яка пара суміжних груп із R -R разом утворює групу O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2, Q незалежно обраний з O, S і NH; 7 UA 114073 C2 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 R являє собою H або R, або, якщо Q являє собою O, SO 3M, де M являє собою катіон металу; 2 1 3 R з будь-яким із R або R разом із атомами вуглецю C-кільця, до яких вони приєднані, утворює необов'язково заміщене бензольне кільце; кожен V та W вибраний із (CH2)n, O, S, NR, CHR і CRR", де n дорівнює 1, 2 або 3, за 1 2 винятком того, що V являє собою C, коли R і R разом із атомами вуглецю C-кільця, до яких вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене бензольне кільце, і W являє собою C, коли 3 2 R і R разом із атомами вуглецю C-кільця, до яких вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене бензольне кільце; T вибраний із CH2, NR, CO, BH, SO та SO2; U вибраний із CH2, NR, O та S; Y являє собою (CH2)n, де n дорівнює 1, 2, 3 або 4; за винятком того, що не всі з T, U та Y являють собою CH 2; або зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (D), кожен мономер якого має формулу (D-I), або один мономер якого має формулу (D), а інший мономер 7 8 має формулу (D-I), й групи R або групи R кожного мономеру разом утворюють димерний мостик, який зв'язує мономери і має формулу -X-R"-X-; де R″ являє собою C3-12 алкіленову групу, вуглеводневий ланцюг якої може перериватися одним або більше гетероатомами, наприклад, O, S, N(H), NMe і/або ароматичними кільцями, наприклад, бензольним або піридиновим, причому зазначені кільця необов'язково містять як замісник NH2; і кожен X являє собою O, S або N(H). Альтернативно, згідно з даним винаходом також для застосування запропоновані сполуки формули (E), як описано вище, і (E-I) для одержання сполук, що являють собою кон'югати згідно з даним винаходом; де (E-I) вибрано з (E-A) і (E-B): L 9 11 L R R 9 QR 11 R R 8 QR N R 8 N H R H R3 Y W 7 N R 7 U N R T 2 6 R R V 6 O R O 1 R E-B E-A та їх солей і сольватів, де: 6 9 R , R , R і R" є такими, як визначено для сполуки формули (D); 7 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 8 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену; 6 9 або будь-яка пара суміжних груп із R -R разом утворює групу -O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2, L R являє собою лінкер для з'єднання з агентом, який зв'язується з клітинами; Q незалежно обраний із O, S і NH; 11 R являє собою H або R, або, якщо Q являє собою O, SO 3M, де M являє собою катіон металу; 2 1 3 R з будь-яким із R або R разом із атомами вуглецю C-кільця, до яких вони приєднані, утворює необов'язково заміщене бензольне кільце; кожен V та W вибраний із (CH2)n, O, S, NR, CHR і CRR", де n дорівнює 1, 2 або 3, за 1 2 винятком того, що V являє собою C, коли R і R разом із атомами вуглецю C-кільця, до яких вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене бензольне кільце, і W являє собою C, коли 3 2 R і R разом із атомами вуглецю C-кільця, до яких вони приєднані, утворюють необов'язково заміщене бензольне кільце; T вибраний із CH2, NR, CO, BH, SO і SO2; U вибраний із CH2, NR, O і S; Y являє собою (CH2)n, де n дорівнює 1, 2, 3 або 4; за винятком того, що не всі з T, U та Y являють собою CH2; або зазначена сполука являє собою димер, кожен мономер якого має формулу (E), кожен мономер якого має формулу (E-I), або один мономер якого має формулу (E) чи (E-1), а інший мономер має формулу (E), (E-I), (B) або (B-1); 7 8 і групи R або групи R кожного мономеру разом утворюють димерний мостик, який зв'язує 8 UA 114073 C2 5 10 15 20 25 30 35 мономери і має формулу -X-R"-X-; де R″ являє собою C3-12 алкіленову групу, вуглеводневий ланцюг якої може перериватися одним або більше гетероатомами, наприклад, O, S, N(H), NMe і/або ароматичними кільцями, наприклад, бензольним або піридиновим, причому зазначені кільця необов'язково містять як замісник NH2; і кожен X являє собою O, S або N(H). Короткий опис фігур На Фігурі 1 показані конкретні варіанти реалізації даного винаходу; На Фігурі 2-6 показані результати біологічних аналізів для конкретних варіантів реалізації даного винаходу. Детальний опис винаходу Згідно з даним винаходом запропонований кон'югат, який містить PBD сполуку, приєднану за допомогою лінкера через положення N10 до агента, який зв'язується з клітинами. Згідно з одним варіантом реалізації винаходу кон'югат містить агент, який зв'язується з клітинами, з'єднаний зі спейсерною зв'язуючою групою, при цьому спейсер з'єднаний із тригером, а тригер з'єднаний із лінкером, що саморозщеплюється, а лінкер, що саморозщеплюється, з'єднаний із положенням N10 PBD сполуки. Описаний кон'югат показаний нижче: де CBA являє собою агент, що зв'язується з клітинами, а PBD являє собою піролбензодіазепінову сполуку згідно з даним винаходом. На ілюстрації показані фрагменти, які 10 1 2 відповідають R , A, L і L в конкретних варіантах реалізації винаходу. Даний винахід підходить для застосування при отриманні PBD сполуки в переважній області у тілі суб'єкта. Згідно з переважними варіантами реалізації даного винаходу кон'югат забезпечує вивільнення активної PBD сполуки, яка не містить будь-яких фрагментів лінкера. При цьому не спостерігається будь-яких залишків, які могли б впливати на реакційну здатність PBD сполуки. Згідно з певними варіантами реалізації винаходу запропоновані кон'югати, які містять PBD димерну групу, що містить лінкер, з'єднаний із агентом, який зв'язується з клітинами. Автори даного винаходу описують в даному тексті способи синтезу, які дозволяють отримати такі димерні кон'югати шляхом застосування нових методів десиметризації PBD. Переважні варіанти Наступні переважні варіанти можуть бути застосовні до всіх аспектів винаходу, описаних вище, чи можуть відноситися до одного аспекту. Переважні варіанти можна об'єднувати в будьякій комбінації. Подвійний зв'язок Згідно з одним варіантом реалізації подвійний зв'язок між C1 та C2 і C2 та C3 відсутній. Згідно з одним варіантом реалізації пунктирні лінії позначають необов'язкову наявність подвійного зв'язку між C2 і C3, як показано нижче: H N 2 R 40 O 2 Згідно з одним варіантом реалізації подвійний зв'язок присутній між C2 і C3, коли R являє собою C5-20 арил або C1-12 алкіл. Згідно з одним варіантом реалізації пунктирні лінії позначають необов'язкову наявність подвійного зв'язку між C1 і C2, як показано нижче: 9 UA 114073 C2 H N 2 R 5 10 15 O 2 Згідно з одним варіантом реалізації подвійний зв'язок між C1 і C2 присутній, коли R являє собою C5-20 арил або C1-12 алкіл. 2 R 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно вибраний із H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, D D =CH-R , =C(R )2, O-SO2-R, CO2R та COR і необов'язково додатково вибраний із галогену або дигалогену. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно вибраний із H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, D D =CH-R , =C(R )2, O-SO2-R, CO2R і COR. 2 D Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно вибраний із H, =O, =CH2, R, =CH-R і D =C(R )2. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою H. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою =O. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою =CH2. 2 D Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою =CH-R . У PBD сполуці група D =CH-R може мати будь-яку конфігурацію, показану нижче: H H N D N R O O 25 30 35 40 45 D R H (II) (I) 20 H Згідно з одним варіантом реалізації зазначена конфігурація являє собою конфігурацію (I). 2 D Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою =C(R )2. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою =CF2. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою R. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений C 520 арил. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений C 112 алкіл. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений C520 арил. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений C 57 арил. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений C 810 арил. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений феніл. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений нафтил. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений піридил. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений хінолініл або ізохінолініл. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R містить від однієї до трьох груп як замісники, більш переважно 1 і 2 групи, й найбільш переважно містить як замісник одну групу. Замісники можуть знаходитися в будь-якому положенні. 2 Коли R являє собою C5-7 арильну групу, єдиний замісник переважно знаходиться у атомі кільця, який не є суміжним зі зв'язком із іншою частиною сполуки, тобто переважно знаходиться в β або γ положенні відносно зв'язку з іншою частиною сполуки. Отже, коли C 5-7 арильна група являє собою феніл, замісник переважно знаходиться в мета- або пара-положенні й більш переважно в пара-положенні. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R вибраний із: 10 UA 114073 C2 * * O O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 O O де зірочка позначає місце приєднання. 2 Коли R являє собою C8-10 арильну групу, наприклад, хінолініл або ізохінолініл, він може містити будь-яку кількість замісників у будь-якому положенні в хіноліновому або ізохіноліновому кільці. Згідно з деякими варіантами реалізації він містить один, два або три замісника, й зазначені замісники можуть знаходитися як у проксимальному, так і в дистальному кільці, або в обох кільцях (якщо міститься більше одного замісника). 2 Згідно з одним варіантом реалізації, якщо R є необов'язково заміщеним, замісники обрані з замісників, представлених нижче в розділі з описом замісників. Коли R є необов'язково заміщеним, замісники переважно вибрані з: галогену, гідроксилу, простої ефірної групи, формілу, ацилу, карбокси, складноефірної групи, ацилокси, аміно, амідо, ациламідо, амінокарбонілокси, уреїдо, нітро, ціано та тіоефірної групи. 2 Згідно з одним варіантом реалізації, коли R або R є необов'язково заміщеними, замісники вибрані з групи, яка складається з R, OR, SR, NRR", NO2, галогену, CO2R, COR, CONH2, CONHR та CONRR". 2 Коли R являє собою C1-12 алкіл, необов'язковий замісник може додатково включати C3-20 гетероциклільні та C5-20 арильні групи. 2 Коли R являє собою C3-20 гетероцикліл, необов'язковий замісник може додатково включати C1-12 алкільні та C5-20 арильні групи. 2 Коли R являє собою C5-20 арильні групи, необов'язковий замісник може додатково включати C3-20 гетероциклільні та C1-12 алкільні групи. Очевидно, що термін "алкіл" включає підкласи алкенів та алкінів, а також циклоалкіл. Таким 2 чином, якщо R являє собою необов'язково заміщений C1-12 алкіл, це означає, що алкільна група необов'язково містить один або більше вуглець-вуглецевий подвійний чи потрійний зв'язок, який може утворювати фрагмент кон'югованої системи. Згідно з одним варіантом реалізації необов'язково заміщена C1-12 алкільна група містить щонайменше один вуглець-вуглецевий подвійний чи потрійний зв'язок, і зазначений зв'язок є кон'югованим із подвійним зв'язком, присутнім між C1 та C2 або C2 та C3. Згідно з одним варіантом реалізації C1-12 алкільна група являє собою групу, вибрану з насиченого C1-12 алкілу, C2-12 алкенілу, C2-12 алкінілу та C3-12 циклоалкілу. 2 Якщо замісник в R являє собою галоген, то він переважно являє собою F або Cl, більш переважно Cl. 2 Якщо замісник в R являє собою просту ефірну групу, то згідно з деякими варіантами реалізації винаходу він може являти собою алкокси-групу, наприклад, C1-7 алкокси-групу (наприклад метокси, етокси), або згідно з деякими варіантами реалізації він може являти собою C5-7 арилокси-групу (наприклад, фенокси, піридилокси, фуранілокси). 2 Якщо замісник в R являє собою C1-7 алкіл, то він переважно може являти собою C 1-4 алкільну групу (наприклад метил, етил, пропіл, бутил). 2 Якщо замісник в R являє собою C3-7 гетероцикліл, то згідно з деякими варіантами реалізації він може являти собою C6 азотовмісну гетероциклільну групу, наприклад, морфоліно, тіоморфоліно, піперидин, піперазиніл. Зазначені групи можуть бути пов'язані з іншою частиною PBD фрагмента через атом азоту. Зазначені групи також можуть містити замісник, наприклад, C1-4 алкільну групу. 2 Якщо замісник в R являє собою біс-окси-C1-3 алкіл, то він переважно являє собою бісоксиметилен або біс-оксиетилен. 2 Особливо переважні замісники для R включають метокси, етокси, фтор, хлор, ціанo, бісоксиметилен, метилпіперазиніл, морфоліно й метилтієніл. 2 Особливо переважні заміщені R групи включають, але не обмежуються ними, 4метоксифеніл, 3-метоксифеніл, 4-етоксифеніл, 3-етоксифеніл, 4-фторфеніл, 4-хлорфеніл, 3,4бісоксиметиленфеніл, 4-метилтієніл, 4-ціанoфеніл, 4-феноксифеніл, хінолін-3-іл та хінолін-6-іл, ізохінолін-3-іл та ізохінолін-6-іл, 2-тієніл, 2-фураніл, метоксинафтил і нафтил. 2 Згідно з одним варіантом реалізації R являє собою галоген або дигалоген. Згідно з одним 2 варіантом реалізації R являє собою -F або -F2, зазначені замісники показані нижче як (III) та (IV) відповідно: 11 UA 114073 C2 H H N N F O O (IV) (III) D 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 F F R D Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно вибраний із R, CO2R, COR, CHO, CO2H і галогену. D Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою R. D Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою галоген. 6 R 6 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn- і галогену. 6 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно вибраний із H, OH, OR, SH, NH2, NO2 й галогену. 6 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно вибраний із H і галогену. 6 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою H. 6 7 Згідно з одним варіантом реалізації R та R разом утворюють групу -O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2. 7 R 7 R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH 2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn й галогену. 7 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою OR. 7 7A 7A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою OR , де R незалежно являє собою необов'язково заміщений C1-6 алкіл. 7A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений насичений C1-6 алкіл. 7A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений C2-4 алкеніл. 7A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою Me. 7A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою CH2Ph. 7A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою аліл. 7 Згідно з одним варіантом реалізації зазначена сполука являє собою димер, де групи R кожного мономеру разом утворюють димерний мостик, який зв'язує мономери і має формулу XR″-X. 8 R 8 Згідно з одним варіантом реалізації зазначена сполука являє собою димер, де групи R кожного мономеру разом утворюють димерний мостик, який зв'язує мономери і має формулу XR″-X. 8 8A 8A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою OR , де R незалежно являє собою необов'язково заміщений C1-4 алкіл. 8A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою необов'язково заміщений насичений C1-6 алкіл або необов'язково заміщений C2-4 алкеніл. 8A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою Me. 8A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою CH2Ph. 8A Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою аліл. 8 7 Згідно з одним варіантом реалізації R і R разом утворюють групу -O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2. 8 9 Згідно з одним варіантом реалізації R і R разом утворюють групу -O-(CH2)p-O-, де p дорівнює 1 або 2. 9 R 9 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно вибраний із H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR", NO2, Me3Sn- і галогену. 9 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою H. 9 Згідно з одним варіантом реалізації R незалежно являє собою R або OR. 10 R 10 Щоб уникнути неправильного тлумачення, якщо R являє собою лінкер, з'єднаний із агентом, який зв'язується з клітинами, зазначений агент, який зв'язується з клітинами, являє 12 UA 114073 C2 10 5 собою фрагмент групи R . Згідно з певними варіантами реалізації даного винаходу, якщо кон'югат являє собою димер, 10 який містить два мономери A, то один мономер містить групу R , яка являє собою лінкер, 10 з'єднаний із агентом, який зв'язується з клітинами, а інший мономер містить групу R , яка являє C собою лінкер, з'єднаний із агентом, який зв'язується з клітинами, або кепуючу групу R . 10 C Переважно інший мономер містить групу R , яка являє собою кепуючу групу R . Таким чином, згідно із зазначеним переважним варіантом реалізації винаходу існує тільки один зв'язок із агентом, який зв'язується з клітинами. 10 15 20 25 30 35 40 45 де R і M є такими, як визначено для кон'югатів згідно з даним винаходом. 10 Згідно з одним варіантом реалізації група R здатна видалятися з положення N10 PBD фрагмента з утворенням N10-C11 імінного зв'язку. Згідно з деякими варіантами реалізації кон'югат згідно з даним винаходом являє собою димерну сполуку, яка містить мономер формули (A) та мономер формули (B). Згідно із 10 зазначеним варіантом реалізації група R не повинна бути здатною видалятися з положення N10, оскільки мономер (B) містить відповідну функціональну групу в положеннях N10 і C11, яка забезпечує біологічну активність. 10 Однак, переважно група R здатна видалятися з отриманням димера, який містить підходящу функціональну групу в положеннях N10 і C11 в обох мономерних ланках. Така функціональна група вважається необхідною для забезпечення перехресного зшивання PBD димера. Дана заявка, зокрема, відноситься до таких R10 груп, які з'єднані з положенням N10 карбаматним зв'язком. Лінкер з'єднує агент (CBA), який зв'язується з клітинами, наприклад, антитіло, з фрагментом D лікарського засобу PBD за допомогою ковалентного зв'язку (зв'язків). Лінкер являє собою біфункціональний або мультифункціональний фрагмент, який можна використовувати для зв'язування одного або більше фрагментів лікарського засобу (D) та одиниці антитіла (Ab) з утворенням кон'югату антитіло-лікарський засіб (ADC). Лінкер (L) може бути стабільним за межами клітини, тобто позаклітинно, або ж він може піддаватися розщепленню під дією ферментативної активності, гідролізу або в умовах інших процесів метаболізму. Кон'югат антитіло-лікарський засіб (ADC) зручно отримувати з використанням лінкера, який містить реакційноздатну функціональну групу для зв'язування з фрагментом лікарського засобу та з антитілом. Тіолова група цистеїну або амінна група, наприклад, N-кінцевий або бічний ланцюг амінокислоти, такої як лізин, в антитілі (Ab) може утворювати зв'язок із функціональною групою лінкерного або спейсерного реагента, фрагментом PBD лікарського засобу (D) або комплексом лікарський засіб-лінкерний реагент (DL). Багато функціональних груп у лінкері, приєднаному до положення N10 PBD фрагмента, можуть бути задіяні для зв'язування з агентом, який зв'язується з клітинами. Наприклад, складноефірні, складнотіоефірні, амідні, тіоамідні, карбаматні, тіокарбаматні, сечовинні, тіосечовинні, прості ефірні, прості тіоефірні або дисульфідні зв'язки можуть утворюватися в результаті взаємодії інтермедіату лінкер-PBD лікарський засіб з агентом, який зв'язується з клітинами. Лінкери ADC переважно запобігають агрегації молекул ADC і забезпечують знаходження ADC у вільно розчинній у водному середовищі формі і в мономерному стані. Лінкери ADC переважно є стабільними поза клітинами. До транспортування або доставки в клітину кон'югат антитіло-лікарський засіб (ADC) переважно є стабільним і залишається 13 UA 114073 C2 5 10 15 20 інтактним, тобто антитіло залишається пов'язаним із фрагментом лікарського засобу. Лінкери є стабільними поза клітинами-мішенями і можуть розщеплюватися з деякою ефективною швидкістю всередині клітин. Ефективний лінкер: (i) підтримує властивості специфічного зв'язування антитіла; (ii) забезпечує внутрішньоклітинну доставку кон'югату або фрагмента лікарського засобу; (iii) залишається стабільним та інтактним, тобто не розщеплюється до моменту доставки або транспортування зазначеного кон'югату до області-мішені; і (iv) підтримує цитотоксичну дію, яка призводить до знищення клітин, або цитостатичну дію фрагмента PBD лікарського засобу. Стабільність ADC можна визначити за допомогою стандартних аналітичних методів, таких як мас-спектрометрія, ВЕРХ та метод розділення/аналізу РХ/МС. Для ковалентного зв'язування антитіла та фрагмента лікарського засобу необхідно, щоб лінкер мав дві реакційноздатні функціональні групи, тобто був бівалентним з точки зору реакційноздатності. Бівалентні лінкерні реагенти, які можуть використовуватися для скріплення двох або більше функціональних або біологічно активних фрагментів, таких як пептиди, нуклеїнові кислоти, лікарські засоби, токсини, антитіла, гаптени та репортерні групи, є відомими, а також описані способи одержання кон'югатів із використанням зазначених лінкерів (Hermanson, GT (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p 234-242). Згідно з іншим варіантом реалізації лінкер може містити як замісники групи, які модулюють агрегацію, розчинність або реакційноздатність. Наприклад, сульфонатний замісник може підвищувати розчинність реагента у воді і полегшувати реакцію поєднання лінкерного реагента з антитілом чи фрагментом лікарського засобу або полегшувати реакцію поєднання Ab-L з D чи D-L з Ab, в залежності від схеми синтезу, який використовується для одержання ADC. 10 Згідно з одним варіантом реалізації R являє собою наступну групу: CBA 1 A L 2 L O * O 25 30 35 40 45 50 55 де зірочка позначає місце приєднання до положення N10, CBA являє собою агент, який 1 1 зв'язується з клітинами, L являє собою лінкер, A являє собою групу, яка зв'язує L з агентом, який зв'язується з клітинами, L2 являє собою ковалентний зв'язок або разом із -OC(=O)1 2 утворює лінкер, що саморозщеплюється, а L або L являє собою здатний до розщеплення лінкер. 1 L переважно являє собою здатний до розщеплення лінкер і може називатися тригером для активації розщеплення лінкера. 1 2 Природа L і L , при його наявності, може сильно варіюватися. Зазначені групи вибираються відповідно до їх здатності до розщеплення, яка може залежати від умов у області-мішені, до якої доставляється кон'югат. Лінкери, які розщеплюються під дією ферментів, є переважними, незважаючи на те, що також можуть використовуватися лінкери, здатні до розщеплення при зміні pH (наприклад, кислотолабільні або лужнолабільні), температури або при опроміненні (наприклад, фотолабільні). Лінкери, здатні до розщеплення в присутності відновника або окислювача, також можуть використовуватися згідно з даним винаходом. 1 L може містити безперервну послідовність амінокислот. Амінокислотна послідовність може являти собою субстратну мішень для ферментативного розщеплення, забезпечуючи за рахунок 10 цього вивільнення R з положення N10. 1 Згідно з одним варіантом реалізації L розщеплюється під дією ферменту. Згідно з одним варіантом реалізації фермент являє собою естеразу або пептидазу. 2 Згідно з одним варіантом реалізації L є присутнім і разом із -C(=O)O- утворює лінкер, що 2 саморозщеплюється. Згідно з одним варіантом реалізації L являє собою субстрат для ферментативної активності, таким чином забезпечуючи вивільнення R10 з положення N10. 1 Згідно з одним варіантом реалізації, коли L розщеплюється під дією ферменту і присутній 2 1 2 L , фермент розщеплює зв'язок між L і L . 1 2 L і L , за наявності, можуть бути зв'язані за допомогою зв'язку, вибраного з: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH- та 14 UA 114073 C2 5 10 15 -NHC(=O)NH-. 1 2 Аміногрупа L , яка зв'язується з L , може являти собою N-кінець амінокислоти або може походити з аміногрупи бічного ланцюга амінокислоти, наприклад, бічного ланцюга амінокислоти лізину. 1 2 Карбоксильна група L , яка зв'язується з L , може являти собою C-кінець амінокислоти або може походити з карбоксильної групи бічного ланцюга амінокислоти, наприклад, бічного ланцюга глутамінової кислоти. 1 2 Гідроксильна група L , яка зв'язується з L , може походити з гідроксильної групи бічного ланцюга амінокислоти, наприклад, бічного ланцюга амінокислоти серину. Термін "бічний ланцюг амінокислоти" включає групи, які зустрічаються в: (i) природних амінокислотах, таких як аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінова кислота, цистеїн, глутамін, глутамінова кислота, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, пролін, серин, треонін, триптофан, тирозин і валін; (ii) мінорних амінокислотах, таких як орнітин і цитрулін; (iii) неприродних амінокислотах, бета-амінокислотах, синтетичних аналогах і похідних природних амінокислот; та (iv) усіх енантіомерах, діастереомерах, ізомерно збагачених формах, 2 3 14 15 мічених ізотопом формах (наприклад, H, H, C, N), захищених формах і їхніх рацемічних сумішах. 2 Згідно з одним варіантом реалізації -C(=O)O- і L разом утворюють групу: Y * O n O 20 25 30 де зірочка позначає місце приєднання до положення N10, хвиляста лінія позначає місце 1 приєднання до лінкера L , Y являє собою -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- або -C(=O)O-, а n дорівнює 03. Феніленове кільце необов'язково містить як замісник один, два або три замісника, описаних у даному тексті. Згідно з одним варіантом реалізації феніленова група необов'язково містить як замісник галоген, NO2, R або OR. Згідно з одним варіантом реалізації Y являє собою NH. Згідно з одним варіантом реалізації n дорівнює 0 або 1. Переважно n дорівнює 0. Коли Y являє собою NH і n дорівнює 0, лінкер, що саморозщеплюється, може називатися памінобензилкарбонільним лінкером (PABC). Лінкер, що саморозщеплюється, забезпечує вивільнення захищеної сполуки при активації віддаленого сайту, діючи таким чином, як показано нижче (для n=0): Y Y O * L CO2 + O + * L * * 35 де L являє собою активовану форму фрагмента частини лінкера, який залишився. Зазначені групи мають перевагу, яка полягає в тому, що сайт активації відділений від сполуки, яка піддається захисту. Як описано вище, феніленова група може бути необов'язково заміщеною. * Згідно з одним варіантом реалізації, описаним у даному тексті, група L являє собою лінкер 1 L згідно з даним описом, який може містити дипептидну групу. 2 Згідно з іншим варіантом реалізації -C(=O)O- і L разом утворюють групу, вибрану з наступних: 15 UA 114073 C2 Y O * n O Y O * n 5 O де зірочка, хвиляста лінія, Y і n є такими, як визначено вище. Кожне феніленове кільце необов'язково містить один, два або три замісники, описані в даному тексті. Згідно з одним варіантом реалізації феніленове кільце, яке містить замісник Y, є необов'язково заміщеним, а феніленове кільце, яке не містить замісника Y, є незаміщеним. Згідно з одним варіантом реалізації феніленове кільце, яке містить замісник Y, є незаміщеним, а феніленове кільце, яке не містить замісника Y, є необов'язково заміщеним. 2 Згідно з іншим варіантом реалізації -(=O)O- і L разом утворюють групу, вибрану з: F O D n E * Y 10 15 20 25 30 35 40 O де зірочка, хвиляста лінія, Y і n є такими, як визначено вище, E являє собою O, S або NR, D являє собою N, CH або CR, і F являє собою N, CH або CR. Згідно з одним варіантом реалізації D являє собою N. Згідно з одним варіантом реалізації D являє собою CH. Згідно з одним варіантом реалізації E являє собою O або S. Згідно з одним варіантом реалізації F являє собою CH. Згідно з переважним варіантом реалізації лінкер являє собою катепсиновий лабільний лінкер. 1 Згідно з одним варіантом реалізації L містить дипептид. Зазначений дипептид може являти собою -NH-X1-X2-CO-, де –NH- і -CO- являють собою N- і C-кінці амінокислотних груп X1 і X2 відповідно. Амінокислоти у дипептиді можуть являти собою будь-яку комбінацію природних амінокислот. Коли лінкер являє собою катепсиновий лабільний лінкер, дипептид може являти собою місце дії для катепсин-опосередкованого розщеплення. Крім того, для зазначених амінокислотних груп, які містять карбоксильну або амінну функціональну групу бічного ланцюга, наприклад, Glu і Lys відповідно, CO і NH можуть являти собою зазначені функціональні групи бічного ланцюга. Згідно з одним варіантом реалізації група -X1-X2- у дипептиді -NH-X1-X2-CO- вибрана з: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg-, -Trp-Citде Cit являє собою цитрулін. Переважно група -X1-X2- у дипептиді -NH-X1-X2-CO- вибрана з: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, 16 UA 114073 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-. Найбільш переважно група -X1-X2- в дипептиді -NH-X1-X2-CO- являє собою -Phe-Lys- або Val-Ala-. Можуть використовуватися інші комбінації дипептидів, включаючи комбінації, описані в джерелі Dubowchik et al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13, 855-869, включеному до даної заявки за допомогою посилання. Згідно з одним варіантом реалізації бічний ланцюг амінокислоти являється дериватизованим, якщо це є прийнятним. Наприклад, аміногрупа або карбоксильна група бічного ланцюга амінокислоти може бути дериватизованою. Згідно з одним варіантом реалізації аміногрупа NH 2 бічного ланцюга амінокислоти, такої як лізин, знаходиться в дериватизованій формі, вибраній із групи, яка складається з NHR та NRR". Згідно з одним варіантом реалізації карбокси-група COOH бічного ланцюга амінокислоти, такої як аспарагінова кислота, знаходиться в дериватизованій формі, вибраній із групи, яка складається з COOR, CONH2, CONHR та CONRR". Згідно з одним варіантом реалізації бічний ланцюг амінокислоти являється хімічно захищеним, якщо це є прийнятним. Захисна група бічного ланцюга може являти собою групу, L описану нижче відносно групи R . Автори даного винаходу виявили, що захищені амінокислотні послідовності піддаються ферментативному розщепленню. Наприклад, було виявлено, що дипептидна послідовність, яка містить бічний ланцюг залишку Lys, захищений Boc-групою, піддається розщепленню катепсином. Захисні групи бічних ланцюгів амінокислот добре відомі в даній області техніки і описані в каталозі Novabiochem. Додаткові стратегії використання захисних груп представлені в джерелі Protective Groups in Organic Synthesis, Greene and Wuts. Можливі захисні групи бічних ланцюгів амінокислот, які містять реакційноздатну функціональну групу у бічному ланцюзі, показані нижче: Arg: Z, Mtr, Tos; Asn: Trt, Xan; Asp: Bzl, t-Bu; Cys: Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt; Glu: Bzl, t-Bu; Gln: Trt, Xan; His: Boc, Dnp, Tos, Trt; Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z, Alloc; Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS; Thr: Bz; Trp: Boc; Tyr: Bzl, Z, Z-Br. Згідно з одним варіантом реалізації захисна група бічного ланцюга обрана таким чином, що вона розташована ортогонально відносно групи, яка являє собою кепуючу групу або її частину (за наявності зазначеної кепуючої групи). Таким чином, видалення захисної групи бічного ланцюга не призводить до видалення кепуючої групи або якої-небудь захисної, функціональної групи, яка є частиною кепуючої групи. Згідно з іншими варіантами реалізації даного винаходу, вибрані амінокислоти являють собою амінокислоти, які не містять реакційноздатної функціональної групи в бічному ланцюзі. Наприклад, амінокислоти можуть бути обрані з: Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro і Val. Згідно з одним варіантом реалізації дипептид використовується в комбінації з лінкером, що саморозщеплюється. Лінкер, що саморозщеплюється, може бути пов'язаний із -X2-. Якщо лінкер, що саморозщеплюється, присутній, то -X2- безпосередньо зв'язаний із зазначеним лінкером, що саморозщеплюється. Переважно група -X2-CO- зв'язана з Y, де Y являє собою NH, з утворенням, таким чином, групи -X2-CO-NH-. -NH-X1- безпосередньо зв'язана з групою A. Зазначена група A може містити функціональну групу CO з утворенням, таким чином, амідного зв'язку з -X1-. 1 2 Згідно з одним варіантом реалізації L і L разом із -OC(=O)- складають групу NH-X1-X2-COPABC-. PABC-група безпосередньо зв'язана з положенням N10. Переважно лінкер, що саморозщеплюється, і дипептид разом утворюють групу -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-, яка показана нижче: 17 UA 114073 C2 O N H H N O O * N H O NH2 5 де зірочка позначає місце приєднання до положення N10, а хвиляста лінія позначає місце 1 приєднання до іншої частини лінкера L або місце приєднання до A. Переважно хвиляста лінія позначає місце приєднання до A. Бічний ланцюг амінокислоти Lys може містити захисну групу, наприклад, Boc, Fmoc або Alloc, як описано вище. Альтернативно, лінкер, що саморозщеплюється, і дипептид разом утворюють групу -NH-ValAla-CO-NH-PABC-, яка показана нижче: O H N N H 10 O O * N H O де зірочка і хвиляста лінія є такими, як визначено вище. Альтернативно, лінкер, що саморозщеплюється, і дипептид разом утворюють групу -NH-ValCit-CO-NH-PABC-, яка показана нижче: O N H H N O O * N H O NH H2 N 15 20 25 30 O де зірочка і хвиляста лінія є такими, як визначено вище. Згідно з деякими варіантами реалізації даного винаходу, переважним може бути те, що коли PBD/фрагмент лікарського засобу містить незахищений імінний зв'язок, наприклад, при присутності фрагмента B, то лінкер не містить вільної аміногрупи (H 2N-). Таким чином, якщо 1 2 лінкер має структуру -A-L -L -, то він переважно не містить вільної аміногрупи. Зазначений 1 переважний варіант особливо застосовний, якщо лінкер містить дипептид, наприклад, як L ; згідно із зазначеним варіантом реалізації переважно одна з двох амінокислот не обрана з лізину. Не обмежуючись будь-якою теорією, автори даного винаходу виявили, що комбінація незахищеного імінного зв'язку в фрагменті лікарського засобу та вільної аміногрупи в лінкері може викликати димеризацію сполуки лікарський засіб-лінкерний фрагмент, яка може перешкоджати кон'югації зазначеної сполуки лікарський засіб-лінкерний фрагмент з антитілом. Перехресне зшивання зазначених груп може посилюватися при наявності вільної аміногрупи, + такої як йон амонію (H3N -), наприклад, при використанні сильної кислоти (наприклад, TFA) для зняття захисту з вільної аміногрупи. 1 Згідно з одним варіантом реалізації A являє собою ковалентний зв'язок. Таким чином, L і 1 агент, який зв'язується з клітинами, зв'язані напряму. Наприклад, якщо L містить безперервну амінокислотну послідовність, то N-кінець зазначеної послідовності може безпосередньо зв'язуватися з агентом, який зв'язується з клітинами. Таким чином, якщо A являє собою ковалентний зв'язок, то зв'язок між агентом, який 1 зв'язується з клітинами, і L може бути обраний із: 18 UA 114073 C2 5 10 15 20 25 -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -C(=O)NHC(=O)-, -S-, -S-S-, -CH2C(=O)- та =N-NH-. 1 Аміногрупа L , яка зв'язується з агентом, що зв'язується з клітинами, може являти собою Nкінець амінокислоти або може походити з аміногрупи бічного ланцюга амінокислоти, наприклад, бічного ланцюга амінокислоти лізину. 1 Карбоксильна група L , яка зв'язується з агентом, що зв'язується з клітинами, може являти собою C-кінець амінокислоти або може походити з карбоксильної групи бічного ланцюга амінокислоти, наприклад бічного ланцюга глутамінової кислоти. 1 Гідроксильна група L , яка зв'язується з агентом, що зв'язується з клітинами, може походити з гідроксильної групи бічного ланцюга амінокислоти, наприклад, бічної групи амінокислоти серину. 1 Тіолова група L , яка зв'язується з агентом. що зв'язується з клітинами, може походити з тіолової групи бічного ланцюга амінокислоти, наприклад, бічного ланцюга амінокислоти серину. Коментарі, наведені вище стосовно аміногруп, карбоксильних, гідроксильних і тіолових груп 1 L , також застосовні до агента, який зв'язується з клітинами. 2 Згідно з одним варіантом реалізації L разом із -OC(=O)- являє собою: O Y n 30 35 40 O * E де зірочка позначає місце приєднання до положення N10, хвиляста лінія позначає місце 1 приєднання до L , n дорівнює 0-3, Y являє собою ковалентний зв'язок або функціональну групу і E являє собою активовану групу, наприклад, у результаті дії ферментів або світла, з отриманням, таким чином, одиниці, що саморозщеплюється. Феніленове кільце необов'язково додатково містить один, два або три замісники, описані в даному тексті. Згідно з одним варіантом реалізації феніленова група необов'язково додатково містить як замісник галоген, NO2, R або OR. Переважно n дорівнює 0 або 1, найбільш переважно 0. E обраний таким чином, що зазначена група є чутливою до активації, наприклад, світлом або під дією ферменту. E може являти собою -NO2 або глюкуронову кислоту, при цьому перша із зазначених груп може бути чутливою до діїнітроредуктази, а остання – до дії βглюкуронідази. Згідно із зазначеним варіантом реалізації, лінкер, що саморозщеплюється, забезпечує вивільнення захищеної сполуки, коли E активований, діючи таким чином, як показано нижче (для n=0): * E * Y E O O Y CO2 + * 45 де зірочка позначає місце приєднання до положення N10, E* являє собою активовану форму E і Y є таким, як описано вище. Зазначені групи мають перевагу, яка полягає в тому, що сайт активації відділений від захищуваної сполуки. Як описано вище, феніленова група може бути 19 UA 114073 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 необов'язково додатково заміщена. 1 Група Y може являти собою ковалентний зв'язок з L . Група Y може являти собою функціональну групу, вибрану з: -C(=O)-NH-O-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -NHC(=O)NH, -C(=O)NHC(=O)- та -S-. 1 де L являє собою дипептид, Y переважно являє собою -NH- або -C(=O)- з утворенням, 1 таким чином, амідного зв'язку між L і Y. Згідно із зазначеним варіантом реалізації дипептидна послідовність не обов'язково є субстратом для ферментативної активності. 1 Згідно з іншим варіантом реалізації A являє собою спейсерну групу. Таким чином, L та агент, який зв'язується з клітинами, є зв'язаними не напряму. 1 L і A можуть бути пов'язані за допомогою зв'язку, вибраного з: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH- та -NHC(=O)NH-. Переважно лінкер містить електрофільну функціональну групу для взаємодії з нуклеофільною функціональною групою агента, який зв'язується з клітинами. Нуклеофільні групи антитіл включають, але не обмежуються ними: (i) N-кінцеві аміногрупи, (ii) аміногрупи бічних ланцюгів, наприклад, лізину, (iii) тіолові групи бічних ланцюгів, наприклад, цистеїну, й (iv) гідроксильні групи цукру або аміногрупи, де антитіло є глікозильованим. Аміногрупи, тіолові й гідроксильні групи є нуклеофільними і здатні реагувати з утворенням ковалентних зв'язків з електрофільними групами лінкерних фрагментів і лінкерних реагентів, включаючи: (i) малеімідні групи, (ii) активовані дисульфіди, (iii) активні складні ефіри, такі як складні ефіри NHS (Nгідроксисукцініміду), складні ефіри HOBt (N-гідроксибензотриазолу), галогенформіати й галогенангідриди; (iv) алкіл- і бензилгалогеніди, такі як галогенацетаміди; й (v) альдегіди, кетони, карбоксильні групи. Приклади деяких із них: Деякі антитіла містять здатні до відновлення міжланцюгові дисульфіди, тобто цистеїнові мостики. Антитіла можна активувати для кон'югування з лінкерними реагентами шляхом обробки відновлювачем, таким як ДТТ (дитіотреїтол). У результаті кожен цистеїновий мостик теоретично зможе утворити два реакційноздатні тіолові нуклеофіли. До антитіл можна вводити додаткові нуклеофільні групи за допомогою реакції лізинів із 2-імінотіоланом (реагентом 20 UA 114073 C2 5 10 Траута), що призводить до перетворення аміну в тіол. Реакційноздатні тіолові групи можуть вводитися до антитіла (або його фрагмента) шляхом введення одного, двох, трьох, чотирьох або більше цистеїнових залишків (наприклад, при отриманні мутантних антитіл, які містять один або більше чужорідних цистеїнових амінокислотних залишків). У US 7521541 описане отримання антитіла шляхом введення реакційноздатних цистеїнових амінокислот. Згідно з деякими варіантами реалізації лінкер містить реакційноздатну нуклеофільну групу, яка є реакційноздатною стосовно електрофільної групи, присутньої в антитілі. Придатні для використання електрофільні групи антитіла включають, але не обмежуються ними, карбонільні групи альдегідів та кетонів. Гетероатом нуклеофільної групи лінкера може взаємодіяти з електрофільною групою антитіла і утворювати ковалентний зв'язок з одиницею антитіла. Придатні для використання нуклеофільні групи лінкера включають, але не обмежуються ними, гідразид, оксим, аміно, гідроксил, гідразин, тіосемікарбазон, гідразинкарбоксилат і арилгідразид. Електрофільна група антитіла забезпечує зручний сайт для приєднання лінкера. Згідно з одним варіантом реалізації група A являє собою: O N 15 20 O 1 де зірочка позначає місце приєднання до L , хвиляста лінія позначає місце приєднання до агента, який зв'язується з клітинами, і n дорівнює 0-6. Згідно з одним варіантом реалізації n дорівнює 5. Згідно з одним варіантом реалізації група A являє собою: O * N n O O 1 де зірочка позначає місце приєднання до L , хвиляста лінія позначає місце приєднання до агента, який зв'язується з клітинами, і n дорівнює 0-6. Згідно з одним варіантом реалізації n дорівнює 5. Згідно з одним варіантом реалізації група A являє собою: O O N H N 25 30 * m n O N 40 O O 1 де зірочка позначає місце приєднання до L , хвиляста лінія позначає місце приєднання до агента, який зв'язується з клітинами, n дорівнює 0 або 1 і m дорівнює 0-30. Згідно з переважним варіантом реалізації n дорівнює 1 і m дорівнює 0-10, 1-8, переважно 4-8 і найбільш переважно 4 або 8. Згідно з іншим варіантом реалізації m дорівнює 10-30 і переважно 20-30. Альтернативно m дорівнює 0-50. Згідно із зазначеним варіантом реалізації m переважно дорівнює 10-40 і n дорівнює 1. Згідно з одним варіантом реалізації група A являє собою: O 35 n * N H O * O nm O 1 де зірочка позначає місце приєднання до L , хвиляста лінія позначає місце приєднання до агента, який зв'язується з клітинами, n дорівнює 0 або 1 і m дорівнює 0-30. Згідно з переважним варіантом реалізації n дорівнює 1 і m дорівнює 0-10, 1-8, переважно 4-8 і найбільш переважно 4 або 8. Згідно з іншим варіантом реалізації m дорівнює 10-30 і переважно 20-30. Альтернативно, m дорівнює 0-50. Згідно із зазначеним варіантом реалізації m переважно дорівнює 10-40 і n дорівнює 1. Згідно з одним варіантом реалізації зв'язок між агентом, який зв'язується з клітинами, і групою A здійснюється через тіоловий залишок агента, який зв'язується з клітинами, й 21 UA 114073 C2 малеімідну групу A. Згідно з одним варіантом реалізації зв'язок між агентом, який зв'язується з клітинами, і A являє собою: O * N S O 5 10 15 20 25 30 35 де зірочка позначає місце приєднання до іншої частини A, і хвиляста лінія позначає місце приєднання до іншої частини агента, який зв'язується з клітинами. Згідно із зазначеним варіантом реалізації атом S, як правило, належить залишку агента, який зв'язується з клітинами. Згідно з кожним із варіантів реалізації винаходу, зазначених вище, замість групи, отриманої з малеіміду, можна використовувати альтернативну функціональну групу, показану нижче: O * N O де хвиляста лінія позначає місце приєднання до агента, який зв'язується з клітинами, як показано раніше, а зірочка позначає зв'язок з іншою частиною групи A. Згідно з одним варіантом реалізації група, отримана з малеіміду, замінена на наступну групу: O * N N N O H де хвиляста лінія позначає місце приєднання до агента, який зв'язується з клітинами, а зірочка позначає зв'язок з іншою частиною групи A. Згідно з одним варіантом реалізації група, отримана з малеіміду, замінена на групу, яка необов'язково разом із агентом, який зв'язується з клітинами, обрана з: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -NHC(=O)NH, -C(=O)NHC(=O)-, -S-, -S-S-, -CH2C(=O)-C(=O)CH2-, =N-NH- та -NH-N=. Згідно з одним варіантом реалізації група, отримана з малеіміду, замінена на групу, яка необов'язково разом із агентом, який зв'язується з клітинами, обрана з: N N * N N N N 40 * де хвиляста лінія позначає місце приєднання до агента, який зв'язується з клітинами, або 22 UA 114073 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зв'язок з іншою частиною групи A, а зірочка позначає інше місце приєднання до агента, який зв'язується з клітинами, або зв'язок з іншою частиною групи A. 1 Інші групи, які підходять для зв'язування L із агентом, який зв'язується з клітинами, описані у WO 2005/082023. 10 L L 10 Група R походить із групи R . Група R може бути перетворена в групу R шляхом L зв'язування агента, який зв'язується з клітинами, з функціональною групою R . Для L 10 перетворення R в R можна використовувати інші способи. Інші способи можуть включати видалення захисних груп при їх наявності або введення відповідної функціональної групи. Q Згідно з одним варіантом реалізації Q обрана з O, S або N(H). Переважно Q являє собою O. 11 R 11 Згідно з одним варіантом реалізації R являє собою H або R, або, якщо Q являє собою O, SO3M, де M являє собою катіон металу. 11 Згідно з одним варіантом реалізації R являє собою H. 11 Згідно з одним варіантом реалізації R являє собою R. 11 Згідно з одним варіантом реалізації, якщо Q являє собою O, то R являє собою SO3M, де M + являє собою катіон металу. Катіон може являти собою Na . L R L Згідно з одним варіантом реалізації R являє собою лінкер для зв'язування з агентом, який зв'язується з клітинами. Згідно з одним варіантом реалізації лінкер містить функціональну групу для утворення зв'язку з агентом, який зв'язується з клітинами. Дана заявка, зокрема, відноситься до таких груп L R , які містять карбаматний зв'язок із положенням N10. У даному тексті опис зв'язуючої групи у 10 вищевказаній групі R також відноситься до її найближчих попередників. L C R відрізняється від групи R , яка не підходить для реакції з агентом, який зв'язується з C L клітинами. Однак, згідно з деякими варіантами реалізації R може бути перетворена в групу R , наприклад, за допомогою відповідних маніпуляцій із захисними групами та іншими C функціональними групами, які являють собою R (або утворюють її частину). L Згідно з одним варіантом реалізації R являє собоюнаступну групу: 1 * 2 O 1 L L G O де зірочка позначає місце приєднання до положення N10, G1 являє собою функціональну 1 2 групу, яка утворює зв'язок із агентом, який зв'язується з клітинами, L являє собою лінкер, L являє собою ковалентний зв'язок або разом із -OC(=O)- утворює лінкер, що 1 2 саморозщеплюється, а L або L являють собою здатні до розщеплення лінкери. 1 2 10 L і L є такими, як визначено вище стосовно R . Вказівка на зв'язок із групою A може 1 розглядатися в даному тексті як вказівка на зв'язок із групою G . 1 Згідно з одним варіантом реалізації, коли L містить амінокислоту, бічний ланцюг зазначеної амінокислоти може бути захищеним. Можуть використовуватися будь-які підходящі захисні групи. Згідно з одним варіантом реалізації захисні групи бічного ланцюга видаляються разом із іншими захисними групами в сполуці (при їх наявності). Згідно іншим варіантам реалізації захисні групи можуть бути розташовані ортогонально відносно інших захисних груп у молекулі (при їх наявності). Підходящі захисні групи для бічного ланцюга амінокислот включають групи, описані в каталозі Novabiochem 2006/2007. Захисні групи для використання в катепсин-лабільному лінкері також описані в джерелі Dubowchik et al. 1 Згідно з певними варіантами реалізації група L включає залишок амінокислоти Lys. Бічний ланцюг зазначеної амінокислоти може містити захисну групу Boc або Alloc. Захисна група Boc є найбільш переважною. 1 Функціональна група G утворює зв'язуючу групу A при її взаємодії з агентом, який зв'язується з клітинами. 1 Згідно з одним варіантом реалізації функціональна група G являє собою або містить аміногрупу, карбоксильну групу, гідроксильну, тіолову або малеімідну групу, яка взаємодіє з відповідною групою агента, який зв'язується з клітинами. Згідно з переважним варіантом 1 реалізації G містить малеімідну групу. 1 Згідно з одним варіантом реалізації група G являє собою алкілмалеімідну групу. Вказана група є підходящою для реагування з тіоловими групами, зокрема, тіоловими групами цистеїну, присутніми в агенті, який зв'язується з клітинами, наприклад, присутніми в антитілі. 23 UA 114073 C2 1 Згідно з одним варіантом реалізації група G являє собою: O N 5 O 1 де зірочка позначає місце приєднання до L і n дорівнює 0-6. Згідно з одним варіантом реалізації n дорівнює 5. 1 Згідно з одним варіантом реалізації група G являє собою: O * N n O O 1 де зірочка позначає місце приєднання до L і n дорівнює 0-6. Згідно з одним варіантом реалізації n дорівнює 5. 1 Згідно з одним варіантом реалізації група G являє собою: O 15 O O N 10 N H O * 30 N H N O * n m O O 1 де зірочка позначає місце приєднання до L , n дорівнює 0 або 1 і m дорівнює 0-30. Згідно з переважним варіантом реалізації n дорівнює 1 і m дорівнює 0-10, 1-2, переважно 4-8 і найбільш переважно 4 або 8. Альтернативно, m дорівнює 0-50. Згідно з зазначеним варіантом реалізації m переважно дорівнює 10-40 і n дорівнює 1. 1 Згідно з одним варіантом реалізації група G являє собою: O N 25 O m n O 20 n * N H O * O nm O 1 де зірочка позначає місце приєднання до L , n дорівнює 0 або 1 і m дорівнює 0-30. Згідно з переважним варіантом реалізації n дорівнює 1 і m дорівнює 0-10, 1-8, переважно 4-8 і найбільш переважно 4 або 8. Альтернативно, m дорівнює 0-50. Згідно із зазначеним варіантом реалізації m переважно дорівнює 10-40 і n дорівнює 1. Згідно з кожним із варіантів реалізації, зазначених вище, замість малеімідної групи можна використовувати альтернативну функціональну групу, показану нижче: O * N O де зірочка позначає зв'язок із іншою частиною групи G. Згідно з одним варіантом реалізації винаходу група, яка має походження з малеіміду, замінена на наступну групу: O * N N N O де зірочка позначає зв'язок із іншою частиною групи G. Згідно з одним варіантом реалізації малеімідна група замінена на групу, вибрану з: -C(=O)OH, -OH, -NH2, 24 UA 114073 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 -SH, -C(=O)CH2D, де D являє собою Cl, Br або I, -CHO, -NHNH2 -C≡CH та -N3 (азид). 1 1 Згідно з одним варіантом реалізації, якщо присутній L , то G являє собою -NH2, -NHMe, COOH, -OH або -SH. 1 1 Згідно з одним варіантом реалізації, якщо присутній L , то G являє собою -NH2 або -NHMe. 1 Будь-яка з вказаних група може являти собою N-кінець амінокислотної послідовності L . 1 1 1 Згідно з одним варіантом реалізації, якщо присутній L , то G являє собою -NH2 і L являє 10 собою амінокислотну послідовність -X1-X2-, як визначено вище стосовно R . 1 1 Згідно з одним варіантом реалізації, якщо присутній L , то G являє собою COOH. Зазначена 1 група може являти собою C кінець амінокислотної послідовності L . 1 1 Згідно з одним варіантом реалізації, якщо присутній L , то G являє собою OH. 1 1 Згідно з одним варіантом реалізації, якщо присутній L , то G являє собою SH. Група G1 може бути перетворена з однієї функціональної групи в іншу. Згідно з одним 1 1 варіантом реалізації, якщо присутній L , то G являє собою -NH2. Зазначена група піддається 1 перетворенню в іншу групу G , яка містить малеімідну групу. Наприклад, група -NH2 може взаємодіяти з кислотами або активованою кислотою (наприклад, N-сукцинімідною формою) 1 зазначених груп G показаних вище, які містять малеімід, . 1 Група G , таким чином, може перетворюватися в функціональну групу, яка є більш підходящою для взаємодії з агентом, який зв'язується з клітинами. L Згідно з іншими варіантами реалізації, R являє собою групу, яка являє собою попередник лінкера, представленого з функціональною групою. 1 1 Як зазначено вище, згідно з одним варіантом реалізації, якщо присутній L , то G являє собою -NH2, -NHMe, -COOH, -OH або -SH. Згідно з іншим варіантом реалізації вказані групи використовуються в хімічно захищеній формі. Хімічно захищена форма, таким чином, є попередником лінкера, який містить функціональну групу. 1 Згідно з одним варіантом реалізації, G являє собою -NH2 в хімічно захищеній формі. Зазначена група може містити карбаматну захисну групу. Карбаматна захисна група може бути вибрана з групи, яка складається з: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Cbz і PNZ. 1 Переважно, якщо G являє собою -NH2, то він містить захисну групу Alloc або Fmoc. 1 Згідно з одним варіантом реалізації, якщо G являє собою -NH2, то він містить захисну групу Fmoc. Згідно з одним варіантом реалізації, зазначена захисна група являє собою таку ж карбаматну захисну групу, як карбаматна захисна група для кепуючої групи. Згідно з одним варіантом реалізації, зазначена захисна група не являє собою таку ж карбаматну захисну групу, як карбаматна захисна група для кепуючої групи. Згідно із зазначеним варіантом реалізації, переважно, що зазначена захисна група видаляється в умовах, у яких карбаматна захисна група кепуючої групи не видаляється. Хімічну захисну групу можна видаляти з отриманням функціональної групи, яка утворює зв'язок із агентом, який зв'язується з клітинами. Зазначена функціональна група потім необов'язково може бути перетворена в іншу функціональну групу, як описано вище. Згідно з одним варіантом реалізації, активна група являє собою амін. Зазначений амін переважно являє собою N-кінцевий амін пептиду і може являти собою N-кінценвий амін переважних дипептидів згідно з даним винаходом. Активна група може піддаватися реакції, яка призводить до отримання функціональної групи, схильної утворювати зв'язок із агентом, який зв'язується з клітинами. Згідно з іншими варіантами реалізації, лінкер являє собою попередник лінкера, який містить активну групу. Згідно із зазначеним варіантом реалізації, лінкер містить активну групу, захищену за допомогою захисної групи. Захисна група може бути видалена з отриманням лінкера, який містить активну групу. Коли активна група являє собою амін, захисна група може являти собою захисну групу для аміногрупи, таку як групи, описані в джерелі Green and Wuts. Захисна група переважно розташована ортогонально відносно інших захисних груп, при їх L наявності, у групі R . Згідно з одним варіантом реалізації, захисна група розташована ортогонально відносно кепуючої групи. Таким чином, захисна група активної групи здатна видалятися при збереженні 25 UA 114073 C2 кепуючої групи. Згідно з іншими варіантами реалізації, захисна група та кепуюча група видаляються в тих же умовах, які використовуються для видалення кепуючої групи. L Згідно з одним варіантом реалізації, R являє собою: O N H 5 H N * O N H O NHBoc де зірочка позначає місце приєднання до положення N10, а хвиляста лінія позначає місце 1 1 приєднання до іншої частини лінкера L або місце приєднання до G . Переважно хвиляста лінія 1 позначає місце приєднання до G . L Згідно з одним варіантом реалізації, R являє собою: O H N N H 10 O O * O N H O де зірочка і хвиляста лінія є такими, як визначено вище. L Згідно з одним варіантом реалізації, R являє собою: O N H H N O O * N H O NH H2 N 15 20 25 30 O де зірочка і хвиляста лінія є такими, як визначено вище. 1 Інші функціональні групи, які підходять для використання, для формування зв'язку між L і агентом, який зв'язується з клітинами, описані у WO 2005/082023. Лінкери можуть містити здатні до розщеплення під дією протеази пептидні фрагменти, які містять одну або більше амінокислотних ланок. Пептидні лінкерні реагенти можуть бути отримані за допомогою способів твердофазного або рідкофазного синтезу (E. Schröder and K. Lübke, The Peptides, volume 1, pp 76-136 (1965) Academic Press), які добре відомі в області пептидної хімії, включаючи хімію t-BOC (Geiser et al "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218) і хімію Fmoc / HBTU (Fields, G. and Noble, R. (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214), на автоматичному синтезаторі, такому як синтезатор пептидів Rainin Symphony (Protein Technologies, Inc., Туксон, Арізона) або Model 433 (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія). Приклади амінокислотних лінкерів включають дипептид, трипептид, тетрапептид або пентaпептид. Приклади дипептидів включають: валін-цитрулін (vc або val-cit), аланінфенілаланін (af або ala-phe). Приклади трипептидів включають: гліцин-валін-цитрулін (gly-val-cit) і гліцин-гліцин-гліцин (gly-gly-gly). Амінокислотні залишки, які містять амінокислотний лінкерний компонент, включають залишки природних амінокислот, а також мінорних амінокислот і неприродних аналогів амінокислот, таких як цитрулін. Амінокислотні лінкерні компоненти можуть бути отримані і можуть бути певними ферментами за селективністю для ферментативного розщеплення, наприклад, пухлиноасоційованою протеазою, катепсином B, C і 26 UA 114073 C2 5 10 15 20 25 D або протеазою плазміном. Бічні ланцюги амінокислот включають бічні ланцюги природних амінокислот, а також мінорних амінокислот і неприродних аналогів амінокислот, таких як цитрулін. Бічні ланцюги амінокислот включають водень, метил, ізопропіл, ізобутил, втор-бутил, бензил, пгідроксибензил, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, (CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, (CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-піридилметил-, 3-піридилметил-, 4-піридилметил-, феніл, циклогексил, а також наступні структури: Коли бічний ланцюг амінокислоти містить більше одного атома водню (гліцин), атом вуглецю, до якого приєднаний зазначений бічний ланцюг амінокислоти, є хіральним. Кожний атом вуглецю, до якого приєднаний бічний ланцюг амінокислоти, незалежно знаходиться в (S) чи (R) конфігурації або утворює рацемічну суміш. Сполука лікарський засіб-лінкерний реагент, таким чином, може знаходитися у вигляді енантіомерно чистої, рацемічної або діастереомерної суміші. Згідно з прикладами варіантів реалізації бічні ланцюги амінокислот вибрані з бічних ланцюгів природних і неприродних амінокислот, включаючи аланін, 2-аміно-2циклогексилоцтову кислоту, 2-аміно-2-фенілоцтову кислоту, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамін, глутамінову кислоту, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, норлейцин, фенілаланін, пролін, серин, треонін, триптофан, тирозин, валін, γаміноолійну кислоту, α,α-диметил-γ-аміноолійну кислоту, β,β-диметил-γ-аміноолійну кислоту, орнітин та цитрулін (Cit). Приклад дипептидного лінкерного реагента валін-цитрулін (val-cit або vc), придатного для створення інтермедіату лінкер-фрагменту PBD лікарського засобу для кон'югування з агентом, який зв'язується з клітинами, наприклад, антитілом, що містить пара-амінобензилкарбамоїльний (PAB) спейсер, що саморозщеплюється, має наступну структуру: O Qm O O CH3 O H3C H NO2 N N H Fmoc N H O NH 30 O H2N де Q являє собою C1C8 алкіл, -O-(C1-C8 алкіл), -галоген, -NO2 або -CN; і m дорівнює цілому числу в діапазоні від 0 до 4. Приклад дипептидного лінкерного реагента phe-lys(Mtr), який містить п-амінобензильну групу, може бути отриманий відповідно до джерела Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 27 UA 114073 C2 38:5257-60 і має таку структуру: Qm Ph H N Fmoc N H 5 10 15 20 25 30 35 OH O N H O HN Mtr де Mtr являє собою моно-4-метокситритил, Q являє собою C1-C8 алкіл, -O-(C1-C8 алкіл), галоген, -NO2 або -CN; і m дорівнює цілому числу в діапазоні від 0 до 4. Лінкер PAB, що саморозщеплюється, (пара-амінобензилоксикарбоніл) приєднує фрагмент лікарського засобу до антитіла в кон'югаті антитіло-лікарський засіб (Carl et al (1981) J. Med. Chem. 24:479-480; Chakravarty et al (1983) J. Med. Chem. 26:638-644; US 6214345; US20030130189; US20030096743; US6759509; US20040052793; US6218519; US6835807; US6268488; US20040018194; WO98/13059; US20040052793; US6677435; US5621002; US20040121940; WO2004/032828). Інші приклади спейсерів, що саморозщеплюються, крім PAB, включають, але не обмежуються ними: (i) ароматичні сполуки, які за електронною будовою подібні до PAB-групи, такі як похідні 2-аміноімідазол-5-метанолу (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), тіазоли (US 7375078), безліч послідовно з'єднаних PAB ланок (de Groot et al (2001) J. Org. Chem. 66:8815-8830); і орто- або пара-амінобензилацеталі та (ii) гомологічні стирольні аналоги PAB (US 7223837). Можуть використовуватися спейсери, які піддаються циклізації при гідролізі амідного зв'язку, такі як заміщені й незаміщені аміди 4-аміноолійної кислоти (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), заміщені відповідним чином біцикло[2.2.1] і біцикло[2.2.2] кільцеві системи (Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) і аміди 2-амінофенілпропіонової кислоти (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867). Здатні до елімінування амін-вмісні лікарські засоби із заміщеним гліцином (Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447) також є прикладами спейсерів, що саморозщеплюються, застосовних у ADC. Згідно з одним варіантом реалізації реагент, який являє собою дипептидний PAB аналог валін-цитрулін, містить 2,6-диметилфенільну групу і має таку структуру: Лінкерні реагенти, придатні для одержання кон'югатів антитіло-лікарський засіб згідно з даним винаходом включають, але не обмежуються ними: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфo-EMCS, сульфo-GMBS, сульфo-KMUS, сульфo-MBS, сульфo-SIAB, сульфo-SMCC та сульфo-SMPB і SVSB (сукцинімідил-(4-вінілсульфон)бензоат), та біс-малеімідні реагенти: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-біс-малеімідодиетиленгліколь (BM(PEO)2) і 1,11-біс-малеімідотриетиленгліколь (BM(PEO)3), які є комерційно доступними від компанії Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, Іллінойс, США та інших постачальників реагентів. Біс-малеімідні реагенти забезпечують послідовне або паралельне приєднання вільної тіолової групи цистеїнового залишку антитіла до фрагменту лікарського засобу, який містить тіол, мітки або лінкерного інтермедіату. Інші функціональні групи, крім малеіміду, які є реакційноздатними стосовно тіолової групи антитіла, PBD фрагменту лікарського засобу або лінкерного інтермедіату, включають йодацетамід, бромацетамід, вінілпіридин, дисульфід, піридилдисульфід, ізоціанат та ізотіоціанат. 28