Мутанти ahas
Формула / Реферат
1. Рекомбінантний, мутагенізований або синтетичний полінуклеотид, який кодує поліпептид великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (AHASL), вибраний з:
а) подвійно заміщеного поліпептиду, що містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та гліцин, ізолейцин або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2;
b) потрійно заміщеного поліпептиду, що містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та
с) потрійно заміщеного поліпептиду, що містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, глутамінову кислоту, валін, триптофан або тирозин заміщення у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2; та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2.
2. Полінуклеотид за п. 1, де полінуклеотид кодує поліпептид вибраний з:
а) подвійно заміщеного поліпептиду, що містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та гліцин, ізолейцин або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2;
b) потрійно заміщеного поліпептиду, що містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та
с) потрійно заміщеного поліпептиду, що містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, глутамінову кислоту, валін, триптофан або тирозин заміщення у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2; та гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2.
3. Полінуклеотид за п. 1 або п. 2, де кодований AHASL походить з рослини.
4. Полінуклеотид за п. 3, де рослину вибирають з Arabidopsis thaliana, кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, соняшнику, календули, пасльонових, картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха, багаторічної трави та фуражних культур.
5. Вектор експресії, що містить полінуклеотид за будь-яким з пп. 1-4.
6. Трансгенна рослина, яка містить вектор експресії за п. 5.
7. Трансгенна рослина за п. 6, де рослина є однодольною.
8. Трансгенна рослина за п. 6, де рослина є дводольною.
9. Трансгенна рослина за п. 6, де рослину вибирають з Arabidopsis thaliana, кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, соняшнику, календули, пасльонових, картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха, багаторічної трави та фуражних культур.
10. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 6-9, де експресія полінуклеотиду у рослині приводить до толерантності до гербіциду, вибраного з групи, яка складається з імідазолінонів, сульфонілсечовин, тріазолопіримідинів та піримідинілоксибензоатів.
11. Насіння рослини, отримане з трансгенної рослини за будь-яким з пп. 6-10, де насіння містить полінуклеотид, що кодує AHASL поліпептид.
12. Очищений білок AHASL, що кодується полінуклеотидом за будь-яким з пп. 1-4.
13. Рекомбінантний, мутагенізований або синтетичний полінуклеотид, який кодує поліпептид великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (AHASL), вибраний з:
а) подвiйно заміщеного поліпептиду, що містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2;
b) потрійно заміщеного поліпептиду, що містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та
с) потрійно заміщеного поліпептиду, що містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінин, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин заміщення у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2; та, фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2;
де вказаний полінуклеотид є полінуклеотидом рослини вибраної з кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, календули, пасльонових, картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха та багаторічної трави.
14. Полінуклеотид за п. 13, де полінуклеотид кодує подвiйно заміщений поліпептид, що містить треонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, та аспарагін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2.
15. Полінуклеотид за п. 13 або п. 14, де полінуклеотид є полінуклеотидом рослини вибраної з кукурудзи, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, календули, пасльонових, картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха та багаторічної трави.
16. Вектор експресії, що містить полінуклеотид за будь-яким з пп. 13-15, який здатний до експресії вказаного полінуклеотиду у клітині-хазяїні.
17. Трансгенна рослина, яка містить вектор експресії за п. 16.
18. Трансгенна рослина за п. 17, де рослину вибирають з Arabidopsis thaliana, кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, календули, пасльонових, картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха та багаторічної трави.
19. Трансгенна рослина за п. 17 або п. 18, де експресія полінуклеотиду в рослині приводить до резистентності до гербіцидів вибраних з групи, яка складається з iмiдазолiнонів, сульфонiлсечовин, тріазолопіримідинів та піримідинілоксибензоатів.
20. Насіння рослини, отримане з рослини за п. 17 або п. 18, де насіння містить полінуклеотид за будь-яким з пп. 13-15.
21. Очищений білок AHASL, який кодується полінуклеотидом за будь-яким з пп. 13-15.
22. Рослина, яка містить перший полінуклеотид, який кодує перший AHASL одинично заміщений поліпептид, другий полінуклеотид, який кодує другий AHASL одинично заміщений поліпептид, або полінуклеотид, який кодує AHASL, який містить два нуклеотидні заміщення, які приводять до амінокислотних заміщень, які відповідають амінокислотним заміщенням вказаного першого та вказаного другого AHASL одинично заміщеного полiпептидiв,
вказаний перший поліпептид містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, та вказаний другий поліпептиду містить гліцин, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2.
23. Рослина, яка містить перший полінуклеотид, який кодує перший AHASL одинично заміщений поліпептид та другий полінуклеотид, який кодує другий AHASL одинично заміщений поліпептид, або полінуклеотид, який кодує AHASL, який містить два нуклеотидні заміщення, які приводять до амінокислотних заміщень, які відповідають амінокислотним заміщенням вказаного першого та вказаного другого AHASL одинично заміщеного поліпептидів,
вказаний перший поліпептид містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2; та вказаний другий поліпептид містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2;
де вказану рослину вибирають з групи, яка складається з Arabidopsis thaliana, кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовнику, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, календули, пасльонових, картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха та багаторічної трави.
24. Рослина за п. 23, де перший поліпептид містить треонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, та другий поліпептид містить аспарагін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2.
25. Рослина за п. 23 або п. 24, де вказану рослину вибирають з кукурудзи, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, календули, пасльонових, картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха та багаторічної трави.
26. Рослина, яка містить перший полінуклеотид, який кодує перший AHASL одинично заміщений поліпептид, другий полінуклеотид, який кодує другий AHASL одинично заміщений поліпептид, та третій полінуклеотид, який кодує третій AHASL одинично заміщений поліпептид, або полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить три заміщення, де три нуклеотидні заміщення приводять до амінокислотних заміщень, які відповідають амінокислотним заміщенням вказаного першого, вказаного другого та третього AHASL одинично заміщеного поліпептиду, або полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить одиничне заміщення, та полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить подвійне заміщення, де нуклеотидні заміщення приводять до амінокислотних заміщень, які відповідають амінокислотним заміщенням вказаних першого, вказаного другого та третього AHASL одинично заміщеного поліпептиду,
вказаний перший поліпептид містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2; вказаний другий поліпептид містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2
та вказаний третiй поліпептид містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2;
27. Рослина, яка містить перший полінуклеотид, який кодує перший AHASL одинично заміщений поліпептид, другий полінуклеотид, який кодує другий AHASL одинично заміщений поліпептид, та третiй полінуклеотид, який кодує третiй AHASL одинично заміщений поліпептид, або полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить три заміщення, де три нуклеотидні заміщення приводять до амінокислотних заміщень, які відповідають заміщенням вказаного першого, другого та третього AHASL одинично заміщених поліпептидiв, або полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить одиничне заміщення, та полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить подвiйне заміщення, де нуклеотидні заміщення приводять до амінокислотних заміщень, які відповідають амінокислотним заміщенням вказаного першого, другого та третього AHASL одинично заміщених поліпептидiв,
вказаний перший поліпептид містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2; вказаний другий поліпептид містить глутамінову кислоту, валін, триптофан або тирозин заміщення у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2;
та вказаний третій поліпептид містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2.
28. Рослина за п. 27, де вказаний перший поліпептид містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2; вказаний другий поліпептид містить глутамінову кислоту, валін, триптофан або тирозин заміщення у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2; та вказаний третій поліпептид містить гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2.
29. Рослина, яка містить перший полінуклеотид, який кодує перший AHASL одинично заміщений поліпептид, другий полінуклеотид, який кодує другий AHASL одинично заміщений поліпептид, та третiй полінуклеотид, який кодує третiй AHASL одинично заміщений поліпептид, або полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить три заміщення, де три нуклеотидні заміщення приводять до амінокислотних заміщень, які відповідають заміщенням вказаного першого, другого та третього AHASL одинично заміщених поліпептидiв, або полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить одиничне заміщення, та полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить подвiйне заміщення, де нуклеотидні заміщення приводять до амінокислотних заміщень, які відповідають амінокислотним заміщенням вказаного першого, другого та третього AHASL одинично заміщених поліпептидiв,
вказаний перший поліпептид містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2; вказаний другий поліпептид містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2;
та вказаний третій поліпептид містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2;
де вказану рослину вибирають з кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, календули, пасльонових, картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха та багаторічної трави.
30. Рослина, яка містить перший полінуклеотид, який кодує перший AHASL одинично заміщений поліпептид, другий полінуклеотид, який кодує другий AHASL одинично заміщений поліпептид, та третiй полінуклеотид, який кодує третiй AHASL одинично заміщений поліпептид, або полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить три заміщення, де три нуклеотидні заміщення приводять до амінокислотних заміщень, які відповідають заміщенням вказаного першого, другого та третього AHASL одинично заміщених поліпептидiв, або полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить одиничне заміщення, та полінуклеотид, який кодує AHASL, що містить подвiйне заміщення, де нуклеотидні заміщення приводять до амінокислотних заміщень, які відповідають амінокислотним заміщенням вказаного першого, другого та третього AHASL одинично заміщених поліпептидiв,
вказаний перший поліпептид містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін заміщення у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2; вказаний другий поліпептид містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргiнин, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин заміщення у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2;
та вказаний третій поліпептид містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, ізолейцин або триптофан заміщення у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2;
де вказану рослину вибирають з кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, календули, пасльонових, картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха та багаторічної трави.
31. Рослина за п. 29 або п. 30, де вказану рослину вибирають з кукурудзи, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, календули, пасльонових, картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха та багаторічної трави.
32. Рослина за будь-яким з пп. 22 та 26-28, де рослина є однодольною.
33. Рослина за будь-яким з пп. 22 та 26-28, де рослина є дводольною.
34. Рослина за будь-яким з пп. 22 та 26-28, де рослину вибирають з групи, яка складається з Arabidopsis thaliana, кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сорго, просо, цукрового буряку, цукрової тростини, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, капусти, маніоки, дині, гарбузу, перцю, соняшнику, календули, пасльонових, картоплі, солодкої картоплі, батату, тютюну, баклажану, томату, горошку, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, верби, олійної пальми, кокосового горіха, багаторічної трави та фуражних культур.
35. Насіння рослини за будь-яким з пп. 22-34, де насіння містить полінуклеотид, що кодує AHASL.
36. Насіння за п. 35, де вказане насіння обробляють складом для обробки насіння.
37. Насіння за п. 36, де складом для обробки насіння є AHAS-інгібуючий гербіцид, вибраний з імідазолінонів, сульфонілсечовин, тріазолопіримідинів та піримідинілоксибензоатів.
38. Насіння за п. 37, де AHAS-інгібуючий гербіцид містить імідазолінон.
39. Насіння за п. 38, де імідазолінон містить один або декілька з імазетапір, імазапік, імазамокс та імазапір.
40. Спосіб боротьби з бур’янами, які знаходяться поблизу зернових, який включає:
i) засівання поля рослинами, що містять полінуклеотид за будь-яким з пп. 1-4 та 13-15; або рослинами за будь-яким з пп. 6-10, 17-19, 22-34; та вирощування з них зернових рослин, та
ii) нанесення ефективної кількості AHAS-інгібіючою гербіциду на бур’яни та зернові на полі, для боротьби з бур’янами, де ефективної кількості гербіциду досить щоб знищити або інгібувати ріст рослин дикого типу.
41. Спосіб отримання трансгенної рослини, який включає наступні стадії:
i) трансформацію рослинної клітини вектором експресії, який включає полінуклеотид за будь-яким з пп. 1-4 та 13-15; та
ii) відтворення з рослинної клітини трансгенної рослини, що експресує AHASL мутантний поліпептид.
42. Спосіб ідентифікації або відбору рослинної клітини, рослинної тканини, рослини або їх частини, який включає:
i) одержання рослинної клітини, рослинної тканини, рослини або їх частини, де вказані рослинна клітина, рослинна тканина, рослина або їх частини містять полінуклеотид за будь-яким з пп. 1-4 та 13-15 ;
ii) взаємодію рослинної клітини, рослинної тканини, рослини або їх частини з щонайменше однією AHAS-інгібіючою сполукою; та
iii) визначення чи рослинна клітина, рослинна тканина, рослина або їх частини є ураженими AHAS інгібіючою сполукою; при цьому проводять ідентифікацію або вибір рослинної клітини, рослинної тканини, рослини або їх частин.
43. Спосіб боротьби з небажаною рослинністю, який включає взаємодію насіння, що містить полінуклеотид за будь-яким з пп. 1-4 та 13-15, або насіння отриманого з рослини за будь-яким з пп. 6-10, 17-19, 22-34 перед посівом та/або після проростання, з AHAS-інгібуючим гербіцидом.
44. Спосіб за п. 40, 42 та 43, де AHAS-інгібуючий гербіцид або АНАS-інгібіючу сполуку вибирають з імідазолінонів, сульфонілсечовин, тріазолопіримідинів, піримідинілоксибензоатів та їх сумiшi.
45. Спосіб за п. 44, де AHAS-інгібуючий гербіцид або АНАS інгібіюча сполука містить імідазолінон.
46. Спосіб за п. 45, де імидазолінон містить один або декілька з імазетапір, імазапік, імазамокс та імазапір.
47. Продукт резистентної до гербiциду рослини, отриманий з рослини, що містить полінуклеотид за будь-яким з пп. 1-4 та 13-15, рослини за будь-яким з пп. 6-10, 17-19, 22-34 або насіння за будь-яким з пп. 11, 20 та 35.
48. Продукт за п. 47, де продуктом є олія з насіння.
Текст
Реферат: Винахід належить до нуклеїнових кислот, які кодують мутанти великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (AHAS), які містить щонайменше дві мутації, наприклад, подвійні та потрійні мутації, придатних для отримання трансгенних або нетрансгенних рослин з підвищеною толерантністю до гербіцидів, які інгібують AHAS. Винахід також належить до векторів експресії, клітин, рослин, які містять полінуклеотиди, які кодують подвійні та потрійні мутанти великої субодиниці AHAS, рослин, які містять два або кілька одинично мутантних поліпептидів великої субодиниці AHAS, та способів їх отримання та застосування. UA 104843 C2 (12) UA 104843 C2 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Даний винахід стосується, головним чином, композиції та способів підвищення толерантності рослин до гербіцидів, які інгібують синтазу ацетогідроксикислот. Передумови винаходу Синтаза ацетогідроксикислот (AHAS; EC 4.1.3.18, також відома як ацетолактат синтаза або ALS), є першим ферментом, який каталізує біохімічний синтез амінокислот з розгалуженим ланцюгом: валіну, лейцину та ізолейцину (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine," in Plant Amino Acids, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227247). AHAS є місцем впливу чотирьох родин гербіцидів різної структури, включаючи сульфонілсечовини (Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626; LaRossa and Falco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161), імідазолінони (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546), тріазолпіримідини (Subramanian and Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines," in Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. and Sonnet, P.E.. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288), та піримідинілоксибензоати (Subramanian et al. (1990) Plant Physiol. 94: 239-244). Імідазолінон та сульфонілсечовину широко застосовують у сучасному сільському господарстві завдяки їх ефективності у дуже низьких дозах та відносній нетоксичності для тварин. Шляхом інгібування активності AHAS ці родини гербіцидів запобігають подальшому росту та розвитку чутливих рослин, включаючи багато видів бур’янів. Приклади наявних на ринку імідазолінонових гербіцидів включають PURSUIT® (імазетапір), SCEPTER® (імазаквін) та ARSENAL® (імазапір). Прикладами сульфонілсечовинних гербіцидів є хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлорімурон етил, тіфенсульфурон метил, трібенурон метил, бенсульфурон метил, нікосульфурон, етаметсульфурон метил, рімсульфурон, трифлузульфурон метил, тріазульфурон, прімісульфурон метил, ціносульфурон, амідосульфурон, флузасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон етил та галосульфурон. Завдяки їх високій ефективності та низькій токсичності імідазолінонові гербіциди переважно застосовують для розпилювання на верхню частину великої кількості рослин. Можливість розпилювання на верхню частину великої кількості рослин зменшує витрати пов’язані з розробкою та підтримкою рослин, та зменшує потребу у підготовці місця перед застосуванням таких хімікатів. Розпилювання на верхню частину бажаних толерантних видів також приводить до здатності отримувати максимальний вихід бажаних видів, з огляду відсутності конкурентних видів. Однак, можливість застосування таких технологій розпилювання залежить від наявності імідазолінон-стійких видів бажаних рослин на площі розпилювання. Серед головних сільськогосподарських культур, деякі бобові виді, такі як соя, є природно стійкими до імідазолінонових гербіцидів завдяки їх здатності до швидкого метаболізму сполук гербіциду (Shaner and Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471). Інші культурні рослини, такі як кукурудза (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886) та рис (Barrett et al. (1989) Crop Safeners for Гербіцидs, Academic Press, New York, pp. 195-220) є частково чутливими до імідазолінонових гербіцидів. Характерна чутливість до імідазолінонових гербіцидів залежить від хімічної природи певного гербіциду та характерного метаболізму сполуки з токсичної у нетоксичну форму у кожній рослині (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546; Brown et al. (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29). Інші фізіологічні відмінності рослини, такі як абсорбція та транслокація, також відіграють важливу роль у чутливості (Shaner and Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471). Рослини, толерантні до імідазолінонів, сульфонілсечовин, триазолпіримідинів та піримідинілоксибензоатів, успішно отримали використовуючи мутагенез насіння, мікроспор, пилку та калусу у Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (тобто, канола) Glycine max, Nicotiana tabacum, цкровий буряк (Beta vulgaris) та Oryza sativa (Sebastian et al. (1989) Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson et al. 1989 Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan et al. (1991) Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand et al. (1993) J. Heredity 84:91-96; WrighT і Penner (1998) Theor. Appl. Genet. 96:612-620; U.S. Patent No. 5,545,822). В усіх випадках, єдиний частково домінантний ядерний ген є стійким. Чотири рослини пшениці, резистентної до імідазолінону, також попередньо ізолювали після мутагенезу насіння Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886). Дослідження успадкування підтвердили, що єдиний частково домінантний ген є резистентним. На основі досліджень алелей автори прийшли до висновку, що мутації чотирьох ідентифікованих ліній знаходились у одному локусі. Один з стійких генів культурного сорту Fidel назвали FS-4 (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886). Комп’ютерна модель трьохвимірної структури інгібіторного комплексу AHAS прогнозує 1 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 декілька амінокислот у запропонованому зв’язувальному сайті інгібітору, як сайти, де введені мутації ймовірно будуть селективно резистентними до імідазолінонів (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368). Рослини тютюну, отримані з включенням деяких з цих раціонально спроектованих мутацій у запропонованих сайтах зв’язування ферменту AHAS, мають специфічну резистентність до єдиного класу гербіцидів (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359368). Резистентність рослин до імідазолінонових гербіцидів також описували у багатьох патентах. Патенти № 4,761,373, 5,331,107, 5,304,732, 6,211,438, 6,211,439 та 6,222,100 зазвичай описують змінений ген AHAS, який відповідає за появу резистентності до гербіцидів у рослин, та особливо описують певні лінії культурних рослин, резистентних до імідазолінону. Патент США № 5,013,659 описує рослини, які проявляють резистентність до гербіцидів, завдяки мутації щонайменше однієї амінокислоти у одній або кількох консервативних ділянках. Мутації, описані у вказаному документі, кодують або крос-резистентність до імідазолінонів та сульфонілсечовин, або резистентність тільки до сульфонілсечовин, проте не описано резистентність тільки до імідазолінону. Патенти США № 5,731,180 та 5,767,361 описують ізольований ген, який має заміну по одній амінокислоті у амінокислотній послідовності AHAS однодольних диких рослин, що приводить до резистентності специфічно до імідазолінону. Окрім цього, рослини рису, які є резистентними до гербіцидів, які впливають на AHAS, отримали завдяки мутаційній селекції та селекції культури тканин. Дивитись патенти США № 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5,952,553 та 6,274,796. У рослинах, як і у всіх інших досліджених організмах, фермент AHAS складається з двох субодиниць: великої субодиниці (з каталітичною функцією) та малої субодиниці (з регуляторною функцією) (Duggleby and Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36). Велика субодиниця AHAS (яку також у даному документі називають AHASL) кодується єдиним геном, як у випадку Arabidopsis та цукрового буряку, або родиною генів як у пшениці, каноли та бавовни. Особливо заміна єдиного нуклеотиду у великій субодиниці надає ферменту стійкості до одного або кількох класів гербіцидів (Chang and Duggleby (1998) Biochem J. 333:765-777). Наприклад, м’яка пшениця, Triticum aestivum L., містить три гомологічні гени великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот. Кожен з генів проявляє значну експресію гербіцидної відповіді та біохімічні данні мутантів у кожному з трьох генів (Ascenzi et al. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17). Кодуючі послідовності всіх трьох генів є просторово гомологічними на нуклеотидному рівні (WO 03/014357). Шляхом секвенування генів AHASL кількох сортів Triticum aestivum, молекулярна основа стійкості до гербіцидів у найбільш IMI-стійких (імідазолінон-стійких) лініях отримали мутацію S653(At)N, в якій наявне заміщення серину на аспарагін у положенні еквівалентному серину у амінокислоті 653 у Arabidopsis thaliana (WO 03/014357). Ця мутація відповідає однонуклеотидному поліморфізму (SNP) у послідовності ДНК, яка кодує білок AHASL. Відомо, що полімерні гени AHASL також наявні у дводольних рослин. Нещодавно, Kolkman et al. ((2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159) описали ідентифікацію, клонування та секвенування для трьох генів AHASL (AHASL1, AHASL2 та AHASL3) резистентних до гербіцидів та дикого типу генотипів соняшника (Helianthus annuus L.). Kolkman et al. зазначали, що резистентність до гербіцидів виникала або при заміщенні Pro197Leu (використовуючи номенклатуру розташування амінокислот Arabidopsis AHASL) або при заміщенні Ala205Val у білку AHASL1, та кожне з цих заміщень забезпечує резистентність як до імідазолінонових, так і до сульфонілсечовинних гербіцидів. Відома певна кількість одиничних мутацій у великій субодиниці AHAS, які приводять до толерантності або резистентності до гербіцидів (Duggleby et al. (2000) Journal of Biochem and Mol. Bio. 33:1-36; Jander et al. (2003) Plant Physiology 131:139-146). Наприклад, заміщення аланіну на валін у положенні 122 Arabidopsis AHASL (або заміщення аланіну на треонін у відповідному положенні 100 Cocklebur AHASL) приводить до резистентності до імідазолінонів та сульфонілсечовин. Заміщення метіоніну на глутамінову кислоту або ізолейцин у положенні 124 Arabidopsis AHASL приводить до резистентності до імідазолінонів та сульфонілсечовин. Заміщення проліну на серин у положенні 197 Arabidopsis AHASL (або проліну на аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан або тирозин у відповідному положенні 192 AHASL дріжджів) приводить до резистентності до імідазолінонів, сульфонілсечовин та триазолопіримідину. Заміщення аргініну на аланін або глутамінову кислоту у положенні 199 Arabidopsis AHASL приводить до резистентності до імідазолінонів. Заміщення аланіну на валін у положенні 205 Arabidopsis AHASL (або аланіну на цистеїн, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, аргінін, треонін, триптофан або тирозин у відповідному положенні 200 AHASL дріжджів) приводить до резистентності до імідазолінонів та 2 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сульфонілсечовин. Заміщення практично будь-якої амінокислоти на триптофан у положенні 574 Arabidopsis AHASL, відповідає положенню 586 AHASL дріжджів, надає стійкості до імідазолінонів, сульфонілсечовин, триазолопіримідину та піримідилоксибензоатів. Заміщення серину на фенілаланін, аспарагін або треонін у положенні 653 Arabidopsis AHASL надає стійкості до імідазолінонів та піримідил оксибензоатів. Патенти США № 5,853,973; 5,928,937; та 6,576,455 описують способи моделювання на основі структури для отримання варіантів AHAS, які включають амінокислотні заміщення у спеціальних положеннях, які відрізняються від положень описаних вище. У Mourad et al. (1992) Planta 188;491-497 показали, що мутантні лінії, резистентні до сульфонілсечовин, є кросрезистентними до триазолопіримідину та мутантні лінії, резистентні до імідазолінонів, є кросрезистентними до піримідилоксибензоатів. Патент США № 5,859,348 описує подвійний мутант великої субодиниці AHAS цукрового буряка, у якому аланін заміщено на треонін у 113 амінокислоті, та пролін на серин у 188 амінокислоті. Рослини цукрового буряка, які містять подвійні мутантні білки AHAS є стійкими як до імідазолінону, так і до сульфонілсечовин. Mourad et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 242:178-184, описують Arabidopsis подвійний мутант AHAS csr1-4. сsr1-4 мутантний AHAS, який містить C-T нуклеотидне заміщення у положенні 589 (відповідає заміщенню проліну на серин у амінокислоті 197 Arabidopsis AHASL) та G-A нуклеотидне заміщення у положенні 1958 (відповідає заміщенню серин на треонин у амінокислоті 653 Arabidopsis AHASL). Lee et al. (1988) EMBO Journal 7:1241-1248, описують тютюновий AHAS подвійний мутант S4-Hra, який включає заміщення Pro-Ala у амінокислоті 196 (відповідає амінокислоті 197 Arabidopsis AHASL) та заміщення Trp-Leu у амінокислоті 573 (відповідає амінокислоті 574 Arabidopsis AHASL). Трансгенні лінії, які містять подвійні мутантні гени, проявляють резистентність до сульфонілсечовинних гербіцидів. Патент США № 7,119,256 описує подвійний мутант великої субодиниці AHAS рису, який містить заміщення триптофан-лейцин у амінокислоті 548 та серин-ізолейцин у амінокислоті 627. Трансгенні рослини, які експресують полінуклеотид, який кодує ці подвійні мутанти білку AHAS, проявляють підвищену резистентність до піримідинілкарбоксильних гербіцидів, біспірибакнатрію. Завдяки своїй високій ефективності та низькій токсичності імідазолінонові гербіциди є переважними у сільському господарстві. Однак, можливість застосування імідазолінонових гербіцидів до певних культур залежить від наявності сортів, стійких до імідазолінону, потрібних культурних рослин. Для отримання таких сортів, резистентних до імідазолінону, залишається потреба у культурних рослинах, які містять мутантні поліпептиди AHAS, які демонструють покращену толерантність до імідазолінонів та/або інших гербіцидів, які інгібують AHAS, у порівнянні із культурними рослинами, які містять існуючі AHAS мутанти. Хоча деякі мутанти AHAS вже є описаними, ще залишається потреба у мутантних поліпептидах AHAS, які, при експресії потрібною культурною рослиною, забезпечують збільшення толерантності до одного або кількох класів гербіцидів, які інгібують AHAS, при порівнянні з існуючими мутантами AHAS у культурних рослинах. Резюме винаходу Винахід стосується нових мутантних поліпептидів AHAS, які проявляють толерантність до гербіциду, зокрема, імідазолінонового гербіциду або сульфонілсечовинного гербіциду, або їх суміші. У бажаних варіантах здійснення винаходу толерантність до гербіциду, викликана мутантами винаходу, покращується та збільшується у порівнянні із толерантністю, викликаною відомими мутантами AHAS. Мутанти винаходу містять щонайменше два амінокислотні заміщення у поліпептиді великої субодиниці AHAS. У одному варіанті здійснення, винахід стосується ізольованого нуклеотиду, який кодує подвійно мутантний поліпептид великої субодиниці AHAS, вибраний з групи, яка складається з поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин 3 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 139 SEQ ID NO:1 або положенню 107 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та гістидин у положенні, яке відповідає положенню 269 SEQ ID NO:1 або положенню 237 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та метіонін у положенні, яке відповідає положенню 416 SEQ ID NO:1 або положенню 384 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 426 SEQ ID NO:1 або положенню 394 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та валін у положенні, яке відповідає положенню 430 SEQ ID NO:1 або положенню 398 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 442 SEQ ID NO:1 або положенню 410 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин або аспарагінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 445 SEQ ID NO:1 або положенню 413 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та глутамінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 580 SEQ ID NO:1 або положенню 548 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 375 SEQ ID NO:1 або положенню 343 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та поліпептиду, який містить валін, цистеїн, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, аргінін, треонін, триптофан або тирозин у положенні, яке відповідає положенню 205 SEQ ID NO:1 або положенню 173 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2. У іншому варіанті здійснення, винахід стосується ізольованого полінуклеотиду, який кодує потрійно мутантний поліпептид великої субодиниці AHAS, вибраний з групи, яка складається з поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін, або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, 4 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінова кислота, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, аргінін у положенні, яке відповідає положенню 57 SEQ ID NO:1 та лейцин у положенні, яке відповідає положенню 398 SEQ ID NO:1 або положенню 366 SEQ ID NO:2; поліпептид, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить лейцин у положенні, яке відповідає положенню 95 SEQ ID NO:1 або положенню 63 SEQ ID NO:2, глутамінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 416 SEQ ID NO:1 або положенню 384 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2, аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та будь-яку амінокислоту у положенні, яке відповідає положенню 574 SEQ ID NO:1 або положенню 542 SEQ ID NO:2. Винахід також стосується AHASL поліпептидів, які містять вищеописані подвійні та потрійні мутанти, векторів експресії, які містять полінуклеотиди, які кодують вищеописані подвійні та потрійні мутанти AHASL, клітин, які містять полінуклеотиди, які кодують вищеописані подвійні та потрійні мутанти AHASL, трансгенних рослин, які містять вищеописані полінуклеотиди та поліпептиди, та способів отримання та застосування трансгенних рослин, які містять полінуклеотиди, які кодують вищеописані подвійні та потрійні мутанти AHASL. Винахід також стосується трансгенних та нетрансгенних рослин, які містять один або кілька полінуклеотидів, які мають дві або більше мутації. У одному варіанті здійснення, рослини винаходу містять перший нуклеотид, який кодує перший одинично мутантний поліпептид AHASL, та другий полінуклеотид, який кодує другий oдинично мутантний поліпептид AHASL, або полінуклеотид, який кодує AHASL, яка містить дві мутації, що приводить до амінокислотних мутацій вказаних першого та другого AHASL одинично мутантних поліпептиди, вибирають з групи, яка складається з: першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 другого поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який 5 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 139 SEQ ID NO:1 або положенню 107 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить гістидин у положенні, яке відповідає положенню 269 SEQ ID NO:1 або положенню 237 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить метіонін у положенні, яке відповідає положенню 416 SEQ ID NO:1 або положенню 384 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 426 SEQ ID NO:1 або положенню 394 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить валін у положенні, яке відповідає положенню 430 SEQ ID NO:1 або положенню 398 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 442 SEQ ID NO:1 або положенню 410 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить ізолейцин або аспарагінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 445 SEQ ID NO:1 або положенню 413 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить глутамінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 580 SEQ ID NO:1 або положенню 548 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 375 SEQ ID NO:1 або положенню 343 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та першого поліпептиду, який містить валін, цистеїн, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, аргінін, треонін, триптофан або тирозин у положенні, яке відповідає положенню 205 SEQ ID NO:1 або положенню 173 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2. У іншому варіанті здійснення, винахід стосується трансгенних та нетрансгенних рослин, які містять перший полінуклеотид, який кодує перший мутантний поліпептид AHASL, другий полінуклеотид, який кодує другий мутантний поліпептид AHASL, та третій полінуклеотид, який кодує третій мутантний поліпептид AHASL; або AHASL, яка кодує полінуклеотид, який містить три мутації, де три нуклеотидні мутації приводять до амінокислотних мутацій, які відповідають мутаціям вказаних першого, другого та третього мутантних поліпептидів AHASL; або AHASL, 6 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 яка кодує полінуклеотид, який містить єдину мутацію, та AHASL, яка кодує полінуклеотид, який містить подвійні мутації, де нуклеотидні мутації приводять до відповідних амінокислотних мутацій, які відповідають амінокислотним мутаціям вказаних першого, другого та третього мутантних поліпептидів AHASL, де вказані перший, другий та третій поліпептиди вибирають з групи, яка складається з: першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, другого поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та третього поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, другого поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та третього поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, другого поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та третього поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, другого поліпептиду, який містить аргінін у положенні, яке відповідає положенню 57 SEQ ID NO:1 та третього поліпептиду, який містить лейцин у положенні, яке відповідає положенню 398 SEQ ID NO:1 або положенню 366 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2, другого поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та третього поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; першого поліпептид, який містить лейцин у положенні, яке відповідає положенню 95 SEQ ID NO:1 або положенню 63 SEQ ID NO:2, другого поліпептиду, який містить глутамінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 416 SEQ ID NO:1 або положенню 384 SEQ ID NO:2 та третього поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та першого поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2, другого поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та третього поліпептиду, який містить будь-яку амінокислоту у положенні, яке відповідає положенню 574 SEQ ID NO:1 або положенню 542 SEQ ID NO:2. Даний винахід стосується способу боротьби із бур’янами, які знаходяться поряд із трансгенними та нетрансгенними рослинами винаходу. Такі рослини мають підвищену резистентність до гербіцидів у порівнянні з рослинами дикого типу. Спосіб включає нанесення ефективної кількості гербіциду, який інгібує AHAS, на бур’яни та на рослини винаходу. Короткий опис фігур Фігура 1 показує повну послідовність білку великої субодиниці Arabidopsis AHAS (амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 1; послідовність нуклеотидів SEQ ID NO: 31) з запропонованим перекладом, який показує положення мутацій, які відмічені напівжирним шрифтом та підкреслені. Нумерація ДНК знаходиться зліва та нумерація амінокислот справа. Фігура 2 показує послідовність білку великої субодиниці AHAS кукурудзи (амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 2; послідовність нуклеотидів SEQ ID NO: 32) з амінокислотами у положеннях заявлених мутацій, відмічених напівжирним шрифтом та підкреслених. Нумерація ДНК знаходиться зліва та нумерація амінокислот справа. 7 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 3 показує вирівнювання положень відповідності білку великої субодиниці Arabidopsis AHAS (AtAHASL, SEQ ID NO: 1) з білком великої субодиниці AHAS видів, де подвійні та потрійні мутації винаходу отримують, шляхом знаходження положень заміщень, які відповідають положенням заміщень у SEQ ID NO: 1: Amaranthus sp. (AsAHASL SEQ ID NO:9), Brassica napus (BnAHASL1A SEQ ID NO:3, BnAHASL1C SEQ ID NO:10, BnAHASL2A SEQ ID NO:11), Camelina microcarpa (CmAHASL1 SEQ ID NO:12, CmAHASL2 SEQ ID NO:13), Solanum tuberosum (StAHASL1 SEQ ID NO:16, StAHASL2 SEQ ID NO:17), Oryza sativa (OsAHASL SEQ ID NO:4), Lolium multiflorum (LmAHASL SEQ ID NO:20), Solanum ptychanthum (SpAHASL SEQ ID NO:14), Сорго bicolor (SbAHASL SEQ ID NO:15), Glycine max (GmAHASL SEQ ID NO:18), Helianthus annuus (HaAHASL1 SEQ ID NO:5, HaAHASL2 SEQ ID NO:6, HaAHASL3 SEQ ID NO:7), Triticum aestivum (TaAHASL1A SEQ ID NO:21, TaAHASL1B SEQ ID NO:22, TaAHASL1D SEQ ID NO:23), Xanthium sp. (XsAHASL SEQ ID NO:19), Zea mays (ZmAHASL1 SEQ ID NO:8, ZmAHASL2 SEQ ID NO:2), Gossypium hirsutum (GhAHASA5 SEQ ID NO:24, GhAHASA19 SEQ ID NO:25), і E.coli (ilvB SEQ ID NO:26, ilvG SEQ ID NO:27, ilvI SEQ ID NO:28). Фігура 4 є векторною мапою основного вектору AE, який використовують для конструювання Arabidopsis AHASL мутантів AE2-AE8 у E. coli, з порівнювальними положеннями мутацій у вказаній Arabidopsis AHASL. Фігура 5 є векторною мапою основного вектору для трансформації рослин AP, який використовують для конструювання векторів AP2-AP5, які відрізняються тільки мутаціями, зазначеними у Таблиці 1. Фігура 6 є векторною мапою основного вектору ZE, який використовують для дослідження AHASL мутантів ZE2, ZE5, ZE6, та ZE7 кукурудзи у E. coli, з відносними положеннями зазначених мутацій. Фігура 7 є мапою вектору ZP для трансформації рослин, який використовують як основний вектор для конструювання векторів ZP2-ZP10. Фігура 8 є таблицею, яка показує відповідні амінокислотні положення AHASL генів, які походять від різних видів. Фігура 9 показує процент ідентичності білку генів AHASL різних видів. Аналіз здійснювали за допомогою програмного забезпечення Vector NTI (штраф за відкриття гепу = 10, штраф за подовження гепу = 0,05, штраф за розділення гепу = 8, blosum 62MT2 matrix). Фігура 10 показує результати дослідження росту насіння на вертикальних дисках декількох ліній Arabidopsis, посіяних на середовище з 37,5 молярним імазетапіром. Використовували наступне насіння: 1) дикий тип екотип Columbia 2; 2) csr1-2 мутант (гомозиготний по AtAHASL S653N мутації у генній копії гену великої субодиниці AHAS); 3) Columbia 2 трансформований AP1; 4) Columbia 2 трансформований AP7; та 5) Columbia 2 трансформований AP2. Фігура 11 є векторною мапою основного вектора AUP для трансформації рослин для конструювання векторів AUP2 та AUP, які відрізняються тільки за мутаціями, зазначеними у Таблиці 3. Фігура 12 є векторною мапою основного вектора BAP1, який містить кодуючу послідовність AtAHASL з мутацією S653N. Детальний опис винаходу Винахід стосується полінуклеотидів, які кодують AHASL, з щонайменше двома мутаціями, наприклад, подвійні та потрійні мутанти, які проявляють толерантність до гербіцидів, зокрема, до імідазлінонових гербіцидів та необов’язково до сульфонілсечовин, триазолопіримідин сульфоаніліду та/або піримідилоксибензоат гербіцидів. Мутанти AHASL винаходу можна використовувати для створення трансгенних рослин, які демонструють рівень резистентності до гербіцидів, достатній, щоб відповідати ринковим вимогам щодо стійкості до гербіцидів, при наявності тільки у однієї батьківської рослини гібриду крос або у одному геномі поліплоїдної рослини. Полінуклеотиди винаходу також можна використовувати як селективні маркери для трансформації зв’язаних генів, які кодують інші властивості, як зазначено у патенті США № 6,025,541. Хоча білки AHASL різних видів відрізняються за довжиною кількома амінокислотами, відносне розташування залишків потрібних для модифікації згідно з даним винаходом зберігається (Фігура 8). Відповідно, мутації описані у даному документі, виражені у положеннях, які відповідають залишкам амінокислот поліпептиду Arabidopsis AHASL (SEQ ID NO: 1, Фігура 1, Фігура 8), доки не вказано протилежне або не є очевидним з контексту. Наприклад, залишок 122 Arabidopsis AHASL відповідає залишку 90 AHASL пшениці, залишку 104 Brassica napus AHASL 1A, залишку 107 B. napus AHASL 1C, залишку 96 O. sativa AHASL, залишку 113 Amaranthus AHASL, залишку 26 Escherichia coli ilvG, залишку 117 Saccharomyces cerevisiae AHASL, залишку 113 цукрового буряку, залишку 111 бавовони, залишку 120 Camelina microcarpa AHASL1, 8 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 залишку 117 Camelina microcarpa AHASL2, залишку 109 Solanum tuberosum AHASL1, залишку 111 Solanum tuberosum AHASL2, залишку 92 Lolium multiflorum, залишку 27 Solanum ptychanthum, залишку 93 Sorgo bicolor, залишку 103 Glycin max, залишку 107 Helianthus annuus AHASL1, залишку 101 Helianthus annuus AHASL2, залишку 97 Helianthus annuus AHASL3, залишку 59 Triticum aestivum та залишку 100 Xanthium sp. Така відповідність є добре відомою фахівцям у галузі. На основі такої відповідності відповідні положення у послідовностях великої субодиниці AHAS, спеціально не наведені у даному документі, можуть бути легко визначені фахівцем. Специфічні типові регіони відповідності, важливі у даному винаході, викладені на Фігурі 3. У переважному варіанті здійснення винахід стосується ізольованого полінуклеотиду, який кодує подвійно мутантну Arabidopsis AHASL, вибраного з групи, яка складається з поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 139 SEQ ID NO:1 або положенню 107 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та гістидин у положенні, яке відповідає положенню 269 SEQ ID NO:1 або положенню 237 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та метіонін у положенні, яке відповідає положенню 416 SEQ ID NO:1 або положенню 384 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 426 SEQ ID NO:1 або положенню 394 SEQ ID NO:2; поліпептид, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та валін у положенні, яке відповідає положенню 430 SEQ ID NO:1 або положенню 398 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 442 SEQ ID NO:1 або положенню 410 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин або аспарагінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 445 SEQ ID NO:1 або положенню 413 EQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та глутамінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 580 SEQ ID NO:1 або положенню 548 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 375 SEQ ID NO:1 або положенню 343 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який 9 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містить аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептид, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та поліпептиду, який містить валін, цистеїн, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, аргінін, треонін, триптофан або тирозин у положенні, яке відповідає положенню 205 SEQ ID NO:1 або положенню 173 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2. У іншому переважному варіанті здійснення винахід стосується ізольованого полінуклеотиду, який кодує потрійно мутантний поліпептид великої субодиниці Arabidopsis AHAS, вибраний з групи, яка складається з: поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, аргінін у положенні, яке відповідає положенню 57 SEQ ID NO:1 та лейцин у положенні, яке відповідає положенню 398 SEQ ID NO:1 або положенню 366 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 of SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить лейцин у положенні, яке відповідає положенню 95 SEQ ID NO:1 або положенню 63 SEQ ID NO:2, глутамінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 416 SEQ ID NO:1 або положенню 384 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2, аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінова кислота, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та будь-яку амінокислоту у положенні, яке відповідає положенню 574 SEQ ID NO:1 або положенню 542 SEQ ID NO:2. Інші переважні варіанти здійснення винаходу включають подвійні та потрійні мутанти AHASL інших видів, де подвійні та потрійні мутації знаходяться у положеннях, які відповідають положенням у мутантних Arabidopsis та кукурудзі описаних вище та на таблиці, показаній на Фігурі 8. Наприклад, відповідні подвійні та потрійні мутанти AHASL мікроорганізмів, таких як E. coli, S. cerevisiae, Salmonella, Synichocystis; та рослин, таких як пшениця, ріж, овес, трітікале, рис, ячмінь, сорго, просо, цукровий буряк, цукрова тростина, соя, арахіс, бавовна, рапс, канола, види Brassica, маніока, диня, гарбуз, перець, соняшник, календула, пасльонові, картопля, батат, тютюн, баклажан, томати, види Vicia, горох, люцерна, кава, какао також є включеними у даний 10 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винахід. Такі подвійні та потрійні мутанти отримують використовуючи відомі способи, наприклад, in vitro, використовуючи сайт-специфічний мутагенез, або in vivo, використовуючи спрямований мутагенез, або подібні технології, як описано у патентах США №. 5,565,350; 5,731,181; 5756,325; 5,760,012; 5,795,972 та 5,871,984. Полінуклеотиди винаходу постачаються у полігенних експресійних кластерах для експресії у потрібних рослинах. Кластер включає регуляторні послідовності, зв’язані з AHASL послідовністю полінуклеотидів винаходу. Термін “регуляторний елемент”, який використовують у даному документі, стосується полінуклеотиду, здатного регулювати транскрипцію функціонально зв’язаного полінуклеотиду. Він включає, проте не обмежується, промоторами, енхансерами, інтронами, 5’ UTRs та 3’ UTRs. Під «функціонально зв’язаними» розуміють функціональний зв'язок між промотором та другою послідовністю, де промотерна послідовність ініціює та опосередковує транскрипцію послідовності ДНК, яка відповідає другій послідовності. Зазвичай, функціонально зв’язаний означає, що приєднана послідовність нуклеотидів є суміжною та, де необхідно, приєднує дві кодуючи ділянки білку, суміжною та у одній зчитувальній рамці. Кластер може додатково містити щонайменше один додатковий ген для співтрансформації у організм. Альтернативно, додатковий ген(и) постачають у полігенних експресуючих кластерах. Такий полігенний експресуючий кластер подається з великою кількістю сайтів рестрикції для введення полінуклеотидної послідовності AHASL, яке регулюється транскрипцією регуляторних елементів. Полігенний експресуючий кластер може додатково містити селективні маркерні гени. Полігенний експресуючий кластер буде включати у 5'-3' напрямок транскрипції, ініціюючу ділянку транскрипції та трансляції (тобто, промотер), AHASL полінуклеотидну послідовність винаходу, та функціональну ділянку термінації транскрипції та трансляції (тобто, ділянка термінації) у рослин. Промотор може бути природним або аналогом, або чужорідним, або гетерологічним до рослини хазяїна та/або полінуклеотидної послідовності AHASL винаходу. Окрім цього, промотор може бути природною послідовністю або альтернативно синтезованою послідовністю. У випадку, де промотор є «чужорідним» або «гетерологічним» до рослини хазяїна, передбачається що промотор не знайдено у рослині хазяїні, у яку вводять промотор. У випадку, де промотор є «чужорідним» або «гетерологічним» до полінуклеотидної послідовності AHASL винаходу, передбачається, що промотор не є природним або природно наявним промотором для функціонально зв’язаної полінуклеотидної послідовності AHASL винаходу. Як вказано у даному документі, рекомбінантний ген містить кодуючу послідовність, функціонально зв’язану з ділянкою ініціювання транскрипції, яка є гетерологічною кодуючій послідовності. Хоча бажано експресувати полінуклеотиди AHASL винаходу використовуючи гетерологічні промотори, послідовності природних промоторів також можна використовувати. Такі конструкції змінять рівень експресії білку AHASL в рослині або клітині рослини. Таким чином, змінюється фенотип рослини або рослинної клітини. Ділянка термінації може бути нативною для ділянки ініціювання транскрипції, може бути нативною для потрібної функціонально зв’язаної послідовності AHASL, може бути нативною для рослини хазяїна, або походити з іншого джерела (наприклад, чужерідного або гетерологічного до промотера, потрібної полінуклеотидної послідовності AHASL, рослини хазяїна або будь-якої їх комбінації). Придатні ділянки термінації є доступними з Ti-плазміди A. tumefaciens, такі як ділянки термінації октопінсинтази та нопалінсинтази. Дивитись також Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plants cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; та Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. Де потрібно ген(и) можуть бути оптимізовані для збільшення експресії у трансформованих рослин. Тобто гени можна синтезувати використовуючи переважні для рослини кодони для покращення експресії. Дивитись, наприклад, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 for a discussion of host-preferred codon usage. Способи є відомим у галузі синтезування переважних для рослин генів. Дивитись, наприклад, Патенти США № 5,380,831 та 5,436,391, та Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, наведені у даному документі як посилання. Додаткові модифікації послідовностей покращують експресію генів у клітинах хазяїнах. Вони включають видалення послідовностей, які кодують оманливі сигнали поліаденілування, сигнали сплайсингу ділянки екзон-нейтрон, транспозон-подібні повтори, та ініші добре охарактеризовані послідовності, які можуть бути небезпечними для експресії генів. Вміст G-C пар у послідовності можна встановити на рівні середньому для клітин хазяїнів, як розраховано шляхом посилання на відомі гени, експресовані клітиною хазяїном. Де можливо, послідовність модифікують для уникнення петлі вторинної структури мРНК. 11 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Послідовності нуклеотидів для покращення експресії генів також використовують у рослинних векторах експресії. Вони включають інтрони кукурудзи AdhI, інтрон 1 гена (Callis et al. Genes and Development 1:1183-1200, 1987) та лідерну послідовність, (W-sequence) вірусу тютюнової мозаїки Tobacco Mosaic virus (TMV), вірус Maize Chlorotic Mottle Virus та вірус мозаїки люцерни (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987 and Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990). Перший інтрон, отриманий з локусу shrunken-1 пшениці, збільшив експресію генів у рекомбінантних генних конструкціях. Патенти США № 5,424,412 та 5,593,874 описують спеціальні інтрони у конструкціях, які експресують гени, та Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929939, 1994) також показали, що інтрони здатні регулювати експресію генів на спеціальних тканиних матриксах. Для подальшого збільшення або оптимізації експресії генів великої субодиниці AHASL, рослинні вектори експресії винаходу також можуть містити ДНК послідовності, які включають ділянки прикріплення до матриксу (MARs). Рослинні клітини, трансформовані такими модифікованими системами експресії, проявляють надекспресію або значну експресію нуклеотидної послідовності винаходу. Полігенні експресуючі кластери можуть додатково містити 5'-лідерні послідовності у конструкції полігенного експресуючого кластеру. Такі лідерні послідовності потрібні для покращення трансляції. Лідери трансляції є добре відомими у галузі та включають: лідерні послідовності пікорнавірусів, наприклад, EMCV-лідер (5'-некодуюча ділянка енцефаломіокардиту) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); лідерні послідовності потівірусів, наприклад, TEV-лідер (вірус гравірування тютюну) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), MDMV-лідер (вірус мозаїкової карликовості кукурудзи) (Virology 154:9-20), та зв’язувальний білок важкого ланцюгу імуноглобуліна людини (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); нетрасльовану лідерну послідовність мРНК з покровного протеїну віруса мозаїки люцерни (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); лідер вірусу тютюнової мозаїки (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237256); та лідерну послідовність вірусу хлорозної мозаїки кукурудзи (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Дивитись також, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Інші способи, які покращують трансляцію, також використовують, наприклад, інтрони тощо. При приготуванні полігенного експресуючого кластеру маніпулюють багатьма фрагментами ДНК, щоб отримати послідовність ДНК у потрібному розташуванні та у потрібній зчитувальній рамці. У напрямку до цього кінця використовують адаптери або лінкери для приєднання фрагментів ДНК або здійснюють інші маніпуляції для забезпечення потрібними ділянками рестрикції, видалення надлишку ДНК, видалення ділянок рестрикції тощо. Для цієї мети використовують in vitro мутагенез, репарацію праймеру, рестрикцію, ренатурація, перезаміщення, наприклад, переміщення та трансверсії. Кілька промоторів використовують у даному винаході. Промотори вибирають в залежності від бажаного результату. Нуклеїнові кислоти комбінують з суттєвими, тканинно-бажаними або іншими промоторами для експресії у рослинах. Такі конститутивні промотори включають, наприклад, коровий промотор Rsyn7 промотора та інші конститутивні промотори, описані у WO 99/43838 та патенті США № 6,072,050; коровий промотор CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); актин рису (McElroy et al. (1990) Plant cell 2:163-171); убіквінтін (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 and Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); ALS промотор (U.S. Patent No. 5,659,026) тощо. Інші конститутивні промотори є включеними, наприклад, у патенти США № 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; та 6,177,611. Переважні для тканин промотори використовують для покращеної спрямованої AHASL експресії у певній тканині рослини. Такі переважні для тканин промотори включають, проте не обмежуються, переважними для листя промоторами, переважними для коріння промоторами, переважними для насіння промоторами, та переважними для стебла промоторами. Тканинноспецифічні промотори описані Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Рослинної клітини Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; та Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Такі промотори можна модифікувати, у разі необхідності, для слабкої експресії. У одному варіанті здійснення, бажані нуклеїнові кислоти спрямовують у хлоропласт для експресії. Таким чином, коли нуклеїнова кислота вводиться у хлоропласт не напряму, 12 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полігенний експресуючий кластер буде додатково містити хлоропласт-спрямовуючу послідовність, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує транзиторний пептид хлоропласту, для того щоб спрямувати потрібний ген у хлоропласти. Такі транзиторні пептиди відомі у галузі. По відношенню до хлоропласт-спрямовуючих послідовностей «функціонально зв’язані» означає, що послідовність нуклеотидів, яка кодує транзиторний пептид (тобто, хлоропласт-спрямовуючу послідовність), є зв’язаною з AHASL полінуклеотидом винаходу, таким чином, що дві послідовності є суміжними та знаходяться у одній рамці зчитування. Дивитись, наприклад, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Поки AHASL білки винаходу включають природний транзиторний пептид хлоропласту, будь-які транзиторні пептиди хлоропластів, відомі у галузі, можуть бути злиті з амінокислотною послідовністю процесованого AHASL білку винаходу шляхом функціонального зв’язування з хлоропластспрямовуючою послідовністю з 5'-кінця нуклеотидної послідовності, яка кодує процесований білок AHASL винаходу. Хлоропласт-спрямовуючі послідовності відомі у галузі та включають маленьку субодиницю рібулозо-1,5-біфосфат карбоксилази хлоропластів (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5(енолпірувіл)шікімат-3-фосфат синтази (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); триптофансинтази (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); пластоціанін (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); хоризмат синтазу (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); та білок що зв’язує хлорофіл a/b, який утворюється на світлі (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Дивитись також Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Способи трансформації хлоропластів є відомими у галузі. Дивитись, наприклад, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Спосіб основано на доставці ДНК, яка містить селективний маркер, за допомогою генної гармати та спрямовування ДНК у геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації. Додатково, трансформацію пластид завершують шляхом трансактивації антисмислового пластидного трансгену за допомогою тканинної експресії РНК-полімерази, яка кодується у ядрі та спрямовується у пластиду. Така система описана у McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305. Для спрямування бажаних нуклеїнових кислот у хлоропласт, їх оптимізують для експресії у хлоропласті, для розрахунку різниці у частоті використання кодону у ядрі рослини та цією органелою. Таким чином, нуклеїнові кислоти можна синтезувати використовуючи кодони переважні для хлоропласту. Дивитись, наприклад, патент США № 5,380,831, включений у даному документі як посилання. Зокрема, даний винахід описує застосування полінуклеотидів, які кодують AHASL мутантні поліпептиди, які містять щонайменше дві мутації, для конструювання рослин стійких до гербіцидів. Цю стратегію у даному документі продемонстрували, використовуючи мутанти Arabidopsis AHASL у Arabidopsis thaliana та кукурудзяні мутанти AHASL2 у кукурудзі, проте ця заявка не обмежена цими генами або цими рослинами. У бажаних варіантах здійснення гербіцидом є імідазолінон та/або сульфонілсечовини. У інших бажаних варіантах здійснення, толерантність до гербіцидів є покращеною та/або підвищеною у порівнянні з диким типом рослин та відомими AHAS мутантами. Винахід також стосується способу отримання трансгенних культурних рослин, які містять AHASL мутантну кодуючу нуклеїнову кислоту, які містить щонайменше дві мутації, де експресія нуклеїнових кислот в рослині приводить до толерантності до гербіцидів у порівнянні з рослинами дикого типу або відомими AHAS мутантними рослинами, який включає: (a) введення в рослинну клітину вектора експресії, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує AHASL мутант з щонайменше двома мутаціями, та (b) отримання з рослинної клітини трансгенної рослини, толерантної до гербіцидів. Рослинна клітина включає, проте не обмежується, протопластом, клітиною, яка продукує гамети, та клітиною, з якої розвивається ціла рослина. Використаний у даному документі термін «трансгенний» стосується будь-якої рослини, рослинної клітини або калусу, рослинної тканини або частини рослини, яка містить весь або щонайменше частину одного рекомбінантного полінуклеотиду. У багатьох випадках весь або частина рекомбінантного полінуклеотиду є стабільно інтегрованою у хромосому або стабільний екстра-хромосомний елемент, що таким чином передається наступним поколінням. 13 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У іншому варіанті здійснення, винахід стосується використання мутантних AHASL поліпептидів винаходу як селективних маркерів. Винахід стосується способу ідентифікації або селекції трансформованої рослинної клітини, рослинної тканини, рослини або їх частини, які містять нуклеїнову кислоту, яка кодує велику субодиницю подвійного мутантного поліпептиду AHAS винаходу описаного вище, де поліпептид використовують як селективний маркер, та де вказана трансформована рослинна клітина, рослинна тканина, рослина або її частина може необов’язково включає додатково ізольовані нуклеїнові кислоти; b) взаємодію трансформованих рослинних клітин, рослинної тканини, рослини або їх частини з щонайменше одним AHAS інгібітором або сполукою, яка інгібує AHAS; c) визначення чи рослинна клітина, рослинна тканина або їх частина уражена інгібітором або інгібуючою сполукою; та d) ідентифікація або селекція трансформованої рослинної клітини, рослинної тканини, рослини або їх частини. Винахід також стосується очищених AHASL білків, які містять подвійні та потрійні мутації описані у даному документі, кориснідля досліджень молекулярного моделювання для конструювання подальшого покращення стійкості до гербіцидів. Способи очищення білків є добре відомими та їх можна легко здійснити, використовуючи комерційно доступні продукти або спеціально розроблені способи, як викладено, наприклад, у Protein Biotechnology, Walsh and Headon (Wiley, 1994). Винахід також стосується нетрансгенних та трансгенних стійких до гербіцидів рослин, які містять один полінуклеотид, який кодує подвійно мутантний поліпептид AHASL, або два полінуклеотиди, які кодують одинично мутантні поліпептиди AHASL. Нетрансгенні рослини отримані таким чином виготовляють за допомогою перехресного запилення першої рослини другою та дозволення рослині, яка прийняла пилок (це може бути як перша, так і друга рослина) утворити насіння, отримане внаслідок перехрісного запилення. Насіння та потомство рослин, отримане таким чином, може мати подвійні мутації перехресні у одному єдиному алелі або двох алелях. Акцептором пилку може бути як перша, так і друга рослина. Перша рослина містить перший полінуклеотид, яки кодує перший одинично мутантний поліпептид AHASL. Друга рослина містить другий полінуклеотид, який кодує другий oдинично мутантний поліпептид AHASL. Перший та другий oдинично мутантні поліпептиди AHASL містять різні єдині амінокислотні заміщення по відношенню до поліпептиду AHASL дикого типу. Може бути вибране насіння або потомство рослин, отримане з них, яке містить один полінуклеотид, який кодує подвійно мутантний поліпептид AHASL, або два полінуклеотиди, які кодують два одинично мутантні поліпептиди AHASL. Вибране потомство рослин показує неочікувано високу толерантність до гербіциду, який інгібує AHAS, наприклад, імідазолінонового гербіциду або сульфонілсечовинного гербіциду, завдяки комбінації двох одинично мутантних поліпептидів AHASL у одній рослині. Потомство рослин показує синергізм по відношенню до толерантності до гербіцидів, у зв’язку з чим рівень стійкості до гербіцидів у потомства рослин, які містять першу та другу мутації з батьківських рослин, є вищим ніж у рослин, які містять дві копії першого полінуклеотиду або дві копії другого полінуклеотиду. Коли перша та друга рослина є гомозиготними по першому та другому полінуклеотидам, відповідно, кожна з отриманих рослин потомства містить копію першого та другого полінуклеотидів та можна уникнути стадію відбору. Коли щонайменше одна з першої та другої рослини є гетерозиготою, можна вибрати рослини з потомства, які містять обидва полінуклеотиди, наприклад, шляхом аналізу ДНК потомства рослин, щоб ідентифікувати потомство рослин, які містять обидва перший та другий полінуклеотиди, або шляхом дослідження потомства рослин на підвищену толерантність до гербіцидів. Потомство рослин, які містять обидва перший та другий полінуклеотиди показує рівень толерантності до гербіцидів більший, ніж рівень толерантності у рослин, які містять дві копії першого або дві копії другого поліпептиду. У одному варіанті здійснення, рослини винаходу містять перший полінуклеотид, який кодує перший одинично мутантний поліпептид AHASL, та другий полінуклеотид, який кодує другий oдинично мутантний поліпептид AHASL, або полінуклеотид, який кодує AHASL, який містить дві нуклеотидні мутації, що призводять до амінокислотних мутацій, які відповідають амінокислотним мутаціям вказаного першого та другого AHASL одинично мутантних поліпептидів, де вказані перший та другий oдинично мутантні поліпептиди AHASL вибрані з групи, яка складається з: першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у 14 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептид, який містить аланін, глутамінова кислота, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептид, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіоніну положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептид, який містить ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 139 SEQ ID NO:1 або положенню 107 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить гістидин у положенні, яке відповідає положенню 269 SEQ ID NO:1 або положенню 237 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить метіонін у положенні, яке відповідає положенню 416 SEQ ID NO:1 або положенню 384 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 426 SEQ ID NO:1 або положенню 394 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить валін у положенні, яке відповідає положенню 430 SEQ ID NO:1 або положенню 398 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 442 SEQ ID NO:1 або положенню 410 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить ізолейцин або аспарагінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 445 SEQ ID NO:1 або положенню 413 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить глутамінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 580 SEQ ID NO:1 або положенню 548 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 375 SEQ ID NO:1 або положенню 343 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; першого поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у 15 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та першого поліпептиду, який містить валін, цистеїн, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, аргінін, треонін, триптофан або тирозин у положенні, яке відповідає положенню 205 SEQ ID NO:1 або положенню 173 SEQ ID NO:2 та другого поліпептиду, який містить фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2. Нетрансгенні рослини, які містять подвійні мутантні AHASL полінуклеотиди, отримують іншими способами, ніж описане вище перехресне запилення, такими як, наприклад, in vivo спрямований мутагенез як описано у Kochevenko et al. (Plant Phys. 132:174-184, 2003), проте не обмежуються ними. Подвійні мутації можуть бути розташовані у єдиному алелі або двох алелях рослинного геному. Інший варіант здійснення винаходу стосується трансгенної рослини трансформованої вектором експресії, який містить ізольований полінуклеотид, де ізольований полінуклеотид кодує подвійний мутантний поліпептид великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (AHASL), вибраний з групи, яка складається з: поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептид, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 139 SEQ ID NO:1 або положенню 107 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та гістидин у положенні, яке відповідає положенню 269 SEQ ID NO:1 або положенню 237 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та метіонін у положенні, яке відповідає положенню 416 SEQ ID NO:1 або положенню 384 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 426 SEQ ID NO:1 або положенню 394 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та валін у положенні, яке відповідає положенню 430 SEQ ID NO:1 або положенню 398 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 442 SEQ ID NO:1 або положенню 410 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та ізолейцин або аспарагінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 445 SEQ ID NO:1 або положенню 413 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2 та глутамінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 580 SEQ ID NO:1 або положенню 548 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, 16 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 375 SEQ ID NO:1 або положенню 343 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та поліпептиду, який містить валін, цистеїн, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, аргінін, треонін, триптофан або тирозин у положенні, яке відповідає положенню 205 SEQ ID NO:1 або положенню 173 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2. Винахід також стосується нетрансгенних та трансгенних толерантних до гербіцидів рослин, які містять один полінуклеотид, який кодує потрійно мутантний поліпептид AHASL, або один або кілька потрійно мутантних полінуклеотидів, які кодують AHASL. Для отримання нетрансгенної рослини з одним або кількома полінуклеотидами, які містять три мутації, потомство рослин, які містять один або два полінуклеотиди, які містять першу та другу вищеописані мутації, піддають перехресному запиленню з третьою рослиною, яка містить третій полінуклеотид, який кодує одинично мутантний поліпептид AHASL. Третій одинично мутантний поліпептид AHASL містить різні заміщення по одній амінокислоті по відношенню до дикого типу поліпептиду AHASL, ніж перший та другий oдинично мутантні поліпептиди AHASL. Насіння або потомство рослин, яке містить один або кілька полінуклеотидів, які містять три мутації, вибирають як описано вище. Відібране потомство рослин має більшу толерантність до гербіцидів, ніж у варіанті комбінування трьох одинично мутантних поліпептидів AHASL у єдиній рослині. Нетрансгенні рослини, які містять потрійні або множинні мутації полінуклеотидів AHASL, можна отримати за способами іншими ніж вищеописане перехресне запилення, такими як, наприклад, in vivo мутагенез як описано вище, проте не обмежується ними. Множинні мутації можуть бути локалізовані у єдиному алелі або багатьох алелях рослинного геному. У одному варіанті здійснення рослини винаходу містять перший нуклеотид, який кодує перший одинично мутантний поліпептид AHASL, другий полінуклеотид, який кодує другий oдинично мутантний поліпептид AHASL, та третій полінуклеотид, який кодує третій одинично мутантний поліпептид AHASL. У іншому варіанті здійснення, рослини винаходу включають AHASL кодуючий полінуклеотид, який містить три мутації, де три нуклеотидні мутації приводять до амінокислотних мутацій, які відповідають мутаціям вказаних першого, другого та третього одинично мутантних поліпептидів AHASL. У ще одному варіанті здійснення, рослини винаходу включають AHASL кодуючий полінуклеотид, який містять одиничну мутацію, та полінуклеотид, який містить подвійні мутації, де нуклеотидні мутації приводять до амінокислотних мутацій, які відповідають мутаціям вказаних першого, другого та третього одинично мутантних поліпептидів AHASL, де вказані перший, другий та третій одинично мутантні поліпептиди AHASL вибирають з групи, яка складається з: поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або 17 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, аргінін у положенні, яке відповідає положенню 57 SEQ ID NO:1 та лейцин у положенні, яке відповідає положенню 398 SEQ ID NO:1 або положенню 366 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить лейцин у положенні, яке відповідає положенню 95 SEQ ID NO:1 або положенню 63 SEQ ID NO:2, глутамінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 416 SEQ ID NO:1 або положенню 384 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2, аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та будь-яку амінокислоту у положенні, яке відповідає положенню 574 SEQ ID NO:1 або положенню 542 SEQ ID NO:2. Альтернативно, рослини, які містять один або кілька полінуклеотидів, які кодують одинично мутантні поліпептиди AHASL, отримують шляхом трансформування рослини двома або кількома такими полінуклеотидами або трансформування першої рослини першим полінуклеотидом, який кодує перший одинично мутантний поліпептид AHASL, та перехресним запиленням першої рослини та другої рослини, яка містить другий полінуклеотид, який кодує другий одинично мутантний поліпептид AHASL. Друга рослина містить другий полінуклеотид, який містить другий oдинично мутантний поліпептид AHASL, який є ендогенним або введений шляхом трансформації. Перший та другий oдинично мутантні поліпептиди AHASL містять різні заміщення по єдиній амінокислоті по відношенню до дикого типу поліпептиду AHASL. Обов’язково, насіння або потомство рослин, які містить обидва перший та другий полінуклеотиди вибирають як описано вище. Ще один варіант здійснення винаходу стосується трансгенної рослини, трансформованої вектором експресії, який містить ізольований полінуклеотид, де ізольований полінуклеотид кодує потрійно мутантний поліпептид великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (AHASL), вибраний з групи, яка складається з: поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить валін, треонін, глутамін, цистеїн або метіонін у положенні, яке відповідає положенню 122 SEQ ID NO:1 або положенню 90 SEQ ID NO:2, аргінін у положенні, яке відповідає положенню 57 SEQ ID NO:1 та лейцин у положенні, яке відповідає положенню 398 SEQ ID NO:1 або положенню 366 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить глутамінову кислоту, ізолейцин, лейцин або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 124 SEQ ID NO:1 або положенню 92 SEQ ID NO:2, серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2 та аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, 18 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2; поліпептиду, який містить лейцин у положенні, яке відповідає положенню 95 SEQ ID NO:1 або положенню 63 SEQ ID NO:2, глутамінову кислоту у положенні, яке відповідає положенню 416 SEQ ID NO:1 або положенню 384 SEQ ID NO:2 та фенілаланін, аспарагін, треонін, гліцин, валін або триптофан у положенні, яке відповідає положенню 653 SEQ ID NO:1 або положенню 621 SEQ ID NO:2; та поліпептиду, який містить серин, аланін, глутамінову кислоту, лейцин, глутамін, аргінін, валін, триптофан, тирозин або ізолейцин у положенні, яке відповідає положенню 197 SEQ ID NO:1 або положенню 165 SEQ ID NO:2, аланін, глутамінову кислоту, серин, фенілаланін, треонін, аспарагінову кислоту, цистеїн або аспарагін у положенні, яке відповідає положенню 199 SEQ ID NO:1 або положенню 167 SEQ ID NO:2 та будь-яку амінокислоту у положенні, яке відповідає положенню 574 SEQ ID NO:1 або положенню 542 SEQ ID NO:2. Даний винахід забезпечує толерантні до гербіцидів рослини або резистентні до гербіцидів рослини, які містять толерантні до гербіцидів або резистентні до гербіцидів AHASL білки, які включають, проте не обмежуються одинично мутантними поліпептидами AHASL та подвійними та потрійними мутантними поліпептидами, які кодуються полінуклеотидами даного винаходу. Під терміном «толерантні до гербіцидів» або «резистентні до гербіцидів» мають на увазі, що рослина є толерантною або резистентною до щонайменше одного гербіциду у кількості, яка зазвичай знищує або пригнічує ріст нормальної рослини дикого типу. Під терміном "білок AHASL толерантний до гербіцидів" або "AHASL білок резистентний до гербіцидів", розуміють, що такий білок AHASL проявляє більшу AHAS активність, по відношенню до AHAS активності дикого типу білку AHASL, при наявності щонайменше одного гербіциду, що впливає на активність AHAS, та при концентрації або рівні гербіциду, який пригнічує AHAS активність дикого типу білку AHASL. Більш того, AHAS активність таких гербіцид-толерантних або гербіцид-резистентних AHASL білків у даному документі називається "гербіцид-толерантна" або "гербіцид-резистентна" AHAS активність. Для даного винаходу терміни "толерантний до гербіцидів" та "резистентний до гербіцидів" використовують взаємозамінно та мають однакове значення та об’єм поняття. Таким же чином терміни "толерантність до гебіцидів" та "резистентність до гербіцидів" використовують взаємозамінно та мають однакове значення та об’єм поняття. Таким же чином терміни "резистентний до імідазолінону" та "резистентність до імідазолінону" використовують взаємозамінно та мають однакове значення та об’єм поняття з термінами "толерантний до імідазолінону" та "толерантність до імідазолінону", відповідно. Винахід включає резистентні до гербіцидів AHASL полінуклеотиди та резистентні до гербіцидів AHASL білки. Термін "резистентний до гербіцидів полінуклеотид AHASL" означає полінуклеотид, який кодує білок, що має резистентну до гербіцидів AHAS активність. Термін "резистентний до гербіцидів білок AHASL" означає білок або поліпептид, який має резистентну до гербіцидів AHAS активність. Окрім цього, відомо, що толерантний до гербіцидів або резистентний до гербіцидів AHASL білок, можна вести в рослину шляхом трансформування рослини або її батьківської форми нуклеотидною послідовністю, яка кодує толерантний до гербіцидів або резистентний до гербіцидів AHASL білок. Такі толерантні до гербіцидів або резистентні до гербіцидів білки AHASL кодуються толерантними до гербіцидів або резистентними до гербіцидів полінуклеотидами AHASL. Альтернативно, толерантний до гербіцидів або резистентний до гербіцидів AHASL білок, такий як, наприклад, одинично мутантний поліпептид AHASL як описано у даному документі, може з’явитись у рослині шляхом природної появи або введеної мутації у ендогенному AHASL гені у геномі рослини або її потомства. Даний винахід стосується рослин, рослинних тканин, рослинних клітин та клітин хазяїв з підвищеною резистентністю або толерантністю до щонайменше одного гербіциду, зокрема імідазолінону або сульфонілсечовинного гербіциду. Переважна кількість або концентрація гербіциду є "ефективною кількістю" або "ефективною концентрацією." Термін "ефективна кількість" та "ефективна концентрація" означає кількість та концентрацію відповідно, яка є достатньою, щоб вбити або зупинити ріст подібної, дикого типу рослини, рослинної тканини, рослинної клітини або клітини хазяїна, проте вказана кількість не знищує або пригнічує так сильно ріст резистентних до гербіцидів рослин, рослинних тканин, рослинних клітин та клітин хазяїв даного винаходу. Зазвичай, ефективна кількість гербіциду є кількістю, яку зазвичай використовують у системах сільськогосподарського виробництва для знищення потрібних бур’янів. Така кількість є відомою фахівцям у галузі. Термін "подібна, дикого типу, рослина, рослинна тканина, рослинна клітина або клітина хазяїн" означає рослину, рослинну тканину, рослинну клітину або клітину хазяїна відповідно, які не є резистентними до гербіцидів та/або не містять певних полінуклеотидів винаходу, описаних 19 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у даному документі. Застосування терміну "дикий тип" тим не менш не означає, що рослина, рослинна тканина, рослинна клітина або клітина хазяїн не містять рекомбінантної ДНК у своєму геномі, та/або не мають резистентних до гербіцидів характеристик, які відрізняються від тих, що описані у даному документі. Як використано у даному документі, доки не вказано протилежне, термін «рослина» означає рослину на будь-якій стадії розвитку, також як будь-яку частину або частини рослини, які можуть бути приєднаними або відділеними від рослини. Такі частини рослини включають, проте не обмежуються органами, тканинами та клітинами рослини. Приклади певних частин рослини включають стебло, коріння, суцвіття, квітку, квітку в колосі, плід, плодоніжку, квітконіжку, тичинку, пильник, приймочку, маточку, зав’язь, пелюстку, чашолисток, плодолисток, кінчик коріння, корінний чехлик, корінні волоски, листові волоски, волоски насіння, пилкове зерно, мікроспору, сім’ядолю, гіпокотиль, епікотиль, ксилему, флоему, паренхіму, ендосперм, супровідні клітини, захисні клітини та будь-які інші відомі органи, тканини та клітини рослини. Більш того насіння розглядають як рослину. Рослини даного винаходу включають як нетрансгенні рослини, так і трансгенні рослини. Під терміном «нетрансгенні рослини» розуміють рослини, які не містять рекомбінантної ДНК у своєму геномі. Під "трансгенною рослиною" розуміють рослину, яка містить рекомбінантну ДНК у своєму геномі. Таку трансгенну рослину отримують шляхом введення рекомбінантної ДНК у геном рослини. Коли таку рекомбінантну ДНК вводять у геном трансгенної рослини, потомство рослини також може містити рекомбінантну ДНК. Потомство рослини, яке містить щонайменше частину рекомбінантної ДНК з щонайменше однієї батьківської рослини є також трансгенною рослиною. У певних варіантах здійснення, даний винахід включає резистентні до гербіцидів рослини, отримані за допомогою мутаційної селекції. Такі рослини включають полінуклеотид, який кодує одинично мутантний поліпептид великої субодиниці AHAS, та є толерантними до одного або кількох гербіцидів, які інгібують AHAS. Такі способи можуть включати, наприклад, піддавання рослин або насіння впливу мутагену, зокрема хімічного мутагена, такого як, наприклад, етилметансульфонату (EMS), та відбір рослин, які проявляють підвищену толерантність до щонайменше одного гербіциду, який інгібує AHAS, зокрема, імідазолінонового гербіциду або сульфонілсечовинного гербіциду. Однак, даний винахід не обмежується толерантними до гербіцидів рослинами, отриманими шляхом мутагенезу з використанням хімічного мутагену EMS. Будь-які відомі у галузі способи мутагенезу використовують для отримання резистентних до гербіцидів рослин даного винаходу. Такі способи мутагенезу можуть включати, наприклад, застосування одного або кількох наступних мутагенів: випромінювання, таке як рентгенівське випромінювання, гамма випромінювання (наприклад, кобальт 60 або цезій 137), нейтрони, (наприклад, продукт злиття ядер урану 235 у атомному реакторі), бета випромінювання (наприклад, що випромінюється радіоізотопами, такими як фосфор 32 або вуглець 14) та ультрафіолетове випромінювання (бажано від 2500 дo 2900 нм), та хімічні мутагени, такі як основні аналоги (наприклад, 5-бром-урацил), зв’язані сполуки (наприклад, 8-етокси кафеїн), антибіотики (наприклад, стрептонігрин), алкілувальні агенти (наприклад, сірчані іприти, азотні іприти, епоксиди, етиленаміни, сульфати, сульфонати, сульфони, лактони), азид, гідроксиламін, азотиста кислота або акридини. Резистентні до гербіцидів рослини також отримують шляхом застосування способів культивування тканин для відбору рослинних клітин, які містять резистентні до гербіцидів мутації, та потім генерування з них резистентних до гербіцидів рослин. Дивитись, наприклад, патенти США № 5,773,702 та 5,859,348, які обидва включені у даний документ як посилання. Подальші деталі мутаційної селекції наведено у “Principals of Cultivar Development” Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company опис якої наведено у даному документі як посилання. Даний винахід стосується способів підвищення толерантності або резистентності рослини, рослинної тканини, рослинної клітини або інших клітин хазяїв до щонайменше одного гербіциду, який впливає на активність ферменту AHAS. Переважно, таким гербіцидом є імідазоліноновий гербіцид, сульфонілсечовинний гербіцид, триазолопіримідиновий гербіцид, піримідинілоксибензоатний гербіцид, сульфоніламіно-карбонілтриазоліноновий гербіцид, або їх суміш. Більш переважно, таким гербіцидом є імідазоліноновий гербіцид, сульфонілсечовинний гербіцид або їх суміш. Для даного винаходу, імідазлінонові гербіциди включають, проте не обмежуються, PURSUIT® (імазетапір), CADRE® (імазапік), RAPTOR® (імазамокс), SCEPTER® (імазаквін), ASSERT® (імазетабенз), ARSENAL® (імазапір), похідним будь-якого з вищенаведених гербіцидів, та сумішшю двох або кількох з вищенаведених гербіцидів, наприклад, імазапір/імазамокс(ODYSSEY®). Більш особливо, імідазоліноновий гербіцид вибирають з, наступних сполук, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідіазолін-2-іл)-нікотинова 20 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислота, [2-(4-ізопропіл)-4-] [метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3-хінолінкарбонова] кислота, [5етил-2-(4-ізопропіл-] 4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинова кислота, 2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинова кислота, [2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-] імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинова кислота, та суміш метил [6-(4-ізопропіл-4-] метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-м-толуолу та метил [2-(4-ізопропіл-4-метил-5-] оксо-2-імідазолін-2-іл)-птолуолу, проте не обмежуються ними. Застосування 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо- 2імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти та [2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-]-іл)-5(метоксиметил)-нікотинової кислоти є бажаним. Особливо бажаним є застосування [2-(4ізопропіл-4-] метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти. Для даного винаходу, сульфонілсечовинні гербіциди включають, проте не обмежуються наступними сполуками: хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлорімурон етил, тіфенсульфурон метил, трібенурон метил, бенсульфурон метил, нікосульфурон, етаметсульфурон метил, рімсульфурон, трифлузульфурон метил, тріазульфурон, прімісульфуронметил, ціносульфурон, амідосульфурон, флузасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон етил, галосульфурон, азімсульфурон, циклосульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флупірсульфурон метил, форамсульфурон, йодосульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, похідні будь-якого з вищенаведених гербіцидів, та суміш двох або кількох з вищенаведених гербіцидів. Триазолопіримідинові гербіциди винаходу включають, проте не обмежуються наступними сполуками: клорансулам, діклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам та пеноксулам. Піримідинілоксибензоатні (або піримідиніл карбокси) гербіциди винаходу включають, проте не обмежуються наступними сполуками: біспірибак, піритіобак, піримінобак, пірибензоксим та пірифталід. Сульфоніламінокарбонілтриазолінонові гербіциди включають, проте не обмежуються, флукарбазоном та пропоксикарбазоном. Відомо, що піримідинілоксибензоатні гербіциди є тісно пов’язаними з піримідинілтіобензоатними гербіцидами та їх узагальнюють під останньою назвою асоціацією Weed Science Society of America. Відповідно, гербіциди даного винаходу також включають піримідинілтіобензоатні гербіциди, які включають, проте не обмежуються вищеописаними піримідинілоксибензоатними гербіцидами. Даний винахід стосується способів підвищення активності AHAS у рослин, які включають трансформацію рослини полінуклеотидним конструктом, який містить промотор функціонально зв’язаний з нуклеотидною послідовністю AHASL винаходу. Способи включають введення полінуклеотидного конструкту винаходу у щонайменше одну рослинну клітину та генерування рослини з неї. Способи включають застосування промотера, який стимулює експресію генів у рослинній клітині. Бажано, такий промотор є конститутивним промотором або тканиннобажаним промотором. Такі методи застосовують при покращенні або підвищенні резистентності рослин до щонайменше одного гербіциду, який впливає на активність ферменту AHAS, особливо імідазолінонового гербіциду. Даний винахід стосується полігенних експресуючих кластерів для експресії полінуклеотидів винаходу у рослинах, рослинних тканинах, рослинних клітинах та інших клітинах хазяїнах. Полігенні експресуючі кластери містять промотор, який експресується у рослині, рослинній тканині, рослинній клітині або інших клітинах хазяїнах функціонально зв’язані з полінуклеотидом винаходу, який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує або непроцесований (тобто, включаючи транзиторний пептид хлоропласту) або процесований білок AHASL (тобто, без транзиторного пептиду хлоропласту). Якщо експресія повинна здійснюватись у пластидах або хлоропластах рослин або рослинних клітин, полігенний експресуючий кластер може також включати функціонально зв’язану хлоропласт-спрямовуючу послідовність, яка кодує транзиторний пептид хлоропласту. Полігенні експресуючі кластери винаходу застосовують у способі покращення толерантності до гербіцидів рослин або клітин хазяїв. Спосіб включає трансформацію рослини або клітини хазяїна полігенним експресуючим кластером винаходу, де полігенний експресуючий кластер містить промотор, який експресується у певній рослині або клітині хазяїні, та промотор є функціонально зв’язаним з полінуклеотидом винаходу, який містить нуклеотидну послідовність, яка кодує резистентний до імідазолінону AHASL білок винаходу. Застосування терміну "полінуклеотидні конструкти" у даному документі не спрямовано на обмеження даного винаходу полінуклеотидним конструктом, який містить ДНК. Фахівці у галузі розуміють, що полінуклеотидні конструкти, особливо полінуклеотиди та олігонуклеотиди, які складаються з рібонуклеотидів та комбінацій рібонуклеотидів та деоксирибонуклеотидів також можна застосовувати у способах, описаних у даному документі. Таким чином, полінуклеотидні 21 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 конструкти даного винаходу включають всі полінуклеотидні конструкти, які можна застосовувати у способах даного винаходу для трансформації рослин, які включають, проте не обмежуються наступними, які складаються з: деоксирибонуклеотидів, рибонуклеотидів та їх комбінацій. Такі деоксирибонуклеотиди та рібонуклеотиди включають як природно присутні молекули, так і синтетичні аналоги. Полінуклеотидні конструкти винаходу також включають всі форми полінуклеотидних конструктів, які віключають, проте не обмежуються наступними: одноланцюгові форми, подвійно-ланцюгові форми, шпильки, стеблові-та-петльові структури тощо. Більш того, фахівцям у галузі зрозуміло, що кожна послідовность нуклеотидів, описана у даному документі, також включає комплемент наведеної нуклеотидної послідовності. Більш того, зрозуміло, що для експресії полінуклеотиду винаходу у певній клітині хазяїні, полінуклеотид є зазвичай функціонально зв’язаним з промотором, який стимулює експресію гену у певній клітині хазяїні. Способи винаходу для експресії полінуклеотидів у клітині хазяїні не залежить від певного промотору. Способи включають застосування будь-якого промотору, відомого у галузі, здатного стимулювати експресію гену у певній клітині хазяїні. Даний винахід включає молекули полінуклеотиду AHASL та їх фрагменти та варіанти. Молекули полінуклеотиду, які є фрагментами цих послідовностей нуклеотидів також є включеними у даний винахід. Під «фрагментом» розуміють частину нуклеотидної послідовності, яка кодує білок AHASL винаходу. Бажано, фрагмент нуклеотидної послідовності AHASL винаходу кодує біологічно активну частину білку AHASL. Біологічно активну частину білку AHASL одержують шляхом ізолювання частини однієї послідовності нуклеотидів AHASL винаходу, яка експресує кодовану частину білку AHASL (наприклад, шляхом рекомбінантної експресії in vitro), та оцінки активності кодованої частини білку AHASL. Молекули полінуклеотиду, які є фрагментами AHASL нуклеотидної послідовності та кодують біологічно активні частини білків AHASL, містять щонайменше приблизно 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 або 2000 нуклеотидів, або до кількості нуклеотидів, наявних у непроцесованій нуклеотидній послідовності, описаній у даному документі (наприклад, 2013 нуклеотидів для SEQ ID NO: 30) в залежності від застосування. Фрагмент нуклеотидної послідовності AHASL, який кодує біологічно активну частину білку AHASL винаходу, буде кодувати щонайменше приблизно 200, 300, 400, 500, 550, 650 або 650 суміжних амінокислот, або до загальної кількості амінокислот, наявних у непроцесованому білку AHASL винаходу (наприклад, 670 амінокислот для SEQ ID NO: 1). Молекули полінуклеотиду, які містять послідовності нуклеотидів, які є варіантами послідовності нуклеотидів, описаної у даному документі, також включені до даного винаходу. "Варіанти" послідовності нуклеотидів AHASL винаходу включають ті послідовності, які кодують мутантні поліпептиди AHASL, описані у даному документі, проте які консервативно відрізняються внаслідок виродженості генетичного коду. Ці природньо наявні алельні варіанти ідентифікують при застосуванні добре відомих технологій молекулярної біології, таких як полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та техніки гібридизації, описаних нижче. Варіант послідовності нуклеотидів також включає послідовності нуклеотидів синтетичного походження, отриманих, наприклад, шляхом сайт-спрямованого мутагенезу, проте які кодують AHASL білок, описаний у даному винаході, як вказано нижче. Зазвичай варіанти полінуклеотидної послідовності винаходу щонайменше приблизно на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% є ідентичними певній послідовності нуклеотидів, описаній у даному винаходу. Варіант полінуклеотидної послідовності AHASL кодує мутантний поліпептид AHASL, відповідно, який має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на приблизно 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% є ідентичною амінокислотній послідовності поліпептиду AHASL, описаного у даному винаході. Окрім цього, фахівці у галузі також визнають, що зміни можна здійснити шляхом мутацій у полінуклеотидних послідовностях винаходу, що призведе до змін у амінокислотній послідовності кодованих подвійних та потрійних мутантних поліпептидів AHASL, без зміни біологічної активності подвійних та потрійних мутантних поліпептидів. Таким чином, ізольована молекула полінуклеотиду, яка кодує подвійний та потрійний мутантний поліпептид AHASL, який містить послідовність, яка відрізняється від подвійних та потрійних мутантних послідовностей показана на Фігурах 1 та 2, отримують шляхом ведення одного або кількох нуклеотидних заміщень, додавань або делецій у відповідні нуклеотидні послідовності, описані у даному документі, таким чином що одне або кілька амінокислотних заміщень, додавань або делецій вводяться в кодований білок. Мутації здійснюють за стандартними технологіями, такими як сайт-спрямований мутагенез та ПЛР-опосередкований мутагенез. Такий варіант послідовності нуклеотидів є також включеним у даний винахід. Наприклад, бажано, консервативні амінокислотні заміщення здійснюють в одному або 22 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кількох прогнозованих, бажано неесенціальних амінокислотних залишках. «Неесенціальний» амінокислотний залишок є залишком, який може бути замінено у послідовності AHASL білку дикого типу (наприклад, послідовності SEQ ID NO: 1) без зміни біологічної активності, у той час як "есенціальний" амінокислотний залишок є потрібним для біологічної активності. "Заміщення консервативної амінокислоти" це, коли амінокислотний залишок замінюють амінокислотним залишком, який має однаковий боковий ланцюг. Родини амінокислотних залишків, які мають однакові бокові ланцюги, є відомими у галузі. Ці родини включають амінокислоти з основними боковими ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними боковими ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними боковими ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними боковими ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Такі заміщення не здійснюють щодо консервативних амінокислотних залишків, або щодо амінокислотних залишків, які входять у консервативний фрагмент. Білки винаходу можна змінювати різними шляхами, включаючи амінокислотні заміщення, делеції, процесінг та вставки. Способи для здійснення таких дій є добре відомими у галузі. Наприклад, варіанти амінокислотної послідовності AHASL білків отримують шляхом мутацій у ДНК. Способи мутагенезу та зміни нуклеотидних послідовностей є добре відомими у галузі. Дивитись, наприклад, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; U.S. Patent No. 4,873,192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) та посилання вказані у даному документі. Посібник відповідних заміщень амінокислот, які не впливають на біологічну активність білку, можна знайти у Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), включеному у даний документ як посилання. Консервативні заміни, такі як заміна одніє амінокислоти іншою, яка має такі ж властивості, є бажаними. Відомо, що молекули полінуклеотиду та поліпептиди винаходу включають молекули полінуклеотиду та поліпептиди, які містять нуклеотид або амінокислотну послідовність достатньо ідентичну подвійній або потрійній послідовності нуклеотидів, показаній на Фігурах 1 та 2, або амінокислотним послідовностям показаним на Фігурах 1 та 2. Термін "достатньо ідентичний" застосовують у даному документі по відношенню до першої амінокислоти або нуклеотидної послідовності, яка містить достатню або мінімальну кількість ідентичного або еквівалентного (наприклад, з однаковими боковими ланцюгами) амінокислотного залишку або нуклеотидів до другої амінокислоти або нуклеотидної послідовності, таким чином, що перша та друга амінокислота або послідовності нуклеотидів має загальний структурний домен та/або загальну функціональну активність. Наприклад, амінокислота або послідовність нуклеотидів, яка містить загальний структурний домен, який на щонайменше 80% ідентичний, бажано 85% ідентичний, більш бажано 90%, 95% або 98% ідентичний, розглядають у даному документі як достатньо ідентичні. Для визначення наявної ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїнових кислот, послідовності розташовують у рядок з метою порівняння. Для вимірювання проценту ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїнових кислот, послідовності розташовують у рядок з метою оптимального порівняння. Процент ідентичності між двома послідовностями є функцією кількості ідентичних позицій спільних для послідовностей (тобто, процент ідентичності дорівнює кількості ідентичних позицій/загальну кількість позицій (наприклад, позицій, що частково перетинаються) 100). У одному варіанті здійснення, дві послідовності мають однакову довжину. Процент ідентичності між двома послідовностями можна визначити використовуючи технології подібні до тих, що описані нижче, з врахуванням або без врахування гепів. При розрахунку процента ідентичності зазвичай підраховують певні сумісності. Визначення проценту ідентичності між двома послідовностями можна здійснити використовуючи математичний алгоритм. Бажаним необмеженим прикладом математичного алгоритму для порівняння двох послідовностей є алгоритм Karlin та Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, модифікований як у Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такий алгоритм є включеним у NBLAST та XBLAST програми Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. BLAST нуклеотидні дослідження здійснюють за програмою NBLAST, кількісний показник = 100, довжина слів = 12, для отримання послідовності нуклеотидів гомологічної до молекул полінуклеотиду винаходу. Дослідження білків BLAST здійснюють за програмою XBLAST, кількісний показник = 50, довжина слів = 3, для отримання амінокислотних 23 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей гомологічних білковим молекулам винаходу. Для отримання ліній гепів з метою порівняння використовують Gapped BLAST як описано у Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Альтернативно, PSI-Blast застосовують для здійснення повторного дослідження, яке визначає просторову взаємодію між молекулами. Дивитись, Altschul et al. (1997) supra. При застосуванні BLAST, Gapped BLAST та PSI-Blast програм, використовують параметри по замовченню відповідних програм (наприклад, XBLAST та NBLAST). Дивитись http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Іншим бажаним не обмежуючим прикладом математичного алгоритму, який використовують для порівняння послідовностей є алгоритм Myers та Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Такий алгоритм включено у програму ALIGN (версія 2.0), яка є частиною програмного забезпечення GCG sequence alignment. При застосуванні програми ALIGN для порівняння амінокислотних послідовностей застосовують таблицю PAM120 вагових залишків, штраф за довжину гепу 12, та штраф за пропуск у послідовності 4. Вирівнювання також здійснюють вручну шляхом перевірки. Доки не вказано протилежне значення ідентичності/подібності послідовностей, наведені у даному документі, стосуються значення, отриманого при використанні непроцесованих послідовностей винаходу та при використанні множинного вирівнювання за допомогою алгоритму Clustal W (Nucleic Acid Research, 22(22):4673-4680, 1994), використовуючи програму AlignX, яка є включеною у програмне забезпечення Vector NTI Suite Version 9 (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008), використовуючи параметри по замовчуванню, або будь-яку еквівалентну програму. Під "еквівалентною програмою" розуміють будь-яку програму порівняння послідовностей, яка для будь-яких двох послідовностей розробляє вирівнювання, яке містить ідентичні нуклеотидні або амінокислотні залишкові пари та однаковий процент ідентичності послідовності при порівнянні з відповідним вирівнюванням, розробленим AlignX у програмному забезпеченні Vector NTI Suite Version 9. Делеції, вставки та заміщення білкових послідовностей, включених у даний документ, не повинні внести радикальні зміни у властивості білку. Однак, коли важко передбачити заздалегідь певний вплив заміщення, делеції або вставки, фахівець оцінює вплив шляхом звичайного скринінгу. Тобто, активність можна оцінити шляхом дослідження активності AHAS. Дивитись, наприклад, Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171:173-179, включений у даному документі як посилання. Як описано у даному документі, полінуклеотиди винаходу застосовують для збільшення толерантності рослин до гербіцидів, які містять у своєму геномі ген, який кодує толерантний до гербіцидів AHASL білок. Такий ген може бути ендогенним геном або трансгеном. Додатково, у певних варіантах здійснення, полінуклеотиди даного винаходу з’єднані з будь-якою комбінацією потрібних полінуклеотидних послідовностей з метою створення рослин бажаного фенотипу. Наприклад, полінуклеотиди даного винаходу з’єднують з будь-якими іншими полінуклеотидами, які кодують поліпептиди, які проявляють пестицидну та/або інсектицидну активність, такі як, наприклад, білки токсину Bacillus thuringiensis (описані у патентах США № 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; та Geiser et al. (1986) Gene 48:109). Отримані комбінації також можуть включати численні копії будь-яких потрібних полінуклеотидів. У той час як полінуклеотиди винаходу застосовують як селективні маркери-гени для трансформації рослин, полігенні експресуючі кластери винаходу можуть містити інший селективний ген-маркер для селекції трансформованих клітин. Селективні гени-маркери, включаючи такі даного винаходу, застосовують для селекції трансформованих клітин або тканин. Гени-маркери включають, проте не обмежуються, генами, які кодують резистентність до антибіотиків, такими які кодують неоміцин фосфотрансферазу II (NEO) та гігроміцин фосфотрансферазу (HPT), також як гени, які забезпечують резистентність до гербіцидних сполук, таких як глюфозинат амонію, бромксиніл, імідазолінони та 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). Дивитись зазвичай, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:46474653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 24 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 ( Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Їх вміст наведено у даному документі як посилання. Вищенаведений перелік селективних генів-маркерів не є обмежуючим. У даному винаході можна використовувати будь-який селективний ген-маркер. Молекули ізольованого полінуклеотиду, які містять нуклеотидну послідовність, яка кодує AHASL білки винаходу, застосовують у векторах для трансформації рослин, таким чином, що створені рослини мають підвищену резистентність до гербіцидів, зокрема до імідазолінонового гербіциду або сульфонілсечовинного гербіциду. Молекули ізольованого AHASL полінуклеотиду винаходу можна застосовувати у векторах самих по собі або у комбінації з нуклеотидною послідовністю, яка кодує маленьку субодиницю (AHASS) ферменту AHAS, для забезпечення резистентності до гербіцидів у рослин. Дивитись патент США № 6,348,643; який включено у даний винахід як посилання. Винахід також стосується вектору експресії у рослинах, який містить промотор, що стимулює експресію у рослині функціонально зв’язаного з молекулою ізольованого полінуклеотиду винаходу. Молекула ізольованого полінуклеотиду містить нуклеотидну послідовність, яка кодує AHASL білок винаходу, або функціональний фрагмент та їх варіант. Вектор експресії у рослинах винаходу не залежить від певного промотору, тільки якщо такий промотор стимулює експресію гену у рослинній клітини. Бажані промотри включають конститутивні промотори та тканинобажані промотори. Вектори трансформації винаходу використовують для отримання рослин трансформованих потрібним геном. Вектор трансформації буде містити селективний ген-маркер винаходу та потрібний для введення ген, який типово експресується у трансформованій рослині. Такий селективний ген-маркер містить полінуклеотид винаходу, який кодує AHASL подвійний або потрійний мутантний поліпептид, де полінуклеотид є функціонально зв’язаним з промотором, який стимулює експресію у клітині хазяїні. Для застосування у рослинах та рослинних клітинах, вектор для трансформації містить селективний ген-маркер, який містить полінуклеотид винаходу, який кодує AHASL подвійний або потрійний мутантний поліпептид функціонально зв’язаний з промотором, який стимулює експресію у рослинній клітині. Вибір генів винаходу дуже залежить від потрібного результату. Наприклад, можуть бути потрібними різні зміни фенотипу, включаючи модифікацію жирнокислотної композиції у рослині, зміну амінокислотного вмісту у рослині та/або механізмів захисту від патогенів тощо. Таких результатів досягають шляхом експресії гетерологічних продуктів або підвищеної експресії ендогенних продуктів у рослині. Альтернативно, результати отримують шляхом зменшення експресії одного або кількох ендогенних продуктів, зокрема ферментів або кофакторів у рослині. Такі зміни приводять до зміни фенотипу трансформованої рослини. У одному варіанті здійснення винаходу, потрібні гени включають гени резистентності до комах, такі як, наприклад, гени Bacillus thuringiensis білку токсину (Патенти США № 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; та Geiser et al. (1986) Gene 48:109). AHASL білки або поліпептиди винаходу виділяють з, наприклад, рослин соняшника та застосовують у композиціях. Також молекулу ізольованого полінуклеотиду, яка кодує білок AHASL винаходу, використовують для експресії білку AHASL винаходу у мікроорганізмі, такому як E. coli або дріжджі. Експресований AHASL білок виділяють з екстрактів E. coli або дріжджів за способами відомими фахівцям у галузі. Полінуклеотиди винаходу застосовують у способах підвищення резистентності толерантних до гербіцидів рослин. У одному варіанті здійснення толерантні до гербіцидів рослини, які містять полінуклеотид винаходу, який кодує подвійний або потрійний поліпептид AHASL. Винахід також стосується толерантних до гербіцидів рослин, які містять два або більше полінуклеотидів, які кодують одинично мутантні поліпептиди AHASL. Полінуклеотиди, які кодують толерантні до гербіцидів білки AHASL та толерантні до гербіцидів рослини, які містять ендогенний ген, який кодує толерантний до гербіцидів білок AHASL, включають полінуклеотиди та рослини винаходу та ті, що відомі у галузі. Дивитись, наприклад, патенти США № 5,013,659, 5,731,180, 5,767,361, 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5,952,553 та 6,274,796; усі включені у даному документі як посилання. Такі способи збільшення резистентності толерантних до гербіцидів рослин включають трансформацію толерантної до гербіцидів рослини щонайменше одним полінуклеотидним конструктом, який містить промотор, який стимулює експресію у рослинній клітині, який є функціонально зв’язаним з полінуклеотидом винаходу. Багаточисельні вектори для трансформації рослин та способи для трансформації рослин є доступними. Дивитись, наприклад, An, G. et al. (1986) Plant Physiol., 81:301-305; Fry, J., et al. 25 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (1987) Plant cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.76:767-774; Hinchee, et al. (1990) Stadler. Genet. Symp.203212.203-212; Cousins, et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481494; Chee, P. P. and Slightom, J. L. (1992) Gene.118:255-260; Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir, et al. (1992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P:119-124; Davies, et al. (1993) Plant cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. and Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148; Franklin, C. I. and Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167; Golovkin, et al. (1993) Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant cell Rep. 13; Ayeres N. M. and Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant cell Rep. 13:582-586; Hartman, et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325; та Wan, Y. C. and Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748. Способи винаходу включають введення полінуклеотидного конструкту у рослину. Під "введенням" розуміють включення у рослину полінуклеотидного конструкту таким чином, що конструкт має доступ до середини рослинної клітини. Способи винаходу не залежать від певного способу введення полінуклеотидного конструкту у рослину, тільки коли полінуклеотидний конструкт має доступ до середини щонайменше однієї клітини рослини. Способи введення полінуклеотидних конструктів у рослини є відомими у галузі, та включають проте не обмежуються способами стабільної трансформації, способами короткочасної трансформації та вірус-опосередкованими способами. Під "стабільною трансформацією" розуміють, що полінуклеотидний конструкт, введений у рослину, вбудовується у геном рослини та успадковується її потомством. Під «короткочасною трансформацією» розуміють, що полінуклеотидний конструкт, введений у рослину, не вбудовується у геном рослини. Для трансформації рослин та рослинних клітин, послідовності нуклеотидів винаходу вводяться, використовуючи стандартні технології, у будь-який відомий у галузі вектор, який є придатним для експресії послідовності нуклеотидів у рослині або рослинній клітині. Вибір вектора залежить від бажаної технології трансформації та виду рослини, яку трансформують. У варіанті здійснення винаходу AHASL нуклеотидна послідовність є функціонально зв’язаною з рослинним промотором, який має високий рівень експресії у рослинній клітині, та цей конструкт потім вводять у рослину, чутливу до імідазолінoну або сульфонілсечовинного гербіциду, та отримують трансформовану рослину. Трансформована рослина є толерантною до впливу такої кількості імідазолінoнового або сульфонілсечовинного гербіциду, яка б вбила або значно пошкодила нетрансформовану рослину. Цей спосіб можна застосовувати до будь-якого виду рослин, однак, найбільш бажано його застосовувати до культурних рослин. Методології для конструювання полігенних експресуючих кластерів у рослині та введення чужорідних нуклеїнових кислот у рослину є загально відомими у галузі та раніше описаними. Наприклад, можна ввести чужерідну ДНК у рослину використовуючи пухлино-викликаючі (Ti) плазмідні вектори. Технології на основі агробактерій є відомими у галузі. Штам Agrobacterium (наприклад, Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes) містить плазміду (Ti або Ri плазміду) та елемент Т-ДНК, яка переноситься у рослину після зараження Agrobacterium. T-ДНК (трансформована ДНК) вбудовується у геном рослинної клітини. T-ДНК локалізується на Ri- або Ti-плазміді або окремо є включеною у так званий бінарний вектор. Описано способи для трансформації на основі агробактерій, наприклад, у Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229f. Трансформацію на основі агробактерій застосовують як до дводольних рослин, так і до однодольних. Трансформація рослин агробактеріями описана у White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; Vol. 1, Engineering and Utilization, під редакцією S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgene Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, під редакцією S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225. Інші способи, які застосовують для доставки чужерідної ДНК включають використання PEG-опосередкованої трансформації протопласту, електропорацію, мікроін’єкцій вусиками, та балістичну трансфекцію або балістичну трансфекцію для безпосереднього введення ДНК. Такі способи є відомими у галузі. (Патент США № 5,405,765 Vasil et al.; Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol. Gen. Genet., 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al. (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) 26 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Academic Press, Inc. (1988) and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). Спосіб трансформації залежить від рослинної клітини, яку трансформують, стабільності використовуваних векторів, рівня експресії продуктів генів та інших параметрів. Інші придатні способи введення послідовності нуклеотидів у рослинні клітини та наступне вбудовування у геном, включають мікроін'єкцію як описано Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334, електропорація, як описано Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, Agrobacterium-опосередковану трансформацію як описано Townsend et al. патент США № 5,563,055, Zhao et al. патент США № 5,981,840, пряму передача генів як описано Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722, та балістичне прискорення частинок як описано у, наприклад, Sanford et al. патент США № 4,945,050; Tomes et al. патент США № 5,879,918; Tomes et al. патент США № 5,886,244; Bidney et al. патент США № 5,932,782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cells, Tissue, і Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); та Lec1 трансформація (WO 00/28058). Також дивитись, Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (цибуля); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (соя); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (соя); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175182 (соя); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (соя); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (рис); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-309 (кукурудза); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (кукурудза); Tomes, U.S. Patent No. 5,240,855; Buising et al. U.S. Patent Nos. 5,322,783 and 5,324,646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cell via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, і Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (кукурудза); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (кукурудза); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (кукурудза); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al. U.S. Patent No. 5,736,369 (зернові); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (пилок); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (вусико-опосередкована трансформація); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (електропорація); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 and Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (рис); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (кукурудза за допомогою Agrobacterium tumefaciens); усі включені у даний документ як посилання. Полінуклеотиди винаходу можуть бути введеними у рослини шляхом взаємодії рослин з вірусами або вірусними нуклеїновими кислотами. Зазвичай, такі способи включають вбудовування полінуклеотидного конструкту винаходу у молекулу вірусної ДНК або РНК. Відомо, що AHASL білок винаходу може бути природно синтезований як частина вірусного поліпротеїну, який потім обробляється шляхом протеолізису in vivo або in vitro для отримання потрібного рекомбінантного білку. Окрім цього, відомо, що промотори винаходу також включають промотори, які використовують для транскрипції за допомогою вірусних РНКполімераз. Способи введення полінуклеотидних конструктів у рослину та експресії кодованого білку, включаючи молекули вірусних ДНК та РНК, є відомими у галузі. Дивитись, наприклад, патенти США № 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 та 5,316,931; включені у даний документ як посилання. Трансформовані клітини вирощують у рослинах звичайними шляхами. Дивитись, наприклад, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Ці рослини потім вирощують та запилюють або такою ж трансформованою породою або різними породами та ідентифікують отриманий гібрид, який має конститутивну експресію бажаних характеристик фенотипу. Два або більше поколінь вирощують, щоб впевнитись, що експресія потрібних характеристик фенотипу є стабільною та успадковується, та після цього саджають насіння, щоб впевнитись, що досягли експресії потрібних характеристик фенотипу. Таким чином, даний винахід стосується трансформованого насіння (яке також називають «трансгенне насіння»), яке містить полінуклеотидний конструкт винаходу, наприклад, полігенний експресуючий кластер винаходу, стабільно вбудований у його геном. Даний винахід можна використовувати для трансформації будь-якого виду рослин, включаючи, однодольні та дводольні, проте не обмежуються ними. Приклади бажаних видів рослин включають, проте не обмежуються наступними видами, зернові або кукурудза (Zea mays), Brassica sp. (наприклад, B. napus, B. rapa, B. juncea), особливо ті види Brassica, які є придатними як джерело насінної олії, люцерна (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), ріж (Secale 27 UA 104843 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 cereale), сорго (Сорго bicolor, Сорго vulgare), просо (наприклад, пурпурне просо (Pennisetum glaucum), просо (Panicum miliaceum), головчасте просо (Setaria italica), пальчикове просо (Eleusine coracana)), соняшник (Helianthus annuus), сафлор (Carthamus tinctorius), пшениця (Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. durum), соя (Glycine max), тютюн (Nicotiana tabacum), картопля (Solanum tuberosum), арахіс (Arachis hypogaea), бавовна (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), батат (Ipomoea batatus), маніока (Manihot esculenta), кава (Coffea spp.), кокос (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цитрусові (Citrus spp.), какао (Theobroma cacao), чай (Camellia sinensis), банан (Musa spp.), авокада (Persea americana), інжир (Ficus casica), гуава (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), олива (Olea europaea), папайя (Carica papaya), анакард (Anacardium occidentale), макадамія (Macadamia integrifolia), мигдаль (Prunus amygdalus), цукровий буряк (Beta vulgaris), цукрова тростина (Saccharum spp.), овес, ячмінь, овочі, декоративні рослини та хвойні. Бажано, рослини даного винаходу є культурними рослинами (наприклад, соняшник, Brassica sp., бавовна, цукровий буряк, соя, арахіс, люцерна, сафлор, тютюн, зерно, рис, пшениця, ріж, ячмінь, тритікале, сорго, просо тощо). Рослини винаходу є резистентними до гербіцидів та таким чином, застосовуються у способах боротьби з бур’янами, які включають нанесення гербіциду. Таким чином, даний винахід також стосується способу боротьби з бур’янами, які знаходяться поблизу резистентних до гербіцидів рослин винаходу. Спосіб включає нанесення ефективної кількості гербіциду на бур’яни та на резистентну до гербіцидів рослину, де рослина має підвищену резистентність до щонайменше одного AHAS-інгібувального гербіциду, зокрема імідазолінoнового або сульфонілсечовинного гербіциду, у порівнянні з рослиною дикого типу. У такому способі боротьби з бур’янами, резистентними до гербіцидів рослинами винаходу є культурні рослини, включаючи соняшник, люцерна, Brassica sp., соя, бавовна, сафлор, арахіс, тютюн, томати, картопля, пшениця, рис, кукурудза, сорго, ячмінь, ріж, просо та сорго, проте не обмежуються ними. Для отримання рослин з підвищеною резистентністю до гербіцидів, зокрема імідазолінoнових та сульфонілсечовинних гербіцидів, застосовують велику кількість композицій для захисту рослин від бур’янів, з метою покращення росту рослин та пониження конкуренції за споживні речовини. Гербіцид використовують самого по собі до сходження, після сходження, перед посадкою та при посадці для боротьби з бур’янами на площі, що оточує рослини, описані у даному документі, або композицію імідазолінонового гербіциду, яка містить інші добавки. Гербіцид також використовують для обробки насіння. Добавки, які додають до композицій імідазолінoнового або сульфонілсечовинного гербіциду, включають інші гербіциди, детергенти, ад’юванти, ліофілізуючі агенти, зв’язувачі, стабілізатори тощо. Композиція гербіциду може бути вологою або сухою та може включати розріджуючи порошки, емульгуючи концентрати та рідкі концентрати. Гербіцид та гербіцидні композиції наносять згідно з традиційними способами, наприклад, шляхом розпилювання, зрошення, посипання тощо. Даний винахід стосується нетрансгенних та трансгенних рослин та насіння з підвищеною толерантністю до щонайменше одного гербіциду, зокрема AHAS-інгібувального гербіциду, більш бажано імідазолінoнових та сульфонілсечовинних гербіцидів, найбільш бажано імідазолінонових гербіцидів. У переважному варіанті здійснення винаходу, рослини та насіння винаходу показують вищій рівень толерантності до гербіциду, ніж подібні рослини, які містять тільки один Одинично мутантний поліпептид AHASL. Такі рослини та насіння винаходу використовують у вдосконалених способах боротьби з бур’янами, які дозволяють нанесення гербіциду на бур’яни та на резистентні до гербіцидів рослини у ефективній кількості, який включає більшу концентрацію гербіциду, ніж яку можна використовувати на подібних рослинах, які містять тільки один AHASL одиничний мутантний поліпептид. Відповідно, такі вдосконалені способи показують гарні результати боротьби з бур’янами, у порівнянні з існуючими способами, в яких використовують рослини, які містять тільки один Одинично мутантний поліпептид AHASL та наносять меншу концентрацію або кількість гербіциду. Даний винахід стосується резистентних до гербіцидів рослин, які містять полінуклеотиди, які кодують AHASL подвійні або потрійні мутантні поліпептиди та резистентні до гербіцидів рослини, які містять два або більше полінуклеотиди, які кодують AHASL одинично мутантні поліпептиди. Ці резистентні до гербіцидів рослини даного винаходу застосовуються у способах одержання резистентних до гербіцидів рослин, за допомогою традиційного розмноження рослин, яке включає статеве розмноження. Способи включають перехресне запилення першої рослини, яка є резистентною до гербіцидів рослиною винаходу, другою рослиною, яка не є резистентною до гербіциду. Другою рослиною може бути будь-яка рослина, яка здатна утворити життєздатне потомство (наприклад, насіння), при запиленні першою рослиною. Зазвичай, проте не обов’язково, перша та друга рослини є рослинами одного виду. Способи можуть 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюAhas mutants
Автори російськоюMcelver, John, A., Singh, Bijay
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/82, A01H 5/00, C12N 9/88, A01H 5/10
Мітки: мутанти
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/154-104843-mutanti-ahas.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Мутанти ahas</a>
Мутанти fad-2 і високоолеїнові рослини
Номер патенту: 99099
Опубліковано: 25.07.2012
Автори: Деспегель Жан-П'єр, Граньєр Крістель
МПК: C12N 9/02, A01H 5/00, C12N 15/82
Мітки: fad-2, високоолеїнові, мутанти, рослини
Формула / Реферат:
1. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує білок дельта-12-олеатдесатуразу (FAD2), причому вказаний білок FAD2 має амінокислотну заміну в положенні, відповідному положенню 108 в білку FAD2 дикого типу, представленому SEQ ID NO: 4 або SEQ ID NO: 8.2. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD2, причому вказаний білок FAD2 має амінокислотну заміну в положенні, відповідному положенню 118 в білку FAD2 дикого типу,...
Резистентні до ahas гербіцидів рослини brassica
Номер патенту: 100122
Опубліковано: 26.11.2012
Автори: Мейлс Даріл, Яо Кенінг, Поттс Дерек
МПК: A01H 5/00, C12N 15/82
Мітки: резистентні, гербіцидів, рослини, brassica
Формула / Реферат:
1. Рослина роду Brassica, що містить:перший геном, який включає перший полінуклеотид AHASL, що кодує перший толерантний до гербіцидів поліпептид, який являє собою велику субодиницю синтази ацетогідроксикислот (AHASL), і другий геном, який включає другий полінуклеотид AHASL, що кодує другий толерантний до гербіцидів поліпептид AHASL, що має заміщення на аспарагін в положенні, яке відповідає положенню 653 в послідовності SEQ ID...
Теплостабільні мутанти ферментів біосинтезу крохмалю
Номер патенту: 84669
Опубліковано: 25.11.2008
Автори: Ханнан Кертіс Л., Берджер Браян, Грін Томас У.
МПК: C12N 15/82, C12N 9/14, A01H 5/00, C12N 15/29, C12N 15/55
Мітки: крохмалю, ферментів, мутанти, теплостабільні, біосинтезу
Формула / Реферат:
1. Полінуклеотид, що кодує мутантну велику субодиницю поліпептиду рослинної ендоспермної АДФ-глюкозопірофосфорилази або біологічно активний фрагмент згаданого мутантного поліпептиду, причому згаданий мутантний поліпептид включає амінокислотні мутації у двох або більше сайтах амінокислотної послідовності згаданого поліпептиду, та такий, що, коли згаданий мутантний поліпептид експресується з малою субодиницею АДФ-глюкозопірофосфорилази з...
Fad-2 мутанти і рослини з високим вмістом олеїнової кислоти
Номер патенту: 96442
Опубліковано: 10.11.2011
Автори: Ву Куншенг, Гуген Неллі, Деспегель Жан-П'єр
МПК: C12N 9/02, C12Q 1/68, A01H 5/02, C12N 15/82
Мітки: олеїнової, мутанти, високим, рослини, вмістом, кислоти, fad-2
Формула / Реферат:
1. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти, що містить послідовність SEQ ID NO: 1 або 5 з додатково видаленим нуклеотидом в положенні 215 або (варіантну) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD2, щонайменше на 80 % ідентичну SEQ ID NO: 1 або 5 з додатково видаленим нуклеотидом, що відповідає положенню 215.2. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, що містить послідовність SEQ ID NO: 9 з додатково видаленим...
Мутанти fgf21 та їх застосування
Номер патенту: 102395
Опубліковано: 10.07.2013
Автори: Хечт Ренді Іра, Ксу Йінг, Белоускі Едвард Джон, Майклс Марк Лео, Лі Юе-Шенг, Еллісон Мюріель Марі, Хамбургер Агнес Єва, Сун Чжонхун
МПК: A61K 38/18, C07K 14/50, A61P 3/00
Мітки: мутанти, fgf21, застосування
Формула / Реферат:
1. Виділений поліпептид, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4, де поліпептид містить а) аргініновий залишок в позиції 98 послідовності SEQ ID NO:4 і b) гліциновий залишок в позиції 171 послідовності SEQ ID NO:4.2. Виділений поліпептид за п. 1, який додатково містить мутацію в позиції 180.3. Злитий поліпептид, який містить поліпептид за п. 1, який є приєднаним до гетерологічного поліпептиду.4. Злитий...
Попередній патент: Ненативний глюкагоновий пептид
Наступний патент: Похідні 1,3-дигідроімідазол-2-тіону як інгібітори дофамін-бета-гідроксилази
Випадковий патент: Інтелектуальний багатоканальний сенсорний пристрій