Fad-2 мутанти і рослини з високим вмістом олеїнової кислоти

1. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти, що містить послідовність SEQ ID NO: 1 або 5 з додатково видаленим нуклеотидом в положенні 215 або (варіантну) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD2, щонайменше на 80 % ідентичну SEQ ID NO: 1 або 5 з додатково видаленим нуклеотидом, що відповідає положенню 215. 2. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, що містить послідовність SEQ ID NO: 9 з додатково видаленим нуклеотидом в положенні 1421 або (варіантну) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD2, щонайменше на 80 % ідентичну SEQ ID NO: 9 або 10 з додатково видаленим нуклеотидом, що відповідає положенню 1421. 3. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, що містить послідовність SEQ ID NO: 3, її комплементарну форму або форму її РНК. 4. Фрагмент щонайменше з 10 нуклеотидів ізольованої молекули нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-3, при цьому вказаний фрагмент містить мутантний кодон, отриманий в результаті вказаної делеції. 5. Вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-3. 6. Клітина-хазяїн, що містить послідовність нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-3 або вектор за п. 5. 2 (19) 1 3 96442 4 18. Рослина або частина рослини, або насіння, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка відповідає SEQ ID NO: 1 або 5 з додатково видаленим нуклеотидом в положенні 215, або варіантну послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD2, щонайменше на 80 % ідентичну SEQ ID NO: 1 або 5 з додатково видаленим нуклеотидом, що відповідає положенню 215, причому вказана рослина або частина рослини, або насіння додатково містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує другий білок FAD-2, який має амінокислотну заміну в положенні 118 або у відповідному йому положенні, в порівнянні з білком FAD2 дикого типу. 19. Рослина або частина рослини, або насіння за п. 18, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка відповідає SEQ ID NO: 9 з додатково видаленим нуклеотидом в положенні 1421, або варіантну послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD2, щонайменше на 80 % ідентичну SEQ ID NO: 9 або 10 з додатково видаленим нуклеотидом, що відповідає положенню 1421. 20. Рослина або частина рослини, або насіння за п. 18, в якій вказаною заміщеною амінокислотою в 118 положенні або у відповідному йому положенні є фенілаланін. 21. Рослина або частина рослини, або насіння за п. 18 або 20, в якій вказаний білок FAD2 дикого типу представлений амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 2 або 6. 22. Рослина або частина рослини, або насіння за будь-яким з пп. 18-21, що отримується в результаті обробки мутагеном, зокрема шляхом обробки EMS. 23. Насіння, отримане з рослини за будь-яким з пп. 7-9 і 18-22. 24. Потомство, отримане з рослини або частини рослини, або насіння за будь-яким з пп. 7-9 і 18-23. 25. Набір для аналізу, який включає перший контейнер, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-4. Даний винахід стосується рослин, насіння і продуктів, їх похідних, зокрема, рослин роду Brassica, продуктів насіння, отриманих з них, які мають мутантні послідовності, що додають олії з насіння високий профіль олеїнової кислоти. Більш конкретно, винахід стосується мутантних послідовностей дельта-12-десатурази жирних кислот, також позначеним в даній заявці як мутантні FAD2-послідовності в таких рослинах, які додають олії з насіння високий профіль олеїнової кислоти. Дельта-12-десатураза жирних кислот (також відома як олеїндесатураза або десатураза олеїнової кислоти) бере участь в ферментативному перетворенні олеїнової кислоти в ліноленову кислоту. Сорти з високим вмістом олеїнової кислоти (можливо в комбінації з низьким рівнем ліноленової кислоти) використовуються для багатьох різних додатків (для застосування в харчовій промисловості, застосування в охороні здоров'я, застосування як біодизельного палива і ін.). Раніше в літературі повідомлялося, що мутантне насіння, з якого отримують олію, з високим вмістом олеїнової кислоти (вміст олеїнової кислоти вище 70% ваги з розрахунку на загальну вагу присутніх в олії жирних кислот) мають недосгатню агрономічну цінність і/або погані характеристики кореневої системи і/або дуже низьку продуктивну здатність. Все ще існує потреба в матеріалі, що має стабільно високий вміст олеїнової кислоти (можливо в поєднанні зі стабільно низьким змістом ліноленової кислоти) на всій території його вирощування і протягом ряду років, а також з хорошими агрономічними характеристиками і з нормальною морфологією насіння олійної культури. Зокрема, рослини не повинні мати фасціації і повинні мати нормальний розвиток кореневої системи. Даний винахід стосується рослини або частини рослини, або насіння, що містить перший ген FAD2 і, можливо, другий ген FAD2, причому вказаний перший або вказаний другий ген FAD2 мають делецію в положенні 1421 і у відповідному йому положенні (що також позначається як DEL.1421) в порівнянні з геном FAD2 дикого типу, таким як ген FAD2 дикого типу з послідовністю SEQ ID NO 9. Іншим об'єктом даного винаходу є рослина або частина рослини, або насіння, що містить перший ген FAD-2, що має делецію в положенні 1421 або у відповідному йому положенні в порівнянні з геном FAD2 дикого типу, таким як ген FAD2 дикого типу з послідовністю SEQ ID NO 9, і другий ген FAD2, що кодує FAD-2-білок, що має заміну амінокислоти в положенні 118 або у відповідному йому положенні в порівнянні з білком FAD-2 дикого типу, таким як білок FAD-2 дикого типу з послідовністю SEQ ID NO 2 або 6. Рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом переважно містить послідовність нуклеїнової кислоти, відповідігу SEQ ID NO 1 або 5, в якій нуклеотид (С) в положенні 215 видалений, або утримуючу (варіантну) послідовність нуклеїнової кислоти, яка щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90% і, ще більш . переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентична SEQ ID NO 1 або 5, в якій нуклеотид, відповідний положенню 215, видалений. Рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом може містити (варіантну) послідовність нуклеїнової кислоти щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90% і ще більш переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичну SEQ ID NO 9, в якій нуклеотид, відповідний положенню 1421, видалений (тобто з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним 5 положенню 1421). Переважно, рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом містить послідовність нуклеїнової кислоти, відповідну SEQ ID NO 9, в якій нуклеотид в положенні 1421 видалений (тобто з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1421). Рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом може містити (різну) послідовність нуклеїнової кислоти, яка щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90% і ще більш переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентична SEQ ID NO 10, в якій нуклеотид, відповідний положенню 1453, видалений (тобто з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1453). Переважно, щоб рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом містило послідовність нуклеїнової кислоти, відповідну SEQ ID NO 10, в якій нуклеотид в положенні 1453 видалений (тобто з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1453). Переважна рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом додатково містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD-2, що має заміну амінокислоти в положенні 118 або у відповідному йому положенні в порівнянні з білком FAD-2 дикого типу, таким як білок FAD2 дикого типу з послідовністю SEQ ID NO 2 або 6. Переважно, вказаною заміщеною амінокислотою в положенні 118 або відповідному положенні є фенілаланін, Рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом може бути отримана за допомогою обробки мутагеном, зокрема, обробки етилметансульфонатом (EMS). Іншим об'єктом даного винаходу є ізольована молекула нуклеїнової кислоти, утримуюча (або що складається з) послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 1 або 5, в якій нуклеотид в положенні 215 видалений (тобто SEQ ID NO 1 або 5 з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 215). Об'єктом винаходу також є (варіантна) молекула нуклеїнової кислої и, що кодує білок FAD2 (або фрагмент вказаного білка), щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90% і, ще більш переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентична SEQ ID NO 1 або 5, в якої нуклеотид, відповідний положенню 215, видалений (тобто з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 215). Ізольована молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може містити (або складатися з) (варіантну) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD2 (або фрагмент), щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90% і, ще більш переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичну SEQ ID NO 9, в якій нуклеотид, відповідний положенню 1421, видалений (тобто з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1421). Переважно, щоб молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом містила (або складалася з) послідовності нуклеїнової кислоти 96442 6 SEQ ID NO 9, в якій нуклеотид в положенні 1421 видалений (тобто SEQ ID NO 9 з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1421). Ізольована молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може містити (або складатися з) (варіантну) послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD2 (або фрагмент), щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90% і, ще більш переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичну SEQ ID NO 10, в якій нуклеотид, відповідний положенню 1453, видалений (тобто з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1453). Переважно, щоб молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом містила (або складалася з) послідовності нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 10, в якій нуклеотид в положенні 1453 видалений (тобто SEQ ID NO 10 з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1453). Переважна молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом містить (складається з) послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 3, комплементарну їй форму або форму її РНК. Також об'єктом винаходу є фрагмент щонайменше з 10 нуклеотидів, переважно, щонайменше з 15, 20. 25, 30 або 40 нуклеотидів, більш переважно, щонайменше з 50 або 100 нуклеотидів ізольованої молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, причому вказаний фрагмент містить мутантний кодон, отриманий в результаті вказаної делеції. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб отримання ліній рослин з високим вмістом олеїнової кислоти, що включає в себе a) індукцію мутагенезу переважно за допомогою обробки EMS щонайменше в деяких клітинах рослини, зокрема, рослини роду Brassica, і переважно, сорту Brassica napus, в якої вміст олеїнової кислоти менше 70%; b) регенерацію рослини щонайменше з однієї вказаної мутантної клітини; c) селекцію регенерованих рослин, які мають послідовність нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, і d) отримання наступних поколінь рослин з вказаних регенерованих рослин. Вказані регенеровані рослини містять послідовність нуклеїнової кислоти, щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90% і, ще більш переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичну SEQ ID NO 9, в якій нуклеотид, відповідний положенню 1421, видалений (тобто з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1421), або послідовність нуклеїнової кислоти, щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90%, і ще більш переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичну SEQ ID NO 10, в якої нуклеотид, відповідний положенню 1453, видалений (тобто з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1453). 7 Переважно, щоб вказані регенеровані рослини містили послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 9, в якій нуклеотид 1421 видалений (тобто SEQ ID NO 9 з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1421), або послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 10, в якій нуклеотид 1453 видалений (тобто SEQ ID NO 10 з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 1453), або послідовність нуклеїнової кислоти SEQ TD NO 3. Більш переважно, щоб вказані регенеровані рослини додатково містили < послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD-2, що має заміну амінокислоти в положенні 118 або у відповідному йому положенні в порівнянні з ι білком FAD2 дикого типу, таким як білок FAD2 дикого типу SEQ ID NO 2 або 6. Переважно, щоб вказаною заміщеною амінокислотою в положенні 118 або у відповідному йому положенні був фенілаланін. Стадія с) може включати в себе будь-який спосіб, відомий в галузі техніки, з тим, щоб ідентифікувати вказану(і) мутацію(ії) (DEL.1421, DEL.1453, DEL.215, і можливо, SNP1590), зокрема, стадія с) може включати в себе застосування поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (RFLP). визначення поліморфізму шляхом випадкової ампліфікації (RAPD) або методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб отримання ліній рослин з високим вмістом олеїнової кислоти, що включає в себе і. схрещування першої рослини згідно з винаходом з другою рослиною, іі. отримання насіння після схрещування на стадії (а), ііі. вирощування фертильних рослин з такого насіння, iv. отримання насіння від потомства рослин на стадії (с) і ν. ідентифікацію серед потомства того насіння, яке володіє високим вмістом олеїнової кислоти. Стадія (ν) по ідентифікації вказаного насіння може включати в себе використання молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. Більш конкретно, стадія (ν) може включати в себе будь-який спосіб, відомий в даній галузі, з тим, щоб ідентифікувати вказану(і) мутацію(ії) згідно з винаходом, і, більш конкретно, стадія (ν) може включати в себе використання поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (RFLP), виявлення поліморфізму шляхом випадкової ампліфікації (RAPD) або метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Інший об'єкт даного винаходу стосується рослинної олії, отриманої з насіння згідно з винаходом, причому вказана олія містить більш ніж (приблизно) 72%, 75%, 80% або 85% олеїнової кислоти з розрахунку на загальну вагу присутніх у вказаній олії жирних кислот. Переважно, щоб рослинна олія згідно з винаходом додатково містила менше ніж (приблизно) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1% або 0,5% ліноленової кислоти. Фіг.1 відповідає списку послідовностей згідно з винаходом. 96442 8 Фіг.2 відповідає документам про депонування сортів MSP05, 28DHS.086 і MSP12. Даний винахід стосується рослин, зокрема, рослин роду Brassica, переважно, сортів Brassica napus, з яких отримують олію, що володіє вмістом олеїнової кислоти вище 70% по вазі з розрахунку на загальну вагу присутніх в олії жирних кислот. Більш конкретно, рослина згідно з винаходом містить щонайменше один мутантний ген FAD2 згідно з винаходом. Переважно, щоб вказаний мутантний ген FAD2 наділяв насіння вказаних рослин і олію, екстраговану з вказаного насіння, високим вмістом олеїнової кислоти (тобто коли вміст олеїнової кислоти вище 70% по вазі з розрахунку на загальну вагу присутніх в олії жирних кислот). Даний винахід стосується також будь-якої частини або будь-якого продукту вказаної рослини, що має щонайменше один мутантний ген FAD2. У контексті даного винаходу під частиною або продуктом рослини мають на увазі лист, сім'ядолю, стебло, черешок, насіння або будь-яку іншу тканину або фрагмент тканини вказаної рослини. Даний винахід стосується також будь-якого потомства вказаної рослини, що має щонайменше один мутантний ген FAD2 згідно з винаходом. У контексті даного винаходу термін "потомство" стосується прямих і непрямих нащадків, потомства і похідних рослини або рослин згідно з винаходом, і включає в себе перше, друге, третє і/або подальші покоління, які можуть бути отримані за допомогою самозапилення, схрещування з рослинами такого ж або відмінного генотипу і можуть бути модифіковані багатьма відповідними методами генної інженерії. Даний винахід стосується також вказаних мутантних генів FAD2, які, якщо присутні в рослині, наділяють насіння високим вмістом олеїнової кислоти. Зокрема, винахід стосується нових ізольованих молекул нуклеїнової кислоти, які відповідають новим варіантним формам генів FAD2 з делецією нуклеотиду в положенні 1421 або у відповідному йому положенні в порівнянні з геном FAD2 дикого типу, наприклад, геном FAD2 дикого типу, представленим послідовністю SEQ ID NO 9. Вказана делеція змінює функції продукту гена FAD2, за допомогою чого в рослині, в якій експресується мутантна послідовність(і), рівень олеїнової кислоти підвищується в порівнянні з відповідним рівнем в рослині, в якій експресується послідовність(і) дикого типу. Зокрема, молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може містити (або складатися з) нуклеотидної послідовності, яка щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90%, і ще більш переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентична будь-якій з SEQ ID NO 9 або її комплементарній формі або формі її РНК, в якій нуклеотид в положенні 1421 або у відповідному йому положенні видалений (тобто додатково видалений нуклеотид, відповідний положенню 1421). Молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, яка містить вказану делецію в положенні 9 1421 або у відповідному йому положенні (також що позначається як DEL.1421), може бути отримана з сортів Brassica napus, наприклад, з сортів CONTACT, CABRIOLET, 28DHS.086 і/або MSP12. Терміном "в положенні 1421" позначають нуклеотид в положенні 1421 в гені FAD2 дикого типу, представленому послідовністю SEQ ID NO 9, а також нуклеотид, відповідний вказаному положенню в гені дикого типу або варіантному гені, який буде мати відмінну послідовність нуклеїнової кислоти внаслідок делецій або додаткових нуклеотидів в послідовності. Термін "відповідний положенню" в даному описі означає, що положення визначене не тільки числом попередніх нуклеотидів. Положення даного нуклеотиду відповідно до даного винаходу може змінитися внаслідок делецій або додаткових нуклеотидів в послідовності нуклеїнової кислоти. Таким чином, під "відповідним положенням", відповідно до даного винаходу, потрібно мати на увазі, що нуклеотид, на який посилаються, може відрізнятися по вказаному номеру, але все ще має схожі сусідні нуклеотиди в лінійній послідовності. Наприклад, таким положенням є положення 1453 в SEQ ID NO 10 або положення 215 в SEQ ID NO 1 або 5. Так само термін "в положенні 118" потрібно розуміти як позначення положення амінокислоти 118 в білці FAD2 дикого типу, представленого послідовністю SEQ ID NO 2 або 6, а також як посилання на амінокислоту, відповідну вказаному положенню в білці дикого типу або варіантному білку FAD2, який буде мати відмінну амінокислотну послідовність внаслідок делецій або додаткових амінокислот в поліпептиді. Термін "відповідний положенню" в даному описі означає, що положення не тільки визначене числом попередніх амінокислот. Положення даної амінокислоти відповідно до даного винаходу може змінитися внаслідок делецій або додаткових амінокислот в поліпептиді. Таким чином, під "відповідним положенням" згідно з винаходом потрібно мати на увазі, що амінокислота(и), на яку(і) посилаються, може(можуть) відрізнятися по вказаному номеру, але все ще має(мають) схожі сусідні амінокислоти в лінійній послідовності. В іншому аспекті молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом кодує білок FAD2, в якому амінокислота в положенні 118 або у відповідному йому положенні замінена в порівнянні з білком FAD2 дикого типу, наприклад, білком FAD2 дикого типу, представленим послідовністю SEQ ID NO 2 або 6. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом містить щонайменше одну мутацію, причому вказана мутація призводить до вказаної заміни в положенні 118 або у відповідному йому положенні, переважно, заміні лейцину на триптофан, більш переважна заміна на фенілаланін, в порівнянні з білком FAD2 дикого типу, таким як білок FAD2 дикого типу, представлений послідовністю SEQ ID NO 2 або 6. Вказана мутація (мутації) змінює функціональні властивості отриманого продукту гена FAD2, за допомогою чого в рослині, в якій експресується(ються) мутантна(і) послідовність(і), змінюється 96442 10 рівень олеїнової кислоти, переважно, збільшується в порівнянні з відповідним рівнем в рослині, в якій експресується(ються) послідовність(і) дикого типу. Зокрема, молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом кодує білок FAD2, що має заміну лейцину в положенні 118 на фенілаланін, в порівнянні з білком FAD2 дикого типу, представленим амінокислотною послідовністю SEQ ID NO 6. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може містити (або складатися з) послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 1, 5, 9 або 10, в якій кодон, що кодує амінокислоту в положенні 118, має щонайменше одну мутацію, внаслідок чого кодує відмінну від лейцину амінокислоту і переважно кодує фенілаланін в положенні 118 згідно з білком FAD2 згідно з винаходом. Іншими словами, молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може містити (або складатися з) послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 1, 5, 9 або 10, яка додатково містить щонайменше одну мутацію в кодоні, що кодує амінокислоту в положенні 118, що кодує в результаті відмінну від лейцину амінокислоту і переважно кодуючу фенілаланін в положенні 118. Переважна молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом містить (або складається з) послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 7. В іншому аспекті молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може кодувати білок FAD2, що має делецію в положенні 118 відносно білка FAD2 дикого типу, наприклад, білка FAD2 дикого типу, представленого амінокислотною послідовністю SEQ ID NO 2 або 6. Більш конкретно, молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може кодувати білок FAD2, в якому в порівнянні з білком FAD2, представленим амінокислотною послідовністю SEQ ID NO 2 або 6, лейцин в положенні 118 видалений. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може містити (або складатися з) послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 або 10, в якій кодон, що кодує амінокислоту в положенні 118, видалений (тобто SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 або 10 з додатково видаленим кодоном, що кодує амінокислоту в положенні 118). Як буде очевидно для фахівців, послідовності нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 і 10 не є єдиними послідовностями, які можуть бути використані для отримання білка FAD2 згідно з винаходом. Також передбачаються будь-які молекули нуклеїнової кислоти, що мають різні послідовності, але які внаслідок виродженності генетичного коду кодують білок FAD2, що містить заміну амінокислоти в положенні 118 (або у відповідному йому положенні) в порівнянні з амінокислотною послідовністю дикого типу, такою як послідовність білка FAD2 дикого типу SEQ ID NO 2 або 6. Зокрема, молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може містити (або складатися з) нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90%, і ще більш переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентична будь-якій з SEQ ID NO 1, 5, 7, 9 і 10, або 11 їх комплементарній формі або формі їх РНК, що кодує білок FAD2, що має заміну амінокислоти в положенні 118 в порівнянні з білком FAD2 дикого типу. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, що має вказану мутацію(ії), що приводить до вказаної заміни амінокислоти в положенні 118, може бути отримана з сортів Brassica napus, таких як сорт 28DHS.086 і/або сорт MSP12. Зокрема, в молекулі нуклеїнової кислоти згідно з винаходом є мутація в положенні 1590 (що також позначається як SNP1590) послідовності нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 10, яка спричиняє зміну в генетичному кодоні з СТТ на ТТТ, що приводить до заміни амінокислоти в положенні 118 відносно амінокислотної послідовності дикого типу, такої як білок FAD2 дикого типу, представлений послідовністю SEQ ID NO 6. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, що містить вказану мутацію SNP1590, що приводить до заміни лейцину в положенні 118 на фенілаланін, змінює функціональні властивості отриманого продукту гена FAD2, за допомогою чого рівень олеїнової кислоти в рослині, в якій експресується мутантна послідовність, збільшений в порівнянні з відповідним рівнем в рослині, в якій експресується послідовність дикого типу. У рамках даного винаходу термін "SNP1590" стосується однонуклеотидного поліморфізму, відповідного вказаній мутації в положенні 1590 нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 10, і може також стосуватися відповідної мутації в будь-якій молекулі нуклеїнової кислоти, що кодує білок FAD2 згідно з винаходом із заміною амінокислоти в положенні 118 (або у відповідному 118 положенні) в порівнянні з білком FAD2 дикого типу, таким як білок FAD2 дикого типу, представленим послідовністю SEQ ID NO 2 або 6. Розглядається будь-який фрагмент молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом щонайменше з 10, 15, 20, 25, 50, 100 або більше нуклеотидів, що містить щонайменше одну мутацію, яка приводить до білка FAD2 згідно з винаходом. Зокрема, розглядається фрагмент молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом щонайменше з 10, 15, 20, 25, 50, 100 або більше нуклеотидів, що містить вказану делецію DEL1421, DEL1453 або DEL215 або вказаний SNP1590. Також розглядається фрагмент молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом щонайменше з 20, 25, 50, 100 або більше нуклеотидів, що включає вказану DEL 1421 і вказаний SNP1590. Такі фрагменти можуть бути використані як праймери, як зонди і/або як маркери. Фрагменти нуклеїнової кислоти згідно з винаходом можуть бути використані як маркери при генетичному картируванні в рослинах. Зокрема, фрагменти нуклеїнової кислоти згідно з винаходом можуть бути використані як маркери в програмах по селекції рослин. Такі маркери можуть включати в себе поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів (RFLP), виявлення поліморфізму шляхом випадкової ампліфікації (RAPD), полімеразну ланцюгову 96442 12 реакцію (ПЛР) або, наприклад, реплікацію послідовностей (3SR), що сама підтримується. Методики маркер-опосередкованої селекції можуть бути використані для ідентифікації і селекції рослин згідно з винаходом або їх потомства, що також є об'єктом винаходу, в процесі селекції. Методики маркер-опосередкованої селекції можуть бути використані в доповнення або як альтернатива іншим видам методів ідентифікації. Прикладом маркер-опосередкованої селекції є використання ПЛР-праймерів, які специфічно ампліфікують молекулу нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. Даний винахід, таким чином, пов'язаний зі способами аналізу сегрегації і селекції генетичних гібридів, що включає в себе рослини, які мають послідовності нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. Об'єктом даного винаходу також є молекула нуклеїнової кислоти щонайменше з 10 або 15 нуклеотидів, переважно, з 20, 25, 50, 100 або більше нуклеотидів, яка в жорстких умовах гібридизується з будь-якою послідовністю нуклеїнової кислоти SEQ ID NO 1, 3, 5, 7 і з 9 по 12, яка містить (або додатково містить) мутацію згідно з винаходом. Прикладом жорстких умов гібридизації є гібридизація приблизно при 50°С, або при приблизно 60°С або вище, і 0.1 × SSC (буфер 0,15 Μ NaCl, 0,015 Μ тринатрію цитрат). Спосіб згідно з винаходом може, наприклад, включати в себе визначення наявності в геномі конкретних алелів FAD2, що містять щонайменше вказану делецію в (або відповідному) положенні 1421 в порівнянні з геном FAD2 дикого типу, таким як ген FAD2 дикого типу, представлений послідовністю SEQ ID 9, і/або вказану заміну, SNP1590, (що приводить до заміни лейцину на фенілаланін) в (або відповідному) положенні 118 в порівнянні з білком FAD2 дикого типу, таким як білок FAD2 дикого типу SEQ ID NO 2 або 6. Таке визначення можна, наприклад, здійснити рядом методів, таких як ПЛР-ампліфікація, ДНК«фінгерпринт», РНК-«фінгерпринт», гель-блотинг і RFLP-аналіз, методи захисту від нуклеази, секвенування відповідного фрагмента нуклеїнової кислоти, отримання антитіл (моноклональних або поліклональних) або альтернативні методи, призначені для розрізнення білків, отриманих з використанням відповідних алелів від інших варіантних форм такого білка або від форми дикого типу. Зокрема, такі фрагменти можуть бути використані в способі маркер-опосередкованої селекції характеристик рослин з високим вмістом олеїнової кислоти, переважно для видів роду Brassica, більш конкретно, для сортів Brassica napus. Інший аспект даного винаходу стосується рекомбінантної нуклеотидної послідовності, що містить одну або декілька суміжних регуляторних послідовностей, функціонально пов'язаних з нуклеотидною послідовністю згідно з винаходом. Вказана суміжна регуляторна послідовність переважно походить з відповідних організмів. Однак вказані суміжні регуляторні послідовності можуть також походити з не відповідних організмів. 13 Вказані суміжні регуляторні послідовності є певними послідовностями, такими як промотори, енхансери, послідовності сигналу секреції і/або термінатори. Інший аспект винаходу стосується вектора, що містить молекулу нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, можливо, функціонально пов'язану з однією або декількома суміжними регуляторними послідовностями, що походять з відповідного або з не відповідного організмів. У контексті даного винаходу "вектор" визначений як будь-який біохімічний конструкт, який може бути використаний для введення нуклеотидної послідовності (за допомогою трансдукції, трансфекції, трансформації, інфекції, кон'югації і т.д.) в клітину. Переважно вектор згідно з винаходом вибраний з групи, що складається з плазмід (включаючи плазмиди, що реплікуються і інтегруються ), вірусів, фагмід, хромосом, транспозонів, ліпосом, катіонних пухирців або їх суміші. Вказаний вектор може вже містити одну або більше суміжних регуляторних послідовностей, що забезпечують експресію вказаної молекули нуклеїнової кислоти і її транскрипцію в поліпептид згідно з винаходом. Даний винахід охоплює також будь-який пептид, який все ще володіє дельта-12олеїндесатуразною активністю, отриманий внаслідок експресії нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, що містить вказану делецію (DEL 1421, DEL 1453 або DEL215), як, наприклад, пептид SEQ ID NO 4. Молекули нуклеїнової кислоти, рекомбінантні молекули нуклеїнової кислоти і/або вектори згідно з винаходом є відповідними для трансформації рослин-мішеней і, таким чином, наділяють рослину, в якій експресується мутантний FAD2 згідно з винаходом, зміненим продуктом гена FAD2, внаслідок чого рівень олеїнової кислоти змінюється, переважно, зростає, в порівнянні з відповідним рівнем в рослині, в якій експресується послідовність дикого типу. Даний винахід стосується також трансформованої клітини-хазяїна або рекомбінантної клітинихазяїна, що містить (або в яку включена) одну або декілька нуклеотидних послідовностей і/або векторів згідно з винаходом, що має делецію 1421. У контексті даного винаходу "трансформована клітина-хазяїн" або "рекомбінантна клітина", яка також називається "трансформантом", є клітиною, що містить одну або декілька нуклеотидних послідовностей і/або векторів згідно з винаходом. Трансформована клітина-хазяїн може бути клітиною, в якій вказаний вектор(и) і/або вказана нуклеотидна послідовність(і) введені за допомогою генетичної трансформації, переважно за допомогою гомологічної рекомбінації або за допомогою будь-яких інших відомих способів, що застосовуються при отриманні рекомбінантного організму. Будь-який спосіб, за допомогою якого нова послідовність може бути включена в геном хазяїна, розглядається в даному винаході. Зокрема, будь-який спосіб, за допомогою якого нова послідовність може бути включена в геном 96442 14 хазяїна і стабільно успадкована його потомством, розглядається в даному винаході. У цей час існує широкий діапазон методів для досягнення прямої або непрямої трансформації вищих рослин екзогенної ДНК. Трансформація рослинних клітин може бути зроблена з використанням векторів. У загальноприйнятій методиці досягнення трансформації використовують Agrobacterium tumefaciens для введення чужорідного гена в рослинну клітинумішень. Віруси рослин також є можливим засобом для перенесення екзогенної ДНК. Може бути використане також пряме захоплення рослинною клітиною. Як правило, протопласти рослини-мішені вміщують в культуру в присутності молекул нуклеїнової кислоти, які будуть перенесені, і речовини, яка забезпечує поглинання протопластом вказаних молекул нуклеїнової кислоти. Корисними речовинами в цьому відношенні є поліетиленгліколь або фосфат кальцію. Як альтернатива поглинання молекул нуклеїнової кислоти може стимулюватися шляхом електропорації. У цьому способі для тимчасового відкриття пор в мембрані протопласта клітини використовується електричний імпульс, і вказані молекули нуклеїнової кислоти з навколишнього розчину надходять в клітину через пори. Точно також для доставки вказаних молекул нуклеїнової кислоти безпосередньо в клітину, і переважно, безпосередньо в ядро клітини, можна використати мікроін'єктування. У цих методах трансформація відбувається в рослинній клітині в культурі. Після етапу трансформації рослинні клітини можуть бути регенеровані в цілі рослини. Відомі методи для регенерації зрілих рослин з калюсу або культури протопласта. Також доступні додаткові способи, які не обов'язково вимагають використання ізольованих клітин і, відповідно, способів регенерації рослин для досягнення трансформації. Такі способи звичайно позначаються як "балістичні", або способи "прискорення частинок", в яких частинки металу, покриті молекулами нуклеїнової кислоти, доставляються в рослинні клітини за допомогою або заряду пороху, або електричного розряду. Таким же чином рослинні клітини в культурі або репродуктивна система рослини, або клітини, наприклад, пилок, можуть бути стійко трансформовані представляючими інтерес молекулами нуклеїнової кислоти. Даний винахід може бути використаний для трансформації фактично будь-якого типу рослин, однодольних рослин або дводольних рослин. Відповідні рослини, які мають бути трансформовані, є переважно олійними культурами, такими як соняшник, соя, бавовна, зернові і т.д., переважно, роду Brassica, більш переважно, сорти Brassica napus. Даний винахід стосується рослини або частини рослини, або насіння, що містить перший ген FAD2 і, можливо, другий ген FAD2, причому вказаний перший або вказаний другий ген FAD2 мають 15 вказану делецію (DEL.1421, DEL.1453 або DEL.215). Зокрема, рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом містить перший ген FAD2 і, можливо, другий ген FAD2, причому вказаний перший або вказаний другий ген FAD2 має делецію в положенні 1421 або у відповідному йому положенні (що позначається також DEL.1421) в порівнянні з геном FAD2 дикого типу, таким як ген FAD2 дикого типу з послідовністю SEQ ID NO 9. Переважно, рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом містить перший ген FAD-2, що має делецію в положенні 1421 або у відповідному йому положенні в порівнянні з геном FAD2 дикого типу, таким як ген FAD2 дикого типу з SEQ ID NO 9, і другий ген FAD2, що кодує білок FAD-2, який має заміну амінокислоти в положенні 118 або відповідному положенні в порівнянні з білком FAD-2 дикого типу, таким як білок FAD-2 дикого типу з SEQ ID NO 2 або 6. Зокрема, рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом переважно містить послідовність нуклеїнової кислоти, відповідної SEQ NO 1 або 5, в якій нуклеотид (С) в положенні 215 видалений (тобто відповідна SEQ ID NO 1 або 5 з додатково видаленим нуклеотид ом в положенні 215), або містить (варіантну) послідовність нуклеїнової кислоти, щонайменше на 80%, переважно, щонайменше на 85%, більш переважно, щонайменше на 90%, і ще більш переважно, щонайменше на 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичну SEQ ID NO 1 або 5, в якій нуклеотид, відповідний положенню 215, видалений (тобто з SEQ ID NO 1 або 5 з додатково видаленим нуклеотидом, відповідним положенню 215). Прикладами таких рослин є сорти CONTACT і CABRIOLET, які є зареєстрованими сортами. Переважна рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом додатково містить послідовність нуклеїнової кислоти, кодуючої FAD-2 білок, що має заміну амінокислоти в положенні 118 або у відповідному йому положенні в порівнянні з білком FAD-2 дикого типу, таким як білок FAD2 дикого типу з SEQ ID NO 2 або 6. Переважно, щоб вказаною заміщеною амінокислотою в положенні 118 або у відповідному йому положенні був фенілаланін. Прикладами таких рослин є сорти 28DHS.086 і MSP12. Сорт MSP05 зареєстрований згідно з Будапештським Договором про Міжнародне Визнання Депонування Мікроорганізмів для Патентної Процедури під інвентарним номером NCIMB 41233, привласненим 9 липня 2004 року. Сорт 28DHS.086 зареєстрований згідно з Будапештським Договором про Міжнародне Визнання Депонування Мікроорганізмів для Патентної Процедури під інвентарним номером NCIMB 41365, привласненим 22 грудня 2005 року. Сорт MSP12 зареєстрований згідно з Будапештським Договором про Міжнародне Визнання Депонування Мікроорганізмів для Патентної Процедури під інвентарним номером NCIMB 41374, привласненим 10 лютого 2006 року. 96442 16 Мутантна рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом виявляє несподівану перевагу в розвитку хорошої кореневої системи. Більш конкретно, належачи до мутантного сорту Brassica napus згідно з винаходом, основний корінь і вторинна коренева система мають довжину, порівнянну (схожу) з довжиною основного кореня і вторинної кореневої системи сортів дикого типу. Для порівняння, мутантний Brassica napus, отриманий способом, описаним в WO98/56239, має основний корінь набагато менший, ніж у особня дикого типу, і його вторинна коренева система істотно ослаблена. Рослина або частина рослини, або насіння згідно з винаходом може бути отримана шляхом обробки мутагеном, більш переважно, шляхом обробки етилметансульфонатом (EMS). Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб отримання ліній рослин з високим вмістом олеїнової кислоти, що включає в себе (а) схрещування першої рослини з другою рослиною, що має щонайменше один ген FAD2, що містить вказану делецію згідно з винаходом, (b) отримання насіння від гібридів на стадії (а), (с) вирощування фертильних рослин з такого насіння; (d) отримання насіння потомства від рослин зі стадії (с), і (e) ідентифікацію такого насіння серед потомства, яке володіє високим вмістом олеїнової кислоти. У вказаному способі отримання ліній рослин з високим вмістом олеїнової кислоти вказана друга рослина переважно має другий мутантний ген FAD2, що містить мутацію SNP1590. В іншому аспекті винахід пов'язаний зі способом збільшення вмісту олеїнової кислоти в рослинах, більш конкретно, в рослинах роду Brassica, і переважно, в рослинах Brassica napus, що включає в себе наступні стадії: (а) індукцію мутагенезу щонайменше в декількох клітинах рослини, більш конкретно, рослини роду Brassica, і переважно, рослини Brassica napus, в якій вміст олеїнової кислоти складає менше 70%; (b) регенерацію рослини щонайменше з однієї вказаної мутантної клітини; (c) селекцію регенерованих рослин, які мають послідовність нуклеїнової кислоти згідно з винаходом і/або якими експресують білок FAD2 згідно з винаходом; і (d) отримання наступних поколінь рослин з вказаних регенерованих рослин. Переважно, з насіння вказаних рослин отримують олію, що має вміст олеїнової кислоти більше ніж 70 ваг.%, більш переважно, більше ніж 75 ваг.% з розрахунку на загальну вагу присутніх в олії жирних кислот. Іншим об'єктом даного винаходу є рослинна олія, отримана щонайменше з однієї рослини згідно з винаходом, причому ця рослинна олія містить більш ніж (приблизно) 70%, 72%, 75%, 80% або 85% олеїнової кислоти. Більш конкретно, рослинна олія згідно з винаходом, переважно, отримана щонайменше з одного сорту роду Brassica згідно з винаходом, більш переважно, щонайменше з одного сорту Brassica napus згідно з винаходом, містить більше ніж (при 17 близно) 70%, 72%, 75%, 80% або 85% олеїнової кислоти. Вказана олія додатково містить менше ніж (приблизно) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1% або 0,5% ліноленової кислоти відносно загальної ваги присутніх в олії жирних кислот. Переважно, щоб вказана олія містила більше ніж (приблизно) 70%, 72%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% або 90%, переважно, від (приблизно) 70% до (приблизно) 90%, більш переважно, від (приблизно) 72% до (приблизно) 89% олеїнової кислоти. Вказана олія додатково містить менше ніж (приблизно) 4%, 3,5%, 3%, 2%, 1% або 0,5%, переважно, від (приблизно) 4% до (приблизно) 0,4% ліноленової кислоти відносно загальної маси жирних кислот, присутніх в олії. Згідно з переважним варіантом здійснення, два подвійних низьких озимих сорти рапсу (ENVOL і LIBERATOR) були оброблені етилметансульфонатом (EMS) в 1992 році. Обробку EMS в концентрації 2,5% і 5% проводили протягом 4 годин або 8 годин. Покоління МІ вирощували в оранжереї після 8 тижнів яровізації в камері зростання і потім збирали в липні 93. Насіння M1 було висіяне в полі у вересні 93, накрито мішечками на початку цвітіння, і насіння М2 було зібране в липні 94. Насіння М2 було висіяне у вересні 94, накрито мішечками на початку цвітіння, і насіння М3 було зібране в липні 95. Далі потомства аналізували на предмет визначення складу жирних кислот, використовуючи аналітичний метод на основі газової хроматографії, який є загальновідомим в даній галузі. Всі потомства із вмістом олеїнової кислоти вище 68% були збережені. Відібране потомство повторно висівали в полі у вересні 1995, накривали мішечками в квітні, потім збирали в липні 1996. На цій стадії потомство піддавали скринінгу на предмет визначення хороших агрономічних і морфологічних характеристик, таких як хороша схожість насіння, хороша осіння ростова здатність, хороша зимостійкість, хороша коренева система, хороша резистентність до фомозу і плямистості листя на світлі, а також чудова стійкість до вилягання. Матеріал, який був дуже високий і дуже пізно сходив, був усунений, також як і матеріал, який утворював сильну фасціацію. Аналіз потомства, що залишилося, методом газової хроматографії був знов проведений для селекції особнів з рівнями олеїнової кислоти вище 68%. Всі такі особні були висаджені в полі у вересні 1996-1997. Потомство під назвою MUT 152-96 виглядало особливо цікавим внаслідок агрономічних і морфологічних характеристик, а також за вмістом в ньому олеїнової кислоти. Це потомство вирощували в ізоляції протягом вегетаційного періоду у вересні 1996-1997. Найбільш цікаві з нащадків [MUT 152-96] за агрономічними і морфологічними характеристиками були відібрані для подальшого розфасування і схрещування. Схрещування проводи 96442 18 ли з озимими олійними сортами рапсу, що мають звичайно в два рази більш низький профіль жирних кислот (тобто вміст олеїнової кислоти нижче 70%) або з низьким вмістом ліноленової кислоти (тобто менш, ніж приблизно 3,5%), для виведення ліній з високим вмістом олеїнової кислоти в поєднанні з низьким вмістом ліноленової кислоти (HOLL). Матеріал піддавали внутрішньородовому схрещуванню, самозапиленню щонайменше до покоління F7. До всіх поколінь застосовували сильний тиск відбору проти фасціацій і у бік нормального розвитку рослини і нормальної кореневої системи. Склад жирних кислот перевіряли в кожному поколінні, і залишали тільки матеріал із вмістом олеїнової кислоти вище 75% і вмістом ліноленової кислоти нижче 3,5%. Таким способом були отримані різні сорти HOLL, такі, наприклад, як MSP05. І за допомогою схрещування сорту MSP05 і сорту CABRIOLET був отриманий сорт 28DHS.086. MSP12 був отриманий за допомогою такого ж способу розмноження, що і MSP05, але як початковий батько, замість батьків, що мають звичайний профіль жирних кислот, був використаний CONTACT. Використаними в цій роботі сортами, у яких звичайні профілі жирних кислот вдвічі нижче були BRISTOL, CAPITOL, CAPVERT, VIVOL і CAIMAN, і ці сорти розмножували або підтримували, використовуючи таку ж схему підтримки, як описано в даному описі вище для ліній HOLL (відповідно до технічних правил, виданих "GNIS" і відредагованими SEDIS, наприклад, дивіться випуск 2003, видання 1, pp.135-147, які стосуються злакових рослин). Для визначення вмісту жирних кислот у випробуваннях - невеликих дослідницьких випробу2 ваннях (6-12 м ) або випробуваннях на етапі роз2 робки (500 м ) і для роботи з секвенування використали елітне насіння. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Насіння перемелювали в першому розчині, що складається з метанолу (800 мл), триметилпентану (200 мл) і 5 г NaOH. Приблизно на 10 г насіння використали приблизно 3 мл розчину (іншими словами, приблизно 10-50 насіння на 1 мл розчину). Екстракцію проводили протягом 20 хвилин, і після цього додавали другий розчин, що складається з триметиламіну (900 мл) і пропанолу-2 (100 мл), в такому ж об'ємі, як і перший розчин. Отриманий розчин перемішували на вортексі і залишали відстоюватися до утворення верхньої фази. Верхню фазу відбирали і переносили в пробірки. Один мікролітр отриманого розчину вносили в газовий хроматограф (Fisons від thermo-electron з колонкою DB3-30 метрів з діаметром 0,25 мм і товщиною 25 мікрометрів). Тривалість вимірювання складала приблизно 4 хвилини. Результати за вмістом олеїнової кислоти коротко викладені в таблиці 1. 19 96442 Таблиця 1 Сорти CONTACT CABRIOLET 28DHS086 MSP12 MSP05 BRISTOL VIVOL CAPVERT CAIMAN CAPITOL Вміст олеїнової кислоти (ваг.%) 71,8-75,2 73,2-76,8 80,3-83,1 80,3-83,5 78,1-81,9 61,4-65,7 60.8-63,2 58,9-65,9 61,9-64,0 59,7-64,6 Оцінка Високий Високий Дуже високий Дуже високий Дуже високий Нормальний Нормальний Нормальний Нормальний Нормальний Вміст олеїнової кислоти з розрахунку на загальну масу жирних кислот, присутніх в екстрагованій олії. Приклад 2 Матеріали рослин, використані для секвенування: - мутантні лінії з більш високим вмістом олеїнової жирної кислоти: CONTACT, CABRIOLET і 28DHS.086; і - сорти дикого типу з нормальним вмістом олеїнової кислоти: Bristol, Capitol, Vivol, Capvert i Caiman. Всі ці лінії вирощували в камері зростання, і у 7-денних рослин збирали сім'ядолі і стебла. Рослинні тканини ліофілізували і використовували для екстракції ДНК. ДНК виділяли за допомогою наборів Qiagen Plant DNA (Qiagen INC.-USA, Valencia CA). ПЛР виконували по протоколу TaqGold (AB Biosystem, Inc,). Реакційна суміш містила 2,5 мкл 10× буфера, 0,2 мкл TaqGold, 0,2 мкл dNTP (25 мМ), 2 мкл праймерів (5 мкМ) і 10 мкл ДНК матриці (2 нг/мкл) і 10,1 мкл Н2О. Цикли ПЛР були наступні: 94°С 5 хвилин; 8 циклів 94°С 40 секунд, 62°С 40 секунд, 72°С 1 хвилина, 94°С 40 секунд, 60°С 40 секунд, 72°С 1 хвилина, 94°С 40 секунд, 58°С 40 секунд, 72°С 1 хвилина, 94°С 40 секунд, 56°С 40 секунд, 72°С 1 хвилина; 3 циклу 94°С 40 секунд, 55°С 40 секунд, 72°С 1 хвилина; затримка на 72°С протягом 7 хвилин. Продукти ПЛР аналізували на 1% агарозному гелі. Для секвенування 5 мкл продуктів ПЛР і 1 мкл екзонуклеази І (розведення 1:50) і 1 мкл лужної фосфатази креветок (розведення 1:5) переносили в нову пробірку. Суміш інкубували при 37°С протягом 20 хвилин і потім при 80°С протягом 15 хвилин для інактивації ферментів. Додавали 40 мкл Н2О, і 6 мкл використовували як матрицю з 1 мкл праймеру для секвенування. Секвенування виконували на аналізаторі ДНК 3730 DNA Analyzer (що поставляється компанією Biosystems). Послідовності збирали і вирівнювали, використовуючи програму SeqMan II від LaserGene (DNASTAR, INC, Madison. WI). 20 Приклад 3 Чотири послідовності гена дельта-12олеїндесатурази (FAD2) Brassica napus, 4684997, 46399190, 8705228 і 4092878, завантажували з Genebank (NCBI). Ці послідовності використовували як запити для пошуку в базі даних послідовностей Monsanto. Використовуючи програми "blastn" (NCBI), отримували декілька результатів з високою оцінкою попадання. Всі знайдені послідовності були завантажені і повторно оброблені програмою Seqmanll (DNASTAR Inc, Madison, Wisconsin, США). Два різних транскрипти були ідентифіковані і позначені Fad2-1 (SEQ ID NO 11) і Fad2-2 (SEQ ID NO 12). Fad2-1 і Fad2-2 мають високу гомологію послідовностей з 97% ідентичністю послідовностей. Для ідентифікації причинних мутацій, пов'язаних з високим вмістом олеїнової кислоти в мутантних лініях і їх потомствах, були розроблені вкладені праймери, що повністю покривають послідовності. 3'-кінець праймера завжди розташовувався у нуклеотиду, яким Fad2-1 відрізнявся від Fad2-2, крім тих, які розташовувалися на 5'- і 3'-кінцях консенсусних послідовностей, в яких не було нуклеотиду, відмінного між цими двома генами. Праймери були також розроблені таким способом, щоб кожний амплікон накладався на іншій, з тим, щоб гарантувати повне покриття всієї послідовності. Ці праймери упорядковували і використовували для отримання локус-специфічних ампліконів у мутантів і у дикою типу. Результати секвенування вказують, що всі локус-специфічні ПЛР-праймери випалювалися, як очікувалося. Послідовності, що належать одному і тому ж гену, збирали разом з допомогою програми SeqManll. Консенсусні геномні послідовності генів Fad2-1 і Fad2-2 дикого типу представлені в SEQ ID NO 9 і 10, відповідно. У таблиці 2 підсумовані характеристики послідовностей обох генів Fad2-1 і Fad2-2. Таблиця 2 Характеристики Ген 5'UTR Екзон Інтрон Екзон CDS 3'UTR Положення в FAD2-1 1-2601 1-1206 1-108 109-1202 1207-2601 1207-2361 2362-2601 Положення в FAD2-2 1-2666 1-1238 1-111 112-1234 1235-2619 1239-2393 2394-2666 Характеристики основані на консенсусних геномних послідовностях після декількох прочитань з різних генотипів. Обидва гени Fad2-1 і Fad2-2 мають кожний по одному інтрону. Розміри інтрону трохи розрізнюються між двома генами. Для Fad2-1 інтрон охоплює 1105 п.н., починаючи з положення 109 по 1213, в той час як 21 для Fad2-2 інтрон складається з 1123 п.н., починаючи з положення 112 по 1234 в консенсусних послідовностях. Інтрон розташований в 5'UTR-області. Передбачувані кодони ініціації трансляції мають положення 1207 і 1239 для генів Fad2-1 і Fad2-2, відповідно. Кодони термінації трансляції мають положення 2370-2372 і 2391-2393, відповідно, для Fad2-1 і Fad2-2. 3'UTR-послідовності становлять 247 пар основ для гена Fad2-1 і 273 пари основ для гена Fad2-2. Делеція в положенні 1421 (позначена як DEL.1421) гена FAD2-1 викликала зсув рамки зчитування в генетичних кодонах, що приводить до передчасної термінації поліпептидів. Точкова мутація в положенні 1590 (SNP1590) гена FAD2-2 (як представлено в SEQ ID NO 7) викликала заміну амінокислотного залишку з лейцину (СТТ) на фенілаланін (ТТТ). І лейцин, і фенілаланін є за природою гідрофобними і мають деякі спільні амінокислотні властивості, але фенілаланін містить велику жорстку ароматичну групу в бічному ланцюгу, який викликає деякі зміни в функції ферменту. Крім того, в поєднанні з DEL.215 ця мутація більш помітно відбивається на фенотипі. Комбінацією різних алелів з цими мутаціями створювали градієнт вмісту олеїнової кислоти, як 96442 22 це можна спостерігати в різних мутантних лініях (дивіться таблицю 1). Дві мутантні лінії, 28DHS.086 і MSP12, несли подвійні мутації по DEL1421 і SNP1590. Оскільки обидві мутації були місенс-мутаціями, функції гена FAD2 були сильно змінені, що привело до найвищого вмісту олеїнової кислоти в цій мутантній лінії. Треба зазначити, що сорти Brassica napus, що несуть тільки мутацію SNP1590, демонструють нормальний вміст олеїнової кислоти (тобто вміст олеїнової кислоти еквівалентний вмісту олеїнової кислоти у диких типів). Дві мутантні лінії, CONTACT і CABRIOLET, несли єдину точкову мутацію в DEL.1421, що приводить до трохи меншого вмісту олеїнової кислоти в порівнянні з подвійними мутантами. Коротко, дані послідовностей переконливо свідчать про те, що такі мутації в Fad2-1 і Fad2-2 асоційовані з вмістом олеїнової кислоти в різних мутантних лініях. Ідентифікація причинних варіацій в послідовностях надто важлива для створення діагностичних аналізів, специфічних для кожного мутантного алелю. Пізнання взаємозв'язків між варіаціями послідовностей і фенотипами може дозволити створити методи аналізу маркерів для точного прогнозу вмісту олеїнової кислоти в рослинах без необхідності проведення хімічного аналізу вмісту жирних кислот. 23 96442 24 25 96442 26 27 96442 28 29 96442 30 31 96442 32 33 96442 34 35 96442 36 37 96442 38 39 96442 40 41 96442 42 43 96442 44 45 96442 46 47 96442 48 49 96442 50 51 96442 52 53 96442 54 55 96442 56 57 96442 58 59 96442 60