Полімерні кон’югати паклітакселю та доцетакселю з pн-контрольованим вивільненням засобу, який має статичну дію на злоякісні новоутворення

Реферат: В даному винаході описаний полімерний кон'югат, який складається з похідної цитостатичного агента, вибраного із групи таксанів, особливо паклітакселю (РТХ), доцетакселю (DTX) або ларотакселю (LTX), та полімерного носія, приготовленого на основі лінійного або біорозкладного прищепленого співполімеру, який складається з одиниць основного UA 104187 C2 (12) UA 104187 C2 співполімеру N-(2-гідроксипропіл)метакроїламіду (НРМА) та одиниць, які включають метакроїловані гідразони амінокислот або олігопептиди. Винахід також стосується способу приготування вищевказаного полімерного кон'югату, в якому полімерний носій піддають полімер-аналогічній трансформації носія шляхом реакції із складним етером оксокислоти та цитостатичним агентом. Полімерний кон'югат застосовують для приготування лікарського засобу для лікування пухлинних захворювань. UA 104187 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Винахід стосується структури та властивостей водорозчинних полімерних терапевтичних агентів (проліків) на основі похідних паклітакселю (PTX), доцетакселю (DTX) та ларотакселю (LTX), створених переважно для лікування солідних пухлин при терапії пухлинних захворювань для лікування людей. Рівень техніки На даний час, тенденції розробки лікарських засобів дуже часто сфокусовані на розробці форм лікарських засобів, які надають можливість специфічного ефекту лікарського засобу замість лише бажаного терапевтичного ефекту. Біологічно активні речовини з таким цільовим ефектом застосовуються в основному в галузях, де небажані побічні ефекти лікарського засобу можуть ушкоджувати здорові частини організму. Ця небезпека особлива актуальна при лікуванні цитостатичною речовиною при хіміотерапії пухлинних захворювань. Відомо, що приєднання цитостатичного агента до водорозчинного полімерного носія за допомогою хімічного зв'язку надає можливість підвищити розчинність в інших випадках нерозчинних або погано розчинних лікарських засобів та суттєво зменшити безпосередню токсичність. Високомолекулярні полімери запобігають швидкій екскреції лікарського засобу з організму шляхом клубочкової фільтрації, забезпечуючи подовжений час циркуляції в крові та присутність в організмі, та таким чином, довший час біодоступності лікарського засобу. Останнім часом, було приготовлено багато полімерних кон'югатів засобів, які мають статичну дію на злоякісні новоутворення, із розчинними полімерами та було проведено дослідження, де лікарський засіб із протираковою дією приєднували до полімеру за допомогою нерозчеплюваного ковалентного зв'язку, гідролітично нестабільного іонного зв'язку та/або ковалентного зв'язку, що надає можливість контролювати вивільнення лікарського засобу і, таким чином, його активацію на основі та ферментативного або площинного хімічного гідролізу цього зв'язку. Системи полімерного носія, як правило, створюють таким чином, щоб забезпечити вивільнення терапевтично активного засобу, який має статичну дію на злоякісні новоутворення, з носія або в пухлині, або, більш специфічно, безпосередньо в пухлинній клітині. Важлива група полімерних терапевтичних засобів представлена полімерними лікарськими засобами, приготовленими на основі співполімерів N-(2гідроксипропіл)метакриламіду (HPMA), представники яких активно безпосередньо досягають пухлин за допомогою цільової структури, приєднаної до полімеру (антитіло, лецитин, гормон). [Duncan 1985, Říhová 2000, Kopeček 2001, 2000, Duncan, 2005; Satchi-Fainaro та ін., 2006]. Проте їх синтез є надзвичайно комплексним. Також при розробці полімерних засобів, які мають статичну дію на злоякісні новоутворення, було доведено, що для специфічного транспорту лікарського засобу в місце розташування пухлини нема потреби застосовувати активний націлюючий носій, але при цьому значно підвищується накопичення полімерних цитостатичних засобів, особливо в солідних пухлинах, але цього можна досягти шляхом підвищення молекулярної маси полімерного терапевтичного засобу вище межі екскреції носія нирками (тобто, пасивне націлювання на солідні пухлини). Цю здатність макромолекул накопичуватися в солідних пухлинах називають EPR ефект (підвищена проникність та утримання) та було доведено, що цей ефект часто проявляється також носіями на основі HPMA співполімерів [Noguchi та ін., 1998; Seymour та ін., 1995]. Одна з основних проблем застосування HPMA співполімерів як пасивно націлюваних високомолекулярних носіїв обумовлена їх нерозчеплюваним вуглецевим ланцюгом і лише полімери, молекулярна маса яких не перевищує 40 - 50 тис. г/моль, можуть екскретуватися з організму. Це означає, що коли накопичення полімеру в організмі після повторного введення лікарського засобу не відбувається та, коли молекулярна маса носія є настільки максимальною, наскільки це можливе для забезпечення пасивного націлювання з максимально можливою ефективністю, то полімерний носій слід створювати як такий, який здатний розщеплюватися в організмі. Такі полімерні носії на основі HPMA співполімерів недавно були розроблені та їх структура була запатентована [Chytil та ін., 2008; Etrych та ін., 2008, Chytil PV 2006-207, Etrych PV 2006 - 592]. В літературі представлено багато інформації про приготування та дослідження властивостей полімерів, які несуть засіб, який має статичну дію на злоякісні новоутворення, приєднаного до полімеру за допомогою зв'язку, здатного до гідролізу в водному середовищі [Kratz 1999]. Серед них, важливе місце відводиться HPMA співполімерам, які несуть засіб, який має статичну дію на злоякісні новоутворення, доксорубіцин, зв'язаний із полімерним ланцюгом за допомогою гідролітично розщеплюваного гідразонового зв'язку [Etrych 2002, Ulbrich 2004a, Ulbrich 2004b, Ulbrich пат. CZ 293787 B6]. Цей зв'язок є відносно стабільним в кровотоці (при транспортуванні в організмі) та гідролітично нестабільним в незначно кислому середовищі 1 UA 104187 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 живої клітини. Швидкість гідролізу цього зв'язку також регулює швидкість вивільнення лікарського засобу і, отже, концентрацію активної речовини в місці бажаного ефекту. При дослідженні в умовах in vitro, а також in vivo на мишах такі полімерні засоби, які мають статичну дію на злоякісні новоутворення, проявляють суттєво підвищену протипухлинну ефективність по відношенню до різних клітинних ліній в порівнянні з вільним лікарським засобом та в багатьох випадках їх застосування призводить до повного видужання піддослідних тварин навіть у випадку терапевтичного методу введення. [Říhová 2001, Etrych 2001]. Підвищення молекулярної маси носія (біорозкладні привиті полімери, міцелярні та наногелеві системі) завжди проводить до підвищення ефективності протипухлинної активності лікарського засобу, що підтверджується системами in vivo. Паклітаксель та доцетаксель належать до групи таксанів, протиракових лікарських засобів, які загально прийнятно застосовуються для лікування пухлини яєчників та пухлин молочної залози, легень, передміхурової залози та інших пухлин [Vanhoefer та ін., 1997]. Крім їх вторинної токсичності, загальної для засобів, які мають статичну дію на злоякісні новоутворення, вони також мають інший недолік - дуже низьку розчинність у водних розчинах, що призводить до необхідності введення в різноманітних наповнювачах, зокрема, в Cremophor EL, що також призводить до інших побічних дій дозованої форми. У деяких схемах введення, введення таксанів в Cremophor EL може навіть суттєво знижувати ефективність терапії [Ng та ін., 2006]. Шляхом зв'язування цих лікарських засобів із полімерними носіями (PEG, HPMA співполімер, полі(глутамінова кислота)), були отримані дуже хороші водорозчинні проліки, які мають подовжений час циркуляції в організмі та підвищене накопичення в солідних пухлинах. Їх протиракова активність була підтверджена на тваринних моделях в умовах in vivo та в деяких випадках також клінічно. Таким чином, паклітаксель (PTX) був ковалентно зв'язаний із полі(етиленгліколем) (PEG) за допомогою не-розщеплюваного естерного або 7-карбаматного зв'язків (C2-OH група), або за допомогою гідролітично нестабільного амінокислотного спейсеру (Ala, Gly) [Greenwald та ін., 1995; Greenwald, 2001; Greenwald та ін., 2003; Pendri та ін., 1998]. Було показано, що протипухлинна активність кон'югату залежить від структури зв'язку, використовуваного між полімером та лікарських засобом, і молекулярна маса носія є іншим важливим фактором. Кон'югат із PTX тестували в фазі I клінічних випробувань [Satchi-Fainaro та ін., 2006], але, ймовірно, не дуже успішно. Кон'югат паклітакселю полі(глутаміновою кислотою) (Xyotax) виявився більш ефективним в клінічних випробуваннях [Winter 2005, Kratz та ін., 2008]. В цьому кон'югаті PTX зв'язаний із поліамінокислотним носієм за допомогою естерного зв'язку через -OH групу в положенні 2. Лікарський засіб вивільняється внаслідок розпаду полімерного ланцюга, утворення Glu похідної PTX та його подальшого гідролізу. На даний час, цей кон'югат знаходиться фазі III клінічних випробувань. Паклітаксель також зв'язували із HPMA співполімерами за допомогою естерного зв'язку із використанням біорозкладного олігопептидного GlyPheLeuGly спейсеру. Було показано, що PTX, після інкубування із лізосомальними ферментами, вивільняється з носія та це вивільнення є важливим для досягнення протиракової активності в умовах in vivo. PNU166945 представляє собою кон'югат HPMA співполімеру із естерно-зв'язаним PTX, який клінічно тестували в фазі I [Terwogt та ін., 2000; Terwogt та ін., 2001], проте, після цієї фази подальше тестування було зупинено. Вищевказані результати свідчать про те, що кон'югація паклітакселю із полімерним носієм приводить до суттєвого поліпшення властивостей лікарського засобу (розчинність, покращена біодоступність). Проте, якщо лікарський засіб знайде своє застосування для лікування людей, то структура та молекулярна маса носія, а також структура спейсеру між полімером та лікарським засобом, контролювання швидкості і, отже, концентрації лікарського засобу в місці бажаного ефекту, слід обережно вибирати та спеціально готувати. При розробці оптимальних структур необхідно підтверджувати функціонування цих структур на доступних моделях in vivo. Суть винаходу Полімерний лікарський засіб відповідно до даного винаходу характеризується тим, що засіб, який має статичну дію на злоякісні новоутворення із групи таксанів, паклітакселю (PTX), доцетакселю (DTX), або ларотакселю (LTX) (далі в даному винаході позначаються як лікарські засоби) зв'язаний з водорозчинним полімерним носієм, приготовленим на основі лінійного або прищепленого HPMA співполімеру. Лікарський засіб зв'язаний з полімерними ланцюгами за допомогою естерної групи, отриманої шляхом ацилювання -OH групи в положенні 2 за допомогою спейсерів, що містять pH-чутливі гідролітично розщеплювані гідразонові зв'язки. Ці спейсери можуть містити амінокислотні залишки різних оксокислот, за допомогою яких карбонільну групу вводять в структуру лікарського засобу, зв'язані із залишками окремих 2 UA 104187 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 амінокислот, олігопептидів, або інших структур, надаючи можливість закінчувати бокові ланцюги полімерного носія гідразоновою групою. У випадку лінійного полімеру молекулярну масу полімерного ланцюга вибирають нижче межі екскреції HPMA співполімерів з організму, переважно в діапазоні 10 - 50 тис. г/моль. У випадку привитого співполімеру молекулярну масу вибирають в діапазоні 50 - 250 тис. г/моль. Полімерний лікарський засіб відповідно до винаходу призначений для внутрішньовенного (ін'єкційного або інфузійного) введення в розчині, але також може вводитися внурішньопухлинно або внутрішньоочеревинно та призначений для лікування солідних пухлин. Полімер із хімічно зв'язаним цитостатичним засобом конструюють таким чином, щоб він був стабільним при циркуляції в кровотоці та запобігав гідролізу гідразонового зв'язку між даним таксаном та полімером, або, можливо, підтримував швидкість гідролізу впродовж транспортування в організмі на максимально можливому низькому рівні (при значенні pH 7,4 в кровотоці), таким чином не буде проявлятися цитотоксичного ефекту вивільненого лікарського засобу або його похідної. Всю систему конструюють у вигляд двофазної системи. У зв'язку із придатним вибором молекулярної маси носія, надається можливість просочування, а також ефективного накопичення в пухлинній тканині, взаємодія із клітинною мембраною повинна відбуватися після початкового накопичення лікарського засобу в пухлинній тканині та молекулярно розчинений полімерний лікарський засіб буде проникати в індивідуальні пухлинні клітини шляхом піноцитозу. Всередині клітин-мішеней, швидкий гідроліз гідразонового зв'язку та вивільнення лікарського засобу або його похідної із носія буде відбуватися внаслідок падіння значення pH із зовнішнього значення (7,4) до внутрішньоклітинного значення (5 – 6). На подальшому етапі гідроліз естерного зв'язку похідної лікарського засобу, вже вивільненого з полімеру, буде відбуватися шляхом хімічного гідролізу, або, більш специфічно, під впливом внутрішньоклітинних ферментів, наприклад, карбоксиестераз. Реалізація запропонованого вище механізму дії полімерних лікарських засобів відповідно до винаходу підтверджується за допомогою експериментів на моделі вивільнення лікарських засобів з полімерного носія. Результати цих тестів, включаючи тести протиракової активної активності, представлені в експериментальному розділі заявки. Полімерні кон'югати із націленим протираковим ефектом відповідно до винаходу характеризуються тим, що цитостатичний агент (таксол, доцетаксель, ларотаксель), приєднаний за допомогою естерного зв'язку та спейсеру, до полімерного носія, утвореного за допомогою лінійного [Etrych патент CZ 297827 B6, publ. 2008], або привитого [Etrych патент CZ 298945 (B6), опубл. 2008] HPMA співполімеру через гідролітично нестабільну гідразонову групу, отриману шляхом реакції карбонільної групи молекули похідної лікарського засобу із гідразидною групою полімерного носія. Полімерні носії зазвичай готують шляхом співполімеризації радикального розчину HPMA із співмономерами відповідно до бажаної композиції. Зв'язування відповідного таксану із полімерним носієм приводить до суттєвого зменшення його цитотоксичності, суттєвого підвищення молекулярної маси лікарського засобу, і, таким чином, подовження часу циркуляції в кровотоці; тобто подовження загального часу знаходження лікарського засобу в організмі і, отже, підвищення його біодоступності. Полімерний лікарський засіб відповідно до винаходу додатково характеризується тим, що зв'язування лікарського засобу із полімерним носієм є відносно стабільним впродовж транспортуванні в кровотоці та в рідинах організму та здатний до гідролітичного розщеплення в слабо кислому середовищі пухлини та, зокрема, всередині цільових пухлинних клітин в ендосомах, які характеризуються слабо кислим значенням pH. Це означає, що лікарський засіб транспортується через кровоток в неактивній формі, зв'язаній із полімером, і він вивільняється та активується переважно після проникнення в цільові пухлинні клітини. Той факт, що лікарський засіб активується лише в клітинах-мішенях, виключає побічні ефекти в інших випадках токсичних цитостатичних засобів та націлює їх ефект переважно на пухлинні клітини. Полімерний носій, приготовлений на основі HPMA співполімерів, молекулярна маса яких, тобто ефективність накопичення в пухлинній тканині, можна контролювати за допомогою змін скелету полімерного носія (нездатний до розкладу лінійний полімер, високомолекулярний біорозкладний привитий полімер), який відповідає за націлений (пасивний) транспорт в пухлину або пухлинні клітини. Сфера використання представленого винаходу включає застосування полімерних лікарських засобів відповідно до винаходу для лікування солідних пухлин при злоякісних захворюваннях в терапії людини. Синтез та структури полімерних кон'югатів 60 3 UA 104187 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Синтез полімерних кон'югатів відповідно до винаходу здійснюють за декілька стадій; детальна кінцева структура кон'югату суттєво залежить від вибраного шляху синтезу. На першій стадій синтезу синтезують основі мономери: HPMA, метакроїловані похідні амінокислот та олігопептидів, які закінчуються гідразидною (CONHNH 2) групою, або можливо, закінчуються гідразидною групою, захищеною за допомогою трет-бутилоксикарбонільної групи (Boc). На другій стадії синтезують полімерні попередники, тобто HPMA співполімери, які несуть функціональні групи (випадкові співполімери), що служать як полімерні носії для лікарських засобів. Полімерний попередник, який несе функціональні гідразидні групи на ланцюзі, може бути приготовлений або шляхом радикальної співполімеризації вказаних вище функціональних мономерів із HPMA, або шляхом полімер-аналогічної трансформації основного співполімеру, що несе функціональні групи. Прищеплені співполімери готують із мультивалентних та напівтелехелатних HPMA співполімерів відповідно до процедури, описаної в [Etrych 2008 патентна публікація]. Основний співполімер (попередник) представляє собою співполімер HPMA та метакроїлованих гідразидів амінокислот або олігопептидів, вибраних групи гліцилу, гліцилгліцилу, ß-аланілу, 6-аміногексаноїлу (AH), 4-амінобензоїлу, або змішаного ацильного похідної із олігопептидів GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly та GlyPheLeuGly), який характеризується тим, що він містить 70 - 98 моль % HPMA та 2 - 30 моль % одиниць з гідразидними функціональними групами (див. Схему 2 із спейсером, що містить 6аміногексаноїл). Похідна лікарського засобу представляє собою сполуку лікарського засобу (PTX, DTX або LTX), отриману шляхом ацилювання гідроксильної групи в положенні 2 лікарського засобу із відповідної оксокислотою. Переважно застосовують наступні оксокислоти: левулинову кислоту, 4-(2-оксопропіл)бензойну кислоту, 4-оксо-пент-2-енову кислоту та 5-оксо-гекс-2-енову та 6-оксогепт-2-енові кислоти (див. Схему 1). Полімерний кон'югат представляє собою сполуку полімерного попередника із похідною лікарського засобу, де похідна лікарського засобу зв'язана з полімерним попередником за допомогою гідразонового зв'язку, отриманого шляхом реакції карбонільної групи похідної лікарського засобу із гідразидними групами полімеру, який характеризується тим, що він містить 70 - 98 моль % HPMA, 1,5 - 29,5 моль % одиниць з гідразидними функціональними групами та 0,5 - 10 моль % одиниць із гідразон-зв'язаною похідною лікарського засобу (див. Схему 3; із спейсером, що містить 6-аміногексаноїл та левулинову кислоту). Опис фігур Фігура 1: Діаграма швидкості вивільнення PTX та його похідних із лінійних полімерних кон'югатів в буфері при значенні рН 5 (модель внутрішньоклітинного середовища). Фігура 2: Діаграма швидкості вивільнення PTX та його похідних із лінійних полімерних кон'югатів в буфері при значенні рН pH 7,4 (модель кровотоку). Фігура 3: Коефіцієнт виживання C57BL/6 мишей із EL-4 лімфомою, яким вводили DTX, LEVDTX похідну та PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV лінійний полімерний кон'югат. Дози лікарського засобу становили 2 × 20 мг DTX еквівалент/кг, PHPMA-AH-NH-N=DTX-LEV кон'югат вводили в дозах 2 × 20 та 2 × 40 мг DTX еквівалент/кг. Фігура 4: Коефіцієнт виживання C57BL/6 мишей із EL-4 лімфомою, яким вводили похідну LEV-PTX паклітаксель та PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV лінійний полімерний кон'югат. Внаслідок обмеженої розчинності PTX не можна вводити у вільній формі. Фігура 5: Коефіцієнт виживання BALB/c мишей із 4T1 карциномою молочної залози, яким вводили паклітаксель, похідну LEV-PTX паклітаксель та PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV лінійний полімерний кон'югат. PTX та PTX-LEV ін'єктували в дозах 2 × 30 мг PTX еквівалент/кг в дні 8 та 12 (див. текст) та PHPMA-AH-NH-N=PTX-LEV кон'югат в дозах 2 × 60 мг PTX еквівалент/кг в дні 8 та 12. Фігура 6: Коефіцієнт виживання C57BL/6 мишей з EL-4 лімфомою, яким вводили PHPMA-AHNH-N=DTX-LEV лінійні полімерні кон'югати із DTX вмістом 8,2 % та 16,3 % в дозах 2 × 30 мг DTX еквіваленту DTX в/в, в дні 9 та 13. Приклади Приклади здійснення синтезу проміжних сполук та кон'югатів відповідно до винаходу Приклад 1: Синтез мономерів та похідних лікарських засобів HPMA готували відповідно до раніше описаної методики [Ulbrich та ін., 2000]. Елементний аналіз: розраховано 58,8 % C, 9,16 % H, 9,79 % N; знайдено 58,98 % C, 9,18 % H, 9,82 % N. Продукт був хроматографічно чистим. 4 UA 104187 C2 1 5 10 15 20 25 30 35 40 6-(Метакрилоїламіно)гексаноїл гідразин (N -(6-гідразино-6-оксогексил)-2-метакриламід) (MAAH-NHNH2) готували відповідно до раніше описаної методики [Ulbrich патенти, Etrych патент]. Естер левулинової кислоти та паклітакселю (в -OH 2 положенні) (LEV-PTX) готували шляхом реакції левулинової кислоти із паклітакселем за допомогою карбодіімідного методу (дициклогексилкарбодіімід, DCC) в N, N’-диметилформаміді (ДМФА). Левулинову кислоту (19,4 мг, 0,167 ммоль) та DCC (37,5 мг, 0,182 ммоль) розчиняли кожен в 0,15 мл ДМФА при лабораторній температурі. Обидва розчини охолоджували до -18 °C та змішували. Через 20 хвилин розчин паклітакселю (100 мг, 0,117 ммоль) та N, Nдиметиламінопіридину (DMAP) (14 мг, 0,117 ммоль) в 0,3 мл ДМФА додавали до цього розчину. Реакцію здійснювали при -18 °C протягом 30 хвилин та при 4 °C протягом 16 годин. За перебігом реакції спостерігали за допомогою ТШХ - 60 F254 силікагелеві пластини (етилацетат: гексан 1:1, Rf(PTX)= 0,25, Rf(LEV-PTX)= 0,15, Rf(Левулинова кислота)= 0,45). Продукт очищали від низькомолекулярних сумішей за допомогою хроматографії на колонці (60 см x 4 см), заповненій силікагелем в етилацетаті. Фракцію, що містить PTX-LEV, продукт збирали та концентрували до 0,4 мл та продукт осаджували за допомогою 20 мл діетилового етеру. Продукт відсмоктували, промивали за допомогою невеликої кількості діетилового етеру та висушували в вакуумі до постійної маси. Вихід становив 98 мг продукту (84 %) з точкою плавлення 136-138 °C. ТШХ (етилацетат: гексан 1:1): в одній посудині при Rf = 0,15. MALDI-TOF MС: 970 (M+Na). Чистоту всіх мономерів та похідних лікарських засобів визначали за допомогою ВЕРХ системи [Shimadzu ВЕРХ система, обладнана колонкою із оберненою фазою Chromolith Performance RP-18e (100× 4,6 мм) та УФ-вид. детектором - Shimadzu SPD-10AVvp (230 нм); елюент: вода-ацетонітрил із градієнтом 50-100 об. % ацетонітрилу, швидкість потоку 0,5 мл·хв 1 ]. Естер левулинової кислоти та доцетаксель (в -OH 2 положенні) (LEV-DTX) готували аналогічно до LEV-PTX шляхом реакції левулинової кислоти із доцетакселем за допомогою карбодііміду методу (DCC) в ДМФА. Левулинову кислоту (38 мг, 0,327 ммоль) та DCC (100 мг, 0,487 ммоль) розчиняли кожен в 0,25 мл ДМФА при лабораторній температурі. Обидва розчини охолоджували до -18 °C та змішували. Через 20 хвилин розчин доцетакселю (200 мг, 0,247 ммоль) та N, Nдиметиламінопіридину (DMAP) (28 мг, 0,229 ммоль) в 0,6 мл ДМФА додавали до цього розчину. Реакцію здійснювали при -18 °C протягом 30 хвилин та при 4 °C протягом 16 годин. За перебігом реакції спостерігали за допомогою ТШХ 60 F254 силікагелеві пластини (етилацетат: гексан 1:1, Rf(DTX) = 0,3, Rf(LEV-DTX) = 0,2, Rf(Левулинова кислота) = 0,45). Продукт очищали від низькомолекулярних сумішей два рази за допомогою хроматографії на колонці (60 см x 4 см), заповненій силікагелем в етилацетаті. Фракцію, що містить DTX-LEV продукт збирали кожного разу та концентрували до 0,6 мл та продукт осаджували за допомогою 20 мл діетилового етеру. Продукт відсмоктували, промивали за допомогою невеликої кількості діетилового етеру та висушували в вакуумі до постійної маси. Вихід становив 179 мг продукту (80 %) з точкою плавлення 86-89 °C. ТШХ (етилацетат: гексан 1:1): в одній посудині при Rf=0,20. MALDI-TOF MС: 929 (M+Na). A B O O O OH O O O OH O O NH O O O NH O O O O O O HO O O O O O HO O O O O O O C HO O OH O O O NH O O O O HO O O O O O 5 UA 104187 C2 Схема 1. Структура естерів левулинової кислоти та 4-(2-оксопропіл)бензойної кислоти із паклітаксельом та доцетаксельом: A) Естер левулинової кислоти та паклітакселю, LEV-PTX; B) Естер 4-(2-оксопропіл)бензойної кислоти та паклітакселю, OPB-PTX; C) Естер левулинової кислоти та доцетакселю, LEV-DTX. 5 10 15 20 25 30 35 Естер 4-(2-оксопропіл)бензойної кислоти та паклітакселю (в -OH 2 положенні) (OPB-PTX) готували за допомогою методу, аналогічного до описаного вище для приготування LEV-PTX, а саме шляхом реакції 4-(2-оксопропіл) бензойної кислоти із паклітакселем, використовуючи реагент для кон'югації DCC в ДМФА. Вихід становив 85 %. Температура плавлення 143-145 °C. ТШХ (етилацетат: гексан 1:1): в одній посудині при Rf = 0,25. MALDI-TOF MС: 1032 (M+Na). Естер 4-(2-оксопропіл)бензойної кислоти та доцетакселю (в -OH 2 положенні) (OPB-PTX) готували за допомогою методу, аналогічного до описаного вище для приготування DTX-LEV, а саме шляхом реакції 4-(2-оксопропіл) бензойної кислоти із доцетакселем, використовуючи DCC в ДМФА. Вихід становив 81 %. Температура плавлення 94-96 °C. ТШХ (етилацетат: гексан 1:1): в одній посудині при Rf = 0,28. MALDI-TOF MС: 990 (M+Na). Естер 4-оксо-пентенової [3-ацетилакрилової] кислоти та паклітакселю (в -OH 2 положенні) (AAK-PTX) готували за допомогою методу, аналогічного до описаного вище для приготування LEV-PTX, а саме шляхом реакції 4-оксо-пентенової кислоти із паклітакселем, використовуючи DCC в ДМФА. Вихід становив 86 %. Температура плавлення 138-139 °C. ТШХ (етилацетат: гексан 3:1): в одній посудині при Rf = 0,6. MALDI-TOF MС: 968 (M+Na). Естер 5-оксо-гексенової кислоти та паклітаксель (в -OH 2 положенні) (OHE-PTX) готували за допомогою методу, аналогічного до описаного вище для приготування PTX-LEV, а саме шляхом реакції 5-оксо-гексенової кислоти із паклітакселем, використовуючи реагент для кон'югації DCC в ДМФА. Вихід становив 85 %. Температура плавлення 132-134 °C. ТШХ (етилацетат: гексан 3:1): в одній посудині при Rf = 0,65. MALDI-TOF MС: 982 (M+Na). Естер 5-оксо-гексенової кислоти та доцетаксель (в -OH 2 положенні) (OHE-DTX) готували за допомогою методу, аналогічного до описаного вище для приготування DTX-LEV, а саме шляхом реакції 5-оксо-гексенової кислоти із доцетакселем, використовуючи реагент для кон'югації DCC в ДМФА. Вихід становив 86 %. Температура плавлення 84-86 °C. ТШХ (етилацетат: гексан 3:1): в одній посудині при Rf = 0,7. MALDI-TOF MС: 940 (M+Na). Приклад 2: Синтез полімерного попередника - співполімеру HPMA із MA-AH-NHNH2 полі(HPMA-cпів-MA-AH-NHNH2) співполімер готували за допомогою співполімеризації радикального розчину HPMA та MA-AH-NHNH2 в метанолі при 60 °C відповідно до раніше описаної процедури [Etrych патент]. NH 2 HN O CH 3 OH O 40 NH CH 3 n O NH CH 3 o Схема 2. Структури полімерного попередника, полі(HPMA-cпів-MA-AH-NHNH2) співполімеру. Приклад 3 Приготування полімерних кон'югатів, що містять похідні лікарських засобів (PHPMA-AH-NH-N=LEV-PTX, PHPMA-AH-NH-N=LEV-DTX, PHPMA-AH-NH-N=OPB–PTX, PHPMA 6 UA 104187 C2 5 10 15 20 25 AH-NH-N=OPB–DTX, PHPMA-AH-NH-N=OHE–PTX, PHPMA-AH-NH-N=OHE–DTX, PHPMA-AHNH-N=AKK–PTX та PHPMA-AH-NH-N=AKK–DTX) Співполімери із похідними PTX, DTX та LTX, зв'язаними із PHPMA носієм, за допомогою гідролітично розщеплюваного гідразонового зв'язку, готували шляхом реакції полімерних попередників, що містять гідразинові групи, із відповідним похідних лікарського засобу в метанолі при каталізі за допомогою оцтової кислоти. Розчин 100 мг полі(HPMA-cпів-MA-AH-NHNH2) співполімеру в 1,1 мл метанолу змішували з розчином LEV-PTX в 0,2 мл метанолу. Через 1 хвилину 40 мкл оцтової кислоти додавали до перемішуваної реакційної суміші при 25 °C. За здійсненням реакції (втрата LEV-PTX) спостерігали за допомогою ТШХ (60 F254 силікагелеві пластини, етилацетат, Rf(LEV-PTX)= 0,8). Через 2 години реакційну суміш очищали від вільної похідної лікарського засобу за допомогою гель-фільтрації на колонці, заповненій Sephadex LH-20 в метанолі. Полімерну фракцію виділяли, концентрували на вакуумному випарнику та продукт осаджували за допомогою 50 мл етилацетату, виділяли шляхом фільтрації на фриті S4, промивали за допомогою 150 мл етилацетату та висушували до постійної маси. Вміст всього PTX або його похідної в полімерному кон'югаті визначали за допомогою ВЕРХ методу (ВЕРХ Shimadzu система) після повного гідролізу полімерного кон'югату в HCl розчині (pH 2) при 37 °C впродовж 1 години та екстрагування PTX похідної за допомогою хлороформу. та розподіл молекулярної маси визначали за допомогою рідинної хроматографії (TSKGel 4000 колонка (300 × 10 мм), 20 % 0,3 M ацетатний буфер (CH3COONa/CH3COOH; pH 6,5; 0,5 г/л NaN3) та 80 % метанол, швидкість потоку 0,5 мл/хв, визначення за допомогою диференційного рефрактометра, детектора розсіювання світла (DAWN-DSP-F, Wyatt Technology, USA) та УФ-детектора (250 нм). Характеристика полімерного лікарського засобу: Загальний вихід лікарського засобу, зв'язаного реакцією: 96 мг (88 %), вміст всього LEV-PTX 9,2 % за масою, вміст вільного PTX