Спосіб контролю специфічної клітинної відповіді на пухлинний антиген у хворих на злоякісні новоутворення

УКРАЇНА (19) UA (11) 42622 (13) U (51) МПК (2009) G01N 33/50 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС видається під відповідальність власника патенту ДО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ (54) СПОСІБ КОНТРОЛЮ СПЕЦИФІЧНОЇ КЛІТИННОЇ ВІДПОВІДІ НА ПУХЛИННИЙ АНТИГЕН У ХВОРИХ НА ЗЛОЯКІСНІ НОВОУТВОРЕННЯ 1 2 (13) 42622 (11) За прототип нами обрано спосіб визначення специфічної клітинної відповіді на раковий ембріональний антиген після проведення дендритноклітинної вакцинотерапії у хворих на колоректальний рак [Generation of Carcinoembryonic antigen (CEA)specific T-cells responses in HLA-A*2402 and HLAA*2402 late-stage colorectal cancer patients after vaccination with dendritic cells loaded with CEA peptides // Ко-Jinn Liu, Chuan-Cheng Wang, Li-Trong Chen and all. - Clinical Cancer Researh. - 2004. - V. 10. - P. 2645-2651], де визначали формування специфічної клітинної відповіді на антиген у хворих після проведення вакцинотерапії по рівню секреції IFN- g мононуклеарними клітинами периферичної крові за допомогою ELISPOT аналізу та проводили цитофлюорометричне визначення внутрішньоклітинної секреції IFN- g СD8+лімфоцитами після субкультивування з раковим ембріональним антигеном [5]. Позитивним в прототипі є те, що за допомогою проведених тестів можливо визначення формування специфічної імунної відповіді на проведену протипухлинну вакцинотерапію. Недоліком даного способу є те, що він не дозволяє оцінити формування специфічної імунної відповіді на аутологічний пухлинний антиген після проведення протипухлинної вакцинотерапії. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб контролю специфічної клітинної відповіді на пухлинний антиген у хворих на злоякісні новоутворення, шляхом визначення внутріш UA Корисна модель належить до експериментальної медицини, а саме – онкології, і може бути використана для спостереження за станом імунної системи хворих на злоякісні новоутворення. Дендритні клітини (ДК) - це високоспеціалізована субпопуляція клітин, головною функцією яких є поглинання, процесінг та презентація антигенів ефекторним клітинам разом з молекулами головного комплексу гістосумісності І та II й костимулюючими молекулами. Вакцинотерапія з використанням ДК інтенсивно досліджується з метою використання в схемах лікування онкологічних хворих [1]. ДК здатні специфічно активувати функції імунної системи організму з метою попередження розвитку рецидивів та метастазів. Перевагами цього методу терапії є висока специфічність дії і відсутність значних побічних ефектів [2]. При проведенні ДК- вакцинотерапії важливе значення мають лабораторні тести, за результатами яких можливо прогнозувати клінічний ефект при проведенні вакцинотерапії. Матеріалом для таких тестів можуть служити периферична кров, пухлинні клітини, лімфоцити, отримані з периферичних лімфатичних вузлів [3]. Для визначення імунного стану у хворих оцінюють загальну кількість лімфоцитів, зміни в субпопуляційному складі лімфоцитів, визначають кількість циркулюючих імунних комплексів, імуноглобулінів, фагоцитарну активність нейтрофілів, макрофагів. Важливе значення мають тести, які можуть визначити формування специфічної імунної відповіді на пухлинний антиген (ПА) [4]. U новоутворення, що включає визначення цитокінового профілю лімфоцитів після субкультивування з пухлинним антигеном, який відрізняється тим, що дослідження проводять після кожного з чотирьох введень протипухлинної вакцини і при одночасному виявленні зменшення секреції інтерлейкіна-4 та збільшення інтерферону- g в лімфоцитах під впливом аутологічного пухлинного антигена прогнозують позитивну відповідь на проведену протипухлинну вакцинотерапію. (19) (21) u200902055 (22) 10.03.2009 (24) 10.07.2009 (46) 10.07.2009, Бюл.№ 13, 2009 р. (72) ХРАНОВСЬКА НАТАЛЯ МИКОЛАЇВНА, СКАЧКОВА ОКСАНА ВОЛОДИМИРІВНА, СІТЬКО ВАЛЕНТИНА ВІТАЛІЇВНА, ШВЕЦЬ ЮЛІЯ ВІКТОРІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "НАЦІОНАЛЬНИЙ ІНСТИТУТ РАКУ" (57) Спосіб контролю специфічної клітинної відповіді на пухлинний антиген у хворих на злоякісні 3 ньоклітинної секреції IFN- g , IL-2, TNF- a , IL-4 цитокінів СD3+-лімфоцитами після субкультивування з ПА, який використовується для виготовлення вакцини, що дасть можливість оцінити формування специфічної клітинної відповіді та ефективність проведеної протипухлинної вакцинотерапії. Поставлена задача вирішується наступним чином: Дослідження по визначенню секреції внутрішньоклітинних цитокінів проводились після кожного з 4-х введень вакцини. Аналіз цитокінового спектра лімфоцитів та визначення поляризації імунної відповіді по Th х 1 типу, що характеризується високим рівнем секреції IFN- g , IL-2, TNF- a , та обумовлює клітинноопосередкований тип імунної відповіді, або по Th x 2 типу, для якого характерна секреція IL-4, IL-5, IL10, що опосередковує гуморальну імунну відповідь [6, 7], дає можливість оцінити ефективність формування специфічної імунної відповіді при проведенні протипухлинної вакцинотерапії. Для цього у хворих беруть кров вранці натщесерце з ліктьової вени з дотриманням правил асептики. Для проведення функціонального тесту використовують мононуклеари периферичної крові хворого, які виділяють на градієнті щільності фікола ( r =1,077), потім клітини двічі відмивають центрифугуванням в середовищі 199 і підраховують, доводять концентрацію клітин до 1 х 106/мл в повному культуральному середовище (ПКС) з додаванням 10 % фетальної телячої сироватки та культивують в об'ємі 1 мл у 24-луночному планшеті (Sarstedt) при 37 °С в атмосфері 5 % СО2 протягом 7 діб. На 1-шу та 3-тю добу додають 5 мкл інтерлейкіну-2. Для визначення продукції внутрішньоклітинних цитокінів використовують двопараметрову проточну цитометрію, за допомогою якої одночасно визначається цитокіновий профіль та субпопуляційний склад лімфоцитів. Після 7 діб культивації лімфоцитів з ПА в ПКС до клітин додають - форболмірістілацетат (індуктор синтезу цитокінів в лімфоцитах) в концентрації 20 мкг/мл та 3 мкг/мл іономіцину , інкубують 5 годин при 37 °С та 5 % СО2, потім відмивають центрифугуванням, фіксують 4 % параформальдегідом та пермобілізують мембрану за допомогою 0,1 % розчином сапоніна. Далі клітини мітять за допомогою МКАТ до поверхневих CD3 лімфоцитів та до внутрішньоклітинних цитокінів: ІЛ-2, ІФН- g , ФНО- a , ІЛ-4, та визначать рівень секреції цитокінів. Всі проточноцитометричні дослідження виконують на приладі FACS Calibur ("Becton Dicinson", США), що оснащений двома лазерами (довжиною хвилі 488 та 625 нм), з використанням програми CellQuest-PRO для комп'ютерів Макінтош для придбання та аналізу даних. Переконливими прикладами ефективності запропонованого способу є представлені функціональні тести двох хворих. 42622 4 1. Хвора Г.Н.Ф. 1964 року народження (історія хвороби № 10511) перебувала у відділенні онкогенікології з діагнозом низькодиференційована пухлина яєчника (гранульозноклітинний рак) ПГЗ № 32889-904/2007 проведена операція пангістеректомія, тазова перитоектомія, резекція сальника. Через півроку після операції хворій було проведено 4 курси ДК- вакцинотерапії, з перервою між вакцинами терміном в 1 місяць. Після кожної вакцинації проведено дослідження по визначенню секреції внутрішньоклітинних цитокінів лімфоцитами. Для проведення тесту використовувалась периферична кров отримана вранці натщесерце з ліктьової вени з дотриманням правил асептики. Для проведення функціонального тесту використовували мононуклеари периферичної крові хворого, які виділяли на градієнті щільності фікола ( r =1,077), потім клітини двічі відмивали центрифугуванням в середовищі 199 і підраховували, доводили концентрацію клітин до 1 х 106/мл в повному культуральному середовищі (ПКС) з додаванням 10 % фетальної телячої сироватки та культивували в об'ємі 1 мл у 24-луночному планшеті (Sarstedt) при 37 °С в атмосфері 5 % СО2 протягом 7 діб. На 1-шу та 3-тю добу додавали 5 мкл інтерлейкіну-2. Для визначення продукції внутрішньоклітинних цитокінів використовували двопараметрову проточну цитометрію, за допомогою якої одночасно визначали цитокіновий профіль та субпопуляційний склад лімфоцитів. Після 7 діб культивації лімфоцитів з ПА в ПКС до клітин додавали - форболмірістілацетат (індуктор синтезу цитокінів в лімфоцитах) в концентрації 20 мкг/мл та 3 мкг/мл іономіцину, інкубували 5 годин при 37 °С та 5 % СО2, потім відмивали центрифугуванням, фіксували 4 % параформальдегідом та пермобілізували мембрану за допомогою 0,1 % розчином сапоніна. Далі клітини мітили за допомогою МКАТ до поверхневих CD3 лімфоцитів та до внутрішньоклітинних цитокінів: ІЛ-2, ІФН- g , ФНО- a , ІЛ-4, та визначали рівень секреції цитокінів. Результати досліджень представлені в табл. 1. На першому етапі досліджень переважно відбувається диференціювання лімфоцитів по Тх2 типу: у відповідь на стимуляцію ПА клітини продукують IL-4 (21,11 % проти 5,17 % в контролі), але з кожною наступною вакцинацією цитокіновий профіль лімфоцитів змінюється, відбувається переключення з Тх2 на Тх1 тип, збільшується секреція IFN- g (після IV вакцини 3,34 % при контрольних значеннях 1,62 %), TNF- a (1,22 % проти 0,90 % в контролі). Зміна цитокінового профіля лімфоцитів в присутності ПА свідчить про формування специфічної клітинної відповіді після проведення протипухлинної вакцинотерапії. Визначення секреції внутрішньоклітинних цитокінів лімфоцитами після субкультивації з ПА. 5 42622 6 Таблиця 1 № 1. 2. 3. 4. 5. Етап вакцинотерапії Після І вакцини контроль ПА Після II вакцини контроль ПА Після III вакцини контроль А Після IV вакцини контроль ПА Практично здорові люди контроль ФГА Примітка * - р