Дельта-8 десатураза та її використання для одержання поліненасичених жирних кислот

Реферат: Розкрито ізольовані фрагменти нуклеїнових кислот та рекомбінантні конструкти, що містять такі фрагменти, що кодують дельта-8 десатурази, та спосіб одержання довголанцюгових поліненасичених жирних кислот (PUFA) з використанням цієї дельта-8 десатурази у рослинах та олійних дріжджах. UA 103745 C2 (12) UA 103745 C2 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана заявка оголошує пріоритет попередньої заявки США за номером 60/795810 від 28 квітня 2006 року та попередньої заявки США за номером 60/837789 від 15 серпня 2006 року, на які у даному тексті зроблено повне посилання. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується полінуклеотидної послідовності, що кодує дельта-8 десатуразу, і використання цієї десатурази в одержанні довголанцюгових поліненасичених жирних кислот (PUFA). РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Жирні кислоти (ліпіди) являють собою водонерозчинні органічні біомолекули, що можуть бути екстраговані із клітин та тканин неполярними розчинниками, такими як хлороформ, простий ефір або бензол. Ліпіди мають кілька важливих біологічних функцій, слугуючи (1) структурними компонентами мембран; (2) формами зберігання та транспорту метаболічного пального; (3) захисним покриттям на поверхні багатьох організмів; та (4) клітинно-поверхневими компонентами, що задіяні у визнаванні клітин, специфічності видів та імунності тканин. Більш конкретно, поліненасичені жирні кислоти (PUFA) є важливими компонентами плазмової мембрани клітини, де вони можуть бути знайдені у таких формах як фосфоліпіди і також можуть знаходитись у тригліцеридах. PUFA також слугують попередниками інших важливих для людини та тварин молекул, включаючи простацикліни, лейкотрієни та простагландіни. Існує дві головних родини PUFA (тобто омега-3 жирні кислоти та омега-6 жирні кислоти). Людське тіло здатне продукувати більшість із PUFA, котрі для нього потрібні. Проте, ейкозапентаенова кислота (ЕРА; 20:5, дельта-5, 8, 11, 14, 17) та докозагексаенова кислота (DHA; 22:6, дельта-4, 7, 10, 13, 16, 19) не можуть ефективно синтезуватись людським тілом і тому мають постачатись через їжу. Оскільки людське тіло не може виробляти адекватні кількості цих PUFA, їх називають незамінними жирними кислотами. Через їх важливу роль у здоров’ї та харчуванні людини, ЕРА та DHA є предметом значного інтересу, як тут обговорюється. DHA являє собою жирну кислоту ряду омега-3 згідно з місцеположенням останнього подвійного зв’язку у метиловому кінці. Вона синтезується шляхом переміжних стадій десатурації та елонгації (дивись Фіг.12). Продукування DHA важливе через її корисну дію на людське здоров’я. Наприклад, було показано, що підвищене поглинання DHA є корисним або має позитивний вплив при запальних хворобах (наприклад, ревматоїдному артриті), діабеті типу ІІ, гіпертензії, атеросклерозі, депресії, інфаркті міокарда, тромбозі, деяких видах раку, і для запобігання початку дегенеративних розладів, таких як хвороба Альцгеймера. У теперішній час головними джерелами DHA є олії із риби та морських водоростей. ЕРА та арахідонова кислота (АА або ARA; 20:4, дельта-5,8,11,14) обидві є дельта-5 незамінними жирними кислотами. ЕРА належить до ряду омега-3 з п’ятьма подвійними зв’язками в ацильному ланцюгу, вона міститься у морських продуктах і є у достатку у жирній рибі із Північної Атлантики. Корисні або позитивні ефекти підвищеного уживання ЕРА були виявлені у пацієнтів з коронарною хворобою серця, високим кров’яним тиском, запальними розладами, хворобами легень та нирок, діабетом типу ІІ, ожирінням, виразковим колітом, хворобою Крона, нервовою анорексією, опіками, остеоартритом, остеопорозом, синдромом дефіциту уваги та гіперактивності, та ранніми стадіями колоректального раку (дивись, наприклад, огляд МсСоll, J., NutraCos. 2(4):35-40 (2003)). АА належить до ряду омега-6 з чотирма подвійними зв’язками. Відсутність подвійного зв’язку у положенні омега-3 надає АА інших властивостей, ніж ті, що знайдені у ЕРА. Ейкозаноїди, одержані із АА, мають сильні запальні властивості та властивості викликати агрегацію тромбоцитів, тоді як ті, що отримані із ЕРА, мають протизапальні та протиагрегаційні властивості. АА визнана як основна омега-6 жирна кислота, знайдена у мозку людини, і яка є важливим компонентом грудного молока та багатьох молочних сумішей для дітей, що основано на її ролі у ранньому неврологічному та зоровому розвитку. АА може бути одержана із деяких продуктів (таких як м’ясо, риба та яйця), але її концентрація низька. Гамма-ліноленова кислота (GLA; 18:3, дельта-6,9,12) є ще однією незамінною жирною кислотою, що знайдена у ссавців. GLA є метаболічним інтермедіатом для дуже довголанцюгових омега-6 жирних кислот і для різних активних молекул. У ссавців формування довголанцюгових PUFA обмежене швидкістю дельта-6 десатурації. Багато фізіологічних та патологічних станів, таких як старіння, стрес, діабети, екзема та деякі інфекції, як було показано, приглушують стадію десатурації дельта-6. Крім того, GLA легко піддається катаболізму через окиснення та швидкий поділ клітин, асоційований з деякими розладами (наприклад, рак або запалення). Як описувалось вище, дослідження показали, що різні омега жирні кислоти знижують ризик 1 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 хвороб серця, мають позитивний ефект щодо розвитку дітей та щодо деяких ментальних захворювань, автоімунних хвороб та скарг на суглоби. Проте, хоча є багато користі для здоров’я, пов’язаної з харчуванням, доповненим цими жирними кислотами, визнано, що різні PUFA запроваджують різні фізіологічні ефекти у тілі (наприклад, найбільш виразним є протилежні фізіологічні ефекти GLA та АА). Таким чином, одержання олій з використанням рекомбінантних засобів, як очікується, має кілька переваг у порівнянні з продукуванням із природних джерел. Наприклад, можуть бути використані рекомбінантні організми, котрі мають кращі характеристики щодо продукування олій, оскільки профіль природних жирних кислот хазяїна може бути змінений шляхом уведення нових біосинтетичних шляхів у хазяїна та/або приглушення небажаних шляхів, результатом чого будуть підвищені рівні продукування бажаних PUFA (або їх кон’югованих форм) та зниження продукування небажаних PUFA. При потребі, рекомбінантні організми можуть запровадити PUFA в особливих формах, котрі можуть мати специфічні застосування; або продукування олій може здійснюватись у такий спосіб, що відношення омега-3 до омега-6 жирних кислот, отриманих таким чином, модифікується, і/або утворюється специфічна PUFA без суттєвого накопичення інших подальших та попередніх PUFA продуктів (наприклад, продукування олій, що містять АА та не містять GLA). Механізм синтезу PUFA часто реалізується шляхом дельта-6 десатурації. Наприклад, синтез довголанцюгових PUFA у ссавців просувається, головним чином, шляхом десатурації дельта-6, де першим кроком є дельта-6 десатурація лінолевої кислоти (LA; 18:2, дельта-9,12) та альфа-ліноленової кислоти (ALA; 18:3, дельта-9,12,15), з утворенням гамма-ліноленової кислоти (GLA; 18:3, дельта-6,9,12)) та стеаридонової кислоти (STA; 18:4, дельта-6,9,12,15), відповідно. Подальші кроки елонгації та десатурації жирної кислоти дають арахідонову кислоту (АА або ARA) та ейкозапентаенову кислоту (ЕРА). Відповідно, гени, що кодують компоненти дельта-6 десатурази, дельта-6 елонгази (які ідентифікуються також як С18/20 елонгази) та дельта-5 десатурази, були клоновані із різновиду організмів, включаючи вищі рослини, морські водорості, мох, гриби, нематоди та людей. Люди можуть синтезувати довголанцюгові PUFA із незамінних жирних кислот, LA та ALA; проте, біосинтез довголанцюгових PUFA у деякій мірі обмежений (вони регулюються харчовими та гормональними змінами), і LA та ALA мають одержуватись із їжі. У РСТ публікації за номером WO 02/26946 (опублікованій 4 квітня 2002 року) описані ізольовані молекули нуклеїнової кислоти, що кодують FAD4, FAD5, FAD5-2 та FAD6 члени родини жирнокислотної десатурази, котрі експресовані у довголанцюгових PUFA-продукуючих організмах, наприклад, Thraustochytrium, Pythium irregular, Schizichytrium та Crypthecodinium. Зазначається, що конструкти, котрі містять гени десатурази, можуть бути використані у будьякій експресійній системі, включаючи рослин, тварин та мікроорганізми, для продукування клітин, здатних створювати довголанцюгові PUFA. РСТ публікація за номером WO 98/55625 (опублікована 19 грудня 1998 року) описує продукування PUFA шляхом експресії генів полікетидо-подібного синтезу у рослинах. РСТ публікація за номером WO 98/46764 (опублікована 22 жовтня 1998 року) описує композиції та методи для приготування довголанцюгових жирних кислот в рослинах, частинах рослин та рослинних клітинах, котрі утилізують нуклеїново-кислотні послідовності та конструкти, що кодують жирно-кислотні десатурази, включаючи дельта-5 десатурази, дельта-6 десатурази та дельта-12 десатурази. Патент США за номером 6075183 (виданий Knutzon et al. 13 червня 2000 року) описує способи та композиції для синтезу довголанцюгових PUFA в рослинах. Патент США за номером 6459018 (виданий Knutzon et al. 1 жовтня 2002 року) описує спосіб продукування STA у насінні рослин з використанням конструкту, який містить ДНК послідовність, що кодує дельта-6 десатуразу. Spychalla et al. (Proc. Natl. Academ. Sci. USA, 94:1142-1147 (1997) описують ізоляцію та ідентифікацію кДНК із Caenorhabditis elegans, котра, коли вона експресована у Arabidopsis, кодує жирнокислотну десатуразу, яка може каталізувати інтродукцію омега-3 подвійного зв’язку в зону 18- та 20-вуглецевих жирних кислот. Альтернативний шлях біосинтезу АА та ЕРА діє у деяких організмах (тобто шлях дельта-9 елонгаза/дельта-8 десатураза). Тут LA та ALA спочатку піддаються елонгації до ейкозадієнової кислоти (EDA; 20:2, дельта-11,14) та ейкозатриєнової кислоти (EtrA; 20:3, дельта-11,14,17), відповідно, дельта-9 елонгазою. Наступна дельта-8 та дельта-5 десатурація цих продуктів дає АА та ЕРА. Дельта-8 шлях має місце, між іншим, в евгленоїдних видах, де є домінуючим шляхом для утворення 20-вуглецевих PUFA. 2 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 РСТ публікація за номером WO 2000/34439 (опублікована 15 червня 2000 року) розкриває амінокислотні та нуклеїновокислотні послідовності для дельта-5 та дельта-8 десатуразних ензимів. Виходячи із інформації, що представлена у заявці правонаступника заявника, котра знаходиться на розгляді і має номер попередньої заявки 60/583041 від 25 червня 2004 року (заявка США за номером 11/166003 від 24 червня 2005 року (РСТ публікація за номером WO 2006/012325 та WO 2006/012326, опублікована 2 лютого 2006 року)), зрозуміло, що нуклеотид дельта-8 десатурази та амінокислотні послідовності РСТ публікації за номером WO 2000/34439 не є коректними. Проте, коректна послідовність подана у відповідному патенті США за номером 6825017 (що виданий Browse et al. 30 листопада 2004 року), котрий описує десатурази, зокрема, дельта-5 та дельта-8 десатурази і їх використання у синтезі PUFA. Browse розкриває ту саму дельта-8 десатуразу у публікації США за номером 2006090221 (що опублікована 24 квітня 2006 року). Заявка правонаступника заявника, котра знаходиться на розгляді і має номер попередньої заявки США 11/166003 від 24 червня 2005 року (РСТ публікація за номером WO 2006/012325 та WO 2006/012326, що опублікована 2 лютого 2006 року), стосується дельта-8 десатурази Eulgena gracilis. Wallis et al. (Arch. Biochem. And Biophys. 365(2):307-316 (травень 1999)) описують клонування гена, що, мабуть, кодує дельта-8 десатуразу у Euglena gracilis. Ця послідовність здається тією самою послідовністю, що розкрита у РСТ публікації за номером WO 2000/34439. Qi et al. (Nat. Biotech. 22(6):739-45 (2004)) описують продукування довголанцюгових PUFA з використанням, окрім іншого, дельта-8 десатурази із Euglena gracilis; проте, повна послідовність дельта-8 десатурази не запроваджена. РСТ публікація за номером WO 2004/057001 (опублікована 8 червня 2004 року) розкриває амінокислотні та нуклеїновокислотні послідовності для дельта-8 десатуразного ензиму із Euglena gracilis. РСТ публікація за номером WO 2005/103253 (опублікована 22 квітня 2005 року) розкриває амінокислотні та нуклеїновокислотні послідовності для дельта-8 десатуразного ензиму із Pavlova salina (дивись також публікацію США за номером 2005/0273885). Sayanova et al. (FEEBS Lett. 580:1946-1952 (2006) описують ізоляцію та ідентифікацію кДНК із вільної живої ґрунтової амеби Acanthamoeba castellani, котра, коли вона експресована у Arabidopsis, кодує С20 дельта-8 десатуразу. Широкі дослідження PUFA із природних джерел та хімічного синтезу недостатні для комерційних потреб. Тому являє інтерес відшукати альтернативні засоби, що дозволять виробляти комерційні кількості PUFA. Біотехнологія пропонує привабливий шлях для продукування довголанцюгових PUFA у безпечний, ефективний у плані витрат спосіб в мікроорганізмах та рослинах. Що стосується мікроорганізмів, множина морських водоростей, бактерій, плісняви та дріжджів можуть синтезувати олії у звичайному порядку клітинного метаболізму. Таким чином, продукування олії включає культивування мікроорганізму у придатному культурному середовищі для проведення синтезу олії, з наступним відокремленням даного мікроорганізму від ферментаційного середовища та обробкою для відновлення внутрішньоклітинної олії. Були зроблені спроби оптимізувати виробництво жирних кислот за допомогою ферментативних засобів, включаючи варіювання таких параметрів як використані мікроорганізми, середовища та умови, що дають можливість продукувати олію Проте, ці зусилля виявились у значній мірі неуспішними щодо поліпшення виходу олії або можливості контролювати властивості отриманої олійної композиції. Одним класом організмів, що раніше не вивчався як виробнича платформа для PUFA (до роботи правонаступника заявника), є, проте, олійні дріжджі. Ці організми можуть накопичувати олію до 80 % від ваги їх сухих клітин. Технологія вирощування олійних дріжджів з високим вмістом олії добре розроблена (наприклад, дивись ЕР 0005277 В1; Ratledge, C., Prog. Ind. Microbiol. 16:119-206 (1982)), і може запропонувати вартісну перевагу у порівнянні з комерційною мікроводоростевою ферментацією для виробництва омега-3 або омега-6 PUFA. Усі дріжджові клітини можуть також репрезентувати зручний шлях інкапсулювання омега-3 або омега-6 PUFA-збагачених олій для застосування у функціональних продуктах та тваринних харчових добавках. Заявка правонаступника заявника, котра знаходиться на розгляді і має номер попередньої заявки США 60/739989 від 23 листопада 2005 року (папка повіреного за номером ВВ-1562), розкриває дельта-9 елонгазу із Euglena gracilis. WO 02/077213 (опублікована 3 жовтня 2002 року) описує молекули ізольованої нуклеїнової кислоти, що кодують жирнокислотну елонгазу зі специфічністю до лінолевої кислоти або альфа 3 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ліноленової кислоти із Isochrysis galbana (тобто дельта-9 елонгазу). Патент США за номером 6403349 (виданий 11 червня 2002 року) стосується ідентифікації нуклеотидної та амінокислотних послідовностей гена елонгази, одержаного із Mortierella alpina. РСТ публікація за номером WO 2004/101757 та РСТ публікація за номером WO 2004/101753 (опублікована 25 листопада 2004 року) стосуються продукування PUFA в олійних дріжджах, і є заявками правонаступника заявника, що знаходяться на розгляді. РСТ публікація за номером WO 2004/071467 (опублікована 26 серпня 2004 року) стосується продукування PUFA в рослинах, тоді як РСТ публікація за номером WO 2004/071178 (опублікована 26 серпня 2004 року) стосується анексинових промоторів та їх застосування в експресії трансгенів у рослинах; обидві є заявками правонаступника заявника, що знаходяться на розгляді. Заявки правонаступника заявника, котрі знаходиться на розгляді і мають номер заявки США 10/985109 та номер заявки США 10/985254 від 10 листопада 2004 року (РСТ публікація за номером 2005/047479 та РСТ публікація за номером 2005/047480, опублікована 26 травня 2005 року), стосуються генів дельта-15 десатурази, придатних для підвищення рівнів омега-3 жирних кислот. Заявки правонаступника заявника, котрі знаходиться на розгляді, також включають заявку США за номером 11/265761 від 2 листопада 2005 року, заявку США за номером 11/264784 від 1 листопада 2005 року та заявку США за номером 11/264737 від 1 листопада 2005 року (способи одержання ЕРА, ARA та DHA, відповідно, у Yarrowia lipolytica), кожна із яких оголошує пріоритет більш ранньої дати подачі попередньої заявки 4 листопада 2004 року. СТИСЛИЙ ВИКЛАД ВИНАХОДУ Даний винахід стосується ізольованого полінуклеотиду, що включає: (а) нуклеотидну послідовність, котра кодує поліпептид, який має дельта-8 десатуразну активність, де даний поліпептид має принаймні 80 % амінокислотну ідентичність, базуючись на методі групування Clustal V, у порівнянні з амінокислотною послідовністю, визначеною у SEQ ID NO:16; (b) нуклеотидну послідовність, котра кодує поліпептид, який має дельта-8 десатуразну активність, де зазначена нуклеотидна послідовність має принаймні 80 % ідентичність послідовності, базуючись на методі групування BLASTN, у порівнянні з нуклеотидною послідовністю, визначеною у SEQ ID NO:15; або (с) комплемент нуклеотидної послідовності (а) або (b), де даний комплемент та нуклеотидна послідовність складаються із тієї самої кількості нуклеотидів і є 100 % комплементарними. У другому варіанті даний винахід стосується оптимізації кодону, а саме, ізольованої молекули нуклеїнової кислоти, котра кодує дельта-8 десатуразний ензим, як визначено у SEQ ID NO:57, де принаймні 162 кодони є кодон-оптимізованими для експресії у виді Yarrowia. У третьому варіанті даний винахід стосується рекомбінантного ДНК конструкту, що включає будь-який із полінуклеотидів даного винаходу, котрий зчеплений у діючий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю. У четвертому варіанті даний винахід стосується клітини, яка містить рекомбінантний ДНК конструкт даного винаходу. Являють інтерес клітини, що вибрані із групи, яка складається із рослин та дріжджів. У п’ятому варіанті даний винахід стосується трансформованого виду Yarrowia, що включає рекомбінантний конструкт даного винаходу. У шостому варіанті даний винахід стосується способу трансформації клітини, що включає трансформацію клітини рекомбінантним конструктом даного винаходу, та селекцію клітин, трансформованих рекомбінантним конструктом даного винаходу. У сьомому варіанті даний винахід стосується способу продукування трансформованих рослин, що включає трансформацію рослинної клітини полінуклеотидом даного винаходу та регенерацію рослини із трансформованої рослинної клітини. Рослиною, якій віддається перевага, є соя. У восьмому варіанті даний винахід стосується способу продукування дріжджів, що включає трансформування дріжджової клітини полінуклеотидом даного винаходу та вирощування дріжджів із трансформованої дріжджової клітини, і, зокрема, олійних дріжджів. У дев’ятому варіанті даний винахід стосується насіння, що містить рекомбінантний конструкт даного винаходу. У десятому варіанті даний винахід стосується способу одержання довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у клітині, який включає: (а) трансформацію клітини рекомбінантним конструктом даного винаходу; 60 4 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (b) селекцію цих трансформованих клітин, що виробляють довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти. В одинадцятому варіанті даний винахід стосується олії, одержаної із насіння, що містить рекомбінантний конструкт даного винаходу або дріжджів, що містять рекомбінантний конструкт даного винаходу. У дванадцятому варіанті даний винахід стосується способу одержання довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у рослинній клітині, що включає: (а) трансформацію клітини рекомбінантним конструктом даного винаходу; (b) селекцію цих трансформованих клітин, що виробляють довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти. У тринадцятому варіанті даний винахід стосується способу продукування принаймні однієї поліненасиченої жирної кислоти у клітині сої, що включає: (а) трансформацію соєвої клітини першим рекомбінантним ДНК конструктом, що містить ізольований полінуклеотид, котрий кодує принаймні один дельта-8 десатуразний поліпептид, зчеплений у діючий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю, і принаймні один додатковий рекомбінантний ДНК конструкт, що містить ізольований полінуклеотид, зчеплений у діючий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю, що кодує поліпептид, вибраний із групи, яка складається із дельта-4 десатурази, дельта-5 десатурази, дельта-6 десатурази, дельта-12 десатурази, дельта-15 десатурази, дельта-17 десатурази, дельта-9 десатурази, дельта-9 елонгази, С14/16 елонгази, С16/18 елонгази, С18/20 елонгази та С20/22 елонгази; (b) регенерацію соєвої рослини із трансформованої клітини стадії (а); та (с) селекцію насіння, одержаного від рослин стадії (b), що має змінений рівень поліненасичених жирних кислот у порівнянні з рівнем у насінні, одержаному від нетрансформованої соєвої рослини. У чотирнадцятому варіанті даний винахід стосується олійної рослини, що включає: (а) перший рекомбінантний ДНК конструкт, що містить ізольований полінуклеотид, який кодує принаймні один дельта-8 десатуразний поліпептид, зчеплений у дієвий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю; та (b) принаймні один додатковий рекомбінантний ДНК конструкт, який містить ізольований полінуклеотид, зчеплений у діючий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю, що кодує поліпептид, вибраний із групи, яка складається із дельта-4 десатурази, дельта-5 десатурази, дельта-6 десатурази, дельта-12 десатурази, дельта-15 десатурази, дельта-17 десатурази, дельта-9 десатурази, дельта-9 елонгази, С14/16 елонгази, С16/18 елонгази, С18/20 елонгази та С20/22 елонгази. Являє також інтерес насіння, одержане від таких олійних рослин, та олія, одержана із такого насіння. У п’ятнадцятому варіанті даний винахід стосується їжі або корму, котрі містять олію даного винаходу. У шістнадцятому варіанті даний винахід стосується їжі або корму, котрі містять інгредієнт, одержаний шляхом обробки насіння даного винаходу. У сімнадцятому варіанті даний винахід стосується ізольованого полінуклеотиду, що містить нуклеотидну послідовність, котра кодує поліпептид, який має дельта-8 десатуразну активність, де нуклеотидна послідовність має принаймні 90 % ідентичність послідовності, базуючись на методі групування BLASTN, у порівнянні з нуклеотидною послідовністю, визначеною у SEQ ID NO:15. У вісімнадцятому варіанті даний винахід стосується способу одержання довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у клітині, що має знижений рівень побічних жирних кислот, зазначений спосіб включає: (а) трансформацію хазяйської клітини принаймні одним рекомбінантним ДНК конструктом, що містить ізольований полінуклеотид, котрий кодує принаймні дві дельта-8 десатурази, зчеплені у діючий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю; та (b) селекцію цих одержаних трансформованих хазяйських клітин, що мають знижений рівень побічних жирних кислот, у порівнянні з рівнем таких побічних жирних кислот у трансформованій хазяйській клітині, що має принаймні один рекомбінантний ДНК конструкт, який містить ізольований полінуклеотид, котрий кодує одну дельта-8 десатуразу, зчеплену у діючий спосіб з регуляторною послідовністю. БІОЛОГІЧНІ ДЕПОЗИТИ Наступні плазміди зберігаються в Американському зібраннітипових культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, і мають наступні позначення, номери доступу та дати вкладення (Таблиця 1). 5 UA 103745 C2 Таблиця 1 АТСС депозити Плазміда pKR72 pKR578 pKR903 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Номер доступу PTA-6019 PTA-6280 PTA-7494 Дата вкладення 28 травня 2004 року 4 листопада 2004 року 12 квітня 2006 року СТИСЛИЙ ОПИС МАЛЮНКІВ ТА ЛІСТИНГИ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Даний винахід може бути краще зрозумілим із наступного детального опису та супровідних малюнків і лістингу послідовностей, котрі утворюють частину даної заявки. Описи послідовностей підсумовують Лістинг послідовностей, що додається. Лістинг послідовностей містить однолітерні коди для символів нуклеотидних послідовностей та одно- та трилітерні коди для амінокислот, як визначено у стандартах IUPAC-IUB, що описані у Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) та у Biochemical Journal 219(2):345-373 (1984). Фіг.1 являє собою плазмідну карту pY121 (вектор експресії дріжджів). Фіг.2 являє собою плазмідну карту pКR902 (вектор експресії сої). Фіг.3 являє собою плазмідну карту pKR903 (вектор експресії сої). Фіг.4 являє собою плазмідну карту pY118 (вектор експресії Yarrowia). Фіг.5 являє собою плазмідну карту pKR973 (вектор експресії сої). Фіг.6 являє собою плазмідну карту pKR912 (вектор експресії сої). Фіг.7 являє собою плазмідну карту pKR983 (вектор експресії сої). Фіг.8А та 8В показують таблицю профілів жирних кислот із соматичних зародків сої, що експресують Pavlova lutherі дельта-8 десатуразу та Isochrysis galbana дельта-9 елонгазу (дивись Приклад 12). Фіг. 9-A, 9-B, 9-C та 9-D являють собою карти плазмід pEgD9ES, pDMW263, pZUF-17 та pZUFnEgD9ES. Фіг.10 показує хроматограму ліпідного профілю клітинного екстракту Euglena gracilis, як описано у Прикладах. Фіг.11-A, 11-B, 11-C та 11-D являють собою карти плазмід pPiD8S, pEXPGUS1-C та pZGD5TCP і pZUFmE9SP8S. Фіг.12 являє собою репрезентативний омега-3 та омега-6 жирнокислотний шлях, що запроваджує конверсію міристинової кислоти через різні інтермедіати у докозагексаенову кислоту (DHA). Фіг.13А та 13В показують групування Clustal V (з параметрами за умовчанням) SEQ ID NO:16 (амінокислотна послідовність дельта-8 десатурази даного прикладу), SEQ ID NO:76 (амінокислотна послідовність Pavlova salina дельта-8 десатуразної послідовності, що розкрита як SEQ ID NO:1 у РСТ публікації No. WO 2005/103253, опублікована 22 квітня 2005 року), SEQ ID NO:77 (амінокислотна послідовність Euglena gracillis дельта-8 десатуразної послідовності, що розкрита як SEQ ID NO:2 у РСТ публікації No. WO 2006/012325, опублікована 2 лютого 2006 року), SЕQ ID NO:17 (амінокислотна послідовність для Rhizopus stolonifer дельта-6 жирнокислотної десатурази (NCBI Accession No. ABB96724 (GI 83027409), локус АВВ96724, CDS DQ291156; Zhang et al., не опубліковано) та SEQ ID NO:2 (амінокислотна послідовність для Rhizopus stolonifer дельта-6 жирнокислотної десатурази (NCBI Accession No. AAX22052 (GI 60499699), локус АAX22052, CDS AY95076; Lu et al., не опубліковано)). Фіг.14 представляє усереднений жирнокислотний профіль для десяти найкращих ЕРА подій соєвої ембріогенної суспензійної культури (cv. Jack), трансформованої Ascl фрагментами pKR973 (SEQ ID NO:45, Фіг.5) та pKR983 (SEQ ID NO:56, Фіг.7) (дивись Приклад 22). SEQ ID NO:1 являє собою послідовність Т7 праймера. SEQ ID NO:2 являє собою амінокислотну послідовність для Rhizopus stolonifer дельта-6 жирнокислотної десатурази (NCBI Accession No. AAX22052 (G1 60499699), локус ААХ22052, CDS AY795076; Lu et al., не опубліковано). SEQ ID NO:3 являє собою послідовність ділянки кДНК інсерту із клону eps1c.pk002.f22 (5’ кінець кДНК інсерту). SEQ ID NO:4 являє собою нуклеотидну послідовність цілком секвенірованого EST eps1c.pk002.f22:fis (повна послідовність інсерту – FIS). SEQ ID NO:5 являє собою виведену амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4 (клон eps1c.pk002.f22:fis). SEQ ID NO:6 являє собою послідовність SeqE праймера. SEQ ID NO:7 являє собою послідовність SeqW праймера. 6 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:8 являє собою амінокислотну послідовність Mortierella alpinа дельта-6 десатурази (NCBI Accession No. BAC82361 (GI 34221934), локус ВАС82361, CDS AB070557; Sakuradani and Shimizu, Biosci. Biotechnol. Biochem. 67:704-711 (2003)). SEQ ID NO:9 являє собою послідовність АР1 універсального праймера. SEQ ID NO:10 являє собою послідовність GSP PvDES праймера. SEQ ID NO:11 являє собою послідовність M13-28Rev праймера. SEQ ID NO:12 являє собою послідовність PvDES seq праймера. SEQ ID NO:13 являє собою повну 5’ кінцеву послідовність із “геномного кроку” Pavlova lutheri дельта-8 десатурази. SEQ ID NO:14 являє собою нуклеотидну послідовність Pavlova lutheri дельта-8 десатурази даного винаходу. SEQ ID NO:15 являє собою нуклеотидну послідовність CDS SEQ ID NO:14 (Pavlova lutheri дельта-8 десатурази даного винаходу). SEQ ID NO:16 являє собою виведену амінокислотну послідовність SEQ ID NO:15 (дельта-8 десатурази даного винаходу). SEQ ID NO:17 являє собою амінокислотну послідовність для Rhizopus stolonifer дельта-6 жирнокислотної десатурази (NCBI Accession No. ABB96724 (GI 83027409), локус АВВ96724, CDS DQ291156; Zhang et al., не опубліковано). SEQ ID NO:18 являє собою послідовність PvDES5’Not-1 праймера. SEQ ID NO:19 являє собою послідовність PvDES3’Not-1 праймера. SEQ ID NO:20 являє собою послідовність GSP PvDES-2 праймера. SEQ ID NO:21 являє собою послідовність pY121. SEQ ID NO:22 являє собою послідовність pKR123r. SEQ ID NO:23 являє собою послідовність pKR900. SEQ ID NO:24 являє собою послідовність pKR925. SEQ ID NO:25 являє собою послідовність pKR902. SEQ ID NO:26 являє собою послідовність pKR607. SEQ ID NO:27 являє собою послідовність pKR903. SEQ ID NO:28 являє собою послідовність GPDsense праймера. SEQ ID NO:29 являє собою послідовність GPDantisense праймера. SEQ ID NO:30 являє собою послідовність pY5-22GPD. SEQ ID NO:31 являє собою послідовність pY118. SEQ ID NO:32 являє собою нуклеотидну послідовність CDS Euglena gracilis дельта-9 елонгази. SEQ ID NO:33 являє собою послідовність oEugEL-1 праймера. SEQ ID NO:34 являє собою послідовність oEugEL-2 праймера. SEQ ID NO:35 являє собою послідовність pKR906. SEQ ID NO:36 являє собою послідовність pKR132. SEQ ID NO:37 являє собою послідовність pKR953. SEQ ID NO:38 являє собою послідовність pKR287. SEQ ID NO:39 являє собою нуклеотидну послідовність Mortierella alpinа дельта-5 десатурази, котра описана у патенті США за номером 6075183 та РСТ публікаціях за номерами WO 2004/071467 та WO 2005/0479479. SEQ ID NO:40 являє собою послідовність pKR277. SEQ ID NO:41 являє собою послідовність pKR952. SEQ ID NO:42 являє собою послідовність pKR457. SEQ ID NO:43 являє собою послідовність модифікованої Kti/Notl/Kti3’Salb3’ касети. SEQ ID NO:44 являє собою послідовність pKR970. SEQ ID NO:45 являє собою послідовність pKR973. SEQ ID NO:46 являє собою послідовність pKR72. SEQ ID NO:47 являє собою послідовність pKR912. SEQ ID NO:48 являє собою послідовність pKR886r. SEQ ID NO:49 являє собою послідовність pKR271. SEQ ID NO:50 являє собою послідовність pKR226. SEQ ID NO:51 являє собою послідовність oCon-1 праймера. SEQ ID NO:52 являє собою послідовність oCon-2 праймера. SEQ ID NO:53 являє собою послідовність pKR179. SEQ ID NO:54 являє собою послідовність pKR226. SEQ ID NO:55 являє собою послідовність pKR582. SEQ ID NO:56 являє собою послідовність pKR983. 7 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:57 являє собою нуклеотидну послідовність для синтетичної (кодоноптимізованої) дельта-8 десатурази, отриманої із кодон-оптимізованої Pavlova lutheri для експресії у Yarrowia lipolytica. SEQ ID NO:58 являє собою послідовність pPiD8S. SEQ ID NO:59 являє собою нуклеотидну послідовність довголанцюгового PUFA елонгаційного ензиму із Isochrysis galbana (NCBI Accession No. AAL 37626 (GI 17226123), локус AAL37626, CDS AF390174). SEQ ID NO:60 являє собою 5’ послідовність кДНК інсерту із клону eeg1c.pk001.n5.f, тоді як SEQ ID NO:61 являє собою 3’ послідовність кДНК інсерту із клону eeg1c.pk001.n5.f. SEQ ID NO:61 являє собою 3’ послідовність кДНК інсерту із клону eeg1c.pk001.n5.f. SEQ ID NO:62 являє собою послідовність, виведену із SEQ ID NO:60 та SEQ ID NO:61 (повна кДНК послідовність, за виключенням polyA хвоста). SEQ ID NO:63 являє собою нуклеотидну послідовність M13F універсального праймера. SEQ ID NO:64 являє собою виведену амінокислотну послідовність SEQ ID NO:63 (дельта-9 елонгаза - клон eeg1c.pk001.n5.f). SEQ ID NO:65 амінокислотна послідовність довголанцюгового PUFA елонгаційного ензиму із Isochrysis galbana (NCBI Accession No. AAL 37626 (GI 17226123), локус AAL37626, CDS AF390174). SEQ ID NO:66 являє собою нуклеотидну послідовність синтетичної (кодон-оптимізованої) дельта-9 елонгази, одержану із кодон-оптимізованої Isochrysis galbana для експресії у Yarrowia lipolytica. SEQ ID NO:67 являє собою послідовність pEgD9ES. SEQ ID NO:68 являє собою послідовність pDMW263. SEQ ID NO:69 являє собою послідовність pZUF17. SEQ ID NO:70 являє собою послідовність pZUFmEgD9ES. SEQ ID NO:71 являє собою послідовність pZUFmE9SP8S. SEQ ID NO:72 являє собою послідовність pEXPGUS1-C. SEQ ID NO:73 являє собою послідовність pZGD5T-CP. SEQ ID NO:74 являє собою послідовність pYZDE2-S. SEQ ID NO:75 являє собою послідовність pY5-22. SEQ ID NO:76 являє собою амінокислотну послідовність Pavlova salina дельта-8 десатуразної послідовності, що розкрита як SEQ ID NO:1 у РСТ публікації No. WO 2005/103253 (опублікована 22 квітня 2005 року). SEQ ID NO:77 являє собою амінокислотну послідовність Eulgena gracilis дельта-8 десатуразної послідовності, що розкрита як SEQ ID NO:2 у заявці правонаступника заявника, що знаходиться на розгляді, котра має номер заявки 11/166003 від 24 червня 2005 року (РСТ публікація No. WO 2006/012325, опублікована 2 лютого 2006 року). SEQ ID NO:78 являє собою послідовність pY5-30. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ На всі патенти, патентні заявки та цитовані в них публікації зроблені повні посилання. У контексті цієї заявки має бути використаний ряд термінів. Термін “жирні кислоти” стосується довголанцюгових аліфатичних кислот (алканових кислот) з різними довжинами ланцюгів, від приблизно С12 до С22 (хоча відомі також кислоти з довшими або коротшими ланцюгами). Домінуючі довжини ланцюгів лежать в області від С 16 до С22. Додаткові подробиці, що стосуються диференціації між “насиченими жирними кислотами” та “ненасиченими жирними кислотами”, між “мононенасиченими жирними кислотами” та “поліненасиченими жирними кислотами” (або “PUFA”), та “омега-6 жирними кислотами” (-6 або n-6) і “омега-3 жирними кислотами” (-3 або n-3), наведені у РСТ публікації No. WO 2004/101757. Тут жирні кислоти описані з допомогою простої системи позначення “X:Y”, де цифра перед двокрапкою визначає кількість вуглецевих атомів у жирній кислоті, і цифра після двокрапки відповідає кількості присутніх подвійних зв’язків. Цифра, що йде за позначенням даної жирної кислоти, вказує на положення подвійного зв’язку від карбоксильного кінця жирної кислоти з афіксом “c” для цис-конфігурації подвійного зв’язку (наприклад, пальмітинова кислота (16:0), стеаринова кислота (18:0), олеїнова кислота (18:1, 9с), петрозелінова кислота (18:1, 6с), LA (18:2, 9c, 12c), GLA (18:3, 6c, 9c, 12c) та ALA (18:3, 9c, 12c, 15c)). Якщо не зазначено інше, 18:1, 18;2 та 18;3 стосуються олеїнової, LA та ліноленової жирних кислот. Якщо спеціально не зазначено інше, передбачається, що подвійні зв’язки мають цис конфігурацію. Наприклад, передбачається, що подвійні зв’язки у 18:2 (9, 12) знаходяться у цис конфігурації. Репрезентативний шлях, що проілюстрований на фіг.12, запроваджений для конверсії 8 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 міристинової кислоти через різні інтермедіати до DHA, і демонструє, яким чином можуть бути одержані омега-3 та омега-6 жирні кислоти із спільного джерела. Термін “проміжні жирні кислоти” стосується будь-якої жирної кислоти, що отримана жирнокислотним метаболічним шляхом, котра може перетворюватись далі до бажаного продукту цим шляхом під дією ензимів іншого метаболічного шляху. Наприклад, коли ЕРА продукується з використанням дельта-9 елонгазного метаболічного шляху (дельта-15 десатураза, дельта-9 елонгаза, дельта-8 десатураза, дельта-5 десатураза та дельта-17 десатураза), можуть утворитись EDA, ERA, DGLA, ETA та ARA, і їх вважають “проміжними жирними кислотами”, оскільки ці жирні кислоти можуть бути конвертовані далі у ЕРА під дією ензимів іншого метаболічного шляху. Термін “побічна жирна кислота” стосується будь-якої жирної кислоти, що одержана на жирнокислотному метаболічному шляху, котра не є ані продуктом призначення даного шляху, ані “проміжною жирною кислотою” даного шляху. Наприклад, коли ЕРА одержується з використанням дельта-9 елонгазного метаболічного шляху (дельта-15 десатураза, дельта-9 елонгаза, дельта-8 десатураза, дельта-5 десатураза та дельта-17 десатураза), під дією дельта5 десатурази на EDA або ERA, відповідно, можуть також утворитись скіадонова кислота (SCI) та юніперонова кислота (JUP). Вони вважаються “побічними жирними кислотами”, оскільки не можуть бути конвертовані далі до ЕРА під дією ензимів іншого метаболічного шляху. Метаболічний шлях, у біохімічному сенсі, може розглядатись як ряд хімічних реакцій, що відбуваються у клітині, котрі каталізуються ензимами, або для утворення метаболічного продукту, який використовується або зберігається клітиною, або для ініціації іншого метаболічного шляху (що був потім названий стадією генерації потоку). Багато із цих шляхів детально розроблені і включають покрокову модифікацію первинної речовини для її формування у продукт, який має бажану точну хімічну структуру. Номенклатура, використана для опису PUFA у даній заявці, наведена нижче у Таблиці 2. У стовпчику, названому “Умовне позначення”, використана система -посилання для зазначення кількості вуглеців, кількості подвійних зв’язків та положення подвійного зв’язку, найближчого до омега вуглецю, рахуючи від омега вуглецю (котрий для цього позначений номером 1). Решта Таблиці підсумовує загальні назви омега-3 та омега-6 жирних кислот, абревіатури, котрі будуть використовуватись у решті специфікації, та хімічні назви кожної сполуки. Таблиця 2 Номенклатура поліненасичених жирних кислот Загальна назва Олеїнова Лінолева Гамма-ліноленова Ейкозадієнова Дигомогаммаліноленова Скіадонова Арахідонова Альфа-ліноленова Стеаридонова Ейкозатриєнова Скорочення Хімічна назва LA GLA EDA DGLA або HGLA SCI АА або ARA ALA Цис-9-октадеценова Цис-9,12-октадекадієнова Цис-6,9,12-октадекатриєнова Цис-11,14-ейкозадієнова Цис-8,11,14-ейкозатриєнова Цис-5,11,14-ейкозатриєнова Цис-5,8,11,14-ейкозатетраенова Цис-9,12,15-октадекатриєнова Цис-6,9,12,15октадекатетраенова Цис-11,14,17-ейкозатриєнова Цис-8.11,14,17ейкозатетраєнова Цис-5,11.14,17-ейкозатриєнова Цис-5,8,11,14,17ейкозапентаенова Цис-7,10,13,16,19докозапентаенова Цис-4,7,10,13,6,19докозагексаенова STA ETrAабо ERA Ейкозатетраєнова ЕТА Юніперонова JUP Ейкозапентаенова ЕРА Докозапентаенова DPA Докозагексаенова DHA Умовне позначення 18:1 18:2 -6 18:3 -6 20:2 -6 20:3 -6 20:3b -6 20:4 -6 18:3 -3 18:4 -3 20:3 -3 20:4 -3 20:4b -3 20:5 -3 22:5 -3 22:6 -3 Термін “незамінна жирна кислота” стосується особливої PUFA, котру організм має уживати, щоб вижити, будучи нездатним синтезувати її знову. Наприклад, ссавці не можуть синтезувати 9 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 незамінну жирну кислоту LA. Інші незамінні жирні кислоти включають, проте не обмежуючись цим, GLA, DGLA, AA, EPA та DHA. Термін “жир” стосується ліпідної речовини, котра є твердою при 25 °C і звичайно насичена. Термін “олія” стосується ліпідної речовини, котра є рідкою при 25 °C і звичайно поліненасичена. PUFA знаходяться в оліях деяких морських водоростей, олійних дріжджах та ниткоподібних грибах. “Мікробні олії” або “одноклітинні олії” є тими оліями, що природно продукуються мікроорганізмами протягом періоду їх життя. Такі олії можуть містити довголанцюгові PUFA. Термін “PUFA біосинтетичний шлях” стосується метаболічного процесу, що перетворює олеїнову кислоту у LA, EDA, GLA, DGLA, AA, ALA, STA, EtrA, ETA, EPA, DPA та DHA. Цей процес добре описаний у літературі (наприклад, дивись РСТ публікацію за номером WO 2005/003322). Спрощено кажучи, цей процес включає елонгацію вуглецевого ланцюга шляхом додавання вуглецевих атомів та десатурації молекули шляхом додавання подвійних зв’язків через ряд спеціальних десатураційних та елонгаційних ензимів (тобто “ензимів PUFA біосинтетичного щляху”), що присутні у мембрані ендоплазматичного ретикулума. Більш конкретно, “ензими PUFA біосинтетичного шляху” стосуються будь-якого із наступних ензимів (та генів, котрі кодують зазначені ензими), пов’язаних з біосинтезом PUFA, включаючи: дельта-4 десатуразу, дельта-5 десатуразу, дельта-6 десатуразу, дельта-12 десатуразу, дельта-15 десатуразу, дельта-17 десатуразу, дельта-9 десатуразу, дельта-8 десатуразу, дельта-9 елонгазу, С14/16 елонгазу, С16/18 елонгазу, С18/20 елонгазу та/або С20/22 елонгазу. “Десатураза” являє собою поліпептид, котрий може піддавати десатурації одну або кілька жирних кислот з утворенням моно- або поліненасиченої жирної кислоти або попередника, що являють інтерес. Особливий інтерес являють тут дельта-8 десатурази, котрі піддають десатурації жирну кислоту між восьмим та дев’ятим вуглецевим атомом, понумерованим від карбоксил-термінального кінця молекули, і котрі можуть, наприклад, каталізувати конверсію EDA у DGLA та/або EtrA у ЕТА. Інші корисні жирнокислотні десатурази включають, наприклад, (1) дельта-5 десатурази, котрі каталізують конверсію DGLA у АА та/або ЕТА у ЕРА; (2) дельта-6 десатурази, котрі каталізують конверсію LA у GLA та/або ALA у STA; (3) дельта-4 десатурази, котрі каталізують конверсію DPA у DHA; (4) дельта-12 десатурази, котрі каталізують конверсію олеїнової кислоти у LA; (5) дельта-15 десатурази, котрі каталізують конверсію LA у ALA та/або GLA у STA; (6) дельта-17 десатурази, котрі каталізують конверсію АА у ЕРА та/або DGLA у ЕТА; і (7) дельта-9 десатурази, котрі каталізують конверсію пальмітату у пальмітолеїнову кислоту (16:1) та/або стеарату в олеїнову кислоту (18:1). Термін “елонгазна система” стосується набору із чотирьох ензимів, котрі відповідальні за елонгацію жирнокислотного вуглецевого ланцюга з утворенням жирної кислоти, котра на два вуглецевих атоми довша, ніж жирнокислотний субстрат, на який діє дана елонгазна система. Більш конкретно, процес елонгації відбувається в асоціації з жирнокислотною синтазою, згідно з чим СоА є ацильним носієм (Lassner et al., Plant Cell 8:281-292 (1996)). На першій стадії, котра, як було встановлено, є субстрат-специфічною і лімітована швидкістю, малоніл-СоА конденсується з довголанцюговим ацил-СоА з утворенням діоксиду вуглецю (СО 2) та кетоацил-СоА (де ацильна складова подовжена на два вуглецеві атоми). Наступні реакції включають відновлення до -гідроксиацил-СоА, дегідратацію до еноїл-СоА та друге відновлення з утворенням елонгованого ацил-СоА. Прикладами реакцій, що каталізуються елонгазними системами, є конверсія GLA у DGLA, STA у ЕТА, LA у EDA, ALA у ERA та ЕРА у DPA. Для цілей даної заявки на ензим, що каталізує першу реакцію конденсації (тобто конверсію малоніл-СоА у -кетоацил-СоА), будемо посилатись, загалом, як на ”елонгазу”. Загалом, селективність елонгаз щодо субстрату дещо широка, але обмежується як довжиною ланцюга так і ступенем ненасичення. Відповідно, елонгази можуть мати різні специфічності. Наприклад, С14/16 елонгаза буде утилізувати С14 субстрат (наприклад, міристиновий), С 16/18 елонгаза буде утилізувати С16 субстрат (наприклад, пальмітат), С 18/20 елонгаза буде утилізувати С18 субстрат (наприклад, GLA, STA) і С20/22 елонгаза буде утилізувати С20 субстрат (наприклад, ЕРА). У подібний спосіб і зі значним інтересом у даному разі “дельта-9 елонгаза” здатна каталізувати конверсію LA та ALA у EDA та EТrA. Важливо зазначити, що деякі елонгази мають широку специфічність, і, отже, окремий ензим може бути здатним каталізувати кілька елонгазних реакцій (наприклад, діяти як С16/18 елонгаза і як С18/20 елонгаза). У варіантах, яким віддається перевага, бажано емпіричним шляхом визначити специфічність жирнокислотної елонгази шляхом перетворення придатного хазяїна геном для жирнокислотної елонгази і визначити її вплив на профіль жирної кислоти хазяїна. Жирнокислотні елонгази від різних видів можуть виявляти значну варіабельність у специфічності щодо субстрату. 10 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, Mortierella alpina дельта-6 елонгаза діє як С18/20 елонгаза (елонгація GLA до DGLA) у дріжджах, але може додатково діяти як С20/22 елонгація LA або ALA до EDA або ETrA, відповідно, у сої. Термін “шлях дельта-9 елонгаза/дельта-8 десатураза” стосується елонгази для елонгації ЕРА до DPA або як дельта-9 елонгаза для біосинтетичного шляху для продукування довголанцюгових PUFA. Цей шлях, як мінімум, включає дельта-9 елонгазу та дельта-8 десатуразу, запроваджуючи таким чином біосинтез DGLA та/або ЕТА із LA та ALA, відповідно. Термін “дельта-9 елонгаза” стосується ензиму, що здатен каталізувати принаймні одну реакцію елонгази, таку як елонгація лінолевої (LA) або альфа-ліноленової кислоти (ALA) до EDA або ETrA, відповідно. Він може діяти як С16/18 елонгаза, С18/20 елонгаза та С20/22 елонгаза і може мати альтернативні, але не такі, що переважають, специфічності щодо дельта-5 та дельта-6 жирних кислот, таких як ЕРА та/або GLA, відповідно. Термін “дельта-8 десатураза” стосується ензиму, що здатен каталізувати принаймні одну реакцію десатурації, таку як десатурація ейкозадієнової кислоти (EDA) або ейкозатриєнової кислоти (ETrA) до DGLA або ЕТА, відповідно. Він діє як С20 десатураза. Терміни “полінуклеотид”, “полінуклеотидна послідовність”, “нуклеїновокислотна послідовність”, “нуклеїновокислотний фрагмент” та “ізольований нуклеїновокислотний фрагмент” використовуються тут у взаємозамінний спосіб. Ці терміни охоплюють нуклеотидні послідовності і таке подібне. Полінуклеотид може бути полімером РНК або ДНК, що є одно- або двохланцюговим, котрий містить, при потребі, синтетичні, неприродні або змінені нуклеотидні основи. Полінуклеотид у формі полімеру ДНК може складатись із одного або кількох сегментів кДНК, геномної ДНК, синтетичної ДНК або їх сумішей. На нуклеотиди (що звичайно знаходяться у своїй 5’-монофосфатній формі) посилаються однолітерним позначенням у наступний спосіб: “A” стосується аденілату або деоксиаденілату (для РНК або ДНК, відповідно), “C” стосується цитиділату або деоксицитиділату, “G” стосується гуанілату або деоксигуанілату, “U” стосується уридату, “T” стосується деокситимідилату, “R” стосується пуринів (А або G), “Y” стосується піримідинів (С або Т), “K” стосується G або Т, “H” стосується А або С або Т, “I” стосується інозину, і “N” стосується будь-якого нуклеотиду. Терміни “субфрагмент, що є функціонально еквівалентним” та “функціонально еквівалентний субфрагмент” використовуються тут у взаємозамінний спосіб. Ці терміни стосуються ділянки або субпослідовності фрагменту ізольованої нуклеїнової кислоти, в якій здатність змінювати експресію гена або утворювати деякий фенотип зберігається, кодує чи не кодує даний фрагмент або субфрагмент активний ензим. Наприклад, даний фрагмент або субфрагмент може бути використаний у конструюванні химерних генів для продукування бажаного фенотипу у трансформованій рослині. Химерні гени можуть бути сконструйовані для застосування у супресії шляхом зв’язування фрагменту нуклеїнової кислоти або її субфрагменту, кодує чи не кодує він активний ензим, у змістовій або антизмістовій орієнтації щодо рослинної промоторної послідовності. Термін “збережний домен” або “мотив” означає набір амінокислот, що консервуються у специфічних положеннях уздовж вибудованої послідовності еволюційно споріднених протеїнів. Хоча амінокислоти в інших положеннях можуть варіювати між гомологічними протеїнами, амінокислоти, котрі сильно законсервовані у специфічних положеннях, відповідають амінокислотам, що є незамінними за структурою, стабільністю або активністю протеїну. Оскільки вони характеризуються високим ступенем консервації у вибудованих послідовностях родини протеїнових гомологів, їх можна використовувати як ідентифікатори, або “сигнатури” для визначення того, чи належить протеїн зі знов визначеною послідовністю до попередньо ідентифікованої протеїнової родини. Терміни “гомологія”, “гомологічний”, “подібний у значній мірі” та “такий, що відповідає у значній мірі” застосовуються тут у взаємозамінний спосіб. Вони стосуються фрагментів нуклеїнової кислоти, де зміни в одній або кількох нуклеотидних основах не впливають на здатність даного фрагменту нуклеїнової кислоти опосередковувати генну експресію або створювати певний фенотип. Ці терміни також стосуються модифікацій фрагментів нуклеїнової кислоти даного винаходу, таких як делеція або інсерція одного або кількох нуклеотидів, що суттєво не змінюють функціональні властивості результуючого фрагменту нуклеїнової кислоти відносно первинного, немодифікованого фрагменту. Таким чином, фахівцям у даній галузі зрозуміло, що даний винахід охоплює більше, ніж специфічні ілюстративні послідовності. Більш того, фахівцеві у даній галузі зрозуміло, що у значній мірі схожі нуклеїновокислотні послідовності, які охоплюються даним винаходом, також визначаються за їх здатністю гібридизуватись (за помірно жорстких умов, наприклад, 0,5X SSC, 0,1 % SDC, 60 °C) з послідовностями, що тут наведені як приклад, або з будь-якою ділянкою розкритих тут 11 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидних послідовностей, і котрі функціонально еквівалентні розкритим тут будь-яким нуклеїновокислотним послідовностям. Умови жорсткості можуть бути відрегульовані для проведення скринінгу помірно схожих фрагментів, таких як гомологічні послідовності із віддалено споріднених організмів, сильно схожих фрагментів, таких як гени, котрі дублюють функціональні ензими із тісно споріднених організмів. Пост-гібридизаційні промивки визначають умови жорсткості. Одна із груп умов, яким віддається перевага, включає ряд промивок, починаючи від 6Х SSC, 0.5 % SDS при кімнатній температурі протягом 15 хвилин, потім повторну промивку 2Х SSC, 0,5 % SDS при 45 °C протягом 30 хвилин, і потім повторену два рази 0,2 Х SSC, 0,5 % SDS при 50 °C протягом 30 хвилин. Більша перевага віддається групі жорстких умов, що включає застосування більш високих температур, де зазначені промивки ідентичні наведеним вище, за виключенням того, що температури кінцевих двох 30-хвилинних промивок у 0,2Х SSC, 0,5 % SDS були підвищені до 60 °C. Ще одна група сильно жорстких умов включає використання двох кінцевих промивок у 0,1Х SSC, 0,1 % SDS при 65 °C. “Ідентичність послідовності” або “ідентичність” у контексті нуклеїновокислотних або поліпептидних послідовностей стосується нуклеїновокислотних основ або амінокислотних залишків у двох послідовностях, котрі є однаковими при їх групуванні на максимальну відповідність по визначеній області порівняння. Таким чином, “відсоток ідентичності послідовності” стосується величини, що визначається шляхом порівняння двох оптимально згрупованих послідовностей по області порівняння, де ділянка полінуклеотидної послідовності в області порівняння може включати добавки або делеції (тобто, гепи), у порівнянні з еталонною послідовністю (котра не містить додатків або делецій), для оптимального групування даних двох послідовностей. Відсоток обчислюється шляхом визначення кількості положень, в яких ідентична нуклеїновокислотна основа або амінокислотний залишок зустрічаються в обох послідовностях, з одержанням кількості положень, що збігаються, діленням кількості положень, що збігаються, на загальну кількість положень в області порівняння та множенням результатів на 100 з одержанням відсотку ідентичності послідовності. Корисні приклади відсотку ідентичностей послідовності включають, проте не обмежуючись цим, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % або 95 %, або будь-який цілий відсоток від 50 % до 100 %. Ці ідентичності можуть бути визначені з використанням будь-яких програм, що тут описані. Групування послідовностей та відсоток ідентичності або подібні розрахунки можуть бути проведені з використанням методів порівняння, розроблених для виявлення гомологічних послідовностей, включаючи, проте не обмежуючись цим, MegAlign™ програму обчислюваного біоінформативного пакету LASARGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Множинне групування послідовностей здійснюється з використанням методу групування Clustal V (Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) Comput. Appl. Biosci. 5: 151-153; Higgins, D.G.et al. (1992) Comput. Appl. Biosci. 8:189-191), з параметрами за умовчанням (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Встановленими параметрами для парних групувань і обчислення відсотку ідентичності протеїнових послідовностей з використанням методу Clustal є KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 та DIAGONALS SAVED=5. Для нуклеїнових кислот ці параметри є KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 та DIAGONALS SAVED=4. Фахівцям у даній галузі добре зрозуміло, що корисними в ідентифікації поліпептидів відносно інших видів є багато рівнів ідентичності послідовності, де такі поліпептиди мають таку саму або схожу функцію чи активність. Корисні приклади відсотку ідентичності включають, проте не обмежуючись цим, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % або 95 %, або будьякий цілий відсоток від 55 % до 100 %. Дійсно, будь-яка ціла амінокислотна ідентичність від 50 до 100 % може бути корисною в описі даного винаходу. Крім того, являє інтерес будь-який повномасштабний або частковий комплемент цього ізольованого нуклеотидного фрагменту. “Ген” стосується фрагменту нуклеїнової кислоти, що експресує специфічний протеїн, включаючи регуляторні послідовності, котрі передують (5’ некодуючим послідовностям) та йдуть за (3’ некодуючими послідовностями) кодуючою послідовністю. “Нативний ген” стосується гена, який існує у природі зі своїми власними регуляторними послідовностями. “Химерний ген” стосується будь-якого гена, що не є нативним геном, який містить регуляторну та кодуючу послідовності, котрі разом у природі не існують. Відповідно, химерний ген може включати регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, котрі одержуються із різних джерел, або регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, котрі одержуються із одного джерела, але розташовані у спосіб, відмінний від того, що існує у природі. “Сторонній” ген стосується гена, що звичайно не існує в організмі хазяїна, але який вводиться в організм хазяїна шляхом переносу гена. Сторонні гени можуть включати нативні гени, уведені у не-нативний організм, або химерні гени. “Трансген” являє собою ген, що введений у геном шляхом процедури трансформації. 12 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 “Кодон-оптимізований ген” являє собою ген, що має свою частоту використання кодону, замислену для імітації частоти переважного використання кодону клітини хазяїна. “Алель” являє собою одну із кількох альтернативних форм гена, що займає даний локус на хромосомі. Коли всі алелі, присутні у даному локусі на хромосомі, є однаковими, ця рослина є гомозиготною у цьому локусі. Якщо алелі, присутні у даному локусі на хромосомі, відмінні, ця рослина є гетерозиготною у цьому локусі. “Кодуюча послідовність” стосується ДНК послідовності, що кодує специфічну амінокислотну послідовність. “Регуляторні послідовності” стосуються нуклеотидних послідовностей, розташованих “угору по течії” (від 5’ некодуючих послідовностей), всередині або “вниз по течії” (від 3’ некодуючих послідовностей) кодуючої послідовності, і котрі впливають на транскрипцію, РНК процесінг або стабільність, або трансляцію асоційованої кодуючої послідовності. Регуляторні послідовності можуть включати, проте не обмежуючись цим, промотори, трансляційні сигнальні послідовності, інтрони, поліаденілувальні розпізнавальні послідовності, РНК процесінгові сайти, ефекторні зв’язувальні сайти та структури типу “стебло-петля”. “Промотор” стосується ДНК послідовності, здатної контролювати експресію кодуючої послідовності або функціональної РНК. Промоторна послідовність складається із найближчих та більш віддалених “верхніх” елементів, на останні елементи часто посилаються як на енхансери. Відповідно, “енхансер” являє собою ДНК послідовність, що може стимулювати промоторну активність, і може бути природним елементом промотору або ксеногенного елемента, що введений для підсилення рівня або тканинної специфічності промотору. Промотори можуть бути отримані у своїй повноті із нативного гена, або можуть складатись із різних елементів, одержаних від різних промоторів, що існують у природі, або навіть включати сегменти синтетичної ДНК. Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що різні промотори можуть спрямовувати експресію гена у різних тканинах або типах клітин, або на різних стадіях розвитку, або діяти як реакція на різні умови навколишнього середовища. Крім того, визнано, що оскільки у більшості випадків точні границі регуляторних послідовностей визначені не повністю, ДНК фрагменти деяких варіацій можуть мати ідентичну промоторну активність. На промотори, що спричиняють експресію гена у більшості типів клітин у більшості випадків, звичайно посилаються як на “конститутивні промотори”. Нові промотори різних типів, корисні у рослинних клітинах, постійно відкривають; множинні приклади можна знайти у компіляції Okamuro, J.K., та Goldberg, R.B. Biochemistry of Plants 15:1-82 (1989). “Трансляційна лідерна послідовність” стосується полінуклеотидної послідовності, що локалізована між промоторною послідовністю гена та кодуючою послідовністю. Трансляційна лідернапослідовність присутня у підданій повному процесінгу мРНК угору від трансляційної старт послідовності. Трансляційна лідерна послідовність може впливати на процесінг первинного транскрипту до мРНК, мРНК стабільність або трансляційну ефективність. Приклади трансляційних лідерних послідовностей описані в літературі (Turner, R. And Foster, G.D., Mol. Biotechnol. 3:225-236 (1995)). “3’ некодуючі послідовності”, “транскрипційний термінатор” або “термінуючі послідовності” стосуються ДНК послідовностей, розташованих вниз від кодуючої послідовності, і включають поліаденілувальні розпізнавальні послідовності та інші послідовності, що кодують регуляторні сигнали, здатні впливати на мРНК процесінг або експресію гена. Сигнал поліаденілування звичайно характеризується впливом на додавання трактів поліаденілової кислоти до 3’ кінця мРНК попередника. Використання різних 3’ некодуючих послідовностей ілюструється Ingelbrecht, I.L., et al. Plant Cell 1:671-680 (1989). “РНК транскрипт” стосується продукту, що є результатом каталізованої РНК полімеразою транскрипції ДНК послідовності. Коли РНК транскрипт є досконалою комплементарною копією ДНК послідовності, на нього посилаються як на основний транскрипт. На РНК транскрипт посилаються як на зрілу РНК, коли РНК послідовність отримана в результаті посттранскрипційного процесінгу основного транскрипту. “Матрична РНК” або “мРНК” стосується РНК, котра є без інтронів і котра може бути трансльована у протеїн даною клітиною. “кДНК” стосується ДНК, що комплементарна до та синтезована із мРНК матриці з використанням ензимної ревертази. кДНК може бути одноланцюговою або може бути конвертована у двохланцбгову форму з використанням фрагменту Klenow ДНК полімерази І. “Змістова” РНК стосується РНК транскрипту, що включає мРНК і може бути трансльована у протеїн всередині клітини або in vitro. “Антизмістова РНК” стосується РНК транскрипту, що комплементарний до всього або частини таргетного первинного транскрипту або мРНК, і що блокує експресію таргетного гена (U.S. Patent No. 5, 107065). Комплементарність антизмістової РНК може бути з будь-якою частиною специфічного генного транскрипту, тобто 5’ некодуючою послідовністю, 3’некодуючою послідовністю, інтронами або кодуючою послідовністю. “Функціональна РНК” 13 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стосується антизмістової РНК, рибозимної РНК або іншої РНК, що не може транслюватись, але ще має вплив на клітинні процеси. Терміни “комплемент” або “зворотний комплемент” використовуються тут у взаємозамінний спосіб щодо мРНК транскриптів, і визначають, як мається на думці, антизмістову РНК даного месиджу. Термін “зчеплений у діючий спосіб” стосується асоціації нуклеїновокислотних послідовностей на окремому нуклеїновокислотному фрагменті, так що функція однієї регулюється іншою. Наприклад, промотор зчеплений у діючий спосіб із кодуючою послідовністю, коли він здатен регулювати експресію цієї кодуючої послідовності (тобто дана кодуюча послідовність знаходиться під транскрипційним контролем промотора). Кодуючі послідовності можуть бути зчеплені у діючий спосіб з регуляторними послідовностями у змістовій або антизмістовій орієнтації. В іншому прикладі ділянки комплементарної РНК даного винаходу можуть бути зчеплені у діючий спосіб, прямо або опосередковано, 5’ з таргетною мРНК, або 3’ з таргетною мРНК, або всередині таргетної мРНК, або перша комплементарна ділянка 5’ і її комплемент 3’ з таргетною мРНК. Стандартна рекомбінантна ДНК і методи молекулярного клонування, що тут застосовані, добре відомі у даній галузі і у більш повній мірі описані у роботі Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989). Способи перетворення добре відомі фахівцям у даній галузі і описані нижче. “PCR” або “полімеразна ланцюгова реакція” являє собою метод синтезу великих кількостей специфічних ДНК сегментів і складається із ряду повторних циклів (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Типово, двохланцюгова ДНК піддається тепловій денатурації, два праймери, комплементарні до 3’ границь даного таргетного сегменту, загартовуються при низькій температурі і потім розтягаються при проміжній температурі. Одна група із таких трьох послідовних кроків називається “циклом”. Термін “рекомбінантний” стосується штучної комбінації двох відокремлених у різний спосіб сегментів послідовності, наприклад, шляхом хімічного синтезу або маніпуляції ізольованими сегментами нуклеїнових кислот методами генної інженерії. Терміни “плазміда”, “вектор” та “касета” стосуються екстрахромосомного елемента, що часто несе гени, котрі не є частиною центрального метаболізму даної клітини, і, звичайно, у формі кругових двохланцюгових ДНК фрагментів. Такі елементи можуть бути автономними реплікаційними послідовностями, геномними інтегруючими послідовностями, фаговими або нуклеотидними послідовностями, лінійними або круговими, одно- або двохланцюгової ДНК або РНК, отриманими із будь-якого джерела, де ряд нуклеотидних послідовностей був об’єднаний або рекомбінований в унікальну конструкцію, котра здатна вводити фрагмент промотору та ДНК послідовність для вибраного генного продукту разом із відповідною 3’ нетрансльованою послідовністю у клітину. “Трансформаційна касета” стосується специфічного вектора, що містить сторонній ген і має елементи на додаток до стороннього гена, які полегшують трансформацію індивідуальної хазяйської клітини. “Експресійна касета” стосується специфічного вектора, що містить сторонній ген і має елементи на додаток до стороннього гена, які дозволяють здійснювати підсилену експресію цього гена у сторонньому хазяїні. Терміни “рекомбінантний конструкт”, “експресійний конструкт”, “химерний конструкт”, “конструкт” та “рекомбінантний ДНК конструкт” використовуються тут у взаємозамінний спосіб. Рекомбінантний конструкт включає штучну комбінацію фрагментів нуклеїнової кислоти, наприклад, регуляторну та кодуючу послідовності, що разом у природі не зустрічаються. Наприклад, химерний конструкт може включати регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, що отримані із різних джерел, або регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, отримані із одного джерела, але розташовані у спосіб, відмінний від того, що є у природі. Такий конструкт може використовуватись сам по собі або у сполученні з вектором. Якщо використовується вектор, вибір вектора залежить від способу, що буде використаний для трансформації хазяйських клітин, як це добре відомо фахівцям у даній галузі. Наприклад, може бути використаний плазмідний вектор. Досвідчений фахівець добре обізнаний щодо генетичних елементів, котрі мають бути присутніми на векторі для успішної трансформації, селекції та розмноження клітин хазяїна, які включають будь-який із ізольованих фрагментів нуклеїнової кислоти даного винаходу. Досвідчений фахівець також визнає, що різні незалежні трансформаційні події дадуть різні рівні та види експресії (Jones et al., EMBO J. 4:2411-2418 (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics 218:78-86 (1989)), і тому ці множинні події мають бути піддані скринінгу для отримання ліній, котрі показують бажані рівень експресії та вид. Такий скринінг може проводитись, серед інших, за методом саузерн аналізу ДНК, норзерн аналізу мРНК експресії, імуноблоттінгового аналізу експресії протеїну або генотипного аналізу. Термін “експресія”, як тут використовується, стосується утворення функціонального 14 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кінцевого продукту (наприклад, мРНК або протеїну [як попередника, так і зрілого]). Термін “експресійна касета”, як тут використовується, стосується дискретного фрагменту нуклеїнової кислоти, в який може бути введена нуклеїновокислотна послідовність або фрагмент. “Зрілий” протеїн стосується поліпептиду, що піддавався пост-трансляційному процесінгу (тобто такого, із якого були вилучені будь-які пре- або пропептиди, присутні у первинному трансляційному продукті). “Попередниковий” протеїн стосується первинного продукту трансляції мРНК (тобто з ще присутніми пре- та пропептидами). Пре- та пропептиди можуть бути, проте не обмежуючись цим, сигналами внутрішньоклітинної локалізації. “Стабільна трансформація”стосується перенесення фрагменту нуклеїнової кислоти у геном організму хазяїна, включаючи ядерний та органеларний геноми, що дає генетично стійку спадковість. На відміну від цього, “тимчасова трансформація” стосується перенесення фрагменту нуклеїнової кислоти у ядро або органелу, що містить ДНК, або організм хазяїна, що дає експресію гена без інтеграції або стабільної спадковості. На хазяйські організми, що містять трансформовані фрагменти нуклеїнової кислоти, посилаються як на “трансгенні” організми. “Антизмістове інгібування” стосується створення антизмістових РНК транскриптів, здатних піддавати супресії експресію таргетного протеїну. “Косупресія” стосується продукування змістових РНК трапнскриптів, здатних приглушувати експресію ідентичних або у значній мірі схожих сторонніх або ендогенних генів (U.S. Patent No. 5231020). Косупресійні конструкти в рослинах були попередньо розроблені шляхом зосередження уваги на гіперекспресії нуклеїновокислотної послідовності, яка має гомологію з ендогенною мРНК, у змістовій орієнтації, що спричинило редукцію всіх РНК, котрі гомологічні з гіперекспресованою послідовністю (Vaucheret et al., Plant J. 16:651-659 (1998); Gura, Nature 404:804-808 (2000)). Загальна ефективність цього феномену низька, і ступінь РНК редукції широко варіює. У недавній роботі описано використання “шпилькових” структур, котрі включають всю або частину мРНК кодуючої послідовності у комплементарній орієнтації, що дає потенційну структуру “стебло-петля” для експресованої РНК (РСТ публікація за номером WO 99/53050, опублікована 21 жовтня 1999 року; РСТ публікація за номером WO 02/00904, опублікована 3 січня 2002 року). Це підвищує частоту косупресії у відновлених трансгенних рослинах. Інша варіація описує використання рослинних вірусних послідовностей для спрямування супресії або “заглушення” найближчих мРНК кодуючих послідовностей (РСТ публікація за номером WO 98/36083, опубліковану 20 серпня 1998 року). Обидва ці косупресивні явища не були висвітлені у механістичний спосіб, хоча генетичне свідчення почало розкривати цю складну ситуацію (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757 (1998)). Термін “олійний” стосується тих організмів, що мають тенденцію зберігати своє джерело nd енергії у формі ліпіду (Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, 2 Ed., Plenum, 1980). Загалом, вміст клітинної олії цих мікроорганізмів йде за сигмоїдною кривою, де концентрація ліпіду зростає доти, поки вона не досягне максимуму у пізній логарифмічній або ранній стаціонарній фазі зростання і потім поступово знижується протягом пізньої стаціонарної фази та фази відмирання (Yongmanitchai and Ward, Appl. Environ. Microbiol. 57:419-25 (1991)). Термін “олійні дріжджі” стосується тих мікроорганізмів, що класифікуються як дріжджі, котрі виробляють олію. Для олійних мікроорганізмів звичайним є накопичення більше приблизно 25 % своєї сухої клітинної ваги у вигляді олії. Приклади олійних дріжджів включають, проте без обмеження, наступні роди: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon та Lipomyces. “Метод групування Clustal V” відповідає методу групування, маркованому Clustal V (що описаний Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)), який можна знайти у програмі MegAlign обчислювального біоінформативного пакету LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). “Параметрами за умовчанням” є параметри, що попередньо задані створювачем програми. Для множинних групувань вони відповідають GAP PENALTY=10 та GAP LENGTH PENALTY=10; і для парних групувань є KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 та DIAGONALS SAVED=5. Після групування послідовностей з використанням програми Clustal V можливо одержати “відсоток ідентичності” шляхом візуалізації таблиці “відхилень послідовностей” у тій самій програмі. “Метод групування BLASTN” являє собою алгоритм, запроваджений Національним центром біотехнологічної інформації (NCBI) для порівняння нуклеотидних послідовностей з використанням параметрів за умовчанням. “Потомство” включає будь-яку наступну генерацію рослини. Даний винахід стосується ізольованого полінуклеотиду, який включає: (а) нуклеотидну послідовність, котра кодує поліпептид, який має дельта-8 десатуразну 15 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активність, де даний поліпептид має принаймні 80 % амінокислотну ідентичність, базуючись на методі групування Clustal V, у порівнянні з амінокислотною послідовністю, визначеною у SEQ ID NO:16; (b) нуклеотидну послідовність, котра кодує поліпептид, який має дельта-8 десатуразну активність, де зазначена нуклеотидна послідовність має принаймні 80 % ідентичність послідовності, базуючись на методі групування BLASTN, у порівнянні з нуклеотидною послідовністю, визначеною у SEQ ID NO:15; або (с) комплемент нуклеотидної послідовності (а) або (b), де даний комплемент та нуклеотидна послідовність складаються із тієї самої кількості нуклеотидів і є 100 % комплементарними. У ще одному аспекті даний винахід стосується ізольованого полінуклеотиду, що містить нуклеотидну послідовність, котра кодує поліпептид, який має дельта-8 десатуразну активність, де дана нуклеотидна послідовність має принаймні 80 % ідентичність послідовності, базуючись на методі групування BLASTN, у порівнянні з нуклеотидною послідовністю, визначеною у SEQ ID NO:15. Було встановлено, що порівняння SEQ ID NO:15 та SEQ ID NO:57 з використанням методу групування BLASTN з параметрами за умовчанням, показало, що ці послідовності мають принаймні 86 % ідентичність послідовностей. Ця дельта-8 десатураза може використовуватись окремо або у комбінації з іншими елементами десатурази та елонгази для продукування різних омега-6 та омега-3 PUFA, включаючи, наприклад, DGLA. ETA, AA, EPA, DPA та/або DHA (Фіг.12). Фахівцеві у даній галузі зрозумілі відповідні комбінації дельта-8 десатурази даного винаходу у сполученні з дельта-4 десатуразою, дельта-5 десатуразою, дельта-6 десатуразою, дельта-12 десатуразою, дельта-15 десатуразою, дельта-17 десатуразою, дельта-9 десатуразою, дельта-8 десатуразою, дельта-9 елонгазою, С14/16 елонгазою, С16/18 елонгазою, С18/20 елонгазою, та/або С20/22 елонгазою, виходячи із конкретної клітини хазяїна (та її профілю нативної PUFA та/або профілю десатурази та/або профілю елонгази), наявності субстрату та потрібного кінцевого продукту(ів). Інколи може бути бажаним мінімізувати побічні жирні кислоти. Відносний надлишок побічних жирних кислот може бути знижений шляхом підвищення загальної активності дельта-8 десатурази. Один підхід до мінімізації побічних жирних кислот може полягати в експресії більше ніж однієї дельта-8 десатурази (тобто такої самої або іншої дельта-8 десатурази). Наприклад, присутність скіадонової кислоти (SCI) та/або юніперонової кислоти (JUP), що звичайно знаходяться у насіннєвих ліпідах голонасінних (Wolff et al., Lipids 35(1):1-22 (2000)), таких як ті, що знаходяться у родині Pinaceae (сосна), може розглядатись як побічні жирні кислоти дельта-6 десатуразного або дельта-9 елонгазного шляху. Хоча ці жирні кислоти, як вважається, мають самі по собі різні корисні для здоров’я властивості (Nakane et al., Biol. Pharm. Bull. 23:758-761 (2000)), їх присутність як побічних жирних кислот на виробничому шляху PUFA, так як в олійному насінні, може бути небажаною, у залежності від застосування. В іншому варіанті даний винахід стосується рекомбінантного конструкта, який містить полінуклеотид даного винаходу, зчеплений у діючий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю. Як зазначалось вище, промотор являє собою ДНК послідовність, що спрямовує клітинний механізм рослини на продукування РНК із суміжної кодуючої послідовності вниз (3’) від промотору. Промоторна ділянка впливає на швидкість, стадію розвитку та тип клітини, в якій РНК транскрипт гена створений. РНК транскрипт піддається процесінгу для продукування мРНК, що слугує матрицею для трансляції РНК послідовності в амінокислотну послідовність закодованого пептиду. 5’ нетрансльована лідерна послідовність являє собою ділянку мРНК угору від кодуючої протеїн ділянки, що може відігравати роль в ініціації та трансляції мРНК. Сигнал 3’ термінація транскрипції/поліаденілування являє собою нетрансльовану ділянку вниз від кодуючої протеїн ділянки, що функціонує у рослинній клітині, спричиняючи термінацію РНК транскрипту та додавання поліаденілатних нуклеотидів до 3’ кінця РНК. Джерело промотору, вибраного для драйву експресії кодуючої послідовності, не є важливим, оскільки він має достатню транскрипційну активність для реалізації даного винаходу шляхом експресії здатної до трансляції мРНК до потрібних фрагментів нуклеїнової кислоти у потрібній тканині хазяїна у коректний час. Для практичного втілення даного винаходу можуть бути використані як гетерологічні, так і негетерологічні (тобто ендогенні) промотори. Наприклад, придатні промотори включають, проте не обмежуючись цим, альфа первинну субодиницю бета конгліцинового промотору, Kunitz трипсин інгібітор 3 промотор, анексиновий промотор, Gly1 промотор, бета субодиницю бета конгліцинового промотору, P34/Gly Bd m 30K промотор, альбуміновий промотор, Leg A1 промотор та Leg А2 промотор. Анексиновий, або Р34 промотор описаний у РСТ публікації за номером WO 2004/071178 16 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (опублікована 26 серпня 2004 року). Рівень активності анексинового промотору порівнянний з рівнем багатьох відомих сильних промоторів, таких як: (1) CaMV 35S промотор (Atanassova et al., Plant Mol. Biol. 37:275-285 (1998); Battraw and Hall, Plant Mol. Biol. 15:527-538 (1990); Holtorf et al., Plant Mol. Biol. 29:637-646 (1995); Jefferson et al., EMBO J. 6:3901-3907 (1987); Wilmink et al., Plant Mol. Biol. 28:949-955 (1995)); (2) Arabidopsis олеозинові промотори (Plant et al., Plant Mol. Biol. 25:193-205 (1994); Li, Texas A&M University Ph.D. dissertation, pp. 107-128 (1997)); (3) Arabidopsis убіквітинові екстензійні протеїнові промотори (Callis et al., J. Biol. Chem. 265(21):12486-93 (1990)); (4) томатний убіквітиновий генний промотор (Rollfinke et al., Gene. 211(2):267-76 (1998)); (5) соєвий теплошоковий протеїновий промотор (Schoffl et al., Mol. Gen. Genet. 217(2-3):246-53 (1989)); та (6) маїсовий Н3 гістонний генний помотор (Atanassova et al., Plant Mol. Biol. 37(2):275-85 (1989)). Іншою корисною особливістю анексинового промотору є його профіль експресії в насінні, що розвивається. Анексиновий промотор найбільш активний у насінні, що розвивається, на ранніх стадіях (до 10 діб після запилення), і у значній мірі спокійний на пізніх стадіях. Профіль експресії анексинового промотору відрізняється від профілю багатьох специфічних щодо насіння промоторів, наприклад, протеїнових промоторів зберігання насіння, котрі часто запроваджують найвищу активність на пізніх стадіях розвитку (Chen et al., Dev. Genet. 10:112-122 (1989); Ellerstrom et al., Plant Mol. Biol. 32:1019-1027 (1996); Keddie et al., Plant Mol. Biol. 24:327-340 (1994); Plant et al., (supra); Li, (supra)). Анексиновий промотор має більш звичайний профіль експресії, але лишається відмінним від інших відомих специфічних до насіння промоторів. Таким чином, анексиновий промотор буде дуже привабливим кандидатом, коли на ранній стадії розвитку потрібна гіперекспресія або супресія гена у зародку. Наприклад, може виникнути проблема в гіперекспресії гена, що регулює ранній розвиток зародку, або гена, включеного у метаболізм до визрівання насіння. Після ідентифікації відповідного промотору, придатного для експресії специфічної кодуючої послідовності, даний промотор потім зчіплюють у діючий спосіб у змістовій орієнтації з використанням звичайних засобів, що добре відомі фахівцям у даній галузі. Стандартна рекомбінантна ДНК та методи молекулярного клонування, що тут застосовані, добре відомі у даній галузі і більш у повній мірі описані у роботі Sambrook, J. Et al., In Molecular nd Cloning: A Laboratory Manual; 2 ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, 1989 (у подальшому, “Sambrook et al., 1989”) або Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K., Eds.; In Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley and Sons: New York, 1990 (у подальшому “Ausubel et al., 1990”). Коли рекомбінантний конструкт створений, він може потім бути введений у потрібну рослинну клітину з використанням методів, що добре відомі звичайним фахівцям у даній галузі (наприклад, трансфекція, трансформація та електропорація). Рослинними клітинами, яким віддається перевага, є олійні рослинні клітини. Потім трансформована рослинна клітина культивується та регенерується за придатних умов, що дозволяють здійснювати експресію довголанцюгової PUFA, котра потім, при потребі, відновлюється та очищається. Рекомбінантні конструкти даного винаходу можуть бути введені в одну рослинну клітину; або, як альтернатива, кожний конструкт може бути введений в окремі рослинні клітини. Експресія у рослинній клітині може проводитись у тимчасовий або стабільний спосіб як описано вище. Потрібна довголанцюгова PUFA може бути експресована у насінні. Крім того, в обсяг даного винаходу входить насіння або частини рослини, отримані із таких трансформованих рослин. Частини рослин включають диференційовані та недиференційовані тканини, включаючи, проте не обмежуючись цим, наступні: корені, стебла, пагони, листя, пилок, насіння, пухлинну тканину та різні форми клітин та культур (наприклад, окремі клітини, протопласти, зародки та калюсну тканину). Дана рослинна тканина може бути у рослині або в рослинному органі, тканині або клітинній культурі. Термін “рослинний орган” стосується рослинної тканини або групи тканин, що складають морфологічно та функціонально відмінну частину рослини. Термін “геном” стосується наступного: (1) увесь комплемент генетичного матеріалу (гени та некодуючі послідовності), присутній у кожній клітині організму або вірусу, або органели; (2) повний набір хромосом, успадкований як (гаплоїдна) одиниця від одного предка. Таким чином, даний винахід також стосується способу трансформації клітини, який включає трансформування клітини рекомбінантним конструктом даного винаходу і селекцію цих клітин, трансформованих рекомбінантним конструктом згідно з п.5. Також являє інтерес спосіб продукування трансформованої рослини, що включає трансформування рослинної клітини полінуклеотидом даного винаходу та регенерацію рослини 17 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 із трансформованої рослинної клітини. Способи трансформування дводольних рослин (головним чином, шляхом використання Agrobacterium tumefaciens) та одержання трансгенних рослин опубліковані, серед інших, для: бавовни (U.S. Patent No. 5004863; U.S. Patent No. 5159135); сої (U.S. Patent No. 5569834; U.S. Patent No. 5416011); Brassica (U.S. Patent No. 5463174); арахісу (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996); McKently et al., Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)); папайi (Ling, K. Et al., Bio/technology 9:752-758 (1991)); та гороху (Grant et al., Plant Cell Rep. 15;254-258 (1995)). Щодо огляду інших загальних методів перетворення рослин дивись роботу Newell, C.A. (Mol. Biotechnol. 16:53-65 (2000)). В одному із цих методів трансформації використовується Agrobacterium rhizogenes (Tepfler, M. and Casse-Delbart, F. Microbiol. Sci. 4:24-28 (1987)). Перетворення сої з використанням прямої доставки ДНК та PEG злиття опубліковано у РСТ публікації за номером WO 92/17598, електропорації (Chowrina, G.M. et al., Mol. Biotechnol 3:1723 (1995); Christou, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3962-3966 (1987)), мікроін’єкції або бомбардування частинками (McCabe, D.E. et al., Bio/Technology 6:923 (1988); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988)). Існує множина методів регенерації рослин із рослинної тканини. Конкретний метод регенерації буде залежати від вихідної рослинної тканини та конкретного виду рослини, що має регенеруватись. Регенерація, розвиток та культивування рослин із окремих рослинних протопластних трансформантів або із різних трансформованих експлантатів добре відомі у даній галузі (Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic: San Diego, CA (1988)). Ця регенерація та процес росту звичайно включають стадії селекції трансформованих клітин та культивування даних індивідуальних клітин через звичайні стадії ембріонального розвитку через кореневу проросткову стадію. Трансгенні зародки та насіння регенеруються у подібний спосіб. Результуючі трансгенні кореневі пагони потім вирощуються у відповідному середовищі рослинного росту, такому як ґрунт. Краще, коли регенеровані рослини самозапилюються, запроваджуючи гомозиготні трансгенні рослини. По-іншому, пилок, одержаний від регенерованих рослин, схрещується з рослинами, що вирощені із насіння агрономічно важливих ліній. Навпаки, пилок від рослин цих важливих ліній використовується для запилення регенерованих рослин. Трансгенна рослина даного винаходу, що містить потрібний поліпептид, культивується з використанням методів, що добре відомі фахівцям у цій галузі. На додаток до обговорених вище процедур, практикам знайомі стандартні ресурсні матеріали, котрі описують специфічні умови та процедури для конструювання, маніпуляції та виділення макромолекул (наприклад, ДНК молекул, плазмід і т.д.), генерації фрагментів рекомбінантної ДНК та рекомбінантних експресійних конструктів, та скринінгу і виділення клонів. Дивись, наприклад, Samdrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: NY (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor: NY (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, Vol.1, Cold Spring Harbor: NY (1998); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, Vol.2, Cold Spring Harbor: NY (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer: NY (1997). Приклади олійних рослин включають, проте не обмежуючись цим, сою, види Brassica, соняшник, маїс, бавовну, льон та сафлор красильний. Приклади поліненасичених жирних кислот, що мають принаймні двадцять вуглецевих атомів та п’ять або більше подвійних зв’язків вуглець-вуглець, включають, проте не обмежуючись цим, омега-3 жирні кислоти, такі як ЕРА, DPA та DHA. Насіння, що отримане від таких рослин, також підпадає під обсяг даного винаходу, так само як і олія, отримана від такого насіння. В одному варіанті даний винахід стосується олійної рослини, що включає: (а) перший рекомбінантний ДНК конструкт, що містить ізольований полінуклеотид, який кодує принаймні один дельта-8 десатуразний поліпептид, зчеплений у діючий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю; та (b) принаймні один додатковий рекомбінантний ДНК конструкт, який містить ізольований полінуклеотид, зчеплений у дієвий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю, що кодує поліпептид, вибраний із групи, яка складається із дельта-4 десатурази, дельта-5 десатурази, дельта-6 десатурази, дельта-8 десатурази, дельта-9 десатурази, дельта-12 десатурази, дельта-15 десатурази, дельта-17 десатурази, дельта-9 елонгази, С14/16 елонгази, С16/18 елонгази, С18/20 елонгази та С20/22 елонгази. Такі десатурази обговорюються, наприклад, у U.S. Patent Nos. WO 98/46763, WO 98/46764, WO 00/127720 та WO 00/40705. Вибір комбінації застосованих касет залежить, частково, від PUFA профілю та/або профілю десатурази/елонгази клітин олійної рослини, що має трансформуватись, та довголанцюгової 18 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 PUFA, котра має експресуватись. В іншому аспекті даний винахід стосується способу створення довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у рослинній клітині, який включає: (а) трансформацію клітини рекомбінантним конструктом даного винаходу; та (b) селекцію цих трансформованих клітин, що виробляють довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти. У ще одному аспекті даний винахід стосується способу продукування принаймні однієї поліненасиченої жирної кислоти у клітині сої, який включає: (а) трансформацію соєвої клітини першим рекомбінантним ДНК конструктом, що містить ізольований полінуклеотид, котрий кодує принаймні один дельта-8 десатуразний поліпептид, зчеплений у діючий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю, і принаймні один додатковий рекомбінантний ДНК конструкт, що містить ізольований полінуклеотид, зчеплений у діючий спосіб з принаймні однією регуляторною послідовністю, що кодує поліпептид, вибраний із групи, яка складається із дельта-4 десатурази, дельта-5 десатурази, дельта-6 десатурази, дельта-8 десатурази, дельта-9 десатурази, дельта-12 десатурази, дельта-15 десатурази, дельта-17 десатурази, дельта-9 елонгази, С14/16 елонгази, С16/18 елонгази, С18/20 елонгази та С20/22 елонгази; (b) регенерацію соєвої рослини із трансформованої клітини стадії (а); та (с) селекцію насіння, одержаного від рослин стадії (b), що має змінений рівень поліненасичених жирних кислот у порівнянні з рівнем у насінні, одержаному від нетрансформованої соєвої рослини. Способи виділення насіннєвих олій добре відомі у даній галузі: (Young et al., Processing of Fats and Oils, In The Lipid Handbook, Gunstone et al., eds., Chapter 5 pp 253-257; Chapman & Hall: London (1994)). Наприклад, соєва олія виготовляється з використанням ряду кроків, включаючи екстракцію та очищення їстівного олійного продукту із насіння, що несе олію. Соєві олії та соєві побічні продукти одержуються з використанням узагальнених кроків, що наведені у Таблиці 3. Таблиця 3 Узагальнені кроки для виробництва соєвої олії та її побічних продуктів Крок процесу #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 Соєве насіння Екстракція олії Знесмолювання Лужне або фізичне рафінування Водна промивка Вибілювання (гідрування) (фракціонування охолодженням) #9 35 40 Дезодорація #10 30 Видалені домішки та/або отримані побічні продукти Процес Мука Лецитин Смоли, вільні жирні кислоти, пігменти Мило Колер, мило, метал Стеарин Вільні жирні кислоти, токофероли, стерини, летючі речовини Олійні продукти Більш конкретно, насіння сої піддається очищенню, темперуванню, лущенню та вальцюванню, підвищуючи у такий спосіб ефективність екстракції олії. Екстракція олії звичайно проводиться розчинником (наприклад, гексаном), але також може досягатись комбінацією фізичного тиску та/або екстракцією розчинником. Результуюча олія називається сирою олією. Сира олія може бути знесмолена шляхом гідрування фосфоліпідів та інших полярних і нейтральних ліпідних комплексів, що полегшує їх відокремлення від тригліцеридної фракції, що не гідрується (соєва олія). Результуючі лецитинові смоли можуть додатково оброблятись для виготовлення комерційно важливих лецитинових продуктів, котрі використовуються у різновиді харчових та промислових продуктів як емульсіфікатори та речовини, що запобігають злипанню. Знесмолена олія потім може піддаватись рафінуванню для видалення домішок (головним чином, жирних кислот, пігментів та залишкових смол). Рафінування здійснюється шляхом додавання каустичного агента, який реагує з вільною жирною кислотою з утворенням мила та гідратів фосфатидів і протеїнів у сирій олії. Вода використовується для вимивання слідів мила, що утворилось підчас рафінування. Побічний мильний продукт може використовуватись 19 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 безпосередньо у тваринних кормах або може піддаватись підкисленню для відновлення вільних жирних кислот. Забарвлення позбавляються шляхом адсорбції вибілюючою землею, котра вилучає більшість хлорофілу та каротинових сполук. Рафінована олія може бути гідрована, з утворенням, у результаті, жирів з різними властивостями плавлення та текстурами. Фракціонування охолодженням може бути використано для вилучення стеарину із гідрованої олії шляхом кристалізації за ретельно контрольованих умов охолодження. Дезодорація (головним чином, шляхом парової дистиляції у вакуумі) є останнім кроком і призначена для вилучення сполук, котрі надають запах або аромат олії. Інші цінні побічні продукти, такі як токофероли та стерини, можуть бути видалені підчас процесу дезодорації. Дезодорований дистилят, що містить ці побічні продукти, може бути проданий для виробництва натурального вітаміну Е та інших високоцінних фармацевтичних продуктів. Рафіновані, вибілені (гідровані, фракціоновані) та дезодоровані олії та жири можуть запаковуватись і прямо продаватись або додатково перероблятись у більш спеціалізовані продукти. Більш детальне посилання на обробку соєвого насіння, виробництво соєвої олії та використання побічних продуктів можна знайти у Erickson, Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization, The American Oil Chemists’ Society and United Soybean Board (1995). Соєва олія є рідкою при кімнатній температурі, оскільки вона має відносно низький вміст насичених жирних кислот у порівнянні з оліями, такими як кокосова, пальмова, пальмовим маслом та какао маслом. Багато перероблених жирів (включаючи спреди, кондитерські жири, тверді масла, маргарини, хлібопекарні жири і т.д.) потребують різних ступенів твердості при кімнатній температурі і можуть вироблятись із соєвої олії лише шляхом зміни її фізичних властивостей. У найбільш загальному випадку це досягається шляхом каталітичного гідрування. Гідрування являє собою хімічну реакцію, в якій водень додається до подвійних зв’язків ненасиченої жирної кислоти за допомогою каталізатора, такого як нікель. Високоолеїнова соєва олія містить ненасичену олеїнову, LA та ліноленову жирні кислоти, і кожна з них може гідруватись. Гідрування має два головних ефекти. По-перше, окиснювальна стійкість олії підвищується в результаті відновлення ненасичених жирних кислот. По-друге, фізичні властивості олії змінюються, оскільки жирнокислотні модифікації підвищують точку плавлення, що дає напівтвердий або твердий жир при кімнатній температурі. Існує багато змінних, котрі впливають на реакцію гідрування, що у свою чергу змінює склад кінцевого продукту. Робочі умови, що включають тиск, температуру, тип каталізатора та концентрацію, перемішування та конструкцію реактора, знаходяться серед найбільш важливих параметрів, котрі можуть контролюватись. Умови селективного гідрування можуть бути використані для гідрування більш насичених жирних кислот у порівнянні з менш насиченими кислотами. Дуже легке або щіткове гідрування часто застосовується для підвищення стабільності рідких олій. Подальше гідрування перетворює рідку олію на фізично твердий жир. Ступінь гідрування залежить від потрібної продуктивності та характеристик плавлення, що передбачаються для кінцевого продукту. Рідкі олії (що використовуються у виробництві хлібопекарських продуктів, твердих жирів та олій, які застосовуються для операцій смаження та обсмажування у торгівлі) та основна сировина для виробництва маргарину знаходяться серед великої множини можливих олійних та жирових продуктів, які одержуються шляхом гідрування. Більш детальний опис гідрування та продуктів гідрування можна знайти у Patterson, H.B.W., Hydrogenation of Fats and Oils: Theory and Practice. The American Oil Chemists’ Society (1994). Гідровані олії стали також контроверсійними через присутність транс-жирнокислотних ізомерів, що виникають в результаті процесу гідрування. Уживання великих кількостей трансізомерів зв’язується зі шкідливими для здоров’я ефектами, включаючи підвищені відношення ліпопротеїнів низької щільності до ліпопротеїнів високої щільності у плазмі крові та підвищений ризик коронарної хвороби серця. У порівнянні з іншими рослинними оліями, олії даного винаходу, як можна вважати, діють подібно до інших олій у харчових застосуваннях з фізичної точки зору. Частково гідровані олії, такі як соєва олія, широко використовуються як інгредієнти для м’яких спредів, маргарину та олій для випічки та смаження. Загалом, накопичення ліпідів в олійних мікроорганізмах запускається як реакція на величину повного відношення вуглецю до азоту, наявне у ростовому середовищі. Цей процес, що веде до de novo синтезу вільного пальмітату (16:0) в олійних мікроорганізмах, детально описаний у РСТ публікації за номером WO 2004/191757. Пальмітат є попередником похідних більш довголанцюгових насичених та ненасичених жирних кислот, котрі утворені шляхом дії елонгаз та десатураз. Наприклад, пальмітат перетворюється в свою ненасичену похідну (пальмітолеїнову кислоту (16:1)) шляхом дії дельта-9 десатурази. Подібно до цього, пальмітат 20 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 подовжується за допомогою С16/18 жирнокислотної елонгази з утворенням стеаринової кислоти (18:1), котра може бути перетворена у свою ненасичену похідну дією дельта-9 десатурази з отриманням у такий спосіб олеїнової кислоти (18:1). Триацилгліцерини (основна одиниця накопичення для жирних кислот) утворюються шляхом етерифікації двох молекул ацил-СоА з гліцерин-3-фосфатом з одержанням 1,2-діацилгліцерин фосфату (який звичайно ідентифікується як фосфатидна кислота). Потім фосфат вилучається, фосфатазою фосфатидної кислоти, з одержанням 1,2-діацилгліцерину. Триацилгліцерин утворюється при додаванні третьої жирної кислоти дією діацилгліцерин-ацил трансферази. Багато мікроорганізмів, включаючи морські водорості, бактерії, плісняву та дріжджі, можуть синтезувати PUFA та омега жирні кислоти у звичайному ході клітинного метаболізму. Особливо добре вивчені гриби, включаючи Schizochytrium aggregatm, види генів Thraustochytrium та Morteriella alpina. Крім того, багато дінофлагелатів (Dinophyceaae) у природній спосіб продукують високі концентрації PUFA. Як такі, були ідентифіковані багато генів, що задіяні у виробленні олії, за допомогою генетичних засобів, і ДНК послідовності деяких із цих генів доступні широкому загалу. Дивись, наприклад, AY131238, Y055118, AY055117, AF296076, AF007561, L11421, NM_031344, AF465283, AF465281, AF110510, AF465282, AF419296, AB052086, AJ250735, AF126799, AF126798 (дельта-6десатурази): AF199596, AF226273, AF320509, AB072976, AF489588, AJ510244, AF419297, AF07879, AF067654, AB022097 (дельта-5 десатурази); AAG36933, AF110509, AB020033, AAL13300, AF417244, AF161219, AY332747, AAG36933, AF110509, X86736, AF240777, AB007640, AB075526, AP002063 (дельта-12 десатурази); NP_441622, BAA18302, BAA02924, AAL36934 (дельта-15 десатурази); AF338466, AF438199, E11368, E11367, D83185, U90417, AF085599, AY504633, NM_069854, AF230693 (дельта-9 елонгаза); AF139720 та CQ831420 (дельта-8 десатураза); та АХ464731, NM_119617, NM_134255, NM_134383, NM_134382, NM_068396, NM_068392, NM_070713, NM_068746, NM_064685 (елонгази). Крім того, патентна література дає багато додаткових ДНК послідовностей генів (та/або подробиць, що стосуються кількох із розглянутих вище генів і способів їх виділення), задіяних у продукуванні PUFA (наприклад, РСТ публікація за номером WO 02/077213 (дельта-9 елонгази); РСТ публікація за номером WO 00/34439, WO 04/057001 та U.S. Patent No. 6825017 (дельта-8 десатурази); U.S. Patent No. 5968809 (дельта-6 десатурази); U.S. Patent No. 5972664 та U.S. Patent No. 6075183 (дельта-5 десатурази); РСТ публікація за номером WO 94/11516, U.S. Patent No. 5443974, РСТ публікація за номером WO 03/099216 та РСТ публікація за номером WO 05/047485 (дельта-12 десатурази); РСТ публікація за номером WO 93/11245 (дельта-15 десатурази); РСТ публікація за номером WO 91/13972 та U.S. Patent No. 5057419 (дельта-9 десатурази); U.S. публікація за номером 2003/0196217 A1 (дельта-17 десатураза); та РСТ публікація за номером WO 00/12720 і РСТ публікація за номером WO 2002/077213, U.S. Patent No. 6403349, U.S. Patent No. 6677145, та U.S. публікація за номером 2004/0111763 (C 14/16, C16/18 та С18/20 елонгази)). На кожен із цих патентів та заявок у даному тексті зроблено повне посилання. Як зрозуміло фахівцеві у даній галузі, конкретні функціональні групи, які потрібно ввести в мікробний хазяйський організм для продукування конкретної PUFA кінцевого продукту, будуть залежати від клітини хазяїна (і профілю її нативної PUFA та/або профілю десатурази/елонгази), наявності субстрату та бажаного кінцевого продукту(ів). LA, GLA, EDA, DGLA, AA, ALA, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA та DHA можуть усі одержуватись в олійних дріжджах шляхом уведення різних комбінацій наступних PUFA ензимних функціональних груп: дельта-4 десатурази, дельта5 десатурази, дельта-6 десатурази, дельта-8 десатурази, дельта-12 десатурази, дельта-15 десатурази, дельта-17 десатурази, дельта-9 десатурази, дельта-9 елонгази, С14/16 елонгази, С16/18 елонгази, С18/20 елонгази та/або С20/22 елонгази. Фахівцеві у даній галузі зрозуміло, яким чином ідентифікувати різні гени-кандидати, що кодують кожен із наведених вище ензимів, згідно з наявною літературою (наприклад, GenBank), патентною літературою та експериментальним аналізом мікроорганізмів, котрі мають здатність виробляти PUFA. Послідовності можуть бути виведені із будь-якого джерела, наприклад, виділеного із природного джерела (із бактерій, морських водоростей, грибів, рослин, тварин, і т.д.), створеного через напівсинтетичну схему або синтезованих de novo. У деяких варіантах перевага віддається маніпуляціям з генами, ендогенними до хазяїна; для інших цілей потрібно вводити гетерологічні гени. Хоча конкретне джерело десатуразних та елонгазних генів, уведених у хазяїна, не є критичним для даного винаходу, міркування щодо вибору специфічного поліпептиду, який має десатуразну або елонгазну активність, включають (1) специфічність субстрату даного поліпептиду, (2) чи є поліпептид або його компонент ензимом, що лімітує швидкість, (3) чи є десатураза або елонгаза суттєвою для синтезу потрібної PUFA, і/або (4) ко-фактори, яких 21 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потребує поліпептид. Краще, коли експресований поліпептид має параметри, сумісні з біохімічним оточенням його місцезнаходження у хазяйській клітині. Наприклад, даний поліпептид може мати конкуренцію щодо субстрату з іншими ензимами у хазяйській клітини. Тому аналізи КМ та специфічної активності поліпептиду ураховуються у визначенні придатності даного поліппетиду для модифікації вироблення PUFA у даній хазяйській клітині. Поліпептид, що використовується у конкретній хазяйській клітини, є таким, що може функціонувати за біохімічних умов, наявних у передбаченій клітині-хазяїні, але, як альтернатива, може бути будьяким поліпептидом, що має десатуразну або елонгазну активність, здатну модифікувати потрібну PUFA. У деяких випадках хазяйський організм, в якому бажано виробляти PUFA, буде мати ендогенні гени, що кодують деякі ензими PUFA біосинтетичного шляху. Наприклад, олійні дріжджі можуть, типово, виробляти 18:2 жирні кислоти (і деякі мають додаткову здатність синтезувати 18:3 жирні кислоти); таким чином, олійні дріжджі мають, типово, нативну дельта-12 десатуразну активність і можуть також мати дельта-15 десатурази. Тому у деяких варіантах перевага віддається експресії нативного десатуразного ензиму, у порівнянні з гетерологічним (або “стороннім”) ензимом, оскільки (1) нативний ензим оптимізований щодо взаємодії з іншими ензимами та протеїнами всередині даної клітини, і (2) маловірогідно, що гетерологічні гени поділяють ту саму кодонову преференцію в організмі хазяїна. Крім того, виникають переваги, коли послідовність нативного гена відома, оскільки це дозволяє здійснювати легкий розрив ендогенного гена шляхом цілеспрямованого розриву. Проте, у багатьох випадках відповідні десатурази та елонгази, потрібні для вироблення бажаних PUFA продуктів, відсутні у вибраному хазяйському організмі. Тому потрібно вводити гетерологічні гени. В одному варіанті даного винаходу була проведена робота з ціллю розробки олійних дріжджів, що накопичують олії, збагачені довголанцюговими омега-3 та/або омега-6 жирними кислотами, через експресію дельта-9 елонгаза/дельта-8 десатуразного шляху, для забезпечення продукування EDA, DGLA, ARA, ALA, ETrA, ETA, EPA, DPA та/або DHA. Тому для експресії генів, що кодують дельта-9 елонгаза/дельта-9 десатуразний шлях, для біосинтезу довголанцюгових PUFA (наприклад, АА та ЕРА) у цих організмах, було потрібно (1) ідентифікувати придатну дельта-9 елонгазу та дельта-8 десатуразу, що функціонують відносно ефективно в олійних дріжджах, виходячи із субстрат-живильних випробувань, та (2) піддати дельта-9 елонгазний та дельта-8 десатуразний ген кодон-оптимізаційним методам (нижче) для додаткового підсилення експресії гетерологічних ензимів в альтернативному олійнодріжджевому хазяїні, для забезпечення у такий спосіб максимального продукування омега-3 та/або омега-6 жирних кислот. Фахівцеві у даній галузі очевидно, що гетерологічні гени будуть експресовані з різними ефективностями в альтернативному хазяїні. Так, омега-3 та/або омега-6 PUFA продукування може бути оптимізоване шляхом селекції особливих десатурази та елонгази, рівню експресії яких у гетерологічному хазяїні віддається перевага щодо експресії альтернативних десатурази або елонгази в хазяйському організмі, що являє інтерес. Крім того, може бути бажаним модифікувати експресію ензимів даного PUFA біосинтетичного шляху для досягнення оптимальної ефективності конверсії кожного, згідно зі специфічною PUFA продуктовою композицію, що являє інтерес. Існує різновид методів генної інженерії для оптимізації експресії даного ензиму. Два таких способи включають оптимізацію кодона та мутацію гена, як описано нижче. Гени, створені за допомогою, наприклад, будь-якого із зазначених двох способів, що мають десатуразну та/або елонгазну активність(ості), були б корисними у даному винаході для синтезу омега-3 та/або омега-6 PUFA. Як зрозуміло фахівцям у даній галузі, часто корисно модифікувати ділянку кодонів, що кодують поліпептид, котрий має бути експресований у сторонньому хазяїні, у такий спосіб, що модифікований поліпептид використовує кодони, яким віддає перевагу альтернативний хазяїн. Використання кодонів, яким віддає перевагу хазяїн, може у значній мірі підсилити експресію стороннього гена, що кодує даний поліпептид. Загалом, кодони, яким віддає перевагу хазяїн, можуть бути визначені серед окремих видів хазяїв, що являють інтерес, шляхом вивчення використання кодонів у протеїнах (краще тих, які експресовані у найбільшій кількості) і визначення, які кодони використовуються найбільш часто. Потім може бути синтезована кодуюча послідовність для потрібного поліпептиду, який має десатуразну або елонгазну активність, яка в цілому або частково використовує кодони, яким віддається перевага у хазяйських видах. Вся (або частини) ДНК також може бути синтезована з вилученням будь-яких дестабілізуючих послідовностей або ділянок вторинної структури, що можуть бути присутніми у транскрибованій мРНК. Вся (або частини) ДНК також може бути синтезована зі зміною базового складу на такий, якому віддається більша перевага у потрібній 22 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хазяйській клітині. У даному винаході бажано модифікувати ділянку кодонів, що кодують поліпептид, який має дельта-8 десатуразну активність, для підсилення експресії гена в організмі хазяїна, включаючи, проте не обмежуючись цим, рослину, частини рослин та/або олійні дріжджі Yarrowia lipolytica. Нуклеїновокислотна послідовність нативного гена (тобто Pavlova lutheri дельта-8 десатураза, визначена тут як SEQ ID NOs: 14, 15 та 16) модифікується із використанням кодонів, яким хазяїн віддає перевагу. Ця десатураза дикого типу має 423 амінокислоти (SEQ ID NO:16); у кодоноптимізованому гені (SEQ ID NO:57), 166 bp 1272 bp кодуючої ділянки (13,1 %) та 161 кодон є кодон-оптимізованими (38,1 %), і сайт ініціаціїтрансляції модифікований. Фахівцеві у даній галузі зрозуміло, що модуляція Pavlova lutheri дельта-8 десатурази, так само як і численних інших гетерологічних дельта-8 десатураз зі змінних джерел, може бути кодон-оптимізована для поліпшення їх експресії в олійно-дріжджовому хазяїні (наприклад, дивись Приклад 18, де синтетична кодон-оптимізована дельта-8 десатураза, одержана із Pavlova lutheri, була створена для експресії у Yarrowia lipolytica). Даний винахід включає повну послідовність синтетичного кодон-оптимізованого гена, як зазначається у супровідному Лістингу послідовностей (SEQ ID NO:57), комплемент цих повних послідовностей та значні ділянки цих послідовностей. Крім того, метод кодон-оптимізації, описаний у РСТ публікації за номером WO 2004/101753, та описаний тут для оптимізації Pavlova lutheri дельта-8 десатурази, у рівній мірі придатний до інших генів на біосинтетичному шляху омега-3/омега-6 жирних кислот. Способи синтезу послідовностей та зведення їх разом добре встановлені у літературі. Наприклад, in viro мутагенез та селекція, сайт-спрямований мутагенез, схильна до помилок PCR (полімеразна ланцюгова реакція) (Melnikov et al., Nucleic Acids Research, 27(4):1056-1062 (February 1999)), “перетасовка генів” та інші засоби можуть бути використані для одержання мутацій природних десатуразних або елонгазних генів (де такі мутації можуть включати делеції, інсерції та точкові мутації, або їх комбінації). Це дає можливість виробляти поліпептид, який має десатуразну або елонгазну активність, відповідно, in vivo з більш потрібними фізичними та кінетичними параметрами для функціонування у хазяйській клітини, такими як триваліший період піврозпаду або більша швидкість продукування бажаної PUFA. Або, при потребі, ділянки потрібного поліпептиду (тобто десатурази або елонгази), важливі для діяльності ензимів, можуть бути визначені шляхом рутинного мутагенезу, експресії результуючих мутантних поліпептидів та визначення їх активностей. Огляд цих методів поданий у РСТ публікації за номером WO 2004/101757. Усі такі мутантні протеїни та нуклеотидні послідовності, що їх кодують, котрі виведені із кодон-оптимізованого гена, описаного тут, підпадають під обсяг даного винаходу. Мікробне виробництво омега-3 та/або омега-6 жирних кислот має кілька переваг. Наприклад, (1) відомо багато мікробів із сильно спрощеними складами олій у порівнянні з більш високими організмами, що робить очистку бажаних компонентів простішою, (2) мікробне виробництво не піддається флуктуаціям, спричиненим зовнішніми чинниками, такими як погода та постачання їжі, (3) олія, вироблена мікробами, у значній мірі вільна від забруднення полютантами із навколишнього середовища, (4) мікроби можуть запроваджувати PUFA в особливих формах, котрі можуть мати специфічні застосування, і (5) мікробним виробництвом олії можна маніпулювати шляхом контролю умов культивування, особливо шляхом запровадження особливих субстратів для експресованих мікробами ензимів, або шляхом додавання сполук/генною інженерією для приглушення небажаних біохімічних шляхів. Окрім цих переваг, виробництво омега-3 та/або омега-6 жирних кислот із рекомбінантних мікробів надає можливість змінювати природний профіль мікробних жирних кислот шляхом запровадження нових біосинтетичних шляхів у хазяїна або приглушення небажаних шляхів, підвищуючи тим самим рівні потрібних PUFA, або їх кон’югованих форм, і знижуючи рівні небажаних PUFA. Наприклад, можливо модифікувати відношення одержаних у такий спосіб омега-3 жирних кислот до омега-6 жирних кислот, виробляти виключно або омега-3 або омега-6 жирні кислоти, виключаючи одночасно продукування альтернативної омега жирної кислоти, або організувати вироблення специфічної PUFA без значного накопичення інших PUFA “нижчих” або “вищих” продуктів (наприклад, запровадити біосинтез АА, ЕРА та/або DHA шляхом дельта-9 елонгаза/дельта-8 десатураза, виключаючи у такий спосіб синтез GLA та/або STA). Гени та генні продукти, що тут описані, можуть вироблятись у гетерологічних мікробних хазяйських клітинах, зокрема, в клітинах олійних дріжджів (наприклад, Yarrowia lipolytica). Експресія в рекомбінантних мікробних хазяях може бути корисною для вироблення різних інтермедіатів PUFA шляху або для модуляції PUFA шляхів, що вже існують в хазяїні, для синтезу нових продуктів, що раніше було неможливим з використанням даного хазяїна. Системи мікробної експресії та експресійні вектори, що містять регуляторні послідовності, 23 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 котрі спрямовують високорівневу експресію сторонніх протеїнів, добре відомі фахівцям у даній галузі. Будь-яка з них може бути використана для конструювання химерних генів для продукування будь-якого із генних продуктів десатуразних та/або елонгазних послідовностей, яким віддається перевага. Ці химерні гени можуть потім бути введені у відповідні мікроорганізми шляхом трансформації, запроваджуючи високорівневу експресію кодованих ензимів. Відповідно, очікується, що введення химерних генів, котрі кодують PUFA біосинтетичний шлях, під контролем відповідних промоторів, приведе до підсиленого вироблення омега-3 та/або омега-6 жирних кислот. Передбачається, що буде корисним експресувати разом різні комбінації цих PUFA десатуразних та елонгазних генів у хазяйському мікроорганізмі. Фахівцеві у даній галузі зрозуміло, що конкретні гени, включені в конкретну енкспресійну касету(ти), будуть залежати від хазяйської клітини, здатності синтезувати PUFA з використанням нативних десатураз та елонгаз, наявності субстрату та потрібного кінцевого продукту(тів). Наприклад, може виникнути потреба сконструювати експресійну касету, що включає гени, які кодують одну або кілька наступних ензиматичних активностей: дельта-4 десатуразу, дельта-5 десатуразу, дельта-6 десатуразу, дельта-8 десатуразу, дельта-12 десатуразу, дельта-15 десатуразу, дельта-17 десатуразу, дельта-9 десатуразу, дельта-9 елонгазу, С14/16 елонгазу, С16/18 елонгазу, С18/20 елонгазу та/або С20/22 елонгазу. Як такий, даний винахід охоплює спосіб продукування PUFA, який включає експонування жирнокислотного субстрату до PUFA ензиму(мів), що тут описані, таке, що даний субстрат перетворюється у потрібний жирнокислотний продукт. Таким чином, кожен PUFA ген та відповідний ензимний продукт, що тут описаний (наприклад, дикого типу, кодон-оптимізований, синтетичний та/або мутантний ензим, що має відповідну десатуразну або елонгазну активність), може бути використаний прямо або опосередковано для вироблення PUFA. Пряме продукування PUFA має місце, коли жирнокислотний субстрат перетворюється безпосередньо у бажаний жирнокислотний продукт без будь-яких проміжних стадій або шляхових інтермедіатів. Наприклад, продукування АА може відбуватись у клітині хазяїна, що виробляє або забезпечується DGLA, шляхом додавання або введення у зазначену клітину експресійної касети, котра запроваджує дельта-5 десатуразну активність. Подібним чином, експресія дельта-8 десатурази даного винаходу надає можливість для прямого синтезу EDA та ETrA (коли як субстрат запроваджені, відповідно, LA та ALA). Так, наприклад, даний винахід може охоплювати спосіб виробництва EDA або ETrA, відповідно, який включає: а) запровадження хазяйського організму, що включає, проте не обмежуючись цим, олійні дріжджі, котрі включають: (і) ген, що кодує дельта-8 десатуразний поліпептид, як визначено у SEQ ID NO: 16 або SEQ ID NO:57; і b) вирощування дріжджів стадії (а) у присутності придатного до ферментації вуглецевого джерела, де ген, що кодує дельта-8 десатуразний поліпептид, експресований, і EDA конвертована у DGLA або ETrA конвертована у ЕТА, відповідно; і с) при потребі, відновлення DGLA або ЕТА, відповідно, стадії (b). У деяких варіантах, яким віддається перевага, нуклеотидна послідовність гена, що кодує дельта-8 десатуразний поліпептид, визначена у SEQ ID NO:57, де принаймні 162 кодони оптимізовані для експресії у Yarrowia. Навпаки, множинні гени, що кодують PUFA біосинтетичний шлях, можуть бути використані у комбінації, так що протікає ряд реакцій з утворенням потрібної PUFA. Наприклад, експресійна касета(ти), що кодує дельта-9 елонгазну, дельта-8 десатуразну, дельта-5 десатуразну та дельта-17 десатуразну активність, надасть можливість клітині хазяїна, котра у природний спосіб виробляє LA, виробляти замість цього ARA (так що LA конвертується у EDA дельта-9 елонгазою; EDA потім може перетворюватись у DGLA дельта-8 десатуразою; потім DGLA конвертується в ARA дельта-5 десатуразою). У споріднений спосіб експресія дельта-8 десатурази даного винаходу дозволяє здійснювати пряме/опосередковане вироблення ЕТА, ЕРА, DPA та/або DHA як “нижні” PUFA, якщо наступні десатуразні та елонгазні реакції каталізуються. У варіанті, якому віддається перевага, де клітина хазяїна являє собою олійні дріжджі, експресійні касети, що кодують кожен із ензимів, потрібний для біосинтезу PUFA, мають бути введені у даний організм, оскільки природно вироблені PUFA у цих організмах обмежуються 18:2 жирними кислотами (тобто LA), і менш часто, 18:3 жирними кислотами (тобто ALA). Як альтернатива, може бути потрібним живлення субстрату. Вектори або ДНК касети, корисні для перетворення придатних мікробних хазяйських клітин, добре відомі у даній галузі. Специфічний вибір послідовностей, присутніх у конструкті, залежить від бажаних експресійних продуктів (вище), природи хазяйської клітини та запропонованих засобів відокремлення трансформованих клітин від нетрансформованих клітин. Проте, типово, вектор або касета містить послідовності, що спрямовують транскрипцію та трансляцію відповідного гена(нів), здатного до селекції маркера та послідовностей, що дозволяють 24 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 автономну реплікацію або хромосомну інтеграцію. Придатні вектори включають ділянку 5’ гена, що контролює ініціацію транскрипції (наприклад, промотор) та ділянку 3’ ДНК фрагменту, що контролює термінацію транскрипції (тобто термінатор). Найбільша перевага віддається положенню, коли обидві контрольні ділянки одержуються із генів від трансформованої клітини хазяїна, хоча слід розуміти, що нема потреби у тому, щоб такі контрольні ділянки отримувались із генів, нативних щодо специфічних видів, вибраних як продукційний хазяїн. Ділянки, що контролюють ініціацію, або промотори, котрі корисні як драйвери експресії десатуразних та/або елонгазних ORF у потрібній мікробній хазяйській клітині, множинні і відомі фахівцям у даній галузі. Фактично, будь-який промотор, здатний спрямовувати експресію цих генів у вибраній хазяйській клітині, придатний для даного винаходу. Експресія в мікробній клітині хазяїна може здійснюватись у тимчасовий або стабільний спосіб. Тимчасова експресія може здійснюватись шляхом індукування активності регульованого промотору, зчепленого у діючий спосіб з потрібним геном, як альтернатива, стабільна експресія може досягатись шляхом використання конститутивного промотору, зчепленого у діючий спосіб з потрібним геном. Як приклад, коли хазяйською клітиною є дріжджі, запроваджуються транскрипційні та трансляційні ділянки, функціональні у дріжджових клітинах, особливо із хазяйських видів. Транскрипційні ініціюючі регуляторні ділянки можуть бути одержані, наприклад, із (1) генів на гліколітичному шляху, таких як алкогольдегідрогеназа, гліцеральдегід-3-фосфат-дегідрогеназа (РСТ публікація за номером WO 2005/003310), фосфогліцерат мутаза (РСТ публікація за номером WO 2005/003310), фруктоза-бісфосфат альдолаза (РСТ публікація за номером WO 2005/049805), фосфоглюкоза-ізомераза, фосфогліцерат кіназа, гліцерин-3-фосфат О-ацилтрансфераза (РСТ публікація за номером WO 2006/031937), і т.д.; або (2) регульовані гени, такі як кисла фосфатаза, лактаза, металотіонеїн, глюкоамілаза, трансляційний елонгаційний фактор EF1- (TEF)–протеїн (U.S. Patent No. 6265185), рибосомний протеїн S7 (U.S. Patent No. 6265185), аміак-транспортерні протеїни (U.S. Application No. 11/185301), експортні протеїни і т.д. Може бути застосована будь-яка із множини регуляторних послідовностей, у залежності від того, чи потрібна конститутивна або індукована експресія, від ефективності промотору в експресії потрібної ORF (відкрита рамка зчитування), легкості конструкції і такого подібного. Нуклеотидні послідовності, що оточують трансляційний ініціюючий кодон ‘ATG’, як було знайдено, впливають на експресію у дріжджових клітинах. Якщо потрібний поліпептид погано експресується у дріжджах, нуклеотидні послідовності екзогенних генів можуть бути модифіковані для включення ефективної дріжджової трансляційної ініціюючої послідовності з отриманням оптимальної генної експресії. Для експресії у дріжджах це може бути зроблено за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу неефективно експресованого гена шляхом його влиття у рамці в ендогенний ген дріжджів, краще, сильноекспресований ген. Як альтернатива, як показано тут у даному винаході у Yarrowia lipolytica, можна визначити консенсусну трансляційну ініціюючу послідовність у хазяїні і ввести цю послідовність у гетерологічні гени для їх оптимальної експресії у потрібному хазяїні. Термінаційна ділянка може бути виведена із 3’ділянки того гена, із якого була отримана ініціююча ділянка, або із другого гена. Відома велика кількість термінаційних ділянок, що задовільно функціонують у різновиді хазяїв (коли використовуються як однакові, так і різні роди та види, із яких вони були виведені). Термінаційна ділянка звичайно вибирається, скоріше, за ознакою зручності, а не через будь-яку практичну потребу. Краще, коли термінаційна ділянка виводиться із дріжджового гена, а саме, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Yarrowia або Kluyveromyces. Відомо також, що у дріжджах функціонують 3’-ділянки генів ссавців, котрі кодують -інтерферон та -2 інтерферон. Термінаційні контрольні ділянки можуть також виводитись із різних генів, нативних до хазяїв, яким віддається перевага. У деяких випадках термінаційний сайт не потрібен; проте, якщо він включений, йому віддається найбільша перевага. Як відомо фахівцеві у даній галузі, просте уведення гена у клонуючий вектор не гарантує, що він буде успішно експресований на потрібному рівні. Як реакція на потребу у високому ступені експресії, було створено багато спеціалізованих експресійних векторів шляхом маніпуляції рядом різних генетичних елементів, що контролюють аспекти транскрипції, трансляції, стабільності протеїну, кисневого обмеження та секреції із клітини хазяїна. Більш конкретно, деякі із молекулярних властивостей, якими маніпулювали для контролю генної експресії, включають: (1) природу релевантних транскрипційних промоторних та термінаторних послідовностей; (2) кількість копій клонованого гена і те, чи є даний ген плазмідним або інтегрованим у геном клітини хазяїна; (3) кінцеву клітинну локалізацію синтезованого стороннього протеїну; (4) ефективність трансляції в хазяйському організмі і коректне складання протеїну в організмі хазяїна; (5) внутрішню стабільність мРНК та протеїну клонованого гена 25 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 всередині клітини хазяїна; та (6) використання кодону у клонованому гені, таке, що його частота наближається до частоти переважного використання кодону хазяйською клітиною. Усі ці типи модифікацій охоплюються даним винаходом як засіб подальшої оптимізації експресії ензимів PUFA біосинтетичного шляху. Коли ДНК, що кодує десатуразний або елонгазний поліпептид, придатний для експресії в олійних дріжджах, одержана, її поміщують у плазмідний вектор, здатний до автономної реплікації у хазяйській клітини; або вона безпосередньо інтегрується у геном клітини хазяїна. Інтеграція експресійних касет може здійснюватись довільно всередині хазяйського генома або може спрямовуватись через використання конструктів, що містять ділянки гомології з геномом хазяїна, достатні для націлювання на рекомбінацію всередині хазяйського локусу. Коли конструкти націлені на ендогенний локус, усі або деякі транскрипційні та трансляційні регуляторні ділянки можуть бути запроваджені ендогенним локусом. Спосіб експресії генів у Yarrowia lipolytica шляхом інтеграції лінійної ДНК у геном хазяїна та інтеграція у множинні місцеположення у геномі можуть бути особливо корисними, коли потрібні високі рівні експресії генів. На завершення цього, бажано ідентифікувати послідовність у даному геномі, що присутня у множинних копіях. Schmid-Berger et al. (J. Bact. 176(9):2477-2482 (1994)) відкрили перший ретротранспозоноподібний елемент Ylt1 у Yarrowia lipolytica. Цей ретротранспозон характеризується присутністю довгих термінальних повторів (LTR; кожен довжиною приблизно 700 bp (пар нуклеотидів)), що називаються zeta ділянками. Ylt1та самостійні zeta елементи були присутні у розсіяний спосіб всередині даного генома у принаймні 35 копіях/геном та 50-60 копіях/геном, відповідно; обидва елементи, як було визначено, діють як сайти гомологічної рекомбінації. Крім того, робота Juretzek et al. (Yeast 18:97-113 (2001)) показала, що експресія генів може бути драматичним чином підвищена шляхом націлювання плазмід на повторювані ділянки геному дріжджів (з використанням лінійної ДНК з LTR zeta ділянками в обох кінцях), у порівнянні з експресією, отриманою з використанням плазмідних трансформантів з малою кількістю копій. Таким чином, zeta-спрямована інтеграція може бути ідеальною як засіб забезпечення множинної інтеграції плазмідної ДНК у Yarrowia lipolytica, і, отже, високорівневої генної експресії. Проте, на жаль, не всі штами Yarrowia lipolytica мають zeta ділянки (наприклад, штам, що ідентифікований як АТСС № доступу 20362). Коли штам не має таких ділянок, можливо також інтегрувати плазмідну ДНК, що включає експресійні касети, в альтернативні локуси з досягненням бажаної кількості копій для даної експресійної касети. Наприклад, альтернативні локуси, яким віддається перевага, включають: Ura3 локус (GenBank Accession No. AJ306421), Leu2 генний локус (GenBank Accession No. AF260230), Lys5 ген (GenBank Accession No. М34929), Асо2 генний локус (GenBank Accession No. AJ001300), Pox3 генний локус (Pox3: GenBank Accession No. XP_503244; або Асо3: GenBank Accession No. AJ001301), дельта-12 десатуразний генний локус, Lip1 генний локус (GenBank Accession No. Z50020) та/або Lip2 генний локус (GenBank Accession No. AJ012632). Слушно, Ura3 ген може бути використаний повторно у комбінації з вибраною 5фторооротовою кислотою (5-фтороурацил-6-карбонової кислоти моногідрат; “5’-FOA”) (нижче) для надання можливості у легкий спосіб інтегрувати генетичні модифікації у Yarrowia геном. Там, де два або кілька генів експресовані із окремих реплікаційних векторів, бажано, щоб кожен вектор мав різні засоби селекції і не мав гомології з іншими конструктами для підтримки стабільної експресії та запобігання пересортуванню елементів серед конструктів. Розумний вибір регуляторних ділянок, засобів селекції та способу розповсюдження введеного конструкту може бути визначений експериментально, так що всі введені гени експресовані на потрібних рівнях для запровадження синтезу бажаних продуктів. Конструкти, що містять потрібний ген, можуть бути введені у клітину хазяїна з використанням будь-якого стандартного способу. Ці способи включають трансформацію (наприклад, літій ацетатну трансформацію [Methods in Ethymology, 194:186-187 (1991)]), протопластне злиття, балістичний удар, електропорацію, мікроін’єкцію або будь-який інший спосіб, що вводить потрібний ген у клітину хазяїна. Більш специфічні способи, придатні для олійних дріжджів (тобто Yarrowia lipolytica), включають U.S. Patent No.4880741 та U.S. Patent No. 5071764, та роботу Chen, D.C. et al. (Appl. Microbiol Biotechnol. 48(2):232-235 (1997)). Для зручності, клітина хазяїна, що піддавалась маніпуляції з використанням будь-якого методу для поглинання ДНК послідовності (наприклад, експресійної касети), буде тут називатись “трансформованою” або “рекомбінантною”. Трансформований хазяїн буде мати принаймні одну копію експресійного конструкта і може мати дві або більше, у залежності від того, чи інтегрований даний ген у геном, ампліфікований або знаходиться на екстрахромосомному елементі, що має множинні кількості копій. 26 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Трансформована хазяйська клітина може бути ідентифікована з використанням різних методів селекції, як описано у РСТ публікації за номером WO 04/101757. Методами селекції для використання у даному винаході, яким віддається перевага, є резистентність до канаміцину, гігроміцину та аміноглікозиду G418, так само як і здатність до зростання на середовищі без урацилу, лейцину, лізину, триптофану або гістидину. В альтернативних варіантах для селекції дріжджових Ura-мутантів застосовується 5-FOA. Дана сполука токсична до дріжджових клітин, що мають функціонуючий URA3 ген, який кодує оротидин 5’-монофосфат декарбоксилазу (ОМР декарбоксилазу); таким чином, виходячи із цієї токсичності, сполука 5-FOA особливо корисна для селекції та ідентифікації Ura мутантних дріжджових штамів (Bartel, P.L. and Fields, S., Yeast 2-Hybrid System, Oxford University: New York, v.7, pp 109-147, 1997). Більш конкретно, можна спочатку нокаутувати нативний Ura3 ген з утворенням штаму, який має Ura-фенотип, де селекція відбувається, базуючись на 5-FOA резистентності. Потім кластер множинних химеричних генів та новий Ura3 ген можуть бути інтегровані в інший локус геному Yarrowia з утворенням у такий спосіб нового штаму, що має Ura+ фенотип. Наступна інтеграція дасть новий Ura3-штам (знову ідентифікований з використанням 5-FOA селекції), коли введений Ura3 ген піддається нокаутуванню. Таким чином, Ura3 ген ( у комбінації з 5-FOA селекцією) може бути використаний як селекційний маркер у множинних раундах трансформації. Після трансформації субстрати, придатні для рекомбінантним чином експресованих десатураз та/або елонгаз (і, при потребі, інших PUFA ензимів, котрі експресовані в клітині хазяїна), можуть бути створені хазяїном або у природний спосіб або у трансгенний, або вони можуть бути запроваджені екзогенним чином. Способи маніпуляції біохімічними шляхами добре відомі фахівцям у даній галузі; і очікується, що буде можливим проводити множинні маніпуляції для максимізації біосинтезу омега-3 та/або омега-6 жирних кислот в олійних дріжджах, і зокрема, у Yarrowia lipolytica. Це може потребувати метаболічного інжинірингу безпосередньо всередині PUFA біосинтетичного шляху або додаткових маніпуляцій шляхами, що вносять вуглець до PUFA біосинтетичного шляху. У випадку маніпуляцій всередині PUFA біосинтетичного шляху може виникнути потреба у підсиленні вироблення LA для надання можливості підвищеного продукування омега-6 та/або омега-3 жирних кислот. Уведення та/або ампліфікація генів, що кодують дельта-9 та/або дельта-12 десатурази, може сприяти реалізації цього. Фахівцеві у даній галузі добре відомо, що для максимізації продукування омега-6 ненасичених жирних кислот сприятливим є їх вироблення у хазяйському мікроорганізмі, котрий у значній мірі вільний від ALA. Так, краще, коли хазяїн вибирається або одержується шляхом вилучення або інгібування десатуразної активності типу дельта-15 або омега-3, що дозволяє здійснювати конверсію LA у ALA. Активність ендогенної десатурази може бути знижена або виключена шляхом, наприклад, (1) запровадження касети для транскрипції антизмістових послідовностей у дельта-15 десатуразний транскрипційний продукт, (2) руйнування дельта-15 десатуразного гена шляхом інсерції, заміщення та/або делеції всього або частини цільового гена; або (3) використання клітини хазяїна, котра природним чином має [або була мутована, щоб мати] низьку дельта-15 десатуразну активність або взагалі її не має. Інгібування небажаних десатуразних шляхів може також здійснюватись шляхом використання специфічних інгібіторів десатурази, таких, що описані у U.S. Patent No.4778630. Як альтернатива, було б бажаним максимізувати продукування омега-3 жирних кислот (та мінімізувати синтез омега-6 жирних кислот). Так, можна було б використати хазяйський мікроорганізм, в якому дельта-12 десатуразна активність, котра дозволяє здійснювати конверсію олеїнової кислоти у LA, вилучена або інгібована, з використанням будь-яких описаних вище засобів (дивись також РСТ публікацію за номером WO 2004/104167, на яку в даному тексті зроблено повне посилання). Після цього відповідні експресійні касети могли б бути введені у хазяїна разом з відповідними субстратами (наприклад, ALA) для конверсії в омега-3 жирнокислотні похідні ALA (наприклад, STA, ETra, ETA, EPA, DPA, DHA). Окрім прямого PUFA біосинтетичного шляху, передбачається, що маніпуляція кількома іншими ензиматичними шляхами, що ведуть до біосинтезу жирних кислот-попередників, може сприяти загальному чистому біосинтезу специфічних PUFA. Ідентифікація та маніпуляція цими спорідненими шляхами буде корисною у майбутньому. Додаткові копії десатуразних та елонгазних генів можуть бути уведені у хазяїна для підвищення виходу омега-3 та/або омега-6 жирнокислотних біосинтетичних шляхів. Експресія десатуразних або елонгазних генів може також бути збільшена на транскрипційному рівні шляхом використання сильнішого промотору (або регульованого або констутивного) для підсилення експресії, шляхом вилучення/делеції дестабілізуючих послідовностей із або мРНК 27 UA 103745 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або кодованого протеїну, або шляхом додавання стабілізуючих послідовностей до мРНК (U.S. Patent No. 4910141). Проте, інший підхід до підсилення експресії десатуразних або елонгазних генів, як показано в даному винаході, полягає у підвищенні трансляційної ефективності кодованих мРНК шляхом заміни кодонів у нативному гені на такі, що забезпечують оптимальну експресію генів у вибраному хазяйському мікроорганізмі. Навпаки, біохімічні шляхи, що конкурують з омега-3 та/або омега-6 жирнокислотними біосинтетичними шляхами за енергію вуглецю, або ензими нативного PUFA біосинтетичного шляху, що заважають продукуванню даного PUFA кінцевого продукту, можуть бути виключені шляхом руйнування гена або піддання знижувальній регуляції іншими засобами (наприклад, антизмістовою мРНК). Для руйнування гена фрагмент сторонньої ДНК (типово, селектовний маркерний ген) уводиться у структурний ген, який має руйнуватись, щоб перервати його кодуючу послідовність і у такий спосіб функціонально інактивувати даний ген. Трансформація розривної касети у хазяйську клітину спричинює заміну функціонального нативного гена гомологічною рекомбінацію з нефункціональним зруйнованим геном (дивись, наприклад: Hamilton et al. J. Bacteriol. 171:4617-4622 (1989); Balbas et al. Gene 136:211-213 (1993); Gueldener et al. Nucleic Acids Res. 24:2519-2524 (1996); and Smith et al. Methods Mol. Cell. Biol. 5:270-277 (1996)). Антизмістова технологія являє собою інший метод знижувальної регуляції генів, коли послідовність цільового гена відома. Для здійснення цього, сегмент нуклеїнової кислоти із бажаного гена клонується та зчіплюється у діючий спосіб з промотором, так що антизмістовий ланцюг РНК буде транскрибований. Цей конструкт потім уводиться у клітину хазяїна, і утворюється антизмістовий ланцюг РНК. Антизмістова РНК інгібує експресію гена шляхом запобігання накопиченню мРНК, що кодує потрібний протеїн. Фахівцеві у даній галузі зрозуміло, що спеціальні міркування асоціюються з використанням антизмістових технологій для зниження експресії даних генів. Наприклад, відповідний рівень експресії антизмістових генів може потребувати використання різних химерних генів, що застосовують різні регуляторні елементи, відомі фахівцям у даній галузі. Хоча руйнування цільового гена та антизмістова технологія пропонують ефективні засоби знижувальної регуляції генів, де послідовність відома, були розроблені інші менш специфічні методології, які не основані на послідовності (наприклад, мутагенез через УФ випромінювання/хімічні агенти або використання мобільних генетичних елементів/транспозонів; дивись РСТ публікацію за номером WO 2004/101757. У контексті даного винаходу може бути корисним модулювати експресію жирнокислотного біосинтетичного шляху з використанням будь-якого із описаних вище методів. Наприклад, даний винахід запроваджує методи, за допомогою яких гени, що кодують ключові ензими на біосинтетичних шляхах, уводяться в олійні дріжджі для вироблення омега-3 та/або омега-6 жирних кислот. Було б особливо корисним експресувати ці гени в олійних дріжджах, котрі природно не мають омега-3 та/або омега-6 жирнокислотних біосинтетичних шляхів, та скоординувати експресію цих генів для максимізації продукування бажаних PUFA продуктів з використанням різних засобів для метаболічного інжинірингу хазяйського організму. Мікробні хазяйські клітини для вироблення омега жирних кислот можуть включати мікробних хазяїв, що зростають на різновиді вихідної сировини, включаючи прості або складні вуглеводи, жирні кислоти, органічні кислоти, олії та спирти, та/або вуглеводні у широкому діапазоні температур та величин рН. Проте, мікробними хазяями, яким віддається перевага, є олійні дріжджі. Ці організми природно здатні до синтезу олії та її накопичення, де дана олія може містити більше приблизно 25 % клітинної сухої ваги, краще, більше приблизно 30 % клітинної сухої ваги, і найкраще, більше приблизно 40 % клітинної сухої ваги. Роди, що типово ідентифікуються як олійні дріжджі, включають, проте не обмежуючись цим: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon та Lipomyces. Більш конкретно, ілюстративні дріжджі, що синтезують олію, включають: Rhodosporidium toruloides, Lipomyces starkeyii, L. lipoferus, Candida revkaufi, C. pulcherrima, C. tropicalis, C. utilis, Trichosporon pullans, T. cultaneun, Rhodotorula glutinus, R. Graminis та Yarrowia lipolytica (що раніше класифікувалась як Candida lipolytica). Найбільша перевага віддається олійним дріжджам Yarrowia lipolytica; і, у подальшому варіанті, найбільша перевага віддається штамам Yarrowia lipolytica, котрі позначаються як АТСС Accession Nos. 20362, 8862, 18944, 76982 та/або LGAM S(7)1 (Papanikolaou, S., and Aggelis, G., Bioresour. Technol. 82(1):43-9 (2002)). Трансформована мікробна клітина хазяїна вирощується за умов, що оптимізують активності десатурази та елонгази і дають найбільший та самий економічний вихід PUFA, яким віддається перевага. Загалом, умови середовища, що можуть бути оптимізовані, включають тип та 28