Спосіб отримання гідропероксидів поліненасичених жирних кислот

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биологически активных веществ - гидро— пероксидов полиненасыценньпс жирных 'кислот (ПНЖК). Цель изобретения увеличение выхода целевого продукта и упрощение способа. Способ основан на непрерывном пропускании со с к о ростью 0,5-15 л/і-'ин раствора ІШЖК с концентрацией 0,01-0,25 ммоль/л ч*°рез слой гранул модифицированного неорганического оксида (ШО), на к о тором иммобилизована липоксигеназа, после чего следует концентрирование целевого продукта на гидрофобизированном силикагеле и элюироьание его о р ганическим растворитеп-М средней или высокой полярности. Гранулы НЮ имеют размер 0 , 1 - 0 , 2 5 мм9 а количество липоксигеназы составляет 0,1-20 мт ка 1 г ШО. Вьіход гидр on ер оксида П Ж составляет 95-98% (по сравнению Н К с 70-75% по известному способу). Упрощение способа достигается за счет непрерывности процесса, а также благодаря быстрому выделению целевого гтодукта. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к споообам получения гидропероксидов полиненасыщенных жирных кислот (ІШМК), и может быть и с пользовано в области биологии, медицины, сельского хозяйства, а также в качестве хроматографических стандартов для определения этих соединении в различных биологических объектах. * Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта и упрощение способа. Способ заключается в пропускании разбавленного раствора ІШЖК через іслой гранул модифицированного неор'ганического сорбента, на котором им мобилизован фермент липоксигеназа. Эту операцию выполняют в щелочной среде, соответствующей наибольшей активности фермента. После этого полученный раствор направляют в с л е дующую колонку, заполненную гкдрофобкзкрованным силикагелем^ на котором палевой тфодукт-гидрспероксид П Ж концентрируется. Десорбцию г и д Н К ропероксида ІЇЇІКК выполняют небольшим количеством органического растворител я , в котором полученный продукт может храниться. Раствор ГШКК с концентрацией 0„010,25 мМ/л пропускают со скоростью 0,5-15 мл/мин на 1 г оксида, а липоксигеназу в количестве 0,1-20 мг им (56) Бутович И.А. и д р . Материалы 6-го Всесоюзного симпозиума по и н женерной энзимологии, Вильнюс: 1988, ч . 2, с . 114. (54) СПОСОБ ДОЛУЧЕНИЙ ГИДРОПЕРОКСИ ДОВ ПОЛІШЕНАСЬШІЕШІЬІХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ З 1631006 мобилизуют на 1 г неорганического носителя с размером гранул 0,1-0,25 мм Использование данного способа п о зволяет упростить процесс, а также увеличить выход целевого продукта с 70-75 до 95-98%. П р и м е р 1, В колонку объемом 0,3 см 3 помещают 100 мг гранул " с и лохрома-С80" размером 0,125-0,16 мм, на которых иммобилизована липоксигеназа в количестве 0,3 м г . Через к о лонку, присоединенную к жидкостному насосу^ пропускают раствор линолевой кислоты с концентрацией 0,1 мМ/л в 0,1 М натрий-боратном буфере (рН 8 , 5 ) , Скорость пропускания раствора линолевой кислоты поддерживают постоянной и равной 5 мл/мин на 1 г оксида. После этого полученный раствор 20 прокачивают через вторую колонку, з а полненную гидрофобизироваиным силикагелем, подсоединенную к выходу колонки с иммобилизованной липоксигеназой. После прокачивания через колонки н е - 25 обходимого объема раствора П Ж к о Н К лонку с силикагелем отсоединяют и промывают 3 мл метанола. Выход гидропероксида линолевой кислоты составляет 98%, а степень чистоты, определен30 ная У и ИК спектроскопией, с о с т а в Ф л я е т 95%. П р и м е р 2. В колонку объемом 0,3 см3 помещают !00 мг гранул "силохрома С 1,5" размером 0 , 1 - 0 э 2 5 мм, на которых иммобилизована липоксиге- 35 наза в количестве 2,0 м г , через к о лонку, присоединенную к жидкостному насосу, пропускают раствор арахидоновой кислоты С Н 9) с концентрацией р 40 0,01 ммоль/л. Скорость пропускания раствора арахидоновой кислоты поддерживают постоянной и равной 15 мл/мин на 1 г оксида. Затем полученный раствор прокачивают через колонку, заполненную г и д - 45 рофобизированным силикггелем С18 и подсоединенную к выходу колонки с иммобилизованной липоксигеназой. После прокачивания через колонки необходимого объема раствора колонку с 50 гидрофобизированным силикагелем отсоединяют и промывают 5 мл этанола. Вы- . ход гидропероксида арахидоновой кислоту составляет 98%, а степень чистоты 9Ь%.. 55 П р и м е р 3 . В колонку объемом 0,3 см 3 помещают 100 мг гранул " с и л о хрома~С80" с размером 0,125-0,16 мм, на которых иммобилизована липоксигеназа в количестве 0,01 мг. Через к о лонку, присоединенную к жидкостному насосу, пропускают раствор линолевой киспоты (рН 8„5) с концентрацией 0,25 ммоль/л. Скорость пропускания арахидоновой кислоты через колонку составляет 0,5 мл/мин на 1 г оксида. - Затем полученный раствор прокачивают через колонку, заполненную г и д рофобизированным силикагелем-С18, присоединенную к выходу колонки с иммобилизированііой липоксигеназой. После прокачивания через колонки н е обходимого объема раствора колонку с силикагелем отсоединяют и промывают 5 мл этанола. Выход гидропероксида линолевой кислоты равен 97%, а с т е пень чистоты 96%, Иммобилизацию липоксигеназы во всех примерах осуществляют по и з в е с т ным методам следующим образом. Аминопропил силохром в количестве 1 г , модифицированный глутаровым а л ь дегидом, перемешивают с 10 мл р а с т в о ра липоксигена ІОІ с концентрацией 0 , 1 - 2 , 0 мг/мл в 0,1 И фосфатном буфере с рН 7 S 5 при 4^С в течение 2-12 ч . После отделения осадка фильтрацией или центрифугированием с п о следующей отмывкой Ю0 мл буферного раствора с 0,5 М определяют степень иммобилизации белка, которая р а в н я е т ся 85-90%. П р и м е р 4 . Аналогичен примеру 1. Вместо "силохрома СЗО" используют широкопористую окись алюминия. Выход 97%. П р и м е р 5 . Аналогичен пример у 1. Вместо "силохрома С80" используют широкопористый окисленный т и т а н . Выход 94%„ П р и м е р 6 . Аналогичен примеру 1. Продукт синтеза вместо метанола элюируют этанолом. Выход 97%. П р и м е р 7. Аналогичен примеру Ї . Продукт синтеза вместо метанола элюируют аиетоном. Выход 96%. П р и м е р 8 . Аналоничен примеру 1. Продукт синтеза вместо метанола элкнфуют смесью диэтиловой эфир гексан - 1/1. Выход 90%. Таким образом, применение способи позволяет увеличить выход целевого продукта с 70-75 (по известному ' способу) до 95-98%, а также упростить процесс получения целевого прод у к т а . Упрощение способа д о с т и г а е т 1631086 ся заменой гомогенного катализатора чающий окисление полиненасыщенных ІЖИРНЬГХ КИСЛОТ В ПРИСУТСТВИИ ЛИПОКСИ" на гетерогенный благодаря которой: геназы в качестве катализатора и поне требуется сложных процессов химиследующее выделение целевого продукческого разделения катализатора и та, о т л и ч а ю щ и й с я тем, продукта, так как катализатор удалячто, с целью увеличения выхода целеется простым фильтрованием; количествого продукта и упрощения способа, во катализатора легко регулировать окисление проводят в непрерывном рев ходе синтеза; катализатор можно жиме путем пропускания водного растиспользовать многократно; синтез вевора полиненасыщенных жирных кислот дется в проточном режиме непрерывно, с концентрацией 0,01-0,25 мМ/л чечем устраняется необходимость перирез гранулы модифицированного неородически останавливать реакцию для изганичекого оксида размером 0,1-0,25 мм влечения из реактора продуктов синсо скоростью 0,5-15 мл/мин на 1 г теза и введения новой порции исходных оксида, содержащих 0,1-20,0 мг лиреагентов. поксигеназы на 1 г оксида, а выдеПредлагаемый способ позволяет отление целевого продукта проводят йроказаться от применения длительной и пусканием полученного раствора через дорогостоящей процедуры хроматографической очистки конечного продукта, 20 слой гидрофобизированного силикагеля с последующим элюнрованием органичесиспользуемой в известном способе. кими растворителями средней и высоФормула и з о б р е т е н и я кой полярности. Способ получения гидропероксидов полиненасыщенных жирных кислот, вклю Редактор М. Келемеш Составитель R. Муронец Техред л.Сердгокова Корректор А. Осауленко Заказ ,524 Тираж 355 Подписное В И Г І Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С С Н ИО СР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д . 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,