Суміш сульфатованих олігосахаридів – похідних гепарину, спосіб їх приготування та фармацевтична композиція

1. Суміш сульфатованих олігосахаридів, що мають загальну структуру полісахаридів, які входять до складу гепарину і мають наступні ознаки: - їх середньомолекулярна маса складає від 1500 до 3000 Да, активність анти-Ха складає від 150 до 200 МОд/мг, активність анти-ІІа нижча за 10 МОд/мг і відношення анти-Ха/анти-ІІа вище за 30, олігосахариди, що входять до складу суміші - містять від 2 до 26 сахаридних ланок, - одна з їх кінцевих груп є ланкою 2-O-сульфату ненасиченої 4,5-уронової кислоти, - містять гексасахаридну фракцію, що складає від 15 до 25 % суміші олігосахаридів, - містять в гексасахаридній фракції від 8 до 15 % гексасахариду DIIa - IIs - Is C2 2 (19) 1 3 R3 R2 N R1 N P R4 N R5 N R6 R7 , в якій радикали R1-R7, однакові або різні, означають лінійні або розгалужені алкільні радикали, що містять від 1 до 6 атомів вуглецю. 11. Спосіб одержання за п. 10, який відрізняється тим, що основа сімейства фосфазенів, яка використовується на стадії деполімеризації, являє собою 2-трет-бутиліміно-2-діетиламіно-1,3диметилпергідро-1,3,2-діазафосфорин або третбутилімінотри(піролідино)фосфоран. 12. Спосіб одержання за п. 7 або 8, який відрізняється тим, що молярне відношення сильна основа/складний ефір складає від 0,2 до 5 і переважно від 0,6 до 2. 13. Спосіб одержання олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-6 з гепаринів, що включає в себе наступні стадії: a) переведення в сіль гепарину натрію під дією хлориду бензетонію, b) етерифікація одержаного гепаринату бензетонію під дією бензилхлориду, c) переведення одержаного складного бензилового ефіру в сіль четвертинного амонію, d) деполімеризація солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину способом, описаним в пп. 10 або 11, e) переведення солі четвертинного амонію в натрієву сіль, f) в разі необхідності омилення гепарину під дією основи, такої як гідроксид натрію, g) в разі необхідності очищення, зокрема за допомогою окислювача, такого як пероксид водню. 14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що реакцію на стадії а) здійснюють дією надмірної кількості хлориду бензетонію на натрієвий гепарин при температурі приблизно від 15 до 25 °С і молярному відношенні сіль/натрієвий гепарин від 3 до 4. 15. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що на стадії b) етерифікацію здійснюють в органічному хлорованому розчині, такому як хлороформ або метиленхлорид при температурі від 25 до 45 °С, переважно від 30 до 40 °С, і потім складний ефір в формі натрієвої солі отримують шляхом осадження за допомогою 10 % мас. ацетату натрію в спирті, такому як метанол, з розрахунку від 1 до 1,2 об'ємної частки спирту на об'ємну частку реакційного середовища. 16. Спосіб за п. 13 або 15, який відрізняється тим, що ступінь етерифікації солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину складає від 50 до 100 % і переважно від 70 до 90 %. 17. Спосіб за пп. 13, 15 або 16, який відрізняється тим, що використовують від 0,5 до 1,5 масових частин бензилхлориду на 1 масову частину солі бензетонію гепарину при тривалості реакції від 10 до 35 годин. 81925 4 18. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що переведення в сіль на стадії с) здійснюють за допомогою хлориду четвертинного амонію і переважно за допомогою хлориду бензетонію, хлориду цетилпіридинію або хлориду цетилтриметиламонію у водному середовищі при температурі від 10 до 25 °С. 19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що молярне відношення хлорид четвертинного амонію/натрієва сіль складного бензилового ефіру гепарину складає від 2 до 3. 20. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що переведення в натрієву сіль четвертинного амонію складного бензилового ефіру деполімеризованого гепарину (стадія е) здійснюють шляхом обробки реакційного середовища спиртовим розчином ацетату натрію і переважно 10 % розчином ацетату натрію в метанолі (маса/об'єм) при температурі від 15 до 25 °С. 21. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що омилення (стадія f) здійснюють за допомогою гідроксиду лужного металу, такого як гідроксид натрію, калію, гідроксид літію, у водному середовищі при температурі від 0 до 20 °С, і переважно від 0 до 10 °С. 22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що використовують від 1 до 5 молярних еквівалентів гідроксиду лужного металу, переважно від 1 до 2 молярних еквівалентів гідроксиду натрію. 23. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що очищення (стадія g) здійснюють за допомогою пероксиду водню у водному середовищі при температурі від 10 до 50 °С, переважно від 20 до 40 °С. 24. Суміш олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-6 як лікарський засіб. 25. Суміш олігосахаридів за будь-яким з пп. 1-6 як лікарський засіб, що має антитромботичну активність. 26. Лікарський засіб за п. 24 або 25 для лікування або профілактики венозних і артеріальних тромбозів, глибокого венозного тромбозу, легеневої емболії, нестабільної стенокардії, інфаркту міокарда, ішемії серця, закупорки периферичних артерій, фібриляції передсердь, проліферації клітин гладкої мускулатури, атеросклерозу і артеріосклерозу, раку шляхом модуляції ангіогенезу і факторів росту, і діабетичних розладів, таких як діабетична ретинопатія і діабетична нефропатія. 27. Фармацевтична композиція, що містить щонайменше один лікарський засіб за п. 24 і один або декілька ексципієнтів, або наповнювачів, або домішок, інертних в фармацевтичному відношенні. 28. Фармацевтична композиція за п. 27, яка відрізняється тим, що є розчином для підшкірних або внутрішньовенних ін'єкцій. 29. Фармацевтична композиція за п. 28, яка відрізняється тим, що є препаратом для інгаляцій, призначеним для введення через легені. 30. Фармацевтична композиція за п. 28, яка відрізняється тим, що є препаратом, призначеним для перорального введення. 31. Суміш полісахаридів за будь-яким з пп. 1-6, яка може бути одержана способом за п. 13. Даний винахід відноситься до сумішей полісахаридів, що є похідними гепарину, способу їх одержання і фармацевтичних композицій, що їх містять. Гепарин являє собою суміш сульфатованих мукополісахаридів тваринного походження, і його застосування основане, зокрема на його антигоагулянтних і антитромботичних властивостях. Однак гепарин має недоліки, що обмежують умови його застосування. Зокрема, його висока антикоагулянтна активність (анти-IIа) може викликати кровотечі. Були запропоновані низькомолекулярні гепарини, одержані шляхом лужної деполімеризації складних ефірів гепарину [ЕР 40144], однак такі продукти також володіють високою антикоагулянтною активністю (анти-IIа). Гепарини з дуже низькою молекулярною вагою були також описані в [US 6384021]. Проте одержані в описаних прикладах значення активності анти-Ха не перевищують 120МОд і відношення анти-Ха/анти-IIа складає від 15 до 50. У [WO-0208295] гепарини з дуже низькою молекулярною вагою були одержані іншим способом, ніж в [US 6384021], і володіли активністю від 100 до 150МОд, при цьому в деяких прикладах застосування значення відношення анти-Ха/анти-IIа були також дуже високими. У вказаному класі лікарських засобів існує постійна потреба в підвищенні активності анти-Ха, зокрема до значень, що перевищують 150МОд/мг, а також у вдосконаленні відношення анти-Ха/антиIIа, і, отже, в розробці нових поколінь похідних гепаринів. Одною з цілей винаходу, таким чином, є поліпшення активності анти-Ха і відношення антиХа/анти-IIа шляхом модифікації способів, описаних в рівні техніки, зокрема шляхом контролю процентного вмісту води на стадії деполімеризації. Одержані таким чином гепарини також володіють чудовою антитромботичною активністю і активністю аХа, близькою до такої ж активності гепарину, зменшуючи при цьому небезпеку виникнення кровотечі завдяки дуже низькій активності alIa. Крім того продукти згідно з винаходом мають значно більшу тривалість напівжиття, ніж гепарин. Таким чином об'єктом винаходу є нові суміші полісахаридів, що є похідними гепарину, які володіють більш високою селективністю відносно активованого фактора X (фактор Ха) і активованого фактора II (фактор IIа), ніж гепарин. Суміші полісахаридів, середньомолекулярна маса яких складає від 1500 до 3000Да прийнято вважати олігосахаридами. Отже, об'єктом винаходу є суміші сульфатованих олігосахаридів, що мають загальну структуру полісахаридів, що входять в склад гепарину, і володіють наступними ознаками: - їх середньомолекулярна маса складає від 1500 до 3000 Да, активність анти-Ха складає від 120 до 200МОд/мг, активність анти-IIа нижче за 10МОд/мг і відношення анти-Ха/анти-Іа вище 30, - олігосахариди, що входять до складу сумішей, містять від 2 до 26 сахаридних ланок, одна з їх кінцевих груп є ланкою 2-О-сульфату ненасиченої 4,5-уроновоїкислоти і містять гексасахарид DIIa-IIs-Is формули: Гексасахарид DIIa-IIs-Is, що міститься в суміші олігосахаридів, описаній в даному винаході, являє собою послідовність, дуже схожу з АТIII і відмінну активністю аХа, яка вище 740МОд/мг. Суміш олігосахаридів, описана в даному винаході, являє собою сіль лужного або лужноземельного металу. Як переважну сіль лужного або лужноземельного металу можна назвати солі натрію, калію, кальцію і магнію. Середньомолекулярну масу визначають високоефективною рідинною хроматографією за допомогою двох з'єднаних послідовно колонок, наприклад, марок TSK G3000 XL і TSK G2000 XL. Визначення здійснюють за допомогою рефрактометрії. Як елюент використовують нітрат літію, витрата становить 0,6мл/хв. Система калібрована за допомогою еталонів, одержаних шляхом фракціонування Еноксапарину (AVENTIS) шляхом хроматографії з використанням агарозполіакриламідного гелю (IBF). Цей спосіб одержання описаний [Barrowcliffe et al, Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) або D.A.Lane et al, Thromb.Res., 12, 257-271 (1977-78)]. Для обчислення результатів використовують програму GPC6 (Perkin Elmer). Активність анти-Ха вимірюють амідолитічним методом на ауксохромному субстраті, описаним [Teien et al, Thromb. Res., 10, 399-410 (1977)], використовуючи як еталон перший міжнародний еталон низькомолекулярних гепаринів. Активність анти-IIа вимірюють методом, описаним [Anderson L.O. et al, Thromb. Res., 15, 531-541 (1979)], використовуючи як еталон перший міжнародний еталон низькомолекулярних гепаринів. Гексасахаридна фракція переважно складає від 15 до 25% суміші олігосахаридів. Переважно суміші згідно з винаходом містять від 8 до 15% гексасахариду AIIa-IIs-Is в гексасахаридній фракції суміші олігосахаридів. Вміст гексасахаридної фракції можна визначити аналітичним методом шляхом високоефективної рідинної хроматографії високого 7 тиску на колонках TSK G3000 XL і TSK G2000 XL або шляхом препаративного відділення гексасахаридної фракції. У цьому випадку суміш піддають хроматографії на колонках, заповнених гелем типу поліакриламід агарози, наприклад, марки Ultrogel АСА 202® (Biosepra). Суміш елююють розчином гідрокарбонату натрію. Переважно як розчин гідрокарбонату натрію використовують розчин, молярна концентрація якого складає від 0,1моль/л до 1моль/л. Більш переважно відділення здійснюють при молярній концентрації 1моль/л. Детенцію здійснюють УФспектрометрією (254нм). Після фракціонування фракцію гексасахариду в розчині гідрокарбонату натрію нейтралізують крижаною оцтовою кислотою. Потім розчин концентрують при зниженому тиску до одержання концентрації ацетату натрію більше за 30% мас. Гексасахаридну фракцію осаджують шляхом додавання від 3 до 5 об'ємів метанолу. Гексасахаридну фракцію виділяють шляхом фільтрування через пористе скло №3. Одержану суміш гексасахаридів можна піддати аналізу шляхом ВЕРХ (високоефективної рідинної хроматографії) для визначення вмісту в ній гексасахариду AIIa-IIs-Is. Гексасахарид АІІа-IIs-Is можна виділити препаративною ВЕРХ або афінною хроматографією на колонці антитромбин III-сефароза методами, що застосовуються фахівцем [M.Hook, I.Bjork, J.Hopwood and U.Lindahl, F.E.B.S letters, vol 656(1) (1976)]. Більш конкретно суміші згідно з винаходом володіють активністю анти-Ха від 150МОд/мг до 200МОд/мг. Переважно активність анти-IIа сумішей згідно з винаходом складає менше 5МОд/мг і більш переважно від 0,5 до 3,5МОд/мг. Приведені нижче приклади застосування показують значення від 1,1 до 1,6МОд/мг, одержані при використанні переважних ознак винаходу. Переважно відношення активність антиХа/активність анти-ІІа сумішей згідно з винаходом складає більше 50 і більш конкретно більше 100. Переважно суміші згідно з винаходом мають середньомолекулярну масу від 2000 до 3000Да, і більш конкретно середньомолекулярну масу від 2400 до 2650Да. Таким чином об'єктом винаходу є суміші, вказані вище, що володіють активністю анти-Ха від 150МОд/мг до 200МОд/мг, активністю анти-ІІа від 0,5 до 3,5МОд/мг і середньомолекулярною масою від 2400 до 2650Да. Суміші олігосахаридів згідно з винаходом можна отримати шляхом деполімеризації солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру гепарину в органічному середовищі за допомогою сильної органічної основи, рКа якої переважно вище 20 (властивості, переважно властиві сімейству фосфазенів, описаних, [наприклад, R.Schwesinger et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169(1987), R.Schwesinger et al, Angew. Chem. 105, 1420(1993)]), переведенням солі четвертинного амонію складного бензилового ефіру деполімеризованого гепарину в натрієву сіль, омиленням залишкового складного ефіру і 81925 8 можливо очищенням. У способі згідно з винаходом використовують основні стадії способу, описаного в WO 0208295, доповнивши його істотною характеристикою, яка дозволяє отримувати суміші олігосахаридів згідно з винаходом, що володіють фізико-хімічними властивостями і видами активності, описаними вище. Дійсно, для одержання специфічних сумішей олігосахаридів згідно з винаходом необхідно контролювати селективність основи, щоб з точністю регулювати вміст води на стадії деполімеризації. Спосіб згідно з винаходом дійсно відрізняється контролем високої селективності основи в процесі деполімеризації. Вона дозволяє здійснювати деполімеризацію гепарину, максимально захищаючи при цьому послідовності, схожі з АТШ, такі як гексасахарид Alla-IIs-Is, описаний згідно з даним винаходом. Ця критична стадія способу забезпечує одержання полісахаридів згідно з винаходом. Вказана характеристика способу виражається в ативностях аХа, несподіваних по відношенню до середньомолекулярної маси сумішей олігосахаридів (150МОд/мг