Фармацевтична композиція, що має протипухлинну активність, яка включає антитіло до her2

1. Фармацевтична композиція, що має протипухлинну активність, яка включає: а) основний вид антитіла до HER2, яке зв’язується з доменом ІІ в HER2 і включає амінокислотні послідовності варіабельного легкого й варіабельного важкого ланцюгів, SEQ ID NO: 3 і 4, відповідно, і 2 (19) 1 3 90480 4 (а) основного виду антитіла до HER2, який вклю11. Фармацевтична композиція, що має протипухчає олігосахаридну структуру G1 або G2, приєдналинну активність, яка включає: ну до його Fc-ділянки; а) основний вид антитіла до HER2, яке включає (б) основного виду антитіла до HER2, який вклюамінокислотні послідовності варіабельного легкого чає вуглеводний фрагмент, приєднаний до його й варіабельного важкого ланцюгів, SEQ ID NO: 3 і легкого ланцюга; 4, відповідно, і (в) основного виду антитіла до HER2, який вклюб) варіант амінокислотної послідовності вказаного чає неглікозилований важкий ланцюг; і основного виду антитіла, який включає лідерне (г) основного виду антитіла до HER2 з сіаліловою подовження VHS- на амінокінці, приєднане до одолігосахаридною структурою, приєднаною до його ного або двох варіабельних доменів його легкого Fc-ділянки. ланцюга, 9. Фармацевтичний препарат, що має протипухде від 5 % до 15 % молекул антитіла в композиції линну активність, який включає композицію за п. 1 включають лідерне подовження VHS- на амінокінта фармацевтично прийнятний носій. ці, за даними кількісного аналізу методом катіоно10. Фармацевтичний препарат за п. 9, який відрізобмінної хроматографії. няється тим, що він є стерильним. Даний винахід стосується композиції, яка включає основний вид антитіла до HER2, яке зв'язується з доменом II в HER2, або варіанта його амінокислотної послідовності, що включає лідерне подовження на аміно-кінці. Винахід також стосується фармацевтичних композицій, які включають вказану композицію, і варіантів терапевтичного використання такої композиції. Антитіла до Неr2 Сімейство рецепторів HER2 тирозинкіназ являє собою важливі модулятори росту, диференціації й виживання клітин. Вказане сімейство рецепторів включає чотири різні представники, включаючи рецептори епідермального фактора росту (EGFR, ErbB1 або HER1), HER2 (ErbB2 або р185neu), HER3 (ЕrbВ3) і HER4 (ЕrbВ4 або tyro2). EGFR, який кодується геном еrbВ1, задіюється в процес злоякісного росту в людини. Зокрема, підвищена експресія EGFR спостерігається при раку молочної залози, сечового міхура, легені, голови, шиї й шлунка, а також у випадку гліобластоми. Підвищена експресія рецептора EGFR часто асоційована з підвищеною продукцією ліганду EGFR, трансформуючого фактора росту альфа (TGF-α), тими самими пухлинними клітинами, приводячи до активації рецептора через шлях аутокринної стимуляції (Baselga and Mendelsohn Pharmac Ther. 64: 127-154 (1994)). Моноклональні антитіла проти EGFR або його лігандів, TGA-α і EGF, розглядаються як терапевтичні засоби при лікуванні таких видів злоякісних новоутворень (див., наприклад, Baselga and Mendelsohn, вище; Masui et. al., Cancer Research, 44: 1002-1007 (1984) і Wu et. al., J. Clin. Invest., 95: 1897-1905 (1995)). Другий представник сімейства HER, p185neu, спочатку був ідентифікований як продукт трансформуючого гену з нейробластом щурів, яким вводили хімічний препарат. Активована форма протоонкогену neu виникає в результаті точкової мутації (заміну валіну на глютамінову кислоту) у трансмембранній ділянці кодованого білка. Ампліфікація людського гомолога neu спостерігається при раку молочної залози і яєчника й корелює з поганим прогнозом (Slamon et. al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et. al., Science, 244: 707712 (1989); патент США №4968603). Дотепер в пухлинах людини не виявлені точкові мутації, аналогічні до лей протоонкогену. Суперекспресія HER2 (найчастіше, але не повністю відповідно до генної ампліфікації) також спостерігається при інших карциномах, включаючи карциноми шлунка, ендометрію, слинної залози, легені, нирки, товстої кишки, щитовидної залози, підшлункової залози й сечового міхура (див., серед інших, King et. al., Science, 229: 974 (1985); Yokota et. al., Lamcet 1: 765-767 (1986); Fukushige et. al., Моl. Cell. Biol., 6: 955-958 (1986); Guerin et. al., Oncogene Res., 3: 2131 (1988); Cohen et. al., Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura et. al., Cancer Res., 51: 1034 (1991); Borst et. al., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990); Weiner et. al., Cancer Res., 50: 421-425 (1990); Kern et. al., Cancer Res., 50: 5184 (1990); Park et. al., Cancer Res., 49: 6605 (1989); Zhau et. al., Моl. Carcinog., 3: 254-257 (1990); Aasland et. al., Br. J. Cancer., 57: 358-363 (1988); Williams et. al., Pathobiology 59: 4652 (1991); і McCann et. al., Cancer, 65: 88-92 (1990)). HER2 може суперекспресуватися при раку передміхурової залози (Gu et. al., Cancer Lett., 99: 185-9 (1996); Ross et. al., Hum Pathol., 28: 827-33 (1997); Ross et. al., Cancer 79: 2162-70 (1997) і Sadasivan et. al., J. Urol., 150: 126-31 (1993)). Антитіла проти щурячого pl85neu і білкових продуктів людського HER2, описані Дребіном зі співавторами (Drebin et. al.), викликають утворення антитіл проти генного продукту лей щурів, p185neu (див., наприклад, Drebin et. al., Cell., 41: 695-706 (1985); Myers et. al., Meth. Enzym., 198: 277-290 (1991); і WO 94/22578). Дребін зі співавторами (Drebin et. al., Oncogene, 2: 273-277 (1988)) показали, що суміші антитіл, активних у відношенні двох різних ділянок на p185neu, приводять до синергічних протипухлинних ефектів на neuтрансформованих клітинах NIH-3T3, імплантованих мишам nude, (див., також патент США №5824311, виданий 20 жовтня 19,98 року). Худзіак із співавт. (Hudziak et. al., Моl. Cell. Biol., 9(3): 1165-1172 (1989)) описують одержання панелей антитіл до HER2, які були охарактеризовані з використанням клітинної лінії пухлини молочної залози людини SK-BR-3. Відносну проліферацію клітин SK-BR-3 після експозиції з антитілами визначають за фарбуванням моношарів кристалі 5 90480 6 чним фіолетовим через 72 години. У рамках даноптори проявляють підвищену експресію принаймні го тесту визначають максимальне інгібування анв деяких клітинних лініях раку молочної залози. титілом, яке називається 4D5, яке інгібує клітинну Рецептори HER в основному знайдені в різних проліферацію на 56%. Інші антитіла в розглянутій сполученнях у клітинах і, вважається, що гетеропанелі знижують клітинну проліферацію в меншодимеризація підвищує розмаїтість клітинних відпому ступені, за даними даного тесту. Було також відей на багато лігандів HER (Earp et. al., Breast показано, що антитіло 4D5 сенсибілізує клітинну Cancer Research and Treatment 35: 115-132 лінію пухлини людини, що здійснює суперекспре(1995)). EGFR зв'язується із шістьома різними лісію. HER2, до цитотоксичних ефектів TNF-α (див. гандами: епідермальний фактор росту (EGF), тратакож патент США №5677171, виданий 14 жовтня нсформуючий фактор росту альфа (TGF-α), афіре1997 року). Описані Худзіаком із співавт. (Husziak гулін, епідермальний фактор росту, який зв'язує et. al.) антитіла до HER2 були також охарактеризогепарин (HB-EGF), бетацелюлін і епірегулін вані іншими авторами (Fendly et. al., Cancer (Groenen et. al., Growth Factors, 11: 235-257 Research, 50: 1550-1558 (1990); Kotts et. al., In Vitro (1994)). Сімейство білків герегулінів, які одержують 26(3): 59A (1990); Sarup et. al., Growth Regulation, при альтернативному сплайсингу одного гену, дає 1: 72-82 (1991); Shepard et. al., J. Clin Immunol., ліганди для HER3 і HER4. Сімейство герегулінів 11(3): 117-127 (1991); Kumar et. al., Моl. Cell. Biol., включає герегуліни альфа, бета й гамма (Holmes 11(2): 979-986 (1991); Lewis et. al., Cancer Immunol. et. al., Science, 256: 1205-1210 (1992); патент США Immunother., 37: 255-263 (1993); Pietras et. al., №5641869; і Schaefer et. al., Oncogene, 15: 1385Oncogene, 9: 1829-1838 (1994); Vitetta et. al., 1394 (1997)), фактори диференціації neu (NDF), Cancer Research, 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski гліальні фактори росту (GGF), фактор, який індуet. al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994); кує активність ацетилхолінового рецептора (ARIA), Scott et. al., J. Biol. Chem., 266: 14300-5 (1991); і фактор, утворений із сенсорних і рухових нейроD'souza et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 7202-7206 нів (SMDF). У літературі є відповідні огляди (див. (1994); Lewis et. al., Cancer Research, 56: 1457Groenen et. al., Growth Factors, 11: 235-257 (1994); 1465 (1996) і Schaefer et. al., Oncogene, 15: 1385Lemke et. al., G. Molec & Cell. Neurosci., 7: 247-262 1394 (1997)). (1996) і Lee et. al., Pharm. Rev., 47: 51-85 (1995)). Рекомбінантна гуманізована версія мишиного Недавно були ідентифіковані три додаткові ліганантитіла HER2 4D5 (huMab4D5-8, rhuMab HER2, ди HER: нейрегулін-2 (NRG-2), який, як повідомляТрастузумаб (Trastuzumab) або HERCEPTIN®; ється, зв'язується з HER3 або HER4 (Chang et. al., патент США №5821337), клінічно активний у паціNature 387: 509-512 (1997); і Carraway et. al., єнтів з метастазуючими раковими пухлинами моNature, 387: 512-516 (1997)), нейрегулін-3, який лочної залози, що здійснюють суперекспресію зв'язується з HER4 (Zhang et. al., PNAS (USA), HER2, яким проводилася попередня велика про94(18): 9562-7 (1997)), і нейрегулін-4, який зв'язутиракова терапія (Basegla et. al., J. Clin. Oncol., 14: ється з HER4 (Harari et. al., Oncogene, 18: 2681-89 737-744 (1996)). Трастузумаб (Trastuzumab), був (1999)), HB-EGF, бетацелюлін і епірегулін також схвалений Агентством з контролю за лікарськими зв'язуються з HER4. й харчовими продуктами США (Food and Drug Оскільки EGF і TGF-α не зв'язуються з HER2, Administration) 25 вересня 1998 року для лікування EGF стимулює EGFR і HER2 до утворення гетеропацієнтів з метастазуючими раковими пухлинами димеру, який активує EGFR, що проводить до фомолочної залози, у випадку, якщо пухлини здійссфорилування HER2 у гетеродимері. Димеризація нюють суперекспресію HER2 білки. та/або трансфосфорилування, як видно, активуУ літературі також описані інші антитіла до ють тирозинкіназу HER2 (див., Earp et. al., вище). HER2 з різними властивостями (Tagliabue et. al., Аналогічно, у тому випадку, коли HER3 спільно Int J. Cancer., 47: 933-937 (1991); McKenzie et. al., експресується з HER2, утворюється активний сигOncogene, 4: 543-548 (1989); Maier et. al., Cancer нальний комплекс і антитіла, спрямовані проти Res., 51: 5361-5369 (1991); Bacus et. al., Molecular HER2, здатні руйнувати даний комплекс Carcinogenesis, 3: 350-362 (1990); Stancovski et. al., (Sliwkowski et. al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991); Bacus et. al., 14665 (1994)). Додатково, афінність HER3 у відCancer Research, 52: 2580-2589 (1992); Xu et. al., ношенні гетерорегуліну (HRG) підвищується до Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993); WO 94/00136; більш високого рівня афінності у випадку спільної Kasprzyk et. al., Cancer Research, 52: 2771-2776 експресії з HER2 (див. також Levi et. al., Journal of (1992); Hancock et. al., Cancer Res., 51: 4575-4580 Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et. al., (1991); Shawver et. al., Cancer Res., 54: 1367-1373 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995); і (1994); Arteaga et. al., Cancer Res., 54: 3758-3765 Lewis et. al., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996) у (1994); Harwerth et. al., J. Bol. Chem., 267: 15160тому, що стосується білкового комплексу HER215167 (1992); патент США №5783186 і Klapper et. HER3. HER4, як і HER3, утворює активний сигнаal., Oncogene 14: 2099-2109 (1997)). льний комплекс із HER2 (Carraway and Cantley, Скринінг із метою виявлення гомологів привів Cell, 78: 5-8 (1994)). до ідентифікації двох інших представників сімейсДля впливу на сигнальну систему HER було тва рецепторів HER: HER3 (патенти США розроблено антитіло rhuMAb 2C4 (Pertuzumab, №№5183884 і 5480968, а також Kraus et. al., PNAS OMNITARG™) як гуманізоване антитіло, яке інгібує (USA) 86: 9193-9197 (1989)) і HER4 (заявка на падимеризацію HER2 з іншими HER рецепторами, тент ЕР №599274; Plowman et. al., Proc. Natl. Acad. що приводить до інгібування здійснюваного під Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993) і Plowman et. al., дією ліганду фосфорилування й активації, а також Nature, 366: 473-475 (1993)). Обидва вказані рецешляхи активації RAS і АКТ у напрямку зчитування 7 90480 8 інформації. На фазі І випробувань Пертузумабу відповідно, і варіант амінокислотної послідовності (Pertuzumab) як єдиного засобу для лікування соосновного виду антитіла, що включає VHS-лідерне лідних пухлин З суб'єктів з розвиненим раком яєчподовження на амінокінці, приєднаної до одного ників піддавали лікуванню Пертузумабом. В одноабо двох варіабельних доменів легкого ланцюга, го пацієнта відзначалася стійка часткова відповідь, де від приблизно 1% до приблизно 20% молекул а в іншого пацієнта відзначалася стабілізація заантитіла в композиції включають VHS-лідерне похворювання протягом 15 тижнів (Agus et. al., Proc. довження на аміно-кінці. Am. Soc. Clin. Oncol., 22: 192, Abstract 771 (2003)). Даний винахід також стосується поліпептиду, Композиції, які включають варіант антитіла який включає амінокислотну послідовність SEQ ID У патенті США №6339142 описується компоNO: 23 або її дезамідований та/або окислений вазиція з антитілом до HER2, яка включає· суміш ріант, а також антитіла, яке включає (а) легкий антитіла проти HER2 і одного або декількох його ланцюг, який містить даний поліпептид, і (b) важваріантів, де кількість активного(их) варіанта(ів) кий ланцюг, який містить амінокислотну послідовстановить менше, ніж приблизно 25%. Трастузуність, вибрану із групи, яка складається з SEQ ID маб (Trastuzumab) являє собою приклад антитіла NO: 16, SEQ ID NO: 24 і дезамідованого та/або до HER2. окисленого варіанта SEQ ID NO: 16 або SEQ ID Райд із співавт. (Reid et. al.) у постерній презеNO: 24. нтації на фармацевтичній конференції (Well Даний винахід також стосується фармацевтиCharacterized Biotech Pharmaceutical Conference) чного препарату, який включає композицію у фар(січень 2003 року) у доповіді, присвяченій ефектам мацевтично прийнятному носії, і способу лікування змін клітинної культури на характеристики гуманіНЕR-2-експресуючого раку в пацієнта, який вклюзованого антитіла («Effects of Cell Culture Process чає введення пацієнтові вказаного фармацевтичChanges on Humanized Antibody Characteristics») ного препарату в кількості, ефективній для лікуописує композицію з неназваним гуманізованим вання раку. IgGl антитілом, яке містить N-кінцеву гетерогенну На Фіг.1 представлена схема білкової структуструктуру, створену комбінацією VHS сигнального ри HER2 і амінокислотних послідовностей домену пептиду, N-кінцевого глютаміну й піроглютамінової I-IV (SEQ ID NO: 19-22, відповідно) його позаклікислоти в його важкому ланцюзі. тинного домену. Рід із співавт. (Reed et. al.) у постерній презенНа Фіг.2А та 2В показані результати порівнянтації на конференції, присвяченій одержанню ання амінокислотних послідовностей варіабельного титіл (ІВС Antibody Production Conference) (лютий легкого (VL) (Фіг.2А) і варіабельного важкого (VH) 2002 року) у доповіді, присвяченій ролі хроматог(Фіг.2В) доменів мишиного моноклонального антирафічного методу в оцінці антитіл («The Ideal тіла 2С4 (SEQ ID NO: 1 і 2, відповідно); VL і VH доChromatographic Antibody Characterization Method») менів гуманізованого антитіла 2С4 версії 574 (SEQ описує спосіб подовження VHS- важкого ланцюга ID NO: 3 і 4, відповідно) і консенсусних послідовЕ25, що представляє собою гуманізоване IgGl анностей каркасних ділянок VL і VH (hum к1, легка титіло. каппа, підгрупа І, humlll, важка, підгрупа III) (SEQ Раус із співавт. (Rouse et. al.) у постерній преID NO: 5 і 6, відповідно). Стрілки вказують на відзентації на конференції WCBP (6-9 січня 2004 ромінності між гуманізованим варіантом 2С4 574 і ку) у доповіді, присвяченій методам оцінки глікопмишиним моноклональним антитілом 2С4, або між ротеїну («Top Down' Glycoprotein Characterization гуманізованим антитілом 2С4 574 і мишиним моby High Resolution Mass Spectometry and Its ноклональним антитілом 2С4 і каркасною ділянкою application to Biopharmaceutical Development»), людської молекули. У дужках показані гіперваріаописують композицію на основі моноклонального бельні ділянки (CDR). антитіла, яке включає N-кінцеву гетерогенну струНа Фіг.3А та 3В показані амінокислотні посліктуру, отриману із залишків сигнального 3AHS або довності легкого ланцюга (SEQ ID NO: 15) і важко2 HS пептиду, на їх легкому ланцюзі. го ланцюга (SEQ ID NO: 16) Пертузумабу У презентації на ІВС конгресі (ІВС Meeting) (Pertuzumab). CDR виділені жирним шрифтом. (вересень 2000 року) Джил Портер (Jill Porter) Вуглеводний фрагмент приєднаний до Asn 299 у представив стратегічний підхід, зв'язаний з виковажкому ланцюзі. ристання порівняльних досліджень і тестів для На Фіг.4А та 4В показані амінокислотні посліхарактеристики біологічних препаратів («Strategic довності легкого ланцюга (SEQ ID NO: 17) і важкоUse of Comparability Studies and Assay for Well го ланцюга Пертузумабу, кожна з яких включає Characterized Biologicals»), у якому обговорюється інтактну послідовність сигнального пептиду на одержувана на пізніх етапах елюції форма аміно-кінці (SEQ ID NO: 18). ZENAPAX, що включає три додаткові амінокислотНа Фіг.5 схематично показане зв'язування 2С4 ні залишки на важкому ланцюзі. у сайті зв'язування гетеродимеру в HER2, що пеДаний винахід стосується композиції, яка решкоджає гетеродимеризації з активованим включає основний вид антитіла до HER2, яке зв'яEGFR або HER3. зується з доменом II в HER2, і варіанту за амінокиНа Фіг.6 показане спряження HER2/HER3 зі слотною послідовністю, що включає лідерне подошляхами МАР і Akt. вження на аміно-кінці. На Фіг.7 проілюстровані результати порівняДодатково, даний винахід стосується композильного вивчення активності Трастузумабу й Перції, яка включає суміш основного виду антитіла до тузумабу (Trastuzumab and Pertuzumab). HER2, що містить послідовності варіабельних ділянок легкого й важкого ланцюгів SEQ ID NO: 3 і 4, 9 90480 10 На Фіг.8А та 8В показані реконструйовані маснокислотних послідовностей у контексті даного спектри відновленого легкого ланцюга (Фіг.8А) і опису включають кислий варіант (наприклад, деважкого ланцюга (Фіг.8В) Пертузумабу. замідований варіант антитіла), основний варіант, На Фіг.9А та 9В наведені результати аналізу антитіло з лідерним подовженням на аміно-кінці нативного Пертузумабу (Фіг.9А) і СРВ(наприклад, VHS-) на його одному або двох легких розщепленого Пертузумабу (Фіг.9В) методом катіланцюгах, антитіло із С-кінцевим лізиновим залионообмінної хроматографії. шком на його одному або двох важких ланцюгах, На Фіг.10 показаний результат аналізу Пертуантитіло з одним або декількома окисленими зазумабу методом гель-хроматографії. лишками метіоніну й т.п., а також включає сполуНа Фіг.11А та 11В показаний результат CEчення різних амінокислотних послідовностей важSDS-LIF аналізу відновленого Пертузумабу кого та/або легкого ланцюгів. Варіанти антитіл, (Фіг.11А) і інтактного Пертузумабу (Фіг.11В). особливо цікаві в контексті даного опису, являють На Фіг.12А та 12В показані пептидні карти піссобою антитіло, яке включає лідерне подовження ля розщеплення Пертузумабу трипсином (Фіг.12А) на аміно-кінці в одному або двох важких ланцюгах, і LYS-C пептидні карти Пертузумабу (Фіг.12В). що необов'язково також включає інші відмінності На Фіг.13 наведені результати СЄ-аналізу Nза амінокислотною послідовністю та/або за глікозв'язаних олігосахаридів, вивільнених з Пертузузилуванням відносно основного виду антитіла. мабу. Термін «варіант за глікозилуванням» антитіла На Фіг.14А та 14В показані олігосахаридні в контексті даного опису стосується антитіла з одструктури, які звичайно спостерігаються в IgG анним або декількома вуглеводними фрагментами, титілах. приєднаними до молекули, яка відрізняється від На Фіг.15 показаний позитивний варіант масодного або декількох вуглеводних фрагментів, спектрального аналізу MALDI-TOF нейтральних приєднаних до антитіла основного виду. Приклади олігосахаридів, вивільнених з Пертузумабу. варіантів за глікозилуванням включають антитіло з На Фіг.16А та 16В наведені амінокислотні посG1 або G2 олігосахаридною структурою замість лідовності легкого ланцюга (SEQ ID NO: 13) і важG0 олігосахаридної структури, приєднаної до Fc кого ланцюга (SEQ ID NO: 14) Трастузумабу ділянки, антитіло з одним або двом вуглеводними (Trastuzuraab). фрагментами, приєднаними до його одного або На Фіг.17А та 17В показана послідовність легдвох легких ланцюгів, антитіло без вуглеводного кого ланцюга Пертузумабу (SEQ ID NO: 23) і варіфрагмента, приєднаного до його одного або двох ант послідовності важкого ланцюга Пертузумабу важких ланцюгів антитіла й т.п., а також сполучен(SEQ ID NO: 24). ня таких змін у глікозилуванні. І. Визначення У тому випадку, коли антитіло містить Fc діляТермін «основний вид антитіла» у контексті нку, олігосахаридна структура, така як структура, даного опису стосується структури амінокислотної показана на Фіг.14А та 14В, може бути приєднана послідовності в композиції, яка у кількісному віддо одного або двох важких ланцюгів антитіла, наношенні являє собою переважну антитільну молеприклад, за залишком 299. У випадку Пертузумакулу в композиції. Переважно, основний вид антибу, G0 являє собою домінуючу олігосахаридну тіла являє собою антитіло до HER2, таке як структуру, з іншими можливими олігосахаридними антитіло, яке зв'язується з доменом II HER2, антиструктурами, такими як G0-F, G-1, Маn5, Маn6, тіло, яке інгібує димеризацію HER більш ефективG1-1, G1(1-6), G1(1-3) і G2, які зустрічаються в но, ніж Трастузумаб (Trastuzumab), та/або антитіменших кількостях у композиції Пертузумабу. ло, яке зв'язується із сайтом гетеродимерного Якщо особливо не вказане інше, термін «G1 зв'язування HER2. Кращий варіант вказаного осолігосахаридна структура» у контексті даного опиновного виду антитіла в контексті даного опису су включає G1(1-6) і G1(1-3) структури. являє собою такий варіант, який включає варіабеТермін «лідерне подовження на аміно-кінці» у льну легку й варіабельну важку амінокислотні посконтексті даного опису стосується одного або делідовності SEQ ID NO: 3 і 4, і найбільш переважно, кількох амінокислотних залишків аміно-кінцевої включає амінокислотні послідовності легкого ланлідерної послідовності, які присутні на аміно-кінці цюга й важкого ланцюга, SEQ ID NO: 15 і 16 (Перодного або декількох важких або легких ланцюгів тузумаб). антитіла. Приклад аміно-кінцевого лідерного подоТермін «варіант амінокислотної послідовності» вження включає три амінокислотні залишки або антитіла в контексті даного опису являє собою складається із трьох амінокислотних залишків антитіло з амінокислотною послідовністю, яка відVHS, присутніх на одному або обох легких ланцюрізняється від послідовності, наявної в основному гах варіанта антитіла. виді антитіла. Звичайно варіанти амінокислотної Термін «дезамідоване» антитіло являє собою послідовності мають принаймні приблизно 70% антитіло, у якому один або декілька аспарагінових гомологію з основним видом антитіла й, переважзалишків були дериватизировані з утворенням, но, вони характеризуються принаймні приблизно наприклад, аспарагінової кислоти, сукциніміду або 80% і, більш переважно, принаймні 90% гомологіізо-аспарагінової кислоти. єю з основним видом антитіла. Варіанти амінокисТермін «гомологія» визначається як відсоток лотної послідовності містять заміщення, делеції залишків в амінокислотній послідовності варіанта, та/або вставки в певних положеннях всередині які оцінюються як ідентичні, за результатами поріданої амінокислотної послідовності або в безпосевняння послідовностей і введення, при необхідноредній близькості від амінокислотної послідовності сті, гепів, для досягнення максимального відсотка основного виду антитіла. Приклади варіантів амігомології. Способи й комп'ютерні програми, засто 11 90480 12 совувані для такого порівняння, відомі в даній гаТерміни «ЕrbВ3» і «HER3» стосуються поліпелузі. Одна з відповідних комп'ютерних програм птидного рецептора, описаного, наприклад, у паявляє собою «Align 2», розроблену компанією тентах США №№5183884 і 5480968, а також у роGenentech Inc., яка була зареєстрована з докуменботі Крауса із співавт. (Kraus et. al., PNAS (USA), тацією для користувачів у Бюро США із захисту 86: 9193-9197 (1989)). авторських прав (United States Copyright Office, Терміни «ErbB4» і «HER4» у контексті даного Washington, DC 20559) 10 грудня 1991 року. опису стосуються поліпептидного рецептора, опиУ контексті даного опису термін «катіонообсаного, наприклад у заявці на патент ЕР №599274; мінний аналіз» стосується способу, за допомогою а також у роботах Плаумана із співавт. (Plowman якого композицію, яка включає дві або більше споet. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 луки, розділяють на основі відмінності їх зарядів з (1993); i·Plowman et. al., Nature, 366: 473-475 використанням катіонообмінника. Катіонообмінник (1993)), включаючи його ізоформи, описані, напризвичайно включає ковалентно зв'язані негативно клад, в WO 99/19488, опублікованій 22 квітня 1999 заряджені групи. Переважно, розглянутий катіонороку. обмінник являє собою слабкий катіонообмінник Термін «ліганд HER» означає поліпептид, який та/або включає карбоксилатну функціональну грузв'язується з рецептором HER та/або активує його. пу, таку як у катіонообмінній колонці PROPAC Ліганд HER, який представляє особливий інтерес у WCX-10™, яка постачається компанією Dionex. контексті даного опису, стосується нативної посліТермін «рецептор HER» являє собою рецепдовності людського ліганду HER, такого як епідертор білка тирозинкінази, який належить до сімейсмальний фактор росту (EGF) (Savage et. al., J. Biol. тва рецепторів HER і включає рецептори EGFR, Chem., 247: 7612-7621 (1972)); трансофрмуючий HER2, HER3 і HER4, а також інші представники фактор росту альфа (TGF-α) (Marquardt et. al., даного сімейства, які можуть бути ідентифіковані в Science 223: 1079-1082 (1984)); амфірегулін, також майбутньому. Рецептор HER звичайно містить відомий як аутокринний фактор росту невриноми позаклітинний домен, який може зв'язувати ліганд або кератиноцитів (Shoyab et. al., Science, 243: HER, ліпофільний трансмембранний домен, кон1074-1076 (1989)); Kimura et. al., Nature, 348: 257сервативний внутрішньоклітинний тирозинкіназний 260 (1990); і Cook et. al., Моl. Cell. Biol., 11: 2547домен і сигнальний домен на карбокси-кінці, який 2557 (1991); бетацелюлін (Ching et. al., Science містить декілька тирозинових залишків, які можуть 259: 1604-1607 (1993)) і Sasada et. al., Biochem. бути фосфориловані. Кращий рецептор HER явBiophys. Res. Commun., 190: 1173 (1993)); гепаринляє собою нативну послідовність людського рецезв'язувальний епідермальний фактор росту (HBптора HER. EGF) (Higashiyama et. al., Science, 251: 936-939 Позаклітинний домен HER2 включає чотири (1991)); епірегулін (Toyoda et. al., J. Biol. Chem., домени: домен І (амінокислотні залишки приблиз270: 7495-7500 (1995)); і Komurasaki et. al., но на ділянці 1-195), домен II (амінокислотні залиOncogene, 15: 2841-2848 (1997)); герегулін (див. шки приблизно на ділянці 196-319), домен III (амінижче); нейрегулін-2 (NRG-2) (Carraway et. al., нокислотні залишки приблизно на ділянці 320-488) Nature, 387: 512-516 (1997)); нейрегулін-3 (NRG-3) і домен IV (амінокислотні залишки приблизно на (Zhang et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 9562-9567 ділянці 489-630) (залишки пронумеровані без сиг(1997)); нейрегулін-4 (NRG-4) (Harari et. al., нального пептиду) (див. Garrett et. al., Моl. Cell., Oncogene, 18: 2681-89 (1999)) або крипто (CR-1) 11: 495-505 (2003); Cho et. al., Nature., 421: 756-760 (Kannan et. al., J. Biol. Chem., 272(6): 3330-3335 (2003); Franklin et. al., Cancer Cell., 5: 317-328 (1997)). Ліганди HER, які зв'язують EGFR, включа(2004); або Plowman et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., ють EGF, TGF-α, амфірегулін, бетацелюлін, HB90: 1746-1750 (1993). Див., також креслення на EGF і епірегулін. Ліганди HER, які зв'язують HER3, Фіг.1, прикладений до даного опису. включають герегуліни. Ліганди- HER, здатні зв'язуТерміни «ErbB1», «HER1», «рецептор епідервати HER4, включають бетацелюлін, епірегулін, мального фактора росту» і «EGFR» у контексті НВ- EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 і герегуліни. даного опису використовуються взаємозамінно й Термін «герегулін» (HRG) у контексті даного стосуються EGFR, описаного, наприклад, у роботі опису стосується поліпептиду, який кодується генКарпентера із співавт. (Carpenter et. al., Ann. Rev. ним продуктом герегуліну, описаному в патенті Biochem., 56: 881-914 (1987), включаючи його приСША №5641869 або в роботі Марчіонні із співавт. родні мутантні форми (наприклад, делеційний му(Marchionni et. al., Nature, 362: 312-318 (1993)). тант EGFR, описаний, наприклад, у роботі Хамфри Приклади герегуліну включають герегулін-α, гереіз співавт. (Humphrey et. al., PNAS (USA), 87: 4207гулін-β1, герегулін-β2, герегулін-βЕЗ (Holmes et. 4211 (1990)). Термін еrbВ1 стосується гену, який al., Science 256: 1205-1210 (1992); і патент США кодує білковий продукт EGFR. №5641869); фактор диференціації леи (NDF) Терміни «ErbB2» і «HER2» використовуються (Peles et. al., Cell 69: 205-216 (1992)); фактор, який взаємозамінно й стосуються людського білка індукує активність ацетилхолінового рецептора HER2, описаного в літературі (див., наприклад, (ARIA) (Falls et. al., Cell 72: 801-815 (1993); фактор Semba et. al., PNAS (USA)., 82: 6497-6501 (1985) і росту гліальних клітин (GGF) (Marchionni et. al., Yamomoto et. al., Nature, 319: 230-234 (1986) (ноNature, 362: 312-318 (1993)); фактор, утворений із мер доступу в Genebank X03363). Термін «еrbВ2» сенсорних і рухових нейронів (SMDF) (Ho et. al., J. стосується гену, який кодує людський еrbВ2, і Biol. Chem., 270: 14523-14532 (1995)); γ-герегулін «neu» стосується гену, який кодує щурячий (Schaefer et. al., Oncogene 15: 1385-1394 (1997)). р185neu. Кращий HER2 являє собою нативну посліТермін включає також біологічно активні фрагмендовність людського HER2. ти та/або варіанти за амінокислотною послідовніс 13 90480 14 тю нативної послідовності поліпептиду HRG, такі спрямоване проти однієї детермінанти на антигені. як EGF-подібний фрагмент його домену (наприКрім своєї специфічності, моноклональні антитіла клад, HRGE1177-244). мають переваги в тому, що вони не забруднені Термін «димер HER» у контексті даного опису іншими імуноглобулінами. Визначення «моноклоявляє собою нековалентно асоційований димер, нальний» вказує на характер антитіла, яке одерякий включає принаймні два різні рецептори HER. жують по суті з гомогенної популяції антитіл, і його Такі комплекси можуть утворюватися, коли клітине слід трактувати в плані обмеження способу на, яка експресує два або декілька рецепторів одержання антитіл певним методом. Наприклад, HER, піддається впливу ліганду HER, і можуть моноклональні антитіла, які використовують відпобути виділені імунопреципітацією і далі проаналівідно до даного винаходу, можуть бути отримані зовані методом ДСН-ПААГ, як описано, наприза методом гідридом, вперше описаному Kohler et. клад, у роботі Silwkowski et. al., J. Biol. Chem., al., Nature, 256: 4 95 (1975), або можуть бути отри269(20): 14661-14665 (1994).. Приклади таких димані з використанням рекомбінантої ДНК (див., мерів HER включають гетеродимери EGFR-HER2, наприклад, патент США №4816567). «МоноклонаHER2-HER3 і HER3-HER4. Крім того, димер HER льні антитіла» можуть бути виділені з бібліотеки може включати два або більше рецепторів HER2, фагових антитіл з використанням методик, описаоб'єднаних з іншим рецептором HER, таким як них у літературі (див., наприклад, Clackson et. al., HER3, HER4 або EGFR. З димером можуть бути Nature, 352: 624-628 (1991) і Marks et. al., J. Моl. асоційовані інші білки, такі як субодиниця цитокіBiol., 222: 581-597 (1991)). нового рецептора (наприклад, gр130). Наведені в даному описі моноклональні антиТермін «сайт гетеродимерного зв'язування» на тіла включають, зокрема, «химерні» антитіла, у HER2 стосується ділянки в позаклітинному домені яких частина важкого та/або легкого ланцюга іденHER2, який контактує або вступає у взаємодію з тична або гомологічна до відповідних послідовносділянкою в позаклітинному домені EGFR, HER3 тей в антитілах, отриманих з конкретного виду або або HER4 при утворенні з них димеру. Така ділянякі належать до конкретного класу або підкласу ка виявлена в домені II в HER2 (Franklin et. al., антитіл, що тоді як частина ланцюга(ів), що залиCancer Cell, 5: 317-328 (2004)). шилася, ідентична або гомологічна до відповідних Терміни «активація HER» або «активація послідовностей в антитілах, отриманих з іншого HER2» стосуються активації або фосфорилуванню виду або які належать до іншого класу або підклаодного або декількох рецепторів HER або рецепсу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, за торів HER2. В основному, активація HER привоумови, що вони демонструють бажану біологічну дить до сигнальної трансдукції (яка, наприклад, активність (патент США №4816567; і Morrison et. викликається внутрішньоклітинним доменом кінаal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 зи, яка фосфорилує тирозинові залишки в рецеп(1984)). Цікаві в контексті даного опису химерні торі HER або в поліпептидному субстраті). HER антитіла включають «приматизовані» антитіла, які активація може бути опосередкована зв'язуванням включають антиген-зв'язувальні послідовності валіганду HER з димером HER, що включає рецепріабельного домену, отримані від приматів, відмінтор HER, який представляє інтерес. Зв'язування них від людини (наприклад, Old World Monkey, Аре ліганду HER з димером HER може активувати доі т.п.), і послідовності константної ділянки людської мен кінази одного або декількох рецепторів HER у молекули. димері й, таким чином, приводити до фосфорилуТермін «фрагменти антитіл» включає частину вання тирозинових залишків в одному або декільінтактного антитіла, що переважно включає його кох рецепторах HER та/або до фосфорилування антиген-зв'язувальну або варіабельну ділянку. тирозинових залишків у додатковому(их) поліпепПриклади антитільних фрагментів включають фратиді(ах) субстрату, такий як внутрішньоклітинні Akt гменти Fab, Fab', F(ab')2 і Fv, диантитіла, лінійні або МАРК кінази. антитіла, одноланцюгові молекули антитіл і полісТермін «антитіло» у контексті даного опису випецифічні антитіла, утворені з антитільного(их) користовується в найбільш широкому змісті й конфрагмента(ов). кретно охоплює інтактні моноклональні антитіла, «Інтактне антитіло» являє собою таке антитіполіклональні антитіла, поліспецифічні антитіла ло, яке включає антиген-зв'язувальну варіабельну (наприклад, біспецифічні антитіла), утворені приділянку, а також константний домен легкого ланнаймні із двох інтактних антитіл і антитільних фрацюга (CL) і константні домени важкого ланцюга гментів, які демонструють бажану біологічну актиСH1, СН2 і СН3. Константні домени можуть являти вність. собою константні домени нативної послідовності Термін «моноклональне антитіло» у контексті (наприклад, константні домени нативної послідовданого опису стосується антитіла, отриманого з ності людини) або їх варіанти за амінокислотною популяції по суті гомогенних антитіл, наприклад, послідовністю. Переважно, інтактне антитіло має індивідуальних антитіл, що включають популяцію, одну або декілька ефекторних функцій й включає представники якої ідентичні або зв'язуються з тим олігосахаридну структуру, приєднану до одного самим епітопом, за винятком можливих варіантів, або двох важких ланцюгів. які можуть виникати в процесі продукції моноклоТермін «ефекторні функції» антитіла стосуєтьнального антитіла, такі як варіанти, наведені в ся біологічної активності, обумовленої Fc ділянкою даному описі. На відміну від препаратів поліклона(нативна послідовність Fc ділянки або варіант Fc льних антитіл, які в типовому випадку включають ділянки за амінокислотною послідовністю) антитірізні антитіла, спрямовані проти різних детерміла. Приклади ефекторних функцій антитіла вклюнант (епітопів), кожне моноклональне антитіло чають зв'язування Clq, комплементзалежна цито 15 90480 16 токсичність, зв'язування Fc рецептора, антитілозняються, насамперед, за своїми цитоплазматичзалежна клітиннозалежна цитотоксичність (ADCC), ними доменами. Активуючий рецептор FcyRIIA фагоцитоз, негативна регуляція рецепторів клітинвключає тирозин-вмісний активуючий мотив імуної поверхні (наприклад, рецептора В клітин; BCR) норецептора (ІТАМ) у своєму цитоплазматичному і т.п.. домені. Інгібуючий рецептор FcyRIIB включає тиЗалежно від амінокислотної послідовності конрозин-вмісний інгібуючий мотив імунорецептора стантної ділянки своїх важких ланцюгів інтактні (ІТІМ) у своєму цитоплазматичному домені (див. антитіла можуть бути розподілені за різними «клаогляд М. in Daeron, Алли. Rev. Immunol., 15: 203сами». Ідентифіковано п'ять основних класів інтак234 (1997)). FcR описані в ряді робіт (Ravetch and тних антитіл: IgA, IgD, IgE, IgG і ІgМ, і деякі з них Kinet, Алли. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991); Capel можуть бути поділені на «підкласи» (ізотипи), наet. al., Immunomethods, 4: 25-34 (1994); і de Haas приклад, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA і IgA2. Важкий et. al., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41 (1995)). Інші ланцюг константних доменів, який відповідає різFcR, включаючи такі форми, які можуть бути іденним класам антитіл, називають α, δ, ε, γ і μ відпотифіковані в майбутньому, охоплюються терміном відно. Субодиничні структури й тривимірні конфі«FcR», який використовується у даному описі. Дагурації різних класів імуноглобулінів добре відомі. ний термін також включає неонатальний рецептор Терміни «антитіло-залежна клітиннозалежна FcRn, який відповідає за пересенення материнсьцитотоксичність» і «ADCC» стосуються клітинної ких IgG у плід (Guyer et. al., J. Immunol., 117-587 реакції, у якій специфічні цитотоксичні клітини, які (1976) і Kim et. al., J. Immunol., 24: 249 (1994)). експресують Fc рецептори (FcR) (наприклад, приТермін «комплементзалежна цитотоксичність» родні клітини-кілери (NK), нейтрофіли й макрофаабо «CDC» стосується здатності молекули лізуваги), розпізнають зв'язане антитіло на цільовій кліти свою мішень у присутності комплементу. Шлях тині й далі викликають лізис цільової клітини. активації комплементу ініціюється в результаті Первинні клітини для реакції ADCC, клітини NK зв'язування першого компонента системи комплеекспресують тільки FcyRIII, тоді як моноцити ексменту (Clq) з молекулою (наприклад, антитілом) у пресують FcyRI, FcyRII і FcyRIII. Експресія FcR на комплексі з відповідним антигеном. Для оцінки гематопоетичних клітинах показана в таблиці 3 на активації комплементу проводять CDC тест, описторінці 464 у роботі Раветча й Кінета (Ravetch саний, наприклад, у роботі Gazzano-Santoro et. al., and Kinet, Алли. Rev. Immunol, 9: 457-92 (1991)). J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Для оцінки ADCC активності молекули, яка предТермін «нативні антитіла» звичайно означає ставляє інтерес, проводять тест ADCC in vitro, гетеродимерні глікопротеїни з масою приблизно описаний у патенті США №5500362 або 5821337. 150000 Дальтон, які складаються із двох ідентичЗастосовувані в таких тестах ефекторні клітини них легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких включають мононуклеарні клітини периферичної (Н) ланцюгів. Кожний легкий ланцюг приєднаний крові (МНПК (РВМС)) і природні клітини-кілери до важкого ланцюга одним ковалентним дисуль(NK). Альтернативно або додатково, ADCC активфідним зв'язком, при цьому кількість дисульфідних ність молекули, яка представляє інтерес, може зв'язків у важких ланцюгах різних імуноглобулінобути оцінена in vitro, наприклад, на моделі тварин, вих ізотипів змінюється. Кожний важкий і легкий такої як описана в роботі Клайнеса із співавт. ланцюг також містить певним чином розташовані (Clynes et. al., PNAS (USA), 95: 652-656 (1998)). міжланцюгові дисульфідні містки. Кожний важкий Термін «ефекторні клітини людини» стосуєтьланцюг містить один кінцевий варіабельний домен ся лейкоцитів, які експресують один або декілька (VH), за яким розташовані багато константних доFcR і виконують ефекторну функцію. Переважно менів. Кожний легкий ланцюг має варіабельний клітина експресує принаймні FcyRIII і виконує домен на одному кінці (VL) і константний домен на ADCC ефекторную функцію. Приклади людських іншому кінці. Константний домен легкого ланцюга лейкоцитів, які задіюються в ADCC, включають певним чином розташований відносного першого мононуклеарні клітини периферичної крові константного домену важкого ланцюга, і варіабе(МНПК), природні клітини-кілери (NK), моноцити, льний домен легкого ланцюга певним чином розцитотоксичні Τ клітини нейтрофіли, при цьому ташований відносно варіабельного домену важкоМНПК і ΝΚ клітини є кращими. Ефекторні клітини го ланцюга. Вважається, що деякі амінокислотні можуть бути виділені зі свого нативного джерела, залишки утворюють інтерфейс між варіабельними наприклад, із крові або МНПК, як показано в данодоменами легкого ланцюга й важкого ланцюга. му описі. Термін «варіабельний» визначає той факт, що Терміни «Fc рецептор» або «FcR» у контексті деякі частини варіабельних доменів істотно відрізданого опису використовується для опису рецепняються за послідовністю між антитілами й викотора, який зв'язується з Fc ділянкою антитіла. Пенують певну роль при зв'язуванні й визначенні реважно FcR являє собою нативну послідовність специфічності кожного конкретного антитіла до людського FcR. Крім того, кращий FcR являє соконкретного антигену. Однак, варіабельність нерібою такий рецептор, який зв'язується з IgG антитівномірно розподілена за варіабельними доменами лом (гамма рецептор), і включає рецептори підкантитіл. Вона сконцентрована в трьох сегментах, ласів FcyRI, FcyRII і FcyRIII, у тому числі алельні які називаються гіперваріабельними ділянками, у варіанти й форми форми вказаних рецепторів, варіабельних доменах, як легкого ланцюга, так і отримані при альтернативному сплайсингу. Рецеважкого ланцюга. Більш висококонсервативні часптори FcyRII включають FcyRIIA («активуючий ретини варіабельних доменів називають каркасними цептор») і FcyRIIB («інгібуючий» рецептор), які ділянками (FR). Варіабельні домени нативних важмають подібні амінокислотні послідовності й відрікого й легкого ланцюга включають, кожний, FR, які 17 90480 18 в основному мають 3-складчасту конфігурацію, Fab фрагмент також містить константний доз'єднаний трьома гіперваріабельними ділянками, мен легкого ланцюга й перший константний домен які утворюють петлі, які об'єднують і в деяких ви(СНІ) важкого ланцюга. Fab' фрагменти відрізняпадках утворюють частину 3-складчастої структуються від Fab фрагментів додаванням декількох ри. Гіперваріабельні ділянки в кожному ланцюзі залишків на карбокси-кінці СНІ домену важкого підтримуються разом у безпосередній близькості ланцюга, що включає один або декілька цистеїнів від FR і разом з гіперваріабельними ділянками із шарнірної ділянки антитіла. Fab'-SH являє соіншого ланцюга беруть участь в утворенні антигенбою позначення Fab', у якому цистеїновий(і) зализв'язувального сайту антитіл (див. Kabat et. al., шок(ки) константних доменів містять принаймні Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th одну вільну тіолову групу. F(ab')2 фрагменти антиEd. Public Health Service, National Institutes of тіл звичайно одержують у вигляді пари Fab' фрагHealth, Bethesda, MD. (1991)). Константні домени ментів, що містять між собою шарнірні цистеїни. не задіюються безпосередньо у зв'язування антиВідомі також інші хімічні структури фрагментів антіла з антигеном, але демонструють різні ефектотитіл. рні функції, такі як участь антитіла в антитілозумоТермін «легкі ланцюга» антитіл з будь-якого вленій клітиннозалежній цитотоксичності (ADCC). виду хребетних може стосуватися одного із двох Термін «гіперваріабельна ділянка» у контексті типів, що чітко відрізняються, які називають каппа даного опису стосується амінокислотних залишків (κ) і лямбда (λ), що визначається амінокислотними антитіла, які відповідають за зв'язування антигену. послідовностями їх константних доменів. Гіперваріабельна ділянка, в основному, включає «Одноланцюгові Fv» або «scFv» фрагменти амінокислотні залишки з «ділянки, що визначає антитіл включають домени VH і VL антитіла, де комплементарність» або «CDR» (наприклад, завказані домени присутні в одноланцюгому поліпелишки 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3) у варіабептиді. Переважно Fv поліпептид також включає льному домені легкого ланцюга й 31-35 (H1), 50-56 поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, що (H2) і 95-102 (Н3) у варіабельному домені важкого дозволяє «scFv» формувати бажану структуру для ланцюга (Kabat et. al., Sequences of Proteins of зв'язування антигену. У літературі є огляд scFv Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, (Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) Antibodies, vol.113, Rosenberg and Moore eds., та/або залишки з «гіперваріабельної петлі» (наSpringer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)). scFv приклад, залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) фрагменти антитіл до HER2 описані в WO у варіабельному домені легкого ланцюга й 26-32 93/16185, у патенті США №5571894 і патенті США (Н1), 53-55 (Н2) і 96-101 (Н3) у варіабельному до№5587458. мені важкого ланцюга (Chothia and Lesk J. Моl. Термін «диантитіла» стосується малих фрагBiol., 196: 901-917 (1987)). Залишки в «каркасній ментів антитіл із двома антигензв'язувальними ділянці» або «FR» включають такі залишки варіасайтами, фрагменти яких включають варіабельний бельного домену, які відрізняються від залишків, домен важкого ланцюга (VH), з'єднаний з варіабещо входять у гіперваріабельний домен, наведений льним доменом легкого ланцюга (VL) в одному і вище. тому ж поліпептидному ланцюзі (VH-VL). При викоРозщеплення антитіл папаїном дає два іденристанні лінкеру, довжина якого занадто мала для тичні антигензв'язувальні фрагменти, які називатого, щоб здійснювалося спарювання між двома ють «Fab» фрагментами, кожний з яких містить доменами одного ланцюга, створюються умови один антигензв'язувальний сайт і залишковий «Fc» для того, щоб домени спаровувалися з комплемефрагмент, найменування якого відображає його нтарними доменами іншого ланцюга з утворенням здатність швидко кристалізуватися. Пепсинова двох антигензв'язувальних сайтів. Диантитіла обробка приводить до одержання фрагмента більш повно описані, наприклад, в ЕР 404097, WO F(ab')2, який містить два антигензв'язувальні сайти 93/11161 і Hollinger et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. й усе ще здатний до об'єднання з антигеном. USA, 90: 6444-6448 (1993). «Fv» являє собою мінімальний антитільний «Гуманізовані» форми антитіл з організмів, віфрагмент, який містить повний сайт розпізнавання дмінних від людини (наприклад, із гризунів), являантигену й зв'язування антигену. Дана ділянка ють собою химерні антитіла, які містять мінімальну складається з димеру, який включає один варіапослідовність, отриману з імуноглобуліну, відмінбельний домен важкого ланцюга й один варіабеного від людського. Найчастіше, гуманізовані анльний домен легкого ланцюга, у твердій, нековатитіла являють собою людські імуноглобуліни (релентній асоціації. Ця така конфігурація, у рамках ципієнтне антитіло), у яких залишки з якої три гіперваріабельні ділянки кожного варіабегіперваріабельної ділянки реципієнта заміщені льного домену взаємодіють, визначаючи сайт зв'язалишками з гіперваріабельної ділянки від виду, зування антигену на поверхні VH-VL димеру. У сувідмінного від людини (донорне антитіло), такого купності, шість гіперваріабельних ділянок як миша, щур, кролик або примат, відмінний від визначають антигензв'язувальну специфічність людини, що мають бажану специфічність, афінантитіла. Однак, навіть одна варіабельна ділянка ність й функціональні властивості. У деяких випад(або половина Fv, що включає тільки три гіперваках залишки каркасної ділянки (FR) людського імуріабельні ділянки, специфічні для антигену) має ноглобуліну заміщають відповідними залишками із здатність розпізнавати антиген і зв'язуватися з джерела, відмінного від людини. Крім того, гуманіним, хоча й з меншою афінністю, ніж повний сайт зовані антитіла можуть включати залишки, які не зв'язування. зустрічаються в реципієнтному антитілі або в донорному антитілі. Такі модифікації створюють для 19 90480 20 того, щоб додатково підвищити функціональні моАнтитіло до HER2, яке «інгібує димеризацію жливості антитіла. У цілому, гуманізоване антитіло HER більш ефективно, ніж Трастузумаб», являє включає по суті всі або принаймні один або, у тисобою таке антитіло, яке знижує або усуває утвоповому випадку, два варіабельні домени, у яких рення димеру HER2 більш ефективно (наприклад, всі або по суті всі гіперваріабельні петлі відповіпринаймні у два рази більш ефективно), ніж Трасдають таким в імуноглобуліні, відмінному від лютузумаб. Переважно таке антитіло інгібує димеридини, або всі або по суті всі FR представляють такі зацію HER2 принаймні також ефективно, як антиFR, які мають послідовність імуноглобуліну людитіло, вибране із групи, яка складаєься з інтактного ни. Гуманізоване антитіло необов'язково також моноклонального антитіла миші 2С4, Fab фрагмебуде включати принаймні частину константної дінти мишиного моноклонального антитіла 2С4, інлянки імуноглобуліну (Fc), у типовому випадку тактного Петузумаба й Fab фрагменти Пертузумалюдського імуноглобуліну. Додаткові деталі опибу. Можна оцінити інгібування димеризації HER сані в літературі (Jones et. al., Nature 321: 522-525 при безпосередньому дослідженні димерів HER (1986); Riechmann et. al., Nature 332: 323-329 або за результатами оцінки активації HER, або за (1988) і Presta Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 проходженням сигналу в напрямку зчитування (1992)). інформації, які приводять до димеризації HER Гуманізовані антитіла до HER2 включають та/або на основі аналізу сайту зв'язування huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, aнтитіла-HER2 і т.п. Тести для скринінгу антитіл на huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, їх здатність інгібувати димеризацію HER, більш huMAb4D5-7 і huMAb4D5-8 або Trastuzumab ефективних, ніж Трастузумаб, описані в літературі (HERCEPTIN®), як показано в таблиці 3 у патенті (Agus et. al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002) і WO США №5821337, що включений у даний опис як 01/00245 (Adams et. al.)). Тільки як приклад слід посилання; гуманізовані антитіла 520С9 (WO зазначити, що можна тестувати інгібування диме93/21319) і гуманізовані антитіла 2С4 наведені в ризації HER при оцінці, наприклад, інгібування даному описі. утворення димеру HER (див., наприклад, Фіг.1А-В У контексті даного опису терміни Трастузумаб у роботі Agus et. al., Cancer Cell, 2: 127-137 (2002) і (HERCEPTIN®) і huMAb4D5-8 стосуються антитіла, WO 01/00245), за зниженням активації ліганду яке включає амінокислотні послідовності легкого й HER у клітинах, які експресують димери HER важкого ланцюгів SEQ ID NO: 13 і 14, відповідно. (див., наприклад, WO 01/00245 і Фіг.2В у роботі У контексті даного опису терміни Пертузумаб Agus et. al., Cancer Cell, 2: 127-137 (2002)); за бло(OMNITARG®) і rhuMAb2C4 стосуються антитіла, куванням зв'язування ліганду HER із клітинами, які яке включає амінокислотні послідовності варіабеекспресують димери HER (див., наприклад, WO льного легкого й варіабельного важкого ланцюгів 01/00245 і Фіг.2Е в роботі Agus et. al., Cancer Cell, SEQ ID NO: 3 і 4, відповідно. У тому випадку, коли 2: 127- 137 (2002)); за інгібуванням росту ракових Пертузумаб являє собою інтактне антитіло, він клітин (наприклад, клітин MCF7, MDA-MD-134, ZRпереважно включає амінокислотні послідовності 75-1, MD-MB-175, T-47D), які експресують димери легкого й важкого ланцюгів SEQ ID NO: 15 і 16, HER у присутності (або за відсутності) ліганду HER відповідно. (див., наприклад, WO 01/00245 і Фіг.3А-D у роботі «Оголене антитіло» являє собою таке антитіло Agus et. al., Cancer Cell, 2: 127-137 (2002)); за інгі(у контексті даного опису), яке не кон'юговано з буванням проходження сигналу в напрямку зчитугетерологічною молекулою, такою як цитотоксичвання інформації (наприклад, за інгібуванням ний фрагмент або радіоактивна мітка. HRG-залежного фосфорилування АКТ або за інгі«Виділене» антитіло являє собою таке антитібуванням HRG- або TGF-α-залежного фосфорилуло, яке було ідентифіковане та/або відновлене з вання МАРК) (див., наприклад, WO01/00245 і компонента його природного оточення. КонтаміФіг.2C-D у роботі Agus et. al., Cancer Cell, 2: 127нуючі компоненти природного оточення включають 137 (2002)). Можна оцінити, інгібує чи антитіло матеріали, які можуть перешкоджати діагностичдимеризацію HER шляхом вивчення сайту зв'язуному або терапевтичному використанню антитіла, вання aнтитілo-HER2, наприклад, при оцінці струкі можуть включати ферменти, гормони й інші протури або моделі, такої як кристалічна структура теїнові й непротеїнові розчинені речовини. У краантитіла, зв'язаного з HER2 (див., наприклад, щих варіантах антитіло очищають (1) до вмісту Franklin et. al., Cancer Cell, 5: 317-328 (2004)). більше, ніж 95мас.% антитіла, за даними методу Антитіло до HER2 може «інгібувати HRGЛоурі, і найбільш переважно до вмісту більше, ніж залежне фосфорилування АКТ» та/або «інгібувати 99мас.% (2) до ступеня, достатнього для одержанHRG- або TGFα-залежне фосфорилування МАРК» ня принаймні 15 залишків N-кінцевої або внутрішбільш ефективно (наприклад, принаймні більш ньої амінокислотної послідовності при проведенні ефективно у два рази), ніж Трастузумаб (див., нацентрифужного варіанта секвенуванні або (3) до приклад, як приклад Agus et. al., Cancer Cell, 2: гомогенності, за результатами аналізу в ДСН127-137 (2002) і WO 01/00245). ПААГ, у відновні або в не відновних умовах, з виАнтитіло до HER2 може являти собою таке анкористанням кумасі-блю або, переважно, з викотитіло, яке «не інгібує розщеплення ектодомену ристанням срібного барвника. Виділене антитіло HER2» (Molina et. al., Cancer Res., 61: 4744-4749 включає антитіло in situ у рекомбінантних клітинах, (2001)). де не є присутнім принаймні один компонентів із Антитіло до HER2, яке «зв'язується з гетероприродного оточення антитіла. Однак, звичайне димерним сайтом зв'язування» HER2, зв'язується антитіло виділяють із використанням принаймні із залишками в домені II (і необов'язково також однієї стадії очищення. зв'язується із залишками інших доменів позаклі 21 90480 22 тинного домену HER2, таких як домени І і III) і мовезикул (які називають апоптозними тілами). Вкаже просторово заважати, принаймні до деякої мізана клітина звичайно представляє таку клітину, ри, утворенню гетеродимеру HER2-EGFR, HER2яка здійснює суперекспресію рецептора HER2. HER3, HER2-HER4. Франкліна із співавт. (Franklin Переважно, така клітина являє собою пухлинну et. al., Cancer Cell, 5: 317-328 (2004)) охарактериклітину, наприклад, клітину молочної залози, яєчзували кристалічну структуру гетеродимеру HER2ника, шлунка, ендометрію, слинної залози, легені, Петузумаб, депонованого в банку даних білків нирки, товстої кишки, щитовидної залози, підшлун(RCSB Protein Data Bank (ID Code IS78)), привівши кової залози або сечового міхура. In vitro така кліприклад антитіла, яке зв'язується з гетеродимертина може являти собою клітину ліній SK-BR-3, ним сайтом зв'язування HER2. BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 і Антитіло, яке «зв'язується з доменом II» в SKOV3. Доступні різні методи для оцінки клітинних HER2, зв'язується із залишками в домені II і неявищ, асоційованих з апоптозом, наприклад, транобов'язково із залишками в іншому(их) домені(ах) слокація фосфатидилсерину (ФС) може бути виміHER2, таких як домени І і III. Краще антитіло, яке ряна за зв'язуванням анексину. Фрагментація ДНК зв'язується з доменом II, зв'язується з місцем з'єдможе бути оцінена за утворенням «ступінчастості» нання між доменами І, II і III в HER2. ДНК і за ядерною/хроматиновою конденсацією, де Термін «агент, який інгібує ріст» у контексті фрагментація ДНК може бути оцінена за збільданого опису стосується сполуки або композиції, шенням числа гіподиплоїдних клітин. Переважно, які інгібують ріст клітини, особливо HERантитіло, яке індукує апоптоз, являє собою таке експресуючої ракової клітини in vitro або in vivo. антитіло, яке приводить до приблизно 2-50Таким чином, агент, який інгібує ріст, може бути кратної, переважно, приблизно 5-50-кратної й, таким агентом, який істотно знижує відсоток HERнайбільш переважно, приблизно до 10-50-кратної експресуючих клітин в S фазі. Приклади рістінгііндукції зв'язування анексину, щодо необроблених буючих агентів включають агенти, які блокують клітин, у тесті на зв'язування анексину з викориспрогресію клітинного циклу (у місці, відмінному від танням клітин ВТ474 (див. нижче). Приклади антиS фази), такі як агенти, які індукують зупинку на G1 тіл до HER2, які індукують апопотоз, включають фазі й зупинку на Μ фазі. Класичні блокатори Μ 7С2 і 7F3. фази включають алкалоїди барвінку (вінкристин і «Епітоп 2С4» являє собою ділянку в позаклівінбластин), таксани й інгібітори топоізомерази II, тинному домені HER2, з якою зв'язується антитіло такі як доксорубіцин, епірубіцин, даунорубіцин, 2С4. Для проведення скринінгу з метою виявлення етопозид і блеоміцин. Дія агентів, які індукують антитіл, які зв'язуються з епітопом 2С4, може бути зупинку на G1 фазі, також поширюється на S фазу, проведений звичайний тест з перехресного блокузупиняючи її, і включають, наприклад, ДНКвання, такий як тест, описаний у відповідному поалкілуючі агенти, такі як тамоксифен, преднізон, сібнику (Antibodies, А Laboratory Manual, Cold дакарбазин, меклоретамін, цисплатин, метотрекSpring Harbor Laboratory, ED Harlow and David Lane сат, 5-фторурацил і ара-С. Додаткова інформація (1988)). Альтернативно, може бути проведене карможе бути знайдена у відповідному посібнику (The тування епітопу для оцінки, чи зв'язується антитіло Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, з епітопом 2С4 в HER2, з використанням для цього eds., Chapter 1, за назвою «Cell cycle regulation, відомих методик та/або можна досліджувати струoncogenes, and antineoplastic drugs» by Murakami ктуру антитіло-НЕR2 (Franklin et. al., Cancer Cell, 5: et. al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особливо 317-328 (2004)) для визначення, який(і) домен(и) с.13). HER2 зв'язується(ються) з антитілом. Епітоп 2С4 Приклади антитіл, «які інгібують ріст», вклювключає залишки домену II у позаклітинному дочають такі антитіла, які зв'язуються з HER2 і інгімені HER2. 2С4 і Пертузумаб зв'язуються з позакбують ріст ракових клітин, суперекспресуючих літинним доменом HER2 у місці сполуки доменів І, HER2. Кращі рістінгібуючі антитіла до HER2 інгіII і III (Franklin et. al., Cancer Cell 5: -317-328 бують ріст пухлинних клітин молочної залози SK(2004)). BR-3 у клітинній культурі більш ніж на 20%, і пере«Епітоп 4D5» являє собою ділянку в позакліважно більш ніж на 50% (зокрема, від приблизно тинному домені HER2, з якою зв'язуються антитіло 50% до приблизно 100%), у концентрації антитіла, 4D5 (АТСС CRL 10463) і Трастузумаб. Даний епіяка дорівнює приблизно 0,5-30г/мл, де інгібування топ розташований близько до трансмембранного росту визначають через шість днів після експозиції домену HER2, локалізуючись всередині домену IV клітин SK-BR-3 з антитілами (див. патент США в HER2. З метою скринінгу антитіл, які зв'язуються №5677171, виданий 14 жовтня 1997 року). Тест на з епітопом 4D5, проводять традиційний тест з пеінгібування росту клітин SK-BR-3 описаний більш рехресного блокування, описаний, наприклад, у детально в вказаному патенті й також наводиться відомому посібнику (Antibodies, А Laboratory нижче в даному описі. Краще рістінгібуюче антитіManual, Cold Spring Harbor Laboratory, ED Harlow ло являє собою гуманізований варіант мишиного and David Lane (1988)). Альтернативно, може бути моноклонального антитіла 4D5, наприклад, Траспроведене картування епітопу для оцінки, чи зв'ятузумаб. зується антитіло з 4D5 епітопом в HER2 (наприАнтитіло, яке «індукує апоптоз», являє собою клад, з одним або декількома залишками на ділятаке антитіло, яке індукує програмовану загибель нці, що включає залишки від приблизно 52 9 до клітин, обумовлену за зв'язуванням анексину V, за приблизно 625, включно, Фіг.1). фрагментацією ДНК, за зморщуванням клітини, «Епітоп 7C2/7F3» являє собою ділянку на Nрозведенню ендоплазматичного ретикулюма, фракінці всередині домену І позаклітинного домену гментації клітин та/або за утворенням мембранних HER2, з яким зв'язуються антитіла 7С2 та/або 7F3 23 90480 24 (кожне з яких депоноване в АТСС, див. нижче). З засіб може попереджати ріст та/або знищувати метою скринінгу антитіл, які зв'язуються з епітопом існуючі ракові клітини, засіб може бути цитостати7C2/7F3, може бути проведений традиційний тест чним та/або цитотоксичним. Ефективна кількість з перехресного блокування, такий як тест, описаможе збільшувати період вільного виживання без ний у відповідному посібнику (Antibodies, А прогресування, приводячи до об'єктивної реакції Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (включаючи часткову реакцію, PR, або повну, CR), ED Harlow and David Lane (1988)). Альтернативно, підвищувати загальний час виживання та/або посможе бути проведене картування епітопу для оцінлабляти один або декілька симптомів раку. ки, чи зв'язується антитіло з епітопом 7C2/7F3 в Термін «НЕR2-експресуючий рак» являє соHER2 (тобто з будь-якими одним або декількома бою такий вид раку, який включає клітини, що місзалишками на ділянці від приблизно 22 до приблитять на поверхні білок HER2. зно 52 залишку в HER2, Фіг.1). Рак, який здійснює «суперекспресію» HER явТермін «лікування» у контексті даного опису ляє собою такий вид раку, який має істотно підвистосується й терапевтичного варіанту лікування, і щений рівень рецептора HER, такого як HER2, на профілактичних, або превентивних заходів. Пацієклітинній поверхні, у порівнянні з нераковою клітинти, які потребують лікування, включають як тих, ною того ж типу тканини. Така суперекспресія мохто вже має захворювання, так і тих пацієнтів, у же бути викликана генною ампліфікацією або підвідношенні яких необхідно провести профілактику. вищеним рівнем транскрипції або трансляції. У цьому зв'язку, пацієнт, який підлягає лікуванню Суперекспресія рецептора HER може бути визнаможе бути діагностований як такий, що має захвочена в діагностичному або прогностичному тесті рювання, або схильний, або чутливий до захворюшляхом оцінки підвищених рівнів білка HER, що вання. має на поверхні клітини (наприклад, у рамках імуТерміни «рак» і «раковий» стосуються або ногістохімічного тесту, ІНС). Альтернативно або описують фізіологічний стан у ссавців, який у тидодатково, можна вимірювати рівні в клітині кодуповому випадку характеризується нерегульованим вальної нуклеїнової кислоти, наприклад, за допоростом клітин. Приклади раку включають, без обмогою флуоресцентної гібридизації in situ (FISH, меження, карциному, лімфому, бластому (вклюдив. WO 98/45479, опублікованої в жовтні 1998 чаючи медулобластому й ретинобластому), сарроку), за допомогою саузерн-блотингу або з викокому (включаючи ліпосаркому й саркому ристанням методики полімеразно-ланцюгової реасиновіальних клітин), нейроендокринні пухлини кції (ПЛР), такої як кількісна ПЛР у масштабі реа(включаючи карциноїдні пухлини, гастриному й рак льного часу (ЗТ-ПЛР). Можна також досліджувати острівкових клітин), мезотеліому, нейриному ступінь суперекспресії рецептора HER за допомо(включаючи акустичну нейрому), менингіому, адегою визначення схованого антигену (наприклад, у нокарциному, меланому й лейкоз або лімфоїдний позаклітинному домені HER) у біологічній рідині, злоякісний ріст. Більш конкретні приклади таких такій як сироватка (див., наприклад, патент США видів раку включають плоскоклітинний рак (напри№4933294, виданий 12 червня 1990 року; WO клад, плоскоклітинний рак епітеліальних клітин), 91/05264, опубліковану 18 квітня 1991 року; патент рак легені, включаючи дрібноклітинний рак легені, США №5401638, виданий 28 березня 1995 року; і недрібноклітинний рак легені, аденокарциному Sias et. al., J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). легені й плоскоклітинну карциному легені, рак очеКрім вказаних вище тестів, фахівцям-практикам ревини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунка, вклювідомо й доступно багато інших тестів in vivo. Начаючи рак шлунково-кишкового тракту, рак підшприклад, клітини в організмі пацієнта піддають лункової залози, гліобластому, рак шийки матки, впливу антитіла, яке може бути необов'язково порак яєчника, рак печінки, рак молочної залози, рак значено міткою, яку виявляють, наприклад, радіосечового міхура, гепатому, рак товстої кишки, рак активним ізотопом, після чого оцінюють рівень прямої кишки, колоректальний рак, рак ендометзв'язування антитіла із клітинами в організму пацірію або матки, карциному слинної залози, рак нирєнта, наприклад, проводячи зовнішнє сканування ки, або ренальний рак, рак передміхурової залози, радіоактивності або при відборі для аналізу біопрак вульви, рак щитовидної залози, гепатокарцисійного зразку, узятого з пацієнта, що раніше підному, анальну карциному, карциному статевого давався впливу антитіла. члена, тестикулярний рак, рак стравоходу, пухлиІ навпаки, рак, який «не експресує рецептор ни жовчних шляхів, а також рак голови й шиї. HER2», являє собою такий вид раку, який не ексТермін «ефективна кількість» стосується кільпресує рецептор HER2 у більшій мірі, ніж нормакості лікарського засобу, яка є ефективною для льні клітини, у порівнянні з нераковими клітинами лікування захворювання в пацієнта. У тому випадтого ж типу тканини. ку, коли вказане захворювання являє собою рак, Рак, який «здійснює суперекспресію» ліганду ефективну кількість лікарського засобу може зниHER, являє собою такий вид раку, який продукує жувати число ракових клітин, знижувати розмір істотно більш високі рівні лігандів у порівнянні з не пухлини, інгібувати (тобто, сповільнювати певною раковою клітиною того ж типу тканини. Така супемірою й переважно зупиняти) інфільтрацію ракорекспресія може бути викликана генною ампліфівих клітин у периферичні органи, інгібувати (тобто, кацією або в результаті підвищеної транскрипції знижувати певною мірою або переважно зупиняти) або трансляції. Суперекспресія HER може бути метастазування пухлини, інгібувати, певною мівизначена діагностично за допомогою оцінки рівня рою, ріст пухлини та/або послабляти, певною міліганду (або нуклеїнової кислоти, яка його кодує) у рою, один або декілька симптомів, асоційованих з пацієнта, наприклад, у біопсійному зразку пухлини раком. Залежно від того ступеня, у який лікарський або при використанні різних діагностичних тестів, 25 90480 26 таких як ІНС, FISH, саузерн-блотинг, ПЛР, а також квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептоу рамках тестів in vivo, описаних вище. зоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіТермін «цитотоксичний агент» у контексті дацин; антиметаболіти, такі як метотрексат, гемциного опису стосується речовини, яка інгібує функції табін (GEMZAR®), тегафур (UFTORAL®), клітин або перешкоджає здійсненню такої функції капецитабін (XELODA®), епотилон і 5-фторурацил та/або викликає деструкцію клітин. Вказаний тер(5-ФУ); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптемін включає радіоактивні ізотопи (At211, I131, I125, рин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуY90, Re186, Re18S, Sm153, Ві212, Ρ32 і радіоактивні ізоринові аналоги, такі як флударабін, 6топи Lu), хіміотерапевтичні агенти й токсини, такі меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; піримідинові як малі молекули токсинів або ензиматично активаналоги, такі як анцитабин, азацитидин, бні токсини бактерій, грибів, рослин або токсини азауридин, кармофур, цитарабін, дідезоксіуридин, тваринного походження, включаючи їх фрагменти доксифлуридин, єноцитабин, флоксуридин; антита/або варіанти. адреналові сполуки, такі як аміноглютетімід, міто«Хіміотерапевтичний агент» являє собою хімітан, трилостан; засоби, які заповнюють фолієву чну сполуку, яку використовують при лікуванні ракислоту, такі як фролінова кислота; ацеглатон; ку. Приклади хіміотерапевтичних агентів включаальдофосфамідний глікозид; амінолевулінова кисють алкілуючі агенти, такі як тіотепа й лота; єнілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бісантциклофосфамід (CYTOXAN®); алкілсульфонати, рен; едатраксат; дефофамін; демекольцин; діазитакі як бісульфан, імпросульфан і піпосульфан; квон; елфорнітин; еліптинію ацетат; етоглюцид; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуренітрат галію; гідроксисечовина; лентинан; лонідаїдопа й уредопа; етиленіміни й метиламеламіни, нин; майтанзиноїди, такі як майтанзин і ансамітовключаючи альтретамін, триетиленмеламін, триецини; мітогуазон; мітоксантрон; мопіданмол; нітратиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і єрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; триметилоломеламін; ацетогеніни (особливо булозоксантрон; 2-етилгідразид; прокарбазин; полілатацин і булатацинон); дельта-9сахаридний комплекс PSK® (JHS Natural Products, тетрагідроканабінол (дронабінол, MARINOL®); Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофіран; спіробета-лапахон; лапахол; колхіцини; бетулинова германій; тенуазонова кислота; триазиквон; 2,2',2"кислота; камптотецин (включаючи синтетичний трихлортриетиламін; трихотецени (особливо Т-2 аналог топотекан (HYCAMTIN®), СРТ-11 (іринотетоксин, веракурин А, рорідин А та ангуїдин); урекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скопотан; дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолектин і 9-амінокамптотецин); бріостатин; калісталактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид («Аrатин; СС-1065 (включаючи його адозелезинові, С»); тіотепа; таксоїд, наприклад, паклітаксел карзелезинові й бізелезинові синтетичні аналоги); (TAXOL®), композиція паклітакселу на основі наподофілотоксин; подофілінова кислота; теніпозид; ночастинок, отримана генноінженерними методакриптофіцини (особливо криптофіцин 1 і криптофіми з альбуміну (ABRAXANE™), і доцетаксел цин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи син(TAXOTERE®); хлоранбуцил; 6-тіогуанін; меркаптетичні аналоги KW-2189 і СВ-ТМ1); елеутеробін; топурин; метотрексат; платинові агенти, такі як панкратистатин; саркодиктіїн; спонгістатин; азотицисплатин, оксаліплатин і карбоплатин; препарати сті засоби, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, барвінку, які перешкоджають полімеризації тубуліхолофосфамід, естрамустин, іфосфамід, меклорену з утворюваних мікротрубочок, що включають тамін, гідрохлорид оксиду меклоретаміну, мелфавінбластин (VELBAN®), вінкристин (ONCOVIN®), лан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, тровіндезин (ELDISIN®, FILDESIN®), і вінорелбін фосфамід, урацилова мазь; нітросечовини, такі як (NAVELBINE®); етопозид (VP-16); іфосфамід; мікармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, токсантрон; лейкововін; новантрон; едатрексат; німустин і ранімнустин; антибіотики, такі як енедіїдауноміцин; аміноптерин; ібандронат; інгібітор нові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, особтопоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин ливо, каліхеаміцин гамма II і калехеаміцин омега II (DMFO); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота, (див., наприклад, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: включаючи бексаротен (TARGRETIN®); бісфосфо183-186 (1994)); динеміцин, включаючи динеміцин нати, такі як клодронат (наприклад, BONEFOS® А; еспераміцин; а також неокарциностатиновий або OSTAC®), етидронат (DIDROCAL®), NEхромофор і родинні хромопротеїнові енедіїнові 58095, золедронова кислота/золедронат хромофори-антибіотики), аклациномізини, актино(ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памідроміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактинат (AREDIA®), тілудронат (SKELID®), або резидноміцин, карабіцин, карминоміцин, карцинофілін, ронат (ACTONEL®); троксацитабін (1,3хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, детодіоксолановий нуклеозидний аналог цитозину); рубіцин, 6-діазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубіцин антисмислові олігонуклеотиди, особливо ті, які (включаючи ADRIAMYCIN®, морфоліноінгібують експресію генів на сигнальних шляхах, доксорубіцин, ціаноморфоліно-доксорубіцин, 2які задіюються в аберантній проліферації клітин, піроліно-доксорубіцин, ліпосомальна форма для такі як, наприклад, РKС-альфа, Raf, H-Ras і рецепін'єкцій доксорубіцину-НСІ (DOXIL®), ліпосомальтор фактора росту епідермальних клітин (EGF-R); ний доксорубіцин TCL D-99 (MYOCET®), пегліловакцини, такі як вакцина THERATOPE® і вакцини ваний ліпосомальний доксорубіцин (CAELYX®) і для генної терапії, наприклад, вакцина дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідаALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® і вакцина рубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, такі як мітоміVAXID®; інгібітор топоізомерази 1 (наприклад, цин С, мікофенолова кислота, ногаламіцин, олиLURTOTECAN®); rmRH (наприклад, ABARELIX®); воміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, BAY439006 (сорафеніб; Bayer); SU-11248 (Pfizer); 27 90480 28 перифозин, інгібітор СОХ-2 (наприклад, целекоктю людське EGFR-спрямоване антитіло (Imclone); сиб або еторикоксиб); протеосомний інгібітор (наантитіла, які зв'язують мутантний EGFR типу II приклад, PS341); бортезоміб (VELCADE®); ССІ(патент США №5212290); гуманізовані й химерні 779; типіфарніб (R11577); орафеніб, АВТ510; інгіантитіла, які зв'язуються з EGFR, описані в патенті бітор Всl-2, такий як облімерсен-натрій США №5891996; і людські антитіла, які зв'язуються (GENASENSE®); піксантрон; інгібітори EGFR (див. з EGFR, такі як ABX-EGF або Панітумумаб наведене нижче визначення); інгібітори тирозинкі(Panitumumab) (див. WO 98/50433, нази (див. наведене нижче визначення); і фармаAbgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto et. al., Eur. цевтично прийнятні солі, кислоти або похідні вкаJ. Cancer, 32A: 636-640 (1996)); EMD7200 (матузузаних вище сполук, а також сполучення двох або маб (matuzumab)) і гуманізоване EGFR антитіло, більше вказаних вище сполук, таких як CHOP, скоспрямоване проти EGFR, яке конкурує з EGF і роченаназва комбінованої терапії з використанTGF-альфа за зв'язування з EGFR (EMD/Merck); ням циклофосфаміду, доксорубіцину, вінкристину людське EGFR антитіло, HuMax-EGFR (GenMab); й преднізолону, і FOLFOX, скорочена назва лікуповністю гуманізовані антитіла, відомі як Е1.1, вання, яка включає оксиплатин (FLOXATIN™), Е2.4, Е2.5, Е6.2, Е6.4, E2.ll, Е6.3 і Е7.6. З, які були об'єднану з 5-ФУ й лейкововіном. описані в патенті США №6235883; MDX-447 У дане визначення також включаються анти(Madarex Inc.); і мАb 806 або гуманізоване мАb 806 гормональні агенти, які діють у плані регуляції або (Johns et. al., J. Biol. Chem., 279(29): 30375-30384 інгібування гормонального впливу на пухлині, такі (2004)). Анти-EGFR антитіло може бути кон'юговаяк анти-естрогени зі змішаним агоністсьне із цитотоксичним агентом з утворенням імуноким/антагоністським профілем, що включають такон'югата (див., наприклад, ЕР659439А2, Merck моксифен (NOLVADEX®), 4-гідрокситамоксифен, Patent Gmb). Антагоністи EGFR включають малі тореміфен (FARESTON®), ідоксифен, дролоксимолекули, такі як сполуки, описані в патентах США фен, ралоксифен (EVISTA®), триоксифен, кеок№№5626582, 5457105, 5475001, 5654307, сифен і селективні модулятори рецептора естро5679683, 6084095, 6265410, 6455534, 6521620, гену (SERM), такі як SERM3; чисті антиестрогени 6596726, 6713484, 5770599, 6140332, 5866572, без агоністських властивостей, такі як фулвест6399602, 6344459, 6602863, 6391874, 6344455, рант (FASLODEX®) і ЕМ800 (такі агенти можуть 5760041, 6002008 і 57474 98, а також у вказані блокувати димеризацію рецептора естрогену (ER), нижче РСТ публікаціях: WO 98/14451, WO інгібувати зв'язування ДНК, підвищувати метабо98/50038, WO 99/09016 і WO 99/24037. Конкретні лізм ER та/або пригнічувати рівні ER), інгібітори малі молекули антагоністів EGFR включають OSIароматази, які включають стероїдні інгібітори аро774 (СР-358774, ерлотиніб, TARCEVA® матази, такі як форместан і екземестан Genentech/OSI Pharmaceutical); PD 183805 (СІ (AROMASIN®), і нестероїдні інгібітори ароматази, 1033, 2-пропенамід, Ν-[4-[(З-хлор-4такі як анастразол (ARIMIDEX®), летрозол фторфеніл)аміно]-7-[3-(4-морфолініл)пропокси]-6(FEMARA®) і аміноглютетімід і інші інгібітори арохіназолініл]-, дигідрохлорид; Pfizer Inc.), ZD1839, матази, які включають ворозол (RIVISOR®), ацегефитиніб (IRESSA™) 4-(3'-хлор-4'-фтораніліно)-7тат мегестролу (MEGASE®), фадрозол, імідазол; метокси-6-(3-морфолінопропокси)хіназолін, агоністи гормон-рилізингу лютеїнізуючого гормону, AstraZeneca), ΖΜ 105180 ((6-аміно-4-(3що включають леупролід (LUPRON® і ELIGARD®), метилфеніламіно)хіназолін, Zeneca); ВІВХ-1382 гозерелін, бузерелін і триптерелін; статеві гормо(N8-(3-хлор-4-фторфеніл)-N2-(1-метилпиперидинни, що включають прогестини, такі як ацетат меге4-ил)піримідо[5,4-d]піримідин-2,8-діамін, стролу й ацетат медроксипрогестерону, естрогени, Boehringer Ingelheim); РKІ-166 ((R)-4-[4-[(1такі як діетилстилбестрол і премарин, і андрогефенілетил)аміно]-1Н-піроло[2,3-d]піримідин-6ни/ретиноїди, такі як флуоксиместерон, всі трансіл]фенол); (R)-6-(4-гідроксифеніл)-4-[(1ретиноєві кислоти й фенретинід; онапристон; анфенілетил)аміно]-7Н-піроло[2,3-d]піримідин); CLтипрогестерони; негативні регулятори рецептора 387785 (N-[4-[(3-бромфеніл)аміно]-6-хіназолініл]-2естрогену (ERD), антиандрогени, такі як флутамід, бутинамід); ЕKВ-569 (N-[4-[(3-хлор-4нілутамід і бікалутамід; тестолактон; і фармацевфторфеніл)аміно]-3-ціано-7-етокси-6-хінолініл]-4тично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якої (диметиламіно)-2-бутенамід) (Wyeth); AG1478 із вказаних вище сполук, а також сполучення двох (Sugen); AG1571 (SU 5271; Sugen); подвійні інгібіабо більше вказаних сполук. тори EGFR/HER2 тирозинкінази, такі як лапатиніб У контексті даного опису термін «EGFR(GW572016 або (N-[3-хлор-4-[(3спрямований лікарський засіб» стосується терапефторфеніл)метокси]феніл]-6-[5-[[[2втичного агента, який зв'язується з EGFR і необометилсульфонил)етил]аміно]метил]-2-фураніл]-4в'язково інгібує активацію EGFR. Приклади таких хіназолінамін; Glaxo-SmithKline) або ціаногуанідинагентів включають антитіла й малі молекули, які хіназолінові й ціаноамідинхіназоламінові похідні. зв'язуються з EGFR. Приклади антитіл, які зв'язу«Інгібітор тирозинкінази» являє собою молекуються з EGFR, включають МАb57 9 (АТСС CRL НВ лу, яка інгібує тирозинкіназну активність тирозинкі8506), МАb 455 (АТСС CRL НВ 8507), МАb 225 нази, такий як рецептор HER. Приклади таких інгі(АТСС CRL НВ 8508), МАb 528 (АТСС CRL 8509) біторів включають EGFR-спрямовані лікарські (див. патент США №4943533, Mendelsohn et. al.) і засоби, вказані в попередньому абзаці, малі молеїх варіанти, такі як химеризоване антитіло 225 кули інгібітора тирозинкінази HER2, такі як ТАK (С225 або Cetuximab; ERBUTIX®) і людське анти165, доступний від Takeda; CP-724714, пероральтіло 225 зі зміненою формою (Н225) (див. WO ний селективний інгібітор рецептора тирозинкінази 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, повнісErbB2 (Pfizer and OSI); подвійні HER інгібітори, 29 90480 30 зокрема, ЕKВ-569 (доступний від Wyeth), який пектин, плацентарний лактоген, фактор некрозу пухреважно зв'язується з EGFR, але інгібує і HER2, і лини α і β; мулеріан-інгібуюча речовина; мишиний клітини, які суперекспресують EGFR; лапатиніб пептид, асоційований з гонадотропіном; інхібін; (GW572016; доступний від Glaxo-SmithKline), пеактивін; фактор росту ендотелію судин; інтегрин; роральний тирозинкіназний інгібітор HER2 і EGFR; тромбопоетин (ТПО); фактор росту нервових кліРKІ-166 (доступний від Novartis); інгібітори panтин, такий як NGF-β; фактор росту тромбоцитів; HER, зокрема, канертиніб (СІ-1033; Pharmacia); фактори, що трансформують, росту (TGF), такі як інгібітори Raf-1, зокрема, антисмисловий агент TGF-α і TGF-β; інсуліноподібний фактор росту І і II; ISIS-5132, доступний від ISIS Pharmaceutical, який еритропоетин (ЕРО); остеоіндуктивні фактори; інгібує сигнальний шлях від Raf-1; TK інгібітори, не інтерферони, такі як інтерферон-α, -β і -γ; колонієспрямовані на HER, такі як іматинібу мезилат стимулюючі фактори (КСФ (CSF)), такі як макро(GLEEVAC™), доступний від Glaxo; інгібітор позафагальний КСФ (М-КСФ (M-CSF)); гранулоцитарклітинно регульованої МАРКО тирозинкінази І СІно-макрофагальний КСФ (ГМ-КСФ (GM-CSF)); 1040 (доступний від Pharmacia); хіназоліни, такі як гранулоцитарний КСФ (Г-КСФ (G-CSF)); інтерлейPD 153035, 4-(3-хлоранілино)хіназолін; піридопікіни (IL), такі як IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, римідини; піримідопіримідини; піролопіримідини, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; фактор некрозу такі як CGP 59326, CGP 60261 і CGP 62706, пірапухлинних клітин, такий як TGF-α і TGF-β; і інші золопіримідини, 4-(феніламіно)-7Н-піроло[2,Зполіпептидні фактори, які включають LIF і набір з d]піримідини; куркумін (диферилоїлметан, 4,5лігандом (KL). У контексті даного опису, термін біс(4-фторанілино)фталімід); нітротіофенові фрацитокіни включає білки із природних джерел або з гменти, що містять тирфостини; PD-0183805 рекомбінантної клітинної культури біологічно акти(Warner-Lamber); антисмислові молекули (напривних еквівалентів нативної послідовності цитокінів. клад, такі, які зв'язуються з нуклеїновою кислотою, II. Композиція з варіантом антитіла до HER2 яка кодує HER); хіноксаліни (патент США Даний винахід стосується, принаймні частково, №5804396); трифостини (патент США №5804396); деяких композицій з антитілом до HER2. ПереважZD6474 (Astra Zeneca); РТK-787 (Novartis/Schering но, антитіло до HER2 (основне антитіло до HER2 AG); інгібітори pan-HER, такі як СІ-1033 (Pfizer); або його варіант, окремо або обидва), представафінітак (ISIS 3521; Isis/Lilly); іматинібу мезилат ляє таке антитіло, яке зв'язується з доменом II в (Gleevac; Novartis); PKI-166 (Novartis); GW2016 HER2, інгібує димеризацію HER2 більш ефектив(Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 но, ніж Трастузумаб (Trastuzumab) та/або зв'язу(Wyeth); семаксиніб (Sugen); ZD6474 (Astra ється із сайтом гетеродимерного зв'язування в Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 HER2. Кращий варіант основного виду антитіла в (Imclone); ціаногуанідинхіназолінові й ціаноамідинконтексті даного опису являє собою такий вид анхіназоламінові похідні; або агенти, описані в інших титіла, який включає амінокислотні послідовності роботах: патент США №5804396; WO 99/09016 варіабельного легкого й варіабельного важкого (American Cyanamid); WO 98/43960 (American ланцюгів SEQ ID NO: 3 і 4, і, найбільш переважно, Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO включає амінокислотні послідовності легкого й 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner важкого ланцюгів SEQ ID NO: 15 і 16 Пертузумаб. Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc.); WO 96/33978 Наведені в даному описі композиції включають (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); WO 96/33980 суміш основного виду HER2 і його варіант за амі(Zeneca) і US 2005/0101617. нокислотною послідовністю, що включає лідерне Термін «антиангіогенний агент» стосується подовження на амінокінці. Переважно, лідерне сполуки, яка блокує або перешкоджає, у деякій подовження на аміно-кінці знаходиться на легкому мірі, розвитку кровоносних судин. Антиангіогенний ланцюзі антитільного варіанта (наприклад, на одфактор може бути представлений, наприклад, маній або двох легких ланцюгах варіанта антитіла). лою молекулою або антитілом, які зв'язуються з Основний вид антитіла до HER2 або варіанти анфактором росту або рецептором фактора росту, титіла може являти собою інтактне антитіло або який задіюється в прогресуванні ангіогенезу. Крафрагмент антитіла (наприклад, Fab, F(ab')2 фрагщий антиангіогенний фактор у контексті даного менти), але переважно обидва являють собою опису являє собою антитіло, яке зв'язується факінтактні антитіла. тором росту ендотелію судин (VEGF), таке як беУ контексті даного опису варіант антитіла вацизумаб (Bevacizumab) (AVASTIN®). включає лідерне подовження на аміно-кінці на Термін «цитокін» являє собою родовий термін його одній або декількох важких або легких ланцюдля позначення білків, які вивільняються однією гах. Переважно, лідерне подовження на аміно-кінці клітинною популяцією, які діють на інші клітини як знаходиться на одній або двох легких ланцюгах міжклітинний медіатор. Приклади таких цитокінів антитіла. Лідерне подовження на аміно-кінці перевключають лімфокіни, монокіни й традиційні поліважно включає VHS- або складається з його. пептидні гормони. У число цитокінів включається Наявність лідерного подовження на аміно-кінці також ростовий гормон, такий як гормон росту люв композиції може бути виявлено різними методадини, N-метіонільний гормон росту людини й горми аналізу, включаючи, без обмеження, аналіз Nмон росту бика, паратиреоідний гормон, тироксин, кінцевої послідовності, тест, заснований на гетероінсулін, проінсулін, релаксин, прорелаксин, глікопгенності за зарядом (наприклад, кат іонообмінна ротеїнові гормони, такі як фолікулостимулювальхроматографія або капілярний зонний електрофоний гормон (ФСГ), тиреоидстимулюючий гормон рез), мас-спектрометрія й т.п. Кількості варіанта (ТСГ) і лютеїнізуючий гормон (ЛГ), фактор росту антитіла в композиції в основному змінюється від клітин печінки, фактор росту фібробластів, пролатієї кількості, що становить нижню межу виявлення 31 90480 32 будь-якого тесту (переважно, при аналізі за метотини, що містить бажаний епітоп. Альтернативно, дом катіонообмінної хроматографії), яка викорисклітини, які експресують HER2 на поверхні своїх товується для виявлення варіанта антитіла, до клітин (наприклад, клітини NIH-3T3, трансформокількості меншої, ніж кількість присутнього основвані для суперекспресії HER2, або клітинна лінія ного виду антитіла. В основному, приблизно 20% карциноми, така як лінія клітин SK-BR-3 (див. або менше (зокрема, від приблизно 1% до приблиStancovski et. al., PNAS (USA), 88: 8691-8695 зно 15%, наприклад, від 5% до приблизно 15%, (1991)), можуть бути використані для одержання переважно, від приблизно 8% до приблизно 12%) антитіл. Фахівцям у даній галузі відомі також інші молекул антитіла в композиції включають лідерне форми HER2, придатні для одержання антитіл. подовження на аміно-кінці. Такі процентні частки (і) Поліклональні антитіла переважно визначають із використанням катіонооПоліклональні антитіла переважно створюють бмінної хроматографії. у тварин шляхом множинних підшкірних (п/к) або Крім варіанта з лідерним подовженням на амівнутрішньоочеревинних (в/о) ін'єкцій релевантного но-кінці, у даному описі розглядаються також інші антигену й ад'юванту. Може бути корисно провесзміни амінокислотної послідовності основного анти кон'югацію релевантного антигену з білком, титіла та/або його варіанта, що включають, без який є імуногенним для виду, який підлягає імуніобмеження, антитіло, яке містить С-кінцевий лізизації, наприклад, з гемоціаніном з молюска новий залишок на його одному або обох важких Megathura crenulata, сироватковим альбуміном, ланцюгах (такий варіант антитіла може бути прибичачим тиреоглобіном і інгібітором соєвого трипсутнім у кількості від приблизно 1% до приблизно сину з використанням біфункуціонального або де20%), дезамідований варіант антитіла (у якому, риватизуючого агента, наприклад, малеїнімідобеннаприклад, Asn-386 та/або Asn-391 в одному або зоїлсульфосукцинімідного ефіру (кон'югація двох важких ланцюгах Пертузумабу дезамідовані), відбувається через цистеїнові залишки), Nантитіло з одним або декількома окисленими мегідроксисукциніміду (через лізинові залишки), глютюніновими залишками (наприклад, Пертузумаб, таральдегіду, бурштинового альдегіду, SOCl2 або що включають окислений мета-254) і т.п. R1N=C=NR, де R і R1 являють собою різні алкільні Крім того, основний вид антитіла або його вагрупи. ріант може включати варіації, обумовлені наявнісТварин імунізують антигеном, імуногенними тю глікозилувания, не обмежуючі приклади яких кон'югатами або їх похідними шляхом об'єднання, включають антитіло, яке має олігосахаридну струнаприклад, від 100г або 5г білка або кон'югата (для ктуру G1 або G2, приєднану до його Fc ділянки, кролика або миші, відповідно) з 3 об'ємами повноантитіло, яке включає вуглеводний фрагмент, приго ад'юванту Фрейнда з наступною ін'єкцією розєднаний до його легкого ланцюга (наприклад, один чину внутрішньошкірно в множинні ділянки. Через або декілька вуглеводних фрагментів, таких як місяць тваринам проводять повторну обробку в глюкоза або галактоза, приєднані до одного або 1/5-1/10 кількості від вихідної кількості пептиду або двох легких ланцюгів антитіла, наприклад, приєдкон'югата в повному ад'юванті Фрейнда шляхом нані до одного або декількох лізинових залишків), підшкірної ін'єкції в множинні ділянки. Через сім-14 антитіло, яке включає один або два неглікозилоднів у тварин відбирають кров і визначають у сивані важкі ланцюги, або антитіло, яке включає сіароватці титр антитіл. Повторну обробку проводять лілований олігосахарид, приєднаний до його однодо досягнення стадії плато на графіку титрів. Пего або двох важких ланцюгів і т.п. реважно, проводять повторну обробку тварин Даний винахід також стосується поліпептиду, кон'югатом на основі того самого антигену, але який включає амінокислотну послідовність SEQ ID кон'югують з іншим білком та/або за допомогою NO: 23 або її дезамідований та/або окислений ваіншого зшиваючого реагенту. Кон'югати можуть ріант. Крім того, даний винахід стосується антитібути також отримані в рекомбінантній клітинній ла, яке включає один або два легкі ланцюги, де культурі у вигляді білків злиття. Крім того, можуть один або декілька вказаних легких ланцюгів, вклювикористовуватися агрегуючі агенти, такі як глиночають амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 23. зем, для посилення імунної відповіді. Антитіло також включає один або два важких лан(іі) Моноклональні антитіла цюги, де один або обидва важкі ланцюги включаМоноклональні антитіла одержують із популяють амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 16 ції по суті гомогенних антитіл, тобто, індивідуальабо SEQ ID NO: 24 (або їх дезамідовані та/або них антитіл, які включають популяцію, представниокислені варіанти). ки якої ідентичні та/або зв'язується з тим самим Композиція може бути з використанням кліепітопом, за винятком можливих варіантів, які мотинної лінії, створеної генноінженерними методажуть виникати при одержанні моноклональних ми, наприклад, із клітинної лінії клітин яєчника киантитіл, таких як варіанти, описані в даному винатайського хом'яка, які експресують антитіло до ході. Так, визначення «моноклональний» вказує на HER2, або може бути отримана методами пептидхарактер антитіла, яке не являє собою суміш ного синтезу. окремих антитіл. III. Одержання антитіл до HER2 Наприклад, моноклональні антитіла можуть Нижче приводиться опис репрезентативних бути отримані з використанням методу гібридом, методик, які використовують для одержання антивперше описаним Колером із співавт. (Kohler et. тіл згідно із даним винаходом. al., Nature, 256: 495 (1975)) або можуть бути ствоАнтиген до HER2, який використовується для рені з використанням методик рекомбінантної ДНК одержання антитіл, може являти собою розчинну (патент США №4816567). форму позаклітинного домену HER2 або його час 33 90480 34 У рамках методики гібридоми мишу або іншу наприклад, середовище D-MEM і середовище підходящу тварину як хазяйський організм, таку як RPMI-1640. Крім того, гібридомні клітини можуть хом'як, імунізують відповідно до наведеного вище вирощуватися in vivo у вигляді асцитних пухлин у опису, для прояву дії лімфоцитів, які продукують тварин. або здатні продукувати антитіла, які можуть спеМоноклональні антитіла, які секретуються субцифічно зв'язуватися з білком, який використовуклонами, можуть бути відповідним чином відділені ється для імунізації. Альтернативно, лімфоцити від культурального середовища, асцитної рідини можуть бути імунізовані in vitro. Лімфоцити далі або сироватки з використанням звичайних процезливають із мієломними клітинами з використандур очищення антитіл, таких як, наприклад, очиням підходящого об'єднуючого агента, такого як щення на колонці з білком А-сефарозою, хроматополіетиленгліколь, з утворенням гібридомних кліграфія на гідроксилапатиті, гель-електрофорез, тин (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and діаліз або афінна хроматографія. Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). ДНК, яка кодує моноклональні антитіла, може Отримані в такий спосіб гібридомні клітини вибути легко виділена й секвенована з використансівають і вирощують у підходящому культуральням традиційних процедур (наприклад, з викорисному середовищі, яке переважно містить одну або танням олігонуклеотидних зондів, які здатні спедекілька речовин, які інгібують ріст або виживання цифічно зв'язуватися з генами, які кодують важкий незлитих вихідних мієломних клітин. Наприклад, й легкий ланцюги мишиних антитіл). Гібридомні якщо вихідні мієломні клітини не містять фермент клітини служать як краще джерело такої ДНК. Пісгіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферазу ля виділення ДНК може бути введена у вектор (HGPRT або HPRT), то культуральне середовище експресії, який потім трансфікують у хазяйські клідля гібридом у типовому випадку буде включати тини, такі як Е. соlі, COS клітини, клітини яєчника гіпоксантин, аміноптерин і тімідин (середовище китайського хом'яка (СНО) або мієломні клітини, HAT), яке в істотній мірі перешкоджає росту які в іншому випадку не продукують антитільний HGPRT-дефіцитних клітин. білок, з досягненням синтезу моноклональних анКращі мієломні клітини являють собою такі клітитіл у рекомбінантних хазяйських клітинах. Рекотини, які ефективно зливаються, підтримують стамбінантна експресія ДНК, яка кодує антитіла, у більний високий рівень продукції антитіл вибранибактеріях описана в ряді оглядів (Skerra et. al., ми антитіло-продукуючими клітинами й чутливі до Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) і середовища, такого як середовище HAT. Серед Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)). них кращими мієломними клітинними лініями є В іншому варіанті моноклональні антитіла або мишині мієломні лінії, такі як лінії, отримані з мифрагменти антитіл можуть бути виділені з бібліошиних пухлин МОРС-21 і МРС-11, доступні від теки фагових антитіл, які одержують з використанSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, ням методик, описаних у літературі (McCafferty et. California USA, і SP-2 або клітини X63-Ag8-653, al., Nature., 348: 552-554 (1990)). Клаксон і Маркс доступні від Американської Колекції типових куль(Clackson et. al., Nature., 352: 624-628 (1991) і тур (American Type Culture Collection, Rockville, Marks et. al., J. Моl. Biol., 222: 581-597 (1991)) опиMaryland USA). Описані також людські мієломні й сують виділення мишиних і людських антитіл, відгетеромієломні клітинні лінії миші-людини для повідно, з використанням фагових бібліотек. Напродукції людських моноклональних антитіл ступні очищення приводять до продукції (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); і Brodeur et. високоафінних (у нМ. діапазоні) людських антитіл, al., Monoclonal Antibodies Production Techniques які одержують за рахунок перегрупування ланцюand Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New гів (Marks et. al., Bio/Technology, 10: 779-783 York, 1987)). (1992)), а також при проведенні комбінаторної інКультуральне середовище, у якій вирощують фекції й рекомбінації in vivo як стратегії створення гібридомні клітини, аналізують для визначення дуже великих фагових бібліотек (Waterhouse et. продукції моноклональних антитіл проти антигену. al., Nuc. Acids, Res., 21: 2265-2266 (1993)). Таким Переважно, специфічність і зв'язування моноклочином, дані методики являють собою життєздатні нальних антитіл, які продукуються гібридомними альтернативи традиційним гібридомним методиклітинами, визначають імуноосадженням або тескам моноклональних антитіл для виділення монотом на зв'язування in vitro, таким як радіоімуноаклональних антитіл. наліз (РІ) або твердофазний імуноферментний ДНК може бути також модифікована, наприаналіз (ELISA). клад, шляхом заміщення кодувальної послідовноАфінність із зв'язування моноклонального ансті константних доменів важкого ланцюга й легкого титіла може бути, визначена, наприклад, за метоланцюга людської молекули гомологічних мишидикою Скетчарда (Scatchard) (Munson et. al., Anal. них послідовностей (патент США №4816567; і Biochem., 107: 220 (1980)). Morrison et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81: 6851 Після ідентифікації гібридомних клітин як клі(1984)) або шляхом ковалентного приєднання до тини, які продукують антитіла з бажаною специфівсієї кодувальної послідовності імуноглобуліну або чністю, афінністю та/або активністю, такі клони до частини кодувальної послідовності для не імуможуть бути піддані субклонуванню за процедуноглобулінового поліпептиду. рами граничного розведення з наступним вирощуВ типовому випадку такі не імуноглобулінові ванням за стандартними методиками (Goding, пептиди заміщають константними доменами антиMonoclonal Antibodies: Principles and Practice, тіла, або вони можуть бути заміщені варіабельниpp.59-103 (Academic Press, 1986)). Підходящі кульми доменами одного антиген-об'єднаного сайту туральні середовища для даної мети включають, антитіла з утворенням химерного бівалентного 35 90480 36 антитіла, яке включає антиген-об'єднаний сайт зі лідовностей. При огляді таких картин можна проспецифічністю до одного антигену й інший антианалізувати ймовірну ролі залишків у функціонуген-об'єднаний сайт зі специфічністю до іншого ванні передбачуваної імуноглобулінової послідовантигену. ності, тобто провести аналіз залишків, які III. Гуманізовані антитіла впливають на здатність даного імуноглобуліну Методи гуманізації антитіл із джерел, відмінзв'язувати свій антиген. У цьому випадку залишки них від людини, описані в літературі. Переважно FR можуть бути відібрані й об'єднані з реципієнтгуманізоване антитіло містить один або декілька ними й імпортними послідовностями, так щоб доамінокислотних залишків, введених у нього з іншосягалися бажані характеристики антитіла, такі як го джерела, яке відмінне від людини. Вказані аміпідвищена афінність для цільового(их) антигенокислотні залишки, відмінні від людських, звину(ів). В основному, залишки гіперваріабельної чайно називають «імпортні» залишки, які в ділянки безпосередньо й найбільш значно залучетиповому випадку беруть із «імпортного» варіабені в процес зв'язування з антигеном, вливаючи на льного домену. Гуманізація може бути по суті пронього. ведена за методикою Вінтера із сотр. (Winter and У документі WO 01/00245 описується одерco-workes) (Jones et. al., Nature, 321: 522-525 жання репрезентативних гуманізованих антитіл до (1986); Riechman et. al., Nature., 332: 323-327 HER2, які зв'язують HER2 і блокують активацію (1988); Verhoeyen et. al., Science, 239: 1534-1536 ліганду рецептора HER. Особливо цікаве в даному (1988)) шляхом заміщення послідовностей гіперконтексті гуманізоване антитіло блокує EGF, TGFваріабельних ділянок на відповідні послідовності α та/або HRG-опосередковану активацію МАРK по людського антитіла. Відповідно, такі «гуманізовасуті настільки ж ефективно, як і інтактне мишине ні» антитіла являють собою химерні антитіла (памоноклональне антитіло 2С4 (або його Fab фрагтент США №4816567), у яких значно менше, ніж в мент) та/або зв'язує HER2 по суті настільки ж ефеінтактному варіабельному домені людського антиктивно, як і інтактне мишине моноклональне антитіла заміщено відповідною послідовністю з виду, тіло 2С4 (або його Fab фрагмент). Описане в відмінного від людини. Практично, гуманізовані даному винаході гуманізоване антитіло може, наантитіла являють собою в типовому випадку людприклад, включати залишки гіперваріабельної діські антитіла, у яких деякі залишки гіперваріабельлянки із джерела, відмінного від людини, включеної ділянки й, можливо, деякі залишки FR заміщені ної у варіабельний домен важкого ланцюга залишками з аналогічних сайтів в антитілах гризумолекули людини й може також включати замінів. щення в каркасній ділянці (FR) у положенні, вибВибір людських варіабельних доменів як леграному із групи, яка складається з 69Н, 71Н і 73Н, кого, так і важкого ланцюгів, які використовують де використовується система нумерації варіабедля одержання гуманізованих антитіл, дуже важльного домену, відповідно до певної системи ливий для досягнення антигенності. Відповідно до (Kabat et. al., Sequences of Proteins of так званого методу «бест-фіт» («best-fit»), або найImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, кращого припасування, послідовність варіабельноNational Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). В го домену в антитілі гризуна піддають скринінгу з одному варіанті гуманізоване антитіло включає використанням повної бібліотеки відомих послідозаміщення в FR за двома або всіма положеннях: вностей варіабельних доменів антитіл людини. 69Н, 71Н і 73Н. Людська послідовність, яка відрізняється найбільРепрезентативне гуманізоване антитіло, яке шою близькістю до послідовності гризуна, відбипредставляє інтерес у даному контексті, включає в рається як каркасна ділянка людської молекули гіперваріабельній ділянці важкого ланцюга залиш(FR) для гуманізованого антитіла (Sims et. al., J. ки GFTFTDYTMX, де X переважно означає D або S Immunol., 151: 2296 (1993)); Chothia et. al., J. Моl. (SEQ ID NO: 7), DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID Biol., 196: 901 (1987)). В іншій методиці використоNO: 8) та/або NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 9), невується конкретна каркасна ділянка, одержувана з обов'язково включаючи модифікації амінокислот консенсусної послідовності всіх людських антитіл таких CDR залишків, тобто такі модифікації, які по певної підгрупи легких або важких ланцюгів. Такосуті зберігають або підвищують афінність антитіл. го роду підхід може бути використаний для одерНаприклад, варіант антитіла, цікавого в контексті жання ряду різних гуманізованих антитіл (Carter et. даного опису, може мати від приблизно одного до al., Proc. Natl. Read. Sci. USA, 89: 4285 (1992)); приблизно семи або приблизно п'ять амінокислотPresta et. al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)). них заміщень у вказаних вище CDR послідовносКрім того, важливо, щоб при гуманізації антитях варіабельної ділянки важкого ланцюга. Такі тіл зберігалася висока афінність до антигену й інші варіанти антитіл можуть бути отримані шляхом корисні біологічні властивості. Для досягнення афінного насичення, наприклад, як буде описано даної мети, відповідно до кращого методу, гуманінижче. Найбільш краще гуманізоване антитіло зовані антитіла одержують при проведенні аналізу включає у варіабельній ділянці важкого ланцюга вихідних послідовностей і різних концептуальних амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4. гуманізованих продуктів з використанням тривиміГуманізоване антитіло може включати залишрних моделей вихідних і гуманізованих послідовки гіперваріабельної ділянки варіабельного доменостей. Тривимірні імуноглобулінові моделі достуну легкого ланцюга KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: пні й відомі фахівцям у даній галузі. Доступні 10); SASYX1X2X3, де X1 означає переважно R або також комп'ютерні програми, які дозволяють побаL, X2 означає переважно Υ або Е, X3 означає печити ймовірні тривимірні конформаційні структури реважно Τ або S (SEQ ID NO: 11); та/або вибраних передбачуваних імуноглобулінових посQQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), наприклад, додатко 37 90480 38 во до CDR залишків варіабельного домену важкола. Перенесення генної сукупності людського заго ланцюга, вказаних у попередньому абзаці. Такі родкового імуноглобуліну в зародкову лінію таких гуманізовані антитіла необов'язково включають мутантних мишей приводить до продукції людсьмодифікації амінокислот у вказаних вище CDR ких антитіл при антигенній провокації (див., напризалишках, наприклад, модифікації, які по суті збеклад, Jakobovits et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., рігають або підвищують афінність антитіла. На90: 2551 (1993); Jakabovits et. al., Nature, 362: 255приклад, варіант антитіла, цікавого в контексті да258 (1993); Bruggermann et. al., Year in Immune, ного опису, може мати від приблизно одного до 7:33 (1993); і патенти США №№5591669, 5589369 і приблизно семи або приблизно п'ять амінокислот5545807. них заміщень у вказаних вище CDR послідовносАльтернативно, методика прояву активності тях варіабельного домену легкого ланцюга. Такі фагів (McCafferty et. al., Nature, 348: 552-553 варіанти антитіл можуть бути отримані шляхом (1990)) може використовуватися для продукції афінного насичення, наприклад, за описаною нижлюдських антитіл і антитільних фрагментів in vitro че методикою. Найбільш краще гуманізоване анз генного репертуару варіабельного домену імунотитіло включає амінокислотну послідовність варіаглобуліну (V) від імунізованих донорів. Відповідно бельної ділянки легкого ланцюга SEQ ID NO: 3. до даної методики, гени для V домену антитіла Даний винахід також стосується «дозрілих» у клонують у рамці зчитування в основному або міплані афінності антитіл, які зв'язуються з HER2 і норному гені білкової оболонки або нитковидного блокують активацію ліганду рецептора HER. Вихібактеріофага, такого як М13 або fd, і проявляють дне антитіло може являти собою людське антитіло як функціональні антитільні фрагменти на поверхабо гуманізоване антитіло, наприклад, антитіло, ні фагової частинки. Оскільки нитковидна частка яке включає варіабельні послідовності легкої містить копію одноланцюгової ДНК фагового генота/або варіабельні послідовності важкого ланцюга му, селекція на основі функціональних властивосSEQ ID NO: 3 і 4, відповідно (наприклад, варіант тей антитіл також приводить до селекції гену, який 574). «Дозріле» у плані афінності антитіло перекодує антитіло, яке демонструє вказані властивосважно зв'язується з рецептором HER2 з афінністю, ті. Таким чином, фаг імітує деякі властивості Вяке перевершує афінність інтактного мишиного клітин. Спосіб фагового дисплея може проводити2С4 або інтактного варіанти 5С4 (наприклад, від ся в різних форматах, як це описано в огляді (див., приблизно двох або приблизно чотирьох разів до наприклад, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David приблизно 10 разів або приблизно 1000 разів підJ., Current Opinion in Structural Biology, 3: 564-571 вищеної афінністю, за даними оцінки з викорис(1993)). Може використовуватися декілька джерел танням HER2-позаклітинного домену (ECD) за месегментів V-гену для фагового дисплея. Клаксон із тодом ELISA). Репрезентативні CDR залишки співавт. (Clackson et. al., Nature, 352: 624-628 варіабельного важкого ланцюга, що підходять для (1991)) виділили різні сукупності антиоксазолонозаміщення, включають Н28, Н30, Н34, Н35, Н64, вих антитіл з невеликої випадкової комбінаторної Н96, Н99 або сполучення двох або більше залишбібліотеки V генів, отриманих із селезінки імунізоків (наприклад, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести ваних мишей. Може бути створений репертуар V або семи таких залишків). Приклади CDR залишків генів від імунізованих донорів-людей, і антитіла до варіабельного домену легкого ланцюга, що підхосукупності різних антигенів (включаючи власні андять для зміни, включають L28, L50, L53, L56, L91, тигени) можуть бути виділені, відповідно, по суті, L92, L93, L94, L96, L97 або сполучення двох або до описаної в літературі методики (Marks et. al., J. більше залишків (наприклад, двох, трьох, чотиМоl. Biol., 222: 581-597 (1991) або Griffith et. al., рьох, п'яти або приблизно до десяти таких залишEMBO J, 12: 725-734 (1993)). Див. також патенти ків). США №№5565332 і 5573905. У даному описі розглядаються різні форми гуЛюдські антитіла можуть бути також отримані манізованого антитіла або «дозрілого» у плані in vitro з використанням активованих В-клітин (див. афінності антитіла. Наприклад, гуманізоване антипатенти США №№5567610 і 5229275). тіло або «дозріле» у плані афінності антитіло може Людські антитіла до HER2 описані в патенті являти собою антитільний фрагмент, такий як Fab, США №5772 997, виданому 30 липня 1998 року, і в який необов'язково може бути кон'югований з одWO 97/00271, опублікованої 3 січня 19.97 року. ним або декількома цитотоксичними агентами з (ν) Фрагменти антитіл одержанням імунокон'югата. Альтернативно, гумаБули розроблені різні методики для одержаннізоване антитіло або «дозріле» у плані афінності ня фрагментів антитіл. Традиційно вказані фрагантитіло може являти собою інтактне антитіло, менти одержують шляхом протеолітичного розщетаке як інтактне IgGl антитіло. плення інтактних антитіл (див., наприклад, (iv) Людські антитіла Moriraoto et. al., Journal of Biochemical and Як альтернатива процесів гуманізації можна Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992); і Brennan одержувати людські антитіла. Наприклад, зараз et. al., Science, 229: 81 (1985)). Однак такі фрагмеможливо створювати трансгенні тварини (напринти можуть бути отримані безпосередньо за допоклад, миші), які здатні при імунізації продукувати могою рекомбінантних хазяйських клітин. Наприповний репертуар людських антитіл, за відсутності клад, антитільні фрагменти можуть бути виділені з продукції ендогенного імуноглобуліну. Наприклад, описаних вище бібліотек фагових антитіл. Альтерописано, що гомозиготні делеції в гені з'єднуючої нативно, фрагменти Fab'-SH можуть бути безподілянки важкого ланцюга антитіла (JH) у химерних і середньо відновлені з Е. соlі і хімічно зв'язані з мутантних мишах зародкової лінії приводять до утворенням фрагмента F(ab')2 (Carter et. al., повного інгібування продукції ендогенного антитіBio/Technology 10; 163-167 (1992)). Відповідно до 39 90480 40 іншого підходу, фрагменти F(ab')2 можуть бути зування (об'єднані сайти антитіло-антиген) зливавиділені безпосередньо з культури рекомбінантних ють із послідовностями константних доменів імухазяйських клітин. Фахівцям у даній галузі відомі ноглобуліну. Злиття здійснюють переважно з консінші методики одержання антитільних фрагментів. тантним доменом важкого ланцюга В інших варіантах антитіло, яке вибирають, являє імуноглобуліну, що включає принаймні частину собою одноланцюговий фрагмент Fv (scFv). Див. шарніра, СН2 і СН3 ділянки. Переважно мати пеWO 93/16185; патент США №5571894; і патент ршу константну ділянку у важкому ланцюзі (СН1), США №5587458. Антитільний фрагмент може тащо містить сайт, необхідний для зв'язування легкож являти собою «лінійне антитіло», наприклад, кого ланцюга, яка присутня принаймні в одній з описане в патенті США №5641870. Такі фрагменти гібридних молекул. ДНК, яка кодує важкий ланцюг лінійного антитіла можуть бути моноспецифічними злитих молекул імуноглобуліну й, при бажанні, або біспецифічними. легкий ланцюг імуноглобуліну, вбудовують в окре(vi) Біспецифічні антитіла мі вектори експресії й піддають спільній трансфекБіспецифічні антитіла являють собою антитіції в підходящий хазяйський організм. У результаті ла, які мають зв'язувальну специфічність принайдосягають більшої стабільності в коректуванні мні до двох різних епітопів. Репрезентативні бісвзаємних пропорцій трьох поліпептидних фрагмепецифічні антитіла можуть зв'язуватися із двома нтів, у випадку якщо використовують нерівні часрізними епітопами на білку HER2. Інші такі антитітини трьох поліпептидних ланцюгів у конструкції ла можуть об'єднувати сайт зв'язування HER2 із для досягнення оптимальних виходів. Однак, можсайтом(ами) зв'язування EGFR, HER3 та/або ливо вбудовувати кодувальні послідовності для HER4. Альтернативно, плече HER2 може бути двох або трьох поліпептидних ланцюгів в один об'єднане із плечем, яке зв'язується із тригерною вектор експресії, у тому випадку, коли експресія молекулою на лейкоциті, такою як молекула Тпринаймні двох поліпептидних ланцюгів, наявних у клітинного рецептора (наприклад, CD2 або CD3), рівних частинах, приводить до високих виходів, або Fc рецептори для IgG (FcγR), такі як або коли такі співвідношення не мають особливого FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) або FcγRIII(CD16), так значення. що досягається фокусування клітинних захисних У кращому варіанті здійснення даного підходу механізмів на HER2-eкспресуючій клітині. Біспебіспецифічні антитіла складаються з гібридного цифічні антитіла можуть також використовуватися важкого ланцюга імуноглобуліну з першою зв'язудля локалізації цитотоксичних агентів у клітинах, вальною специфічністю в одному плечі й гібридної які експресують HER2. Вказані антитіла мають пари важкого ланцюга-легкого ланцюга імуноглоHER2-зв'язувальне плече і плече, яке зв'язує цибуліну (із забезпеченням другої зв'язувальної спетотоксичний агент (наприклад, сапорин, антицифічності) в іншому плечі. Було виявлено, що інтерферон а, алкалоїд барвінку, ланцюг рицину А, така асиметрична структура полегшує відділення метотрексат або радіоактивний ізотоп гаптену). бажаної біспецифічної сполуки від небажаних Біспецифічні антитіла можуть бути отримані у викомбінацій імуноглобулінових ланцюгів, оскільки гляді антитіл повної довжини або фрагментів аннаявність легкого ланцюга імуноглобуліну в одній титіл (наприклад, фрагментів F(ab')2 біспецифічних половині біспецифічної молекули полегшує процес антитіл). розділення. Вказаний підхід описаний в WO В документі WO 96/16673 описане біспецифіч94/04690. Додаткові деталі одержання біспецифічне антитіло HER2/FcγRIII і в патенті США них молекул описані в роботі Суреша із співавт. №5837234 описує біспецифічне антитіло (Suresh et. al., Methods in Enzymclogy, 121: 210 HER2/FcγRI IDM1 (Osidem). Біспецифічне антитіло (1986)). HER2/Fc-α показано в WO 98/02463. У патенті Відповідно до іншого підходу, описаного у паСША №5821337 описується біспецифічне антитіло тенті США №5731168, інтерфейс між парою антиHER2/CD3. MDX-210 являє собою біспецифічне тільних молекул може бути сконструйований таким HER2-FcγRIII антитіло. чином, щоб максимізувати відсоток гетеродимерів, Способи одержання біспецифічних антитіл віякі одержують із культури рекомбінантних клітин. домі в даній галузі. Традиційний спосіб одержання Кращий інтерфейс включає принаймні частину біспецифічних антитіл повної довжини заснований домену СН3 константного домену антитіла. Відпона спільній експресії двох пар важкого ланцюга відно до даного методу, один або декілька бокових легкого ланцюга імуноглобуліну, де обидва ланцюланцюгів малих амінокислот з інтерфейсу в першій ги мають різну специфічність (Millstein et. al., антитільній молекулі заміщають більш довгими Nature, 305: 537-539 (1983). У результаті випадкобоковими ланцюгами (наприклад, тирозином або вого перерозподілу важкого й легкого ланцюгів триптофаном). Компенсаторні «порожнини» іденімуноглобуліну одержувані гібридоми (квадроми) тичного або близького розміру щодо великого(их) створюють потенційну суміш із 10 різних антитільбокового(их) ланцюга(ів) створюють на інтерфейсі них молекул, серед яких тільки одна має правильдругої антитільної молекули шляхом заміщення ну біспецифічну структуру. Очищення такої кореквеликих бокових ланцюгів амінокислот більш дрібтної молекули, яке звичайно проводиться методом ними (наприклад, аланіном або треоніном). Це афінної хроматографії, досить складне, і вихід створює механізм підвищення виходу гетеродимепродукту низький. Аналогічні процедури описані в рів щодо інших небажаних проміжних продуктів, WO 93/08892 і в літературі (Traunecker et. al., таких як гомодимери. EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)). Біспецифічні антитіла включають зшивку «геВідповідно до іншого підходу, варіабельні дотерокон'югатних» антитіл. Наприклад, одне з антимени антитіл з бажаними специфічностями із зв'ятіл у гетерокон'югаті може бути об'єднане з авіди 41 90480 42 ном, інше - з біотином. Було висловлене припумен важкого ланцюга (VH), з'єднаний з варіабельщення, що такі антитіла, наприклад, дозволяють ним доменом легкого ланцюга (VL) за допомогою клітинам імунної системи досягати небажаних клілінкеру, який занадто короткий для того, щоб дотин для впливу на них (патент США №4676980) і зволити спарювання між доменами на одному й можуть використовуватися для лікування ВІЛтому ж ланцюзі. Відповідно, домени VH і VL одного інфекції (HIV) (WO 91/00360, WO 92/200373 і ЕР фрагмента змушують спаровуватися з комплемен03089). Гетерокон'югатні молекули можуть бути тарними доменами VL і VH іншого фрагмента, що отримані з використанням методів зшивки. Підхоприводить до утворення двох антигендящі зшиваючі агенти відомі в даній галузі й, зокзв'язувальних сайтів. Була також запропонована рема, описані в патенті США №4676980, де навеінша стратегія одержання фрагментів біспецифічдено різноманітні методики зшивки. них антитіл за рахунок використання димерів одМетодики одержання біспецифічних молекул з ноланцюгових Fv (sFv) (див. Gruber et. al., J. антитільних фрагментів описані в літературі. НаImmunol., 152: 5368 (1994) ). приклад, біспецифічні антитіла можуть бути отриРозглядаються також антитіла більш ніж із мані з використанням хімічної зшивки. Бренан із двома валентностями. Наприклад, можуть бути співавт. (Brennan et. al., Science, 229: 81 (1985)) отримані триспецифічні антитіла (Tutt et. al., J. описує процедуру, у рамках якої інтактні антитіла Immunol., 147: 60 (1991)). піддають протеолітичному розщепленню з утво(vii) Інші модифікації амінокислотних послідовренням F(ab')2 фрагментів. Вказані фрагменти відностей новлюють у присутності арсеніду натрію як дитіолОписуються також модифікації амінокислотних комплексоутворюючогоагента для стабілізації послідовностей антитіл до HER2. Наприклад, монайближчих дитіолів і попередження утворення же бути бажано поліпшити афінність із зв'язування внутрішньомолекулярних дисульфідних зв'язків. та/або інші біологічні властивості антитіла. ВаріанУтворені фрагменти Fab' потім перетворять у тіоти амінокислотної послідовності антитіла до HER2 нітробензоатні похідні (ТНБ). Один з Fab'-ТНБ поодержують шляхом введення відповідних нуклеохідних далі перетворюють в Fab'-тіол шляхом відтидних змін у нуклеїнову кислоту для антитіла до новлення меркаптоетиламіном і змішують із HER2 або шляхом пептидного синтезу. Такі модиеквімолярною кількістю іншого Fab'-Тнб похідного фікації включають,- наприклад, делеції та/або з утворенням специфічного антитіла. Одержувані вставки, та/або заміщення залишків в амінокислобіспецифічні антитіла можуть бути використані як тних послідовностях антитіла до HER2. Викорисагентів для селективної іммобілізації ферментів. товують будь-яке сполучення делецій, вставок і Останнім часом вдалося спростити метод беззаміщень для створення остаточної конструкції, за посереднього виділення фрагментів Fab'-SH з Е. умови, що остаточна конструкції має бажані хараксоlі, які можуть бути хімічно зв'язані з утворенням теристики. Зміни амінокислотного ланцюга також біспецифічних антитіл. Шалаби із співавт. (Shalaby можуть змінювати пост-трансляційні процеси анet. al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)) описують титіла до HER2, такі як зміна числа або положення одержання молекул повністю гуманізованого біссайтів глікозилувания. пецифічного антитіла F(ab')2. Кожний фрагмент Корисний спосіб ідентифікації деяких залишків Fab' окремо секретується з Е. cоlі, після чого його або ділянок антитіла до HER2, які мають кращу піддають безпосередньо хімічному зв'язуванню in локалізацію для мутагенезу, називається «мутагеvitro з утворенням біспецифічного антитіла. Отринез за методом сканування аланіну», описаний у мане в такий спосіб біспецифічне антитіло здатне літературі (Cunningham and Wells Science, 244: зв'язуватися із клітинами, які здійснюють суперек1081-1085 (1989)). Відповідно до даної методики, спресію рецептора HER2, і нормальними людсьідентифікують залишок або групу цільових залишкими Т-клетками, а також запускати літичну активків (наприклад, заряджені залишки, такі як arg, asp, ність цитотоксичних лімфоцитів людини проти his, lys i glu) і заміщають нейтральними або негапухлинних мішеней молочної залози людини. тивно зарядженими амінокислотами (найбільш Описано велику кількість методик одержання й переважно аланіном або поліаланіном), для того виділення фрагментів біспецифічних антитіл безщоб зробити ефект на взаємодію амінокислот з посередньо з культури рекомбінантних клітин. Наантигеном HER2. Такі амінокислотні положення, приклад, біспецифічні антитіла одержують із викоякі демонструють функціональну чутливість до ристанням лейцинових зиперів (Kostelny et. al., J. заміщень, далі коректують шляхом введення доImmunol., 148(5): 1547-1553 (1992)). Пептиди з даткових або інших варіантів на основі сайтів залейциновим зипером з білків Fos і Jun зв'язують із міщення. Таким чином, тоді як сайт введення для Fab' частинами двох різних антитіл шляхом геннодосягнення варіацій в амінокислотній послідовносго злиття. Антитільні гомодимери відновлюють у ті визначений, природа мутації per se заздалегідь шарнірній ділянці з утворенням мономерів і потім не визначена. Наприклад, для аналізу функціонупіддають повторному окисленню з утворенням вання мутації в даному сайті проводять аlа скануантитільних гетеродимерів. Даний метод може вання або випадковий мутагенез у цільовому котакож використовуватися для одержання антитідоні або на ділянці, і експресовані варіанти льних гомодимерів. Методика утворення «диантиантитіла до HER2 піддають скринінгу на наявність тіл», описана в роботі Холлінгера із співавт. бажаної активності. (Hollinger et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: Вставки амінокислотної послідовності вклю6444-6448 (1993)), забезпечує альтернативний чають аміно- та/або карбокси-кінцеві злиття, які механізм одержання фрагментів біспецифічних змінюються за довжиною від одного залишку до антитіл. Фрагменти включають варіабельний дополіпептидів, що містять сотні або більше залиш 43 90480 44 ків, а також вставки між послідовностями одного in Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth або великої кількості амінокислотних залишків. Publishers, New York (1975)): Приклади кінцевих вставок включають антитіло до (1) неполярні: Ala (A), Val (V), Leu (L), lle (I), Pro HER2 з N-кінцевим метіонільним залишком або (Ρ), Phe (F), Trp (W), Met (M); антитіло, злите із цитотоксичним поліпептидом. (2) незаряджені полярні: Gly (G), Ser (S), Thr Інші варіанти молекулярної вставки антитіла до (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); HER2 включають варіант злиття на N- або С-кінці (3) кислі: Asp (D), Glu (E); антитіла до HER2 з ферментом (наприклад, (4) основні: Lys (K), Arg (R), His (H) ADEPT) або поліпептидом, що підвищує період Альтернативно, природні залишки можуть бунапіввиведення антитіла із сироватки. ти поділені на групи на підставі спільності властиІнший тип варіанта являє собою варіант із завостей їх бокових ланцюгів: міщення амінокислот. Вказані варіанти містять (1) гідрофобні: Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, принаймні один амінокислотний залишок у молеlle; кулі антитіла до HER2, який заміщений іншим за(2) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr, Asn, лишком. Сайти, що представляють найбільший Gln; інтерес для мутагенезу за типом заміщення, вклю(3) кислі: Asp, Glu; чають гіперваріабельні ділянки, або CDR, але для (4) основні: His, Lys, Arg; цієї мети можуть також розглядатися зміни в діля(5) залишки, які впливають на орієнтацію ланнці FR або Fc. Консервативні заміщення проілюстцюга: Gly, Pro; ровані в таблиці 1 у колонці «краще заміщення». (6) ароматичні: Trp, Tyr, Phe. Якщо такі заміщення приводять до зміни біологічНе консервативні заміщення будуть приводити ної активності, то можуть бути введені більше істодо обміну представників з одного або декількох тні зміни, позначені як «типові заміщення» у табкласів на представників іншого класу. лиці 1, або які додатково описані нижче в примітці Будь-який цистеїновий залишок, який не задіза класами амінокислот і далі може бути проведеюється в підтримання відповідної конформації ний скринінг продуктів. антитіла до HER2, також може бути заміщений в основному серином, з поліпшенням стабільності Таблиця 1 молекули до окислення й із запобіганням аберантного зшивання. І навпаки, можуть бути додані цистеїновий (і) зв'язок(и) до антитіла для підвищення Вихідний Кращі заміТипові заміщення його стабільності (особливо, коли антитіло являє залишок щення собою антитільний фрагмент, такий як фрагмент Ala (A) Val; Leu; Ile Val Fv). Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Особливо кращий варіант із заміщення вклюAsn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln чає заміщення одного або декількох залишків у Asp (D) Glu; Asn Glu гіперваріабельній ділянці вихідного антитіла (наCys (C) Ser; Ala Ser приклад, гуманізованого або людського антитіла). Gln (Q) Asn; Glu Asn В основному, остаточний(і) варіант(ти), що вибиGlu (E) Asp; Gln Asp рається(ються) для подальшої роботи, буде(уть) Gly (G) Ala Ala мати поліпшені біологічні властивості щодо вихідHis (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg ного антитіла, з якого він(и) був(ли) отриманий(ні). Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Но- Leu Зручний спосіб створення таких варіантів із замірлейцин щення включає методику досягнення дозрівання Leu (L) Норлейцин; Ile; Val; Met; lle за афінністю з використанням фагового дисплея. Ala; Phe Коротко, така методика полягає в тому, що декільLys (K) Arg; Gln; Asn Arg ка сайтів гіперваріабельної ділянки (наприклад, 6Met (M) Leu; Phe; Ile Leu 7 сайтів) піддають мутуванню з утворенням всіх Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr можливих амінокислотних заміщень у кожному Pro (P) Ala Ala сайті. Одержувані в такий спосіб варіанти антитіл Ser (S) Thr Thr переглядають у моновалентному режимі з викориThr (T) Val; Ser Ser станням частинок ниткоподібних фагів у вигляді Trp (W) Tyr; Phe Tyr злиття із продуктом гену III від М13, упакованого Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe всередині кожної частинки. Варіанти з фаговим дисплеєм далі піддають скринінгу на наявність Val (V) lle; Leu; Met; Phe;Ala; Нор- Leu біологічної активності (наприклад, афінності із лейцин зв'язування), відповідно до описаної методики. Для ідентифікації сайтів гіперваріабельної ділянки, Істотні модифікації в біологічних властивостях підходящих для модифікації кандидатів, проводять антитіла відслідковують при проведенні селекції мутагенез із сканування аланіну для ідентифікації таких варіантів за заміщенням, які значно відріззалишків гіперваріабельної ділянки, які істотно няються за своїм ефектом на збереження (а) струвпливають на зв'язування з антигеном. Альтернактури поліпептидного скелету в зоні заміщення, тивно або додатково, може бути корисно проананаприклад, на пластинчасту або спіральну конфолізувати кристалічну структуру комплексу антигенрмацію, (b) заряд або гідрофобність молекули в антитіло для ідентифікації контактних точок між сайті-мішені або (с) об'єм бокового ланцюга. Аміантитілом і людським HER2. Такі контактні залишнокислоти можуть бути згруповані за подібностями ки й прилеглі залишки можуть розглядатися як у властивостях бокових ланцюгів (A. L. Lehninger, 45 90480 46 кандидати для заміщення за розробленою метоМолекули нуклеїнових кислот, які кодують вадикою. При одержанні таких варіантів, панель варіанти антитіла до HER2 за амінокислотною посліріантів піддають скринінгу, відповідно до наведедовністю, одержують із використанням багатьох ного опису, і антитіла з поліпшеними методик, відомих у даній галузі. Вказані методики властивостями, які визначаються за одним або включають, без обмеження, виділення із природдекількома релевантними тестами, відбирають ного джерела (у випадку наявності природних вадля подальшої роботи. ріантів амінокислотної послідовності) або підхід на Інший тип амінокислотного варіанта антитіла основі олігонуклеотидного (або сайтзаснований на зміні вихідної картини глікозилуспрямованого) мутагенезу, ПЛР-мутагенезу й кавання антитіла. Під зміною в цьому випадку розусетного мутагенезу раніше отриманого варіанта міється делеція одного або декількох вуглеводних або не варіантної версії антитіла до HER2. фрагментів, наявних в антитілі, та/або додавання (viii) Скринінг антитіл з бажаними властивосодного або декількох сайтів глікозилувания, які не тями присутні в антитілі. Вище були описані методики одержання антиГлікозилування антитіл відбувається в типотіл. Можна також проводити відбір антитіл з певвому випадку за механізмом N-зв'язування або Оними біологічними властивостями, при бажанні. зв'язування. N-зв'язування стосується приєднання Для ідентифікації антитіла, яке блокує активавуглеводного фрагмента до бокового ланцюга цію ліганду рецептора HER, визначають здатність аспарагінового залишку. Трипептидні послідовносантитіла блокувати зв'язування ліганду HER із ті аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де X клітинами, які експресують рецептор HER (наприможе бути будь-якою амінокислотою, за винятком клад, у кон'югації з іншим рецептором HER, з яким проліну, являють собою розпізнавані послідовності рецептор HER, який представляє інтерес, утворює для ферментативного приєднання вуглецевого гетероолігомер HER). Наприклад, клітини, які ексфрагмента до бокового ланцюга аспарагіну. Таким пресують в природному стані рецептор HER або чином, наявність однієї із вказаних трипептидних гетеродимер HER або трансфіковані для цілей послідовностей у поліпептиді створює потенційний експресії рецептора HER або гетеродимеру HER, сайт глікозилувания. О-зв'язане глікозилування можуть інкубуватися з антитілом, після чого їх підстосується приєднання одного із цукрів: Nдають впливу міченого ліганду HER. Далі визнаацетилгалактозаміну, галактози або ксилози, до чають здатність антитіла до HER2 блокувати зв'ягідроксіамінокислоти, найчастіше такої, як серин зування ліганду з рецептором HER у або треонін, хоча може також використовуватися гетероолігомері HER 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Наприклад, інгібування зв'язування HRG з ліДодавання сайтів глікозилувания до антитіла нією клітин пухлини молочної залози MCF7 антитізвичайно здійснюється шляхом зміни амінокислотлами до HER2 може бути досягнуте при викорисної послідовності, так щоб вона містила одну або танні моношарових культур клітин MCF7 у форматі декілька вказаних вище трипептидних послідовно24-лункових планшетів на льоді, по суті як описано стей (у випадку сайтів N-зв'язаного глікозилував WO 01/00245. До кожної лунки додають монокния). Зміна може бути також здійснена шляхом лональні антитіла до HER2 і проводять інкубацію додавання або заміщення одного або декількох протягом 30 хвилин. Потім додають 125І-мічений серинових або треонінових залишків до послідовrHRGβ1177-224 (25пм) і продовжують інкубацію ще ності вихідного антитіла (у випадку сайтів Опротягом 4-16 годин. Будують криві залежності зв'язаного глікозилувания). відповіді від дози й обчислюють показник ІК50 для У тому випадку, коли антитіло включає ділянку антитіла, яке представляє інтерес. В одному варіFc, може бути змінена будь-яка олігосахаридна анті антитіло, яке блокує активацію ліганду рецепструктура, яка приєднується до неї. Наприклад, тора HER, має показник ІК50 за інгібуванням зв'яантитіла зі зрілою вуглеводною структурою, яка не зування HRG із клітинами MCF7 у даному тесті, містить фукози, приєднаної до ділянки Fc антитіла, рівний приблизно 50нМ або менше, більш переваописані в заявці на патент США 2003/0157108 Al жно, 10нМ або менше. У тому випадку, коли анти(Presta, L). Див. також патент США 2004/0093621 тіло являє собою антитільний фрагмент, такий як A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.). Антитіла, які фрагмент Fab, показник ІК50 для інгібування зв'ямістять у вуглеводній структурі поділяючий її на зування HRG із клітинами MCF7 у даному тесті дві частини N-ацетилглюкозамін (GlcNAc), яка становить, наприклад, близько 100нМ або менше, приєднана до ділянки Fc антитіла, розглядаються більш переважно, 50нМ або менше. в WO 03/011878 (Jean-Mairet et al.) і в патенті США Альтернативно або додатково, може бути ви№6602684 (Umana et al.). Антитіла, що містять значена здатність антитіла до HER2 блокувати принаймні один галактозний залишок в олігосахастимульоване лігандом HER фосфорилування ридній структурі, приєднаній до ділянки Fc антитітирозину в рецепторі HER, присутньому в гетерола, описані в WO 97/30087 (Patel et al.). Див. також димері HER. Наприклад, клітини, які ендогенно WO 98/58964 (Raju, S) і WO 99/22764 (Raju, S), які експресують рецептори HER або трансфіковані стосуються антитіл зі зміненим вуглеводом, приєдля цілей його експресії, інкубують з антитілом, днаним до Fc ділянки. У даному описі також розгпісля чого проводять тест на визначення активнолядаються антитільні композиції, яка включають сті з фосфорилування тирозину, залежному від основний вид антитіла з такими вуглеводними ліганду HER, з використанням антиструктурами, приєднаними до одного або двох фосфотирозинмоноклонального антитіла (яке неважких ланцюгів Fc ділянки. обов'язково може бути кон'юговано з міткою, яка виявляється). Для визначення активації рецептора 47 90480 48 HER і блокування даної активності антитілом може SK-BR-3, як показують дані експерименту із спільтакож використовуватися тест на активацію кіназної імунопреципітації, описаного в WO 01/00245, ного рецептора, описаний у патенті США значно більш ефективно, ніж моноклональне анти№5766863. тіло 4D5, і переважно, значно більш ефективно, В одному варіанті може бути проведений ніж моноклональне антитіло 7F3. скринінг на наявність антитіла, яке інгібує HRGДля ідентифікації рістінгібуючої здатності в анстимуляцію фосфорилування р180 тирозину в клітитіл до HER2, можна провести скринінг антитіл, тинах MCF7, по суті відповідно до методики, опиякі інгібують ріст ракових клітин, що здійснюють саної в WO 01/00245. Наприклад, клітини MCF7 суперекспресію HER2. В одному варіанті вибране вносять у лунки 24-лункових планшетів і додають рістінгібуюче антитіло здатне інгібувати ріст SKдо кожної лунки моноклональні антитіло до HER2, BR-3 клітини в клітинній культурі приблизно на 20після чого проводять інкубацію протягом 30 хви100% і, переважно, приблизно на 50-100% у конлин при кімнатній температурі, потім додають до центрації антитіла приблизно 0,5-30мкг/мл. Для кожної лунки rHRGβ1177-244 до кінцевої концентрації ідентифікації таких антитіл може бути проведений 0,2нМ, і інкубація ще може бути продовжена ще тест із використанням SK-BR-3 клітин, як описано протягом 8 хвилин. Далі середовища відсмоктують в патенті США №5677171. Відповідно до даного із кожної лунки й зупиняють реакцію додаванням тесту, клітини SK-BR-3 вирощують у суміші 1:1 F12 100 мкл буфера, який містить ДСН, для зразків і DMEM середовища з добавкою 10% фетальної (5% ДСН, 25мМ DTT і 25мМ Трис-НСІ, рН6,8). Косироватки теляти, глютаміну й пеніциліжний зразок (25мкл) піддають електрофорезу в ну/стрептоміцину. Клітини SK-BR-3 висівають у градієнті 4-12% гелю (Novex) і потім електрофорекількості 20000 клітин у чашки для культури клітин тично переносять на полівінілідендифторидну діаметром 35мм (2мл/35мм чашку). До кожної чамембрану. Одержують антифосфотирозинові шки додають 0,5-30мкг/мл антитіла до HER2. Че(1мкг/мл) імуноблоти, і інтенсивність переважної рез шість днів підраховують кількість клітин і поріреактивної смуги, що відповідає Мr~180000, вивнюють із їх кількістю в необробленому варіанті з значають кількісно денситометрією в прохідному використанням електронного лічильника клітин світлі. Вибране антитіло переважно істотно інгібує COULTER™. Ті антитіла, які інгібують ріст клітин HRG-стимульоване фосфорилування р180 тироSK-BR-3 приблизно на 20-100% або приблизно на зину приблизно на 0-35% від контрольного зна50-100%, відбирають як рістінгібуючі антитіла. У чення в даному тесті. За даними денсинометрії в патенті США №5677171 описані тести для скринінпрохідному світлі будують криву залежності дозагу рістінгібуючих антитіл, таких як 4D5 і 3Е8. відповідь для інгібування HRG-стимуляції фосфоДля вибору антитіл, які індукують апопотоз, рилування р180 тирозину й обчислюють показник може бути проведений тест на зв'язування анекIК50 для антитіла, яке представляє інтерес. В одсину з використанням клітин ВТ474. Клітини ВТ474 ному варіанті антитіло, яке блокує активацію лігависівають у чашки Петрі для культивування, як нду рецептора HER, має показник ІК50 для інгібубуло описано в попередньому абзаці. Далі серевання HRG-стимуляції фосфорилування р180 довище видаляють і заміняють свіжим середовитирозину в даному тесті, що дорівнює приблизно щем без добавок або середовищем, яке містить 50мМ або менше, більш переважно, 10мМ або 10мкг/мл моноклонального антитіла. Після трименше. У тому випадку, коли антитіло являє собою денної інкубації моношари промивають ФБР і відоантитільний фрагмент, такий як фрагмент Fab, кремлюють при обробці трипсином. Далі клітини показник ІК50 для інгібування HRG-стимуляції фоцентрифугують, суспендують у Са2+сфорилування р180 тирозину в даному тесті може зв'язувальному буфері й вносять аліквоти в пробістановити, наприклад, близько 100нМ або менше, рки, як вказувалося вище в тесті на визначення більш переважно, 50нМ або менше. рівня загибелі клітин. Далі пробірки мітять анексиМожна також оцінити рістінгібуючі ефекти анном (наприклад, анексин V-FTIC) (1мкг/мл). Зразки титіла на MDA-MB-175 клітини, наприклад, по суті аналізують із використанням проточного цитометвідповідно до описаної в літературі методики ра FACSCAN™ і програмного забезпечення (Schaefer et al., Oncogene 15: 1385-1394 (1997)). FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Ті Відповідно до даного тесту, MDA-MB-175 клітини антитіла, які індукують статистично значимі рівні обробляють моноклональним антитілом до HER2 зв'язування анексину відносно контролю, відбира(10мкг/мл) протягом 4 днів і фарбують кристалічють як апоптоз-індукуючі антитіла. Крім тесту на ним фіолетовим. Інкубація з антитілом до HER2 зв'язування анексину, може бути проведений тест може демонструвати рістінгібуючий ефект на дану на фарбування ДНК із використанням клітин клітинну лінію аналогічно до того, що відбувається ВТ474. Для проведення такого тесту клітини під дією моноклонального антитіла 2С4. В іншому ВТ474, які були оброблені розглянутим антитілом, варіанті екзогенний HRG несуттєво реверсує таке як було описано в попередніх двох параграфах, інгібування. Переважно, антитіло здатне інгібувати інкубують з 9мкг/мл HOECHST 33342™ протягом 2 проліферацію MDA-MB-175 клітин більшою мірою, годин при температурі 37°С і потім аналізують у ніж моноклональне антитіло 4D5 (і необов'язково, проточному цитрометрі EPICS ELITE™ (Coulter більшою мірою, ніж моноклональне антитіло 7F3) Corporation) з використанням програмного забезяк у присутності, так і під час відсутності екзогенпечення MODFIT LT™ (Verity Software House). Анного HRG. титіла, які індукують зміни у відсотку апоптозних В одному варіанті антитіло, яке представляє клітин, які перевищують в 2 або більше рази (і пеінтерес, до HER2 може блокувати герегулінреважно в 3 або більше рази) відповідний рівень у залежну асоціацію HER2 з HER3 у клітинах MCF7 і необроблених клітинах (аж до 100% апоптозних 49 90480 50 клітин), відбирають як проапоптозні антитіла, за РІІ and PAP-S), інгібітор momordica charantia, куррезультатами даного тесту. Див. WO 98/17797, у цин, кротин, інгібітор sapaonaria officinalis, гелонін, якому описані тести для скринінгу антитіл, які індумітогелін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і кують апоптоз, таких як 7С2 і 7F3. трихотецени. Див., наприклад, WO 93/21232, опуДля скринінгу антитіл, які зв'язуються з епітобліковану 28 жовтня 1993 року. пом на HER2, що зв'язується з антитілом, яке Даний винахід також стосується імунокон'югапредставляє інтерес, проводять традиційний тест та, утвореного між антитілом і сполукою з нуклеоз перехресного блокування, такий як описаний у літично активністю (наприклад, з рибонуклеазою відповідному посібнику (Antibodies, A Laboratory або ДНК-ендонуклеазою, такою як дезоксирибонуManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow клеаза; ДНКаза). and David Lane (1988) ) для оцінки, чи блокує антиДоступно багато радіоактивних ізотопів для тіло в перехресному режимі зв'язування антитіла, одержання радіокон'югованих антитіл до HER2. такого як 2С або Пертузумаб, з HER2. АльтернаПриклади включають At211, I131, І125, Y90, Re186, тивно або додатково, може бути проведене картуRe188, Sm153, Ві212, Ρ32 і радіоактивні ізотопи Lu. вання епітопу за методиками, відомими у даній Кон'югати антитіл і цитотоксичного агента могалузі, або може бути проведене дослідження жуть бути отримані з використанням багатьох біструктури антитіло-НЕR2 (Franklin et al., Cancer функціональних білкових зв'язувальних агентів, Cell 5: 317-328 (2004)) для виявлення, який(і) дотаких як N-сукцинімідил-3-(2мен(и) HER2 зв'язується(ються) з антитілом. піридилдитіол)пропіонат (SPDP), сукцинімідил-4(іх) Імунокон'югати (N-малеімідометил) циклогексан-1-карбоксилат, Даний винахід також стосується імунокон'югаімінотіолан (IT), біфункціональні похідні імідоефірів тів, які включають антитіло, кон'юговане із цитото(такі як диметиладипімідат-НСl), активні складні ксичним агентом, таким як хіміотерапевтичний ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди агент, токсин (наприклад, мала молекула токсину (такі як глютаральдегід), біс-азидосполуки (такі як або ензиматично активний токсин бактеріального, біс(п-азидобензоїл)гександиамін), біс-діазонієві грибного, рослинного або тваринного походження, похідні (такі як біс-(пвключаючи їх фрагменти та/або варіанти) або радіазонійбензоїл)етилендіамін), діізоціанати (такі як діоактивний ізотоп (тобто радіоактивний кон'югат). толуол-2,6-діізоціанат) і біс-активні фтористі споВище були описані хіміотерапевтичні агенти, луки (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). Наякі використовують при створенні таких імунокоприклад, рициновий імунотоксин може бути отрин'югатів. Кон'югати антитіла й однієї або декількох маний за описаною у літературі методикою (Vitetta малих молекул токсину, таких як калхеаміцин, et al., Science 238: 1098 (1987)). 1майтанзин (патент США №5208020), трихотен і Ізотіоціанатобензил-3СС1065, також включені в даний опис. метилдіетилентриамінпентаоцтова кислота, мічеВ одному кращому варіанті здійснення даного на вуглецем-14 (МХ-DTPA) являє собою приклад винаходу антитіло піддають кон'югуванню з однією хелатуючого агента, який застосовують для кон'юабо декількома молекулами майтанзину (зокрема, гації радіонуклеотиду з антитілом. Див WO від приблизно 1 до приблизно 10 молекул майтан94/11026. Лінкер може являти собою «розщеплюзину на молекулу антитіла). Майтанзин може бути, ваний лінкер», який полегшує вивільнення цитокнаприклад, перетворений в May-SS-Me, який може сичного агента в клітину. Наприклад, може викобути відновлений до May-SH3 і далі піддадуть реристовуватися кислотолабільний лінкер, лінкер акції з модифікованим антитілом (Chari et al., чутливий до пептидази, диметиловий лінкер або Cancer Research 52: 127-131 (1992)) з утворенням лінкер, який містить дисульфідний зв'язок (Chari et імунокон'югата майтанзиноїд-антитіло. al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)). Інший імунокон'югат, який представляє інтеАльтернативно, білок злиття, який включає анрес, включає антитіло до HER2, кон'юговане з одтитіло до HER2 і цитотоксичний агент, може бути нією або декількома молекулами каліхеаміцину. отриманий, наприклад, з використанням рекомбіСімейство каліхеаміцинових антибіотиків здатне нантних методик або методів пептидного синтезу. створювати розриви у двуланцюговій ДНК, при У ще одному варіанті здійснення даного винавикористанні в субпікомолярних концентраціях. ходу антитіло може бути кон'юговане з «рецептоСтруктурні аналоги каліхеаміцину, які можуть при ром» (таким як стрептавідин) для використання в цьому використовуватися, включають, без обменацілюванні на пухлинні клітини, де кон'югат антиження γ1I, α2l, α3l, N-ацетил-γ1l, PSAG і θ1l(Hunman тіло-рецептор вводять пацієнтові, після чого із et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) і Lode кровотоку видаляють незв'язаний кон'югат з викоet al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)). Див. ристанням хелатуючого агента й далі вводять «літакож патенти США №№5714586; 5712374; ганд» (наприклад, авідин), який кон'югований із 5264584 і 5773001, наведені в даному описі як цитотоксичним агентом (наприклад, з радіонуклеопосилання. тидом). Ензиматично активні токсини і їх фрагменти, (х) Інші модифікації антитіл які можуть при цьому використовуватися, включаІнші модифікації антитіл також наводяться в ють А ланцюг дифтерійного токсину, активні фрагданому описі. Наприклад, антитіло може бути зв'яменти дифтерійного токсину, які не зв'язуються, зане з одним з багатьох небілкових полімерів, наланцюг А екзотоксину (з Pseudomonas aeruginosa), приклад, з поліетиленгліколем, поліпропіленгліколанцюг А рицина, ланцюг А абрину, ланцюг А молем, поліоксіалкіленами або співполімерами децину, альфа-сарцин, білки Aleurites fordii, діанполіетиленгліколю й поліпропіленгліколю. Антитіло тинові білки, білки Phytolaca americana (РАРІ, РАможе бути також захоплене в мікрокапсули, одер 51 90480 52 жувані, наприклад, за методикою коацервації й у (такої як IgG1, ІgG2, ІgG3 або IgG4), який відповідає процесі міжшарової полімеризації (наприклад, гідза підвищення періоду напіввиведення із сироватроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсуки in vivo молекули IgG. Антитіла із заміщеннями в ли й полі-(метилметациталатні) мікрокапсули, відділянці Fc і з підвищеними періодами напіввивеповідно) у колоїдних системах доставки лікарських дення із сироватки також описані в WO 00/42072 засобів (наприклад, у ліпосомах, альбумінових (Presta, L.). мікросферах, мікроемульсіях, наночастинках і наОписані також сконструйовані антитіла із нокапсулах) або в макроемульсіях. Такі методики трьома або більше (переважно чотирма) сайтами описані в керівництві Ремінгтона (Remington's зв'язування функціонального антитіла (заявка на Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, Α., Ed., патент США №US2002/0004587 Al, Miller et al.). (1980)). Наведені в даному описі антитіла до HER2таМоже бути бажано модифікувати антитіло згікож можуть бути виготовлені у вигляді імуноліподно із даним винаходом з погляду зміни його ефесом. Ліпосоми, які містять антитіла, одержують за кторних функцій, таким чином, щоб підсилити анвідомими у даній галузі методиками, такими як титіло-зумовлено клітиннозалежну цитотоксичність описані в літературі (Epstein et al., Proc. Natl. Acad. (ADCC) та/або комплементзалежну цитотоксичSci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. ність антитіла (CDC). Такий результат може бути Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); патенти США досягнуть при введенні одного або декількох амі№№4485045 і 4544545; і WO 97/38731, опубліконокислотних заміщень в Fc ділянку антитіла. вана 23 жовтня 1997 року). Ліпосоми з підвищеним Альтернативно або додатково, у ділянку Fc періодом циркуляції в кровотоці описані в патенті можуть бути введені один або декілька цистеїноСША №5013556. вих залишків, що сприяє утворенню в даній ділянці Особливо корисні ліпосоми можуть бути ствоміжланцюгових дисульфідних зв'язків. Одержуване рені за методикою випарювання зі оберненням в такий спосіб гомодимерне антитіло може мати фази на основі ліпідної композиції, яка містить підвищену здатність до інтерналізації та/або підфосфатидилхолін, холестерин і ПЕГвищену комплементзалежну здатність до знищендериватизований фосфатидилетаноламін (ПЕГня клітин і антитіло-зумовлену клітиннозалежну ФЕ). Ліпосоми піддають екструзії через фільтри із цитотоксичність (ADCC). Див. Caron et al., J. Exp. заданим розміром пор з одержанням ліпосом баMed., 176: 1191-1195 (1992) і Shopes, В. J. жаного діаметру. Fab' фрагменти антитіла за даImmunol., 148: 2918-2922 (1992). Гомодимерні анним винаходом можуть бути кон'юговані з ліпосотитіла з підвищеною протипухлинною активністю мами, описаними в роботі Мартіна із співавт. можуть бути також отримані з використанням ге(Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)) за теробіфункціональних зшиваючих лінкерів, як опидопомогою реакції обміну дисульфідними зв'язкасано в літературі (див. Wolff et al., Cancer ми. До складу ліпосом може бути також необов'язResearch, 53: 2560-2565 (1993)). Альтернативно, ково включений хіміотерапевтичний агент (див. може бути сконструйоване антитіло, яке має поGabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19) 1484 двійні Fc ділянки й, у цьому зв'язку, може мати (1989)). підвищену здатність до комплементзалежного ліIV. Фармацевтичні композиції зису й ADCC (див. Stevenson et al., Anti-Cancer Терапевтичні композиції згідно із даним винаDrug Design 3: 219-230 (1989)). ходом одержують при змішуванні композиції з неВ документі WO 00/42072 описуються антитіла обов'язковими фармацевтично прийнятними носіз підвищеною функцією ADCC у присутності людями, ексципієнтами або стабілізаторами ських ефекторних клітин, де антитіла включають (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, заміщення амінокислот у своїх ділянках Fc. ПереOslo, Α., Ed., (1980)) у вигляді ліофілізованих комважно, антитіло з підвищеною ADCC здатністю позицій або водних розчинів, придатних для зберівключає заміщення в положеннях 298, 333 та/або гання. Прийнятні носії, ексципієнти або стабіліза334 в Fc ділянці. Переважно, змінена ділянка Fc тори є нетоксичними для реципієнтів у являє собою ділянку Fc людського IgGl, яка вклювикористовуваних дозуваннях і включають буфечає або складається із заміщень за одним, двома ри, такі як буфери на основі фосфату, цитрату й або трьома положеннями. інших органічних кислот; антиоксиданти, які вклюАнтитіла зі зміненим Clq зв'язуванням та/або чають аскорбінову кислоту й метіонін; консерванти комплементзалежною цитотоксичністю (CDC) опи(такі як октадецилдиметилбензиламонію хлорид, сані в WO 99/51642, у патенті США №6194551У1, у гексаметонію хлорид, бензалконію хлорид, бензепатенті США №6242195У1, у патенті США тонію хлорид, фенол, бутиловий або бензиловий №6528624 У1 і в патенті США №6538124 (Idusogie спирт, алкілпарабени, такі як метил- або пропілпаet al.). Антитіла включають амінокислотні заміщенрабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3ня за одним або декількома положеннями амінопентанол, і м-крезол); низькомолекулярні (які міскислот 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 та/або 334 тять менше, ніж приблизно 10 залишків) поліпепу своїй ділянці Fc. тиди, білки, такі як сироватковий альбумін, желаДля підвищення періоду напіввиведення антитин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі тіла із сироватки можна включати епітоп зв'язуяк полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, вання сальважного рецептора антитіла (особливо глютамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; фрагмента антитіла), як описано, наприклад, у моносахариди, дисахариди й інші вуглеводи, які патенті США №5739277. У контексті даного опису включають глюкозу, манозу або декстрини; хелатермін «епітоп зв'язування сальважного рецептотуючі агенти, такі як ЕДТА; цукри, такі як сахароза, ра» стосується епітопу ділянки Fc молекули IgG маніт, трегалоза або сорбіт; солеутворюючі проти 53 90480 54 іони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, активації HER (або HER2) у ракових клітинах і інкомплекси Zn-білок); та/або неіонні поверхневоших тестованих клітинах істотно перевершує ріактивні речовини, такі як TWEEN™, PLURONICS™ вень активації даного рецептора в неракових або або поліетиленгліколь (ПЕГ). Композиції ліофілізонормальних клітинах того ж типу тканини. Така ваіних антитіл до HER2 описані в WO 97/04801. надлишкова активація може бути результатом Композиція за даним винаходом може також суперекспресії рецептора HER та/або наявність містити більше однієї активної сполуки, при необвище нормального рівня ліганду HER, доступного хідності, для використання за показниками в плані для активації рецептора HER у ракових клітинах. проведеного лікування, переважно сполуки, які Така надлишкова активація може викликати та/або мають комплементарну активність, які не роблять може бути викликана злоякісним статусом ракової несприятливого ефекту одна на одну. Наприклад, клітини. У деяких варіантах рак може бути піддаможе бути бажано також, забезпечити наявність ний діагностичному або прогностичному тестуванантитіл, які зв'язуються з EGFR, HER2 (наприклад, ню для визначення, чи має місце ампліфікація антитіла, яке зв'язується з іншим епітопом на та/або суперекспресія рецептора HER, що привоHER2), HER3, HER4 або фактори росту ендотелідить до такої надлишкової активації рецептора альних клітин судин (VEGF), у складі однієї компоHER. Альтернативно або додатково, рак може зиції. Альтернативно або додатково, композиція бути підданий діагностичному або прогностичному може також включати хіміотерапевтичний агент, тестуванню для визначення, чи має місце ампліфіцитотоксичний агент, цитокін, рістінгібуючий агент, кація та/або суперекспресія ліганду HER у раковій антигормональний агент, EGFR-спрямований літканині, що сприяє надлишковій активації рецепкарський засіб, антиангіогенний агент, інгібітор тора. У підмножині таких видів раку надлишкова тирозинкінази, та/або кардіопротектор. Такі молеактивація рецептора може бути результатом функули можуть бути присутні у підходящому сполукціонування аутокринного стимулюючого шляху. ченні в кількостях, які ефективні для цілей передРізні репрезентативні тести, які використовуються бачуваного лікування. для виявлення активації HER, описані нижче більш Активні інгредієнти можуть бути також захопдокладно. лені.в одержувані мікрокапсули, наприклад, при (і) Димери HER використанні методу коацервації або міжшарової Зразки можуть бути оцінені на наявність димеполімеризації, наприклад, до складу гідроксиметирів HER, як індикаторів активації HER або HER2. лцелюлозних або желатинових мікрокапсул і поліБудь-який відомий у даній галузі метод може ви(метилметацилатних) мікрокапсул, відповідно, до користовуватися для виявлення димерів HER, таскладу колоїдних системах доставки лікарських ких як EGFR-HER2, HER2-HER3. Нижче описані засобів (наприклад, у ліпосоми, альбумінові мікродеякі кращі методики. Вказані методики дозволясфери, мікроемульсії, наночастинки й нанокапсують виявити нековалентні білок-білкові взаємодії ли) або макроемульсії. Такі методики описані в або іншим способом вказують на близькість, що посібнику Ремінгтона (Remington's Pharmaceutical існує між білками, які представляють інтерес. Sciences, 16th edition, Oslo, Α., Ed., (1980)). Для виявлення димерів HER можуть бути виМожуть бути отримані препарати із пролонгокористані імуноафінні методи, такі як імунопрециваним вивільненням. Підходящі приклади препапітація або ELISA. В одному варіанті здійснення ратів із пролонгованим вивільненням включають даного винаходу використовують антитіла до напівпроникні матриці на основі твердих гідрофоHER2 для імунопреципітації комплексів, які вклюбних полімерів, які містять антитіло, де вказані чають HER2 з пухлинних клітин, і отриманий імуматриці мають цілком певну форму, наприклад, нопреципітат потім зондують на наявність EGFR плівок або мікрокапсул. Приклади матриць у преабо HER3 шляхом імуноблотингу. В іншому варіапаратах із пролонгованим вивільненням включанті антитіла до EGFR або HER3 можуть бути викоють поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі-(2ристані для імунопреципітації, і далі імунопреципігідроксіетилметакрилат) або полі(вініловий тат зондують із використанням антитіл до HER2. У спирт)), полілактиди (патент США №3773919), ще одному варіанті використовують ліганди HER, співполімери L-лютамінової кислоти й етил-Lспецифічні до комплексів EGFR, HER3, EGFRглютамат, етиленвінілацетат, який не розкладаHER2 або комплексам HER2-HER3, для одержанється, співполімери молочної кислоти-гліколевої ня преципітатних комплексів, які далі зондують на кислоти, як розкладаються, такі як LUPRON наявність HER2. Наприклад, ліганди можуть бути DEPOT™ (ін'єковані мікросфери, які складаються кон'юговані з авідином, і отриманий комплекс із співполімеру молочної кислоти-гліколевої кислоочищають на колонку з біотином. ти й ацетату лейпроліду) і полі-D-(-)-3В інших варіантах, таких як ELISA або антитігідроксимасляна кислота. льний аналіз за типом «сендвіча», антитіла до Використовувані для введення in vivo компоHER2 іммобілізують на твердій основі, приводять у зиції повинні бути стерильними. Стерильність легконтакт із пухлинними клітинами або лізатом пухко досягається шляхом фільтрування через стелинних клітин, промивають і піддають впливу анрильні мембрани для фільтрування. титіл проти EGFR або HER3. Зв'язування вказаних V. Скринінг пацієнтів, які підходять для терапії антитіл, яке може бути виявлене. безпосередньо Відповідно до кращого варіанта здійснення або за вторинним антитілом, кон'югованим із мітданого винаходу, пацієнт, який вибирається для кою, яка виявляється, вказує на наявність гетеропроведення даної терапії, має пухлину або іншу димерів. У деяких варіантах іммобілізують антитіклітину або тканину, які демонструють активацію ло до EGFR або HER3, і антитіло до HER2 HER (і переважно HER2). В одному варіанті рівень використовують на стадії виявлення. В інших варі 55 90480 56 антах ліганди HER можуть використовуватися задимерів EGFR-HER2 або HER2-HER3, як описано мість антитіл до HER або в сполученні з ними. в роботі Наги із співавт. (Nagy et al., Cytometry, 32: Хімічне або УФ-опосередковане зв'язування 120-131 (1998)). Наведені методики дозволяють також може використовуватися для ковалентного виміряти зниження періоду дії флуоресценції в приєднання димерів на поверхню живих клітин донора через перенесення енергії. У конкретному (Hunter et al., Biochem. J., 320: 847-53). Приклади варіанті, для дослідження димеризації EGFRхімічних зшиваючих агентів включають дитіоHER2 або HER2-HER3 може бути використана біс(сукцинімідил) пропіонат (DSP) і 3,3технологія проточної цитометрії (Foerster-type 'дитіобіс(сульфосукцинімідил) пропіонат (DTSSP). FRET метод (FCET)), описана в літературі (див., В іншому варіанті клітинний екстракт із хімічно наприклад, Nagy et al., вище, і Brockhoff et al., зшитих пухлинних клітин аналізують електрофореCytometry, 44: 338-48 (2001)). зом у ДСН-ПААГ і проводять імуноблотинг із антиFRET переважно використовують у сполученні тілами проти EGFR та/або HER3. Суперзсув смуги зі стандартними методиками імуногістохімічного відповідної молекулярної ваги, найімовірніше, вімічення (Kenworthy, Methods, 24: 289-96 (2001)). дображає наявність димерів EGFR-HER2 або Наприклад, антитіла, кон'юговані з відповідними HER2-HR3, оскільки HER2 являє собою кращий флуоресцентними барвниками, можуть використопартнер у димерному комплексі з EGFR і HER3. вуватися як зонди для мічення двох різних білків. Такий результат може бути підтверджений наступЯкщо білки знаходяться у достатній близькості ним імуноблотингом з антитілами до HER2. один до одного, то флуоресцентні барвники діють Метод флуоресцентного резонансного переяк донори й акцептори для FRET. Перенесення несення енергії (FRET) також може використовуенергії виявляють стандартними методами. Переватися для виявлення димерів EGFR-HER2 або несення енергії може бути виявлене за допомогою димерів HER2-HER3. FRET виявляє зміни білкових проточної цитометрії або при використанні систем конформацій і наявність білок-білкових взаємодій дігітальної мікроскопії, таких як системи, що вклюin vivo і in vitro, на підставі виявлення перенесення чають конфокальну мікроскопію або флуоресцентенергії від донорного флуорофору до акцепторнону мікроскопію із широким полем, об'єднані з каго флуорофору (Selvin, Nat. Struct. Biol., 7: 730-734 мерою зі зв'язаними зарядами (CCD). (2000) ). Перенесення енергії має місце тільки в В одному варіанті здійснення даного винаходу тому випадку, якщо донорний флуорофор знахоантитіла до HER2 і, або антитіла до EGFR, або до диться в достатній близькості до акцепторного HER3 безпосередньо мітять двома різними флуофлуорофору. У типовому експерименті, проведерофорами, наприклад як описано в роботі Наги із ному за методом FRET, два білки або два сайти на співавт. (Nagy et al., вище). Пухлинні клітини або одному білку мітять різними флуоресцентними лізат пухлинних клітин піддають контакту з дифезондами. Один із зондів, донорний зонд, збуджуренціально міченими антитілами, які діють як доють до високоенергетичного стану відбитим світнори й акцептори для FRET у присутності димерів лом із заданою довжиною хвилі. Донорний зонд EGFR-HER2 або HER2-HER3. Альтернативно, непотім переносить свою енергію на другий зонд, мічені антитіла проти HER2 і, або проти EGFR, або акцепторний зонд, приводячи до зниження інтенпроти HER3, використовують разом з диференціасивності флуоресценції донора й підвищенню емільно міченими вторинними антитілами, які діють сії флуоресценції в акцептора. Для вимірювання як донори й акцептори. Див., наприклад, роботу рівня перенесення енергії донорну інтенсивність у Брокхоффа із співавт. (Brockhoff et al., вище). Визразку, міченому донорним і акцепторним зондаявляють перенесення енергії, виявляють і визнами, порівнюють із відповідною інтенсивністю в зрачають наявність димерів, якщо мітки знаходяться у зку, міченим тільки донорним зондом. Необов'язтісній близькості. ково інтенсивність акцептора порівнюють тільки в В інших варіантах ліганди рецептора HER, які зразках донора-акцептора й акцептора. Відповідні специфічні для HER2 і, або для EGFR, або для зонди, відомі в даній галузі, включають, наприHER3, мітять флуоресцентною міткою й викорисклад, мембранопроникаючі барвники, такі як флутовують для FRET досліджень. оресцин і родамін, органічні барвники, такі як ціаУ ще інших варіантах здійснення даного винанінові барвники, і лантанідні атоми (Selvin, вище). ходу наявність димерів на поверхні пухлинних кліМетоди й прилади, використовувані для виявлентин підтверджують спільною локалізацією HER2 ня й вимірювання перенесення енергії, також віабо з EGFR, або з HER3 з використанням стандадомі в даній галузі (Selvin, вище). ртних прямих або опосередкованих імунофлуореМетодики, засновані на FRET підході, прийнясцентних методик і конфокальної мікроскопії лазетні для виявлення й вимірювання білок-білкової рного сканування. Альтернативно, використовують взаємодії в індивідуальних клітинах, також відомі в лазерне сканування (LSI) для виявлення зв'язуданій галузі. Наприклад, мікроскопія для виявленвання антитіл і спільної локалізації HER2 або з ня перенесення флуоресцентної резонансної енеEGFR, або з HER3 у масштабі високопродуктивноргії донора із фотоосвітлення (pbFRET) і мікроского аналізу, з використанням мікролункових планпія для ідентифікації періоду дії флуоресценції шетів, як описано в літературі (Zuck et al., Proc. (FLIM) можуть використовуватися для виявлення Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11122-27 (1999)). димеризації рецепторів на клітинній поверхні В інших варіантах присутність димерів EGFR(Selvin, вище; Gadella & Jovin, J. Cell Biol., 129: HER2 та/або HER2-HER3 ідентифікують за раху1543-58 (1995)). В одному варіанті використовують нок виявлення ензиматичної активності, що залеpbFRET на клітинах, або "у суспензії", або «in situ», жить від близькості димерних компонентів. Антитідля. виявлення й вимірювання рівня утворення ло до HER2 кон'югує з одним ферментом, а 57 90480 58 антитіло до EGFR або HER3 кон'югує із другим другу мішень. Другий цільовий зв'язувальний фраферментом. Додають перший субстрат для пергмент також не обмежується яким-небудь чином і шого ферменту й у результаті реакції одержують може являти собою, наприклад, антитіло або фрадругий субстрат для другого ферменту. Це запусгмент антитіла, або ліганд рецептора HER, або кає реакцію з іншою молекулою з утворенням спофрагмент ліганду, компетентний за зв'язуванням. луки, яку виявляють, такої як барвник. Наявність Агент, який розщеплює, являє собою такий агент, іншого хімічного компонента руйнує другий субякий буде розщеплювати лише зв'язувальну групу страт, запобігаючи реакції із другим ферментом, в першій зв'язульній сполуці, якщо перша зв'язуякщо перший і другий ферменти, і, значить, обидвальна сполука і друга зв'язувальна сполука знава антитіла не знаходяться у тісній близькості. У ходяться у тісній близькості. конкретному варіанті пухлинні клітини або лізати В одному варіанті здійснення даного винаходу клітин піддають контакту з антитілом до HER2, яке перша зв'язувальна сполука включає еТаg™, у кон'югують із глюкозооксидазою, і антитілом до якому антитіло до HER2 служить як перший цільоHER3 або HER1, яке кон'югують з пероксидазою вий зв'язувальний фрагмент. Друга зв'язувальна хрону. До реакційної суміші додають глюкозу, располука включає антитіло до EGFR або HER3, зом з попередником барвника, таким як ДАВ, і каприєднане до фрагмента, що розщеплює, здатноталазу. Наявність димерів виявляють за розвитком му розщеплювати сполучну групу еТаg™. Перевафарбування на ДАВ. жно, зв'язувальний фрагмент повинен бути актиДимери можуть бути також виявлені з викоривований для того, щоб він зміг розщеплювати станням методів, заснованих на системі еТаg™ зв'язувальну групу. Пухлинні клітини або лізати тесту (Aclara Bio Sciences, Mountan View, CA), як пухлинних клітин піддають контакту з еТаg™, що описано, наприклад, у заявці на патент США зв'язується з HER2 і з модифікованим антитілом 2001/0049195, опублікованої 6 грудня 2001 року, до EGFR або HER3, які зв'язуються з EGFR або яка включена в даний опис повністю як посилання. HER3 на поверхні клітин. Незв'язану зв'язувальну Мітка еТаg™, або «електрофоретична мітка», сполуку переважно видаляють і, при необхідності, включає репортерний фрагмент, який виявляєтьактивують агент, який розщеплює. Якщо присутні ся, такий як флуоресцентна група. Вказана мітка димери EGFR-HER2 або HER2-HER3, агент, який також може включати «модифікатор мобільності», розщеплює, буде розщеплювати зв'язувальну груякий складається по суті із фрагмента, що має пу й вивільняти еТаg, за рахунок близькості агенунікальну електрофоретичну рухомість. Вказані та, який розщеплює, до зв'язувальної групи. Вільфрагменти дозволяють здійснювати відділення й ний еТаg™ може бути потім виявлений з виявлення еТаg™ зі складної суміші в певних умовикористанням будь-якого відомого методу, такого вах електрофоретичного поділу, наприклад, при як капілярний електрофорез. проведенні капілярного електрофорезу (КЕ). ЧасУ одному варіанті агент, який розщеплює, явтина мітки еТаg™, яка містить репортерний фрагляє собою такий активований хімічний компонент, мент і необов'язково модифікатор мобільності, який діє на зв'язувальну групу. Наприклад, зв'язузв'язують із першим цільовим зв'язувальним фравальний агент може бути активований за допомогментом за допомогою розщеплюваної зшиваючої гою впливу світла на зразок. групи з утворенням першої зв'язаної сполуки. ПеВ іншому варіанті конструюють еТаg™ з викорший цільовий зв'язувальний, фрагмент специфічристанням антитіл до EGFR або HER3 як перший но розпізнає певну першу мішень, таку як нуклеїцільовий зв'язувальний фрагмент, а другу зв'язунова кислота або білок. Перший цільовий вальну сполуку конструюють на основі антитіла до зв'язувальний фрагмент не обмежується якимHER2. небудь чином і може являти собою, наприклад, У ще одному варіанті димер HER виявляють із полінуклеотид або поліпептид. Переважно, первикористанням антитіла або іншого реагенту, який ший цільовий зв'язувальний фрагмент являє соспецифічно або переважно зв'язується з димером, бою антитіло або фрагмент антитіла. Альтернатиу порівнянні з варіантом його зв'язування з рецепвно, перший цільовий зв'язувальний фрагмент тором HER димеру. може являти собою ліганд рецептора HER або (іі) Фосфорилування HER2 його фрагмент, компетентний за зв'язуванням. Після імунопреципітації з антитілами до EGFR, Зв'язувальна група переважно включає розHER2 або HER3, як було описано в попередньому щеплюваний фрагмент, такий як ензиматичний абзаці, може бути необов'язково проведений фунсубстрат, або будь-який хімічний зв'язок, який мокціональний тест на димери, як альтернатива або же бути розщеплений в певних умовах. У тому доповнення до імуноблотингу. В одному варіанті випадку, коли перший цільовий зв'язувальний після імунопреципітації з антитілом до HER3 профрагмент з'єднується зі своєю мішенню, вводять водять тест на визначення активності тирозинкіната/або активують фрагмент, який розщеплює, при зи рецептора в імунопреципітаті. Оскільки HER3 цьому зв'язувальна група розщеплюється, вивільне містить тирозинкіназної активності, наявність няючи частину еТаg™, що містить репортерний тирозинкіназної активності в імунопреципітаті буде фрагмент і модифікатор мобільності. Таким чином, вказувати на те, що, цілком ймовірно, HER3 задіюнаявність «вільного» еТаg™ вказує на зв'язування ється в асоціацію з HER2 (Graus-Porta et. al., цільового зв'язувального фрагмента зі своєю міEMBO J., 16: 1647-55 (1997); Klapper et. al., Proc. шенню. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 4995-5000 (1999)). Цей Переважно, друга зв'язувана сполука включає результат може бути підтверджений імуноблотинагент, який розщеплює, і другий цільовий зв'язугом з антитілами до HER2. В іншому варіанті після вальний фрагмент, який специфічно розпізнає імунопреципітації з антитілом до HER2 проводять 59 90480 60 тест для визначення тирозинкіназної активності (iv) Види раку із суперекспресією, відмінною рецептора EGFR. У рамках даного тесту імунопвід HER2 реципітат піддають контакту з радіоактивним АТФ і Хоча рак може бути охарактеризований за супептидним субстратом, який імітує сайт трансфоперекспресією рецептора HER2, даний винахід сфорилування HER2 під дією EGFR in vivo. Фостакож стосується способу лікування раку, який не форилування пептиду вказує на наявність спільної стосується НЕR2-експресуючого виду раку. імунопреципітації й, таким чином, димеризації Для визначенні експресії HER2 при раку досEGFR з HER2. Тести на тирозинкіназну активність тупно багато діагностичних/прогностичних тестів. рецептора відомі в даній галузі й включають тести, В одному варіанті суперекспресію HER2 аналізуякі виявляють фосфорилування цільових субстрають за методикою ІНС, наприклад, з використантів, наприклад, у випадку фосфотирозинового анням HERCEPTEST® (Dako). Занурені в парафін титіла, і активацію відповідних сигнальних шляхів тканинні зрізи з біопсійного зразка пухлини піддатрансдукції, таких як МАРК шлях. ють ІНС тесту й проводять фарбування для визнаФосфорилування рецептора HER може бути чення інтенсивності фарбування на білок HER2 з оцінене за допомогою імунопреципітації одного використанням наступних критеріїв: або декількох рецепторів HER, таких як рецептор Бал 0: не спостерігається фарбування або HER2 (HER2), і вестерн-блот-аналізу. Наприклад, фарбування мембрани спостерігається менше ніж позитивний результат виявляється за наявністю в 10% пухлинних клітин. смуги фocфo-HER2 у гелі з використанням фосБал 1+: слабке фарбування / фарбування, яке фотирозинового антитіла, яке виявляє фосфоринезначно виявляється, мембрани більш ніж в 10% лований(і) тирозиновий (і) залишок(ки) в імунопрепухлинних клітин. Клітини фарбуються лише в чаципітованому(их) рецепторі(ах) HER. Антистині мембрани. фосфотирозинові антитіла комерційно доступні від Бал 2+: від слабкого до помірно повного фарPanVera (Madison, WI), дочірньої компанії бування мембрани більш ніж в 10% пухлинних Invitrogen, Chemicon International Inc. (Temecula, клітин. CA) або від Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). Бал 3+: від помірного до сильного повного фаНегативний результат відповідає відсутності такої рбування мембрани більш ніж в 10% пухлинних смуги. клітин. В іншому варіанті фосфорилування рецептора Вказані види пухлини з балами від 0 до 1+ у HER2(HER2) оцінюють за результатами імуногісплані оцінки суперекспресії HER2 розглядаються тохімічного аналізу з використанням фосфояк такі, які не суперекспресують HER2, тоді як пухспецифічного антитіла до HER2 (клон PN2A; Thor лини з балами від 2+ або 3+ характеризуються як et al., J. Clin. Oncol., 18(18): 3230-3239 (2000)). такі, які суперекспресують HER2. Інші методики виявлення фосфорилування Пухлини, які здійснюють суперекспресію рецептора(ів) HER включають, без обмеження, HER2, можуть бути ранжовані на підставі резульKIRA ELISA (патенти США №№5766863, 5891650, татів імуногістохімічного аналізу за числом копій 5914237, 6025145 і 6287784), мас-спектрометрію молекул HER2, які експресується у клітині, які мо(включаючи порівняння розмірів фосфорилованожуть бути визначені біохімічно: го й нефосфорилованого HER2) і тест на близь0=0-10000 копій/клітину, кість e-tag з використанням і антитіла до HER (на1+= принаймні приблизно 200000 коприклад, HER2), і фосфо-специфічного або пій/клітину, фосфотирозин-специфічного антитіла (наприклад, 2+= принаймні приблизно 500000 коз використанням набору для тестування еТаg™, пій/клітину, доступного від компанії Aclara BioSciences, 3+= принаймні приблизно 2000000 коMountan View, CA). Нижче описане більш докладпій/клітину. но проведення тесту на еТаg. Суперекспресія HER2 на рівні 3+, яка веде до Можна також використати фосфо-специфічні ліганд-залежної активації тирозинкінази (Hudziak антитіла. в клітинному варіанті для виявленні стаet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7159-7163 тусу фосфорилування в клітинному зразку з наяв(1987)), здійснюється приблизно в 30% випадків ністю білка, який задіюється в сигнальній трансдупри раку молочної залози, і в цих пацієнтів знижукції (US 2003/0190689). ється рівень виживання, вільний від рецидивів, а (iiі) Ліганди HER2 також показник загального виживання (Slamon et Рівні ліганду HER, такого як TGF-α, у пухлині al., Science, 244: 707-712 (1989); Slamon et al., або в асоціації з пухлиною можуть бути виявлені Science. 235: 177-182 (1987)). Альтернативно або за відомими процедурами. Такі тести дозволяють додатково, можуть бути проведені FISH тести, такі ідентифікувати білок та/або нуклеїнову кислоту, як INFORM™ (постачається від компанії Ventana, яка кодує його в досліджуваному зразку. В одному Arizona) або PATHVISION™ (Vysis, Illinois) на фікваріанті рівні ліганду HER у пухлині можуть бути сованому у формаліні, зануреному в парафін зразвизначені з використанням імуногістохімічного меку пухлинної тканини для виявлення рівня (при тоду (ІНС) (див., наприклад, Scher et al., Clin. його наявності) суперекспресії HER2 у пухлині. Cancer Research, 1: 545-550 (1995)). АльтернативВ одному варіанті рак може являти собою тано або додатково, можна оцінити рівні ліганду HER кий вид, який експресує (і може здійснювати супе- кодувальній нуклеїновій кислоті в тестованому рекспресію) EGFR, і така експресія може бути оцізразку, наприклад, за допомогою FISH, саузерннена за методами оцінки експресії HER2, блотингу або ПЛР методик. описаними вище.