Удосконалений метод для кількісного визначення днк у біологічному зразку

Реферат: Винахід належить до вдосконаленої методики кількісного визначення нуклеїнових кислот, унікальних для трансгенної кукурудзи, з позначенням Bt11, у біологічному зразку, а також композицій для застосування в цій методиці. Винахід також належить до використаних у цій методиці пар праймерів, які є унікальними для об'єкта Bt11. UA 105044 C2 (12) UA 105044 C2 UA 105044 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0001] Цей винахід стосується вдосконаленої методики кількісного визначення нуклеїнових кислот, унікальних для трансгенної кукурудзи з позначенням Bt11, у біологічному зразку, а також композицій, рекомендованих до використання в цій методиці. [0002] У зв'язку з застосуванням нормативних вимог, зокрема Директиви Європейської комісії (ЕС) 1139/98, Директиви ЕC 49/2000 та Директиви ЕC 50/2000, що регламентують використання трансгенних культурних рослин, виникла необхідність у точному вимірюванні рівнів ДНК трансгенних видів, які можуть бути присутніми, наприклад, у зерні, використовуваному для харчових цілей. Причиною значної уваги, що приділяється аналітичним методам виявлення та кількісного аналізу ДНК цих трансгенних рослин, є той факт, що порогове значення для маркування, встановлене Постійним комітетом Європейської комісії у 1999 році, становить 1 %. [0003] Наявність трансгена можна розпізнати за допомогою добре відомого методу виявлення нуклеїнових кислот, який включає, окрім іншого, термічну ампліфікацію (полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)) з використанням полінуклеотидних праймерів або гібридизацію ДНК з використанням зондів нуклеїнової кислоти. У більшості випадків для простоти й однотипності реагентів та методів, використовуваних для виявлення окремої конструкції ДНК, яка застосовувалася для перетворення різних видів рослин, ці методи виявлення, як правило, зосереджуються на часто застосовуваних генетичних елементах, наприклад промотори, термінатори та гени-маркери, оскільки для багатьох конструкцій ДНК області кодуючої послідовності є взаємозамінними. Унаслідок цього такі методи можуть виявитися малоінформативними для конструкцій, що відрізняються тільки в кодуючій послідовності. Окрім цього, такі методи можуть виявитися непридатними для диференціації різних трансгенних об'єктів, особливо отриманих з використанням аналогічної конструкції ДНК. [0004] З метою розмежування трансгенних об'єктів були розроблені методи ПЛР для конкретних об'єктів. Вставка гетерологічної конструкції ДНК в геном рослини створює унікальні специфічні для об'єктів стики між послідовністю інтегрованої ДНК та геномною послідовністю рослини. Для трансгенних об'єктів, у тому числі Bt11, була розроблена кількісна методика ПЛР (кількісна ПЛР), специфічна для кожного об'єкта. До факторів, які здатні обмежувати застосовуваність таких методів, можуть належати, наприклад, вплив первинної концентрації ДНК, встановлені наглядовими органами стандарти, вибір праймерів та протоколу ПЛР, повторюваність від зразка до зразка, відтворюваність результатів між різними лабораторіями, а також порогові значення для виявлення низьких рівнів і високої чутливості. [0005] З вищевикладених причин існує необхідність у вдосконаленні кількісного виявлення нуклеїнових кислот трансгенної кукурудзи Bt11 у біологічному зразку. КОРОТКИЙ ВИКЛАД [0006] Цей винахід стосується трансформованої кукурудзи (Zea mays) лінії Bt11, яка містить дві гетерологічні експресійні касети, одна з яких містить кодуючу послідовність cry1Ab, яка кодує інсектицидний білок Cry1Ab, що надає рослинам кукурудзи Bt11 стійкість до комах-шкідників, а інша містить кодуючу послідовність pat, яка кодує білок PAT, що надає рослинам кукурудзи Bt11 стійкість до гербіцидів на основі глюфосинату амонію. Створення об'єкта Bt11 описане в патенті США № 6,114,608, зміст якого включено в цей документ в якості посилання. Дві експресійні касети були включені в межах області 15 cM на довгому плечі хромосоми 8, біля позиції 117, а в проміжку були фланковані двома спільними маркерами: ZIB3 та UMC150a. [0007] Цей винахід пропонує композиції та вдосконалені методи кількісного виявлення специфічної для Bt11 ДНК у біологічних зразках, що мають відношення до ендогенного гена кукурудзи adh1. Таке кількісне визначення ДНК Bt11, наприклад у суміші зерен кукурудзи, що включає зерно лінії Bt11 та зерно, відмінне від Bt11, засновано на використанні пари праймерів та зонду, призначених для виявлення послідовності 5'-з'єднання у Bt11. [0008] В одному варіанті цього винаходу пропонується метод для визначення кількості ДНК об'єкта Bt11 у біологічному зразку, що містить нуклеїнові кислоти кукурудзи, у цьому варіанті здійснення метод включає (a) вступ біологічного зразка в контакт із першою парою праймерів, що містить перший праймер, який складається з SEQ ID NO: 1, і другий праймер, який складається з SEQ ID NO: 2, і зондом, маркованим флуоресцентним барвником, який містить SEQ ID NO: 3, в якому перша пара праймерів при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнових кислот із геномною ДНК кукурудзи лінії Bt11, утворює перший амплікон, що містить SEQ ID NO: 4, і в якому перший амплікон вказує на наявність об'єкта Bt11; (b) вступ біологічного зразка в контакт із другою парою праймерів, що містить перший праймер, який складається з SEQ ID NO: 5, і другий праймер, який складається з SEQ ID NO: 6, і з другим зондом, маркованим флуоресцентним барвником, який містить SEQ ID NO: 7, в якому друга пара праймерів при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнових кислот із геномною ДНК 1 UA 105044 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кукурудзи утворює другий амплікон, що містить SEQ ID NO: 8, і в якому другий амплікон вказує на наявність гена кукурудзи adh1; (c) забезпечення умов для реакції ампліфікації нуклеїнових кислот та інструменту ПЛР, здатного провести кількісну ПЛР у реальному часі; (d) проведення кількісної ПЛР у реальному часі з використанням праймерів і зондів (a) та (b), утворюючи таким чином перший і другий амплікони; (e) одночасне виявлення відносної кількості першого та другого ампліконів при їх утворенні за допомогою згаданого інструмента ПЛР та (f) підрахунок відносної кількості першого амплікону порівняно з кількістю другого амплікону, за якого кількість першого амплікону вказує на кількість ДНК Bt11 у біологічному зразку. [0009] У другому варіанті цей винахід пропонує пару праймерів, що містять перший праймер, який складається з SEQ ID NO: 1, і другий праймер, який складається з SEQ ID NO: 2, в якому пара праймерів при застосуванні в ПЛР з геномною ДНК кукурудзи лінії Bt11 утворює перший амплікон, що містить SEQ ID NO: 4, який вказує на наявність об'єкта Bt11. [0010] У ще іншому варіанті цей винахід надає полінуклеотидний зонд, який складається з SEQ ID NO: 3, який при маркуванні флуоресцентним барвником на 5'- і 3'-кінцях практичний для використання в кількісній ПЛР у реальному часі для виявлення та кількісного визначення амплікону Bt11. [0011] Вищезгадані та інші варіанти винаходу стануть більш зрозумілими з наданого нижче детального опису. ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ У ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID NO: 1 є праймером Bt11-5For. SEQ ID NO: 2 є праймером Bt11-5Rev. SEQ ID NO: 3 є зондом Bt11. SEQ ID NO: 4 є ампліконом кількісної ПЛР Bt11. SEQ ID NO: 5 є праймером Zmadh1-F. SEQ ID NO: 6 є праймером Zmadh1-R. SEQ ID NO: 7 є зондом Zmadh1-P. SEQ ID NO: 8 є ампліконом кількісної ПЛР adh1. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС [0012] Запропоновані нижче визначення основних понять надані для більшої ясності викладення суті цього винаходу та з метою надання допомоги фахівцям із загальним знанням цієї галузі в практичному застосуванні цього винаходу. Якщо не вказано іншого, використані в цьому документі терміни слід розуміти згідно з їх традиційним тлумаченням фахівцями у відповідній сфері. Визначення загальновживаних термінів молекулярної біології можна знайти також у тлумачному словнику з класичної та молекулярної генетики Рігера (Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1994). У цьому документі використано номенклатуру для основ ДНК та амінокислот, визначену у Зводі федеральних правил США 37 § 1.822. [0013] "Достовірність" методу ПЛР — близькість узгодження між результатом випробування та прийнятим еталонним значенням. [0014] "Ефективність ампліфікації" — швидкість ампліфікації, яка приводить до теоретичного кута нахилу в –3,32 з ефективністю 100 % у кожному циклі. Ефективність реакції можна розрахувати з допомогою наступного рівняння: Ефективність = [10(-1/нахил)] – 1. [0015] Термін "ампліфікований" у контексті цього винаходу означає побудову численних копій молекули нуклеїнової кислоти або численних копій, комплементарних молекулі нуклеїнової кислот, з використанням як мінімум однієї з молекул нуклеїнової кислоти в якості матриці. Системи ампліфікації включають, окрім іншого, систему полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), систему лігазної ланцюгової реакції (ЛЛР), метод ізотермічної ампліфікації нуклеїнових кислот (NASBA, корпорація Cangene, Mississauga, Ontario), системи Q-бета реплікази, метод транскрипційної ампліфікації (TAS) та ампліфікації з витісненням ланцюга (SDA). Див., наприклад, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (Діагностична молекулярна біологія: принципи та застосування), D. H. Persing et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). Продукт ампліфікації називається ампліконом. [0016] "Коефіцієнт лінійності (R2)» – це коефіцієнт кореляції градуювальної кривої, отриманої з допомогою лінійно-регресійного аналізу. [0017] Термін "Динамічний діапазон" у контексті цього винаходу означає діапазон концентрацій ДНК Bt11, вище якого метод, що пропонується в цьому винаході, використовується в лінійний спосіб із прийнятним рівнем достовірності й точності. [0018] Термін "трансгенний об'єкт" у контексті цього винаходу стосується рекомбінантної рослини, отриманої шляхом трансформації та регенерації клітини або тканини рослини з 2 UA 105044 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гетерологічною ДНК, наприклад експресійною касетою, що містить досліджуваний ген. Термін "об'єкт" означає первинний трансформант та/або потомство трансформанта з гетерологічною ДНК. Термін "об'єкт" також стосується потомства, отриманого шляхом схрещування трансформанта та кукурудзи іншої лінії. Навіть після повторного зворотного схрещування з рекурентною батьківською клітиною введена ДНК і фланкуюча ДНК трансформованої батьківської клітини присутні в потомстві гібриду в аналогічній хромосомній локалізації. Термін "об'єкт" також стосується ДНК первинного трансформанта, що містить введену ДНК і фланкуючу геномну послідовність у безпосередній близькості до введеної ДНК, що, як очікується, перейде до потомства, яке отримує введену ДНК, у тому числі досліджуваний трансген, у результаті схрещування однієї батьківської клітинної лінії, що містить введену ДНК (наприклад, первинний трансформант і потомство, отримані в результаті самозапилення) і батьківську клітинну лінію, яка не містить введену ДНК. Зазвичай у результаті трансформації тканини рослини утворюються численні об'єкти, кожен з яких представляє введення конструкції ДНК у різне розташування генома клітини рослини. Окремий об'єкт вибирають на підставі експресії трансгена або інших потрібних характеристик. Таким чином, терміни "об'єкт Bt11", "Bt11" "Bt11об'єкт" є взаємозамінними. [0019] Термін "експресійна касета" в контексті цього винаходу означає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну направити експресію окремої нуклеотидної послідовності в належну клітинугосподаря, яка містить промотор, активно зв'язаний з досліджуваною нуклеотидною послідовністю, що активно зв'язана з сигналами термінації. Зазвичай вона також містить послідовності, необхідні для належної трансляції нуклеотидної послідовності. Експресійна касета також може містити послідовності, які не є необхідними в прямій експресії досліджуваної нуклеотидної послідовності, але які присутні через зручні сайти рестрикції для видалення касети з вектору експресії. Експресійна касета, яка містить досліджувану нуклеотидну послідовність, може бути гібридною, це означає, що як мінімум один з її компонентів є гетерологічним по відношенню до як мінімум одного з її інших компонентів. Експресійна касета також може бути екпресійною касетою, яка, хоч і зустрічається в природі, була отримана в рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії. Однак у більшості випадків експресійна касета гетерологічна відносно господаря, тобто певна послідовність нуклеїнової кислоти експресійної касети не зустрічається у клітині-господарі у природі, і її необхідно ввести в клітину-господаря або предка клітини-господаря за допомогою процесу трансформації, що застосовується в даній галузі науки. Експресія нуклеотидної послідовності в експресійній касеті може знаходитися під контролем конститутивного промотора або індукованого промотора, який починає транскрипцію тільки після того, як клітина-господар піддається дії певного зовнішнього подразника. У випадку багатоклітинного організму, такого як рослина, промотор також може бути специфічним для певної тканини, органу або стадії розвитку. Експресійна касета або її фермент після їх трансформації в рослину можуть також називатися "вставлена послідовність" або "вставна послідовність". [0020] "Ген" - певна ділянка, розташована в межах генома, яка окрім кодуючої послідовності може містити інші, у першу чергу регуляторні послідовності нуклеїнових кислот, відповідальні за контроль експресії, а саме за транскрипцію та трансляцію кодуючої частини. Ген також може містити інші нетрансльовані 5'- і 3'-послідовності та термінуючі кодони. Іншими можливими компонентами є, наприклад, інтрони. [0021] "Гетерологічна" послідовність нуклеїнових кислот - це послідовність нуклеїнових кислот, яка не пов'язана природнім чином із приймаючою її клітиною-господарем, включаючи численні копії, які не зустрічаються в природі, наявної в природі послідовності нуклеїнових кислот. [0022] "Межа виявлення (LOD)» — мінімальна кількість або концентрація ДНК у зразку, які можуть бути достовірно виявлені, але не завжди виражені в кількісній формі. Показник LOD щодо методу, який пропонується цим винаходом, складає менше 1/20 цільової концентрації. В умовах експерименту за допомогою методу, що є предметом цього винаходу, наявність ДНК Bt11 щонайменше у 95 % випадків при LOD, що забезпечує ≤ 5 % хибно-негативних результатів. [0023] "Межа кількісного визначення (LOQ)» — мінімальна кількість або концентрація ДНК Bt11 у зразку, які можуть бути надійно кількісно визначені з прийнятним рівнем достовірності й точності. Показник LOQ для методу, що є предметом цього винаходу, складе менше 1/10 значення цільової концентрації з RSDr ≤ 25 %. Цільова концентрація використовується в якості порогу, продиктованого нормативними вимогами. [0024] Під "здійснимістю" слід розуміти простоту використання, застосовність і ефективність втілення та/або супутні питомі витрати (наприклад, вартість зразка у доларах) описаного в цьому документі методу. 3 UA 105044 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0025] Термін "праймери" в контексті цього винаходу означає ізольовані нуклеїнові кислоти, які приєднані до комплементарної нитки цільової ДНК шляхом гібридизації нуклеїнової кислоти для утворення гібриду праймера та нитки цільової ДНК, і потім простягнуті вздовж нитки цільової ДНК з допомогою полімерази, такої як ДНК-полімераза. Для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти можуть використовуватися пари або набори праймерів, наприклад за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших традиційних методів ампліфікації нуклеїнових кислот. [0026] "Зонд" - це ізольована нуклеїнова кислота, до якої прикріплений звичайний маркер, що піддається виявленню, або репортерна група, така як хемілюмінесцентний агент, радіоактивний ізотоп, ліганд або фермент. Такий зонд є компліментарним до нитки ДНК кукурудзи лінії Bt11 або традиційної лінії кукурудзи. ДНК Bt11 може також походити з рослини кукурудзи Bt11 або її зразка, який включає ДНК з Bt11. Згідно з цим винаходом зонди містять не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, а і поліаміди, а також інші матеріали, використовувані в якості зондів, які, зокрема, прикріплюються до цільової послідовності ДНК і можуть використовуватися для виявлення наявності цієї цільової послідовності ДНК. [0027] Довжина праймерів і зондів зазвичай складає не менше 10-15 нуклеотидів. Довжина праймерів і зондів може також складати не менше 20 нуклеотидів, або не менше 25 нуклеотидів, або не менше 30 нуклеотидів. Такі праймери та зонди зокрема схрещуються з цільовою послідовністю у високоточних умовах схрещування. Згідно з цим винаходом праймери та зонди можуть повністю доповнювати цільову послідовність, хоча відмінні від цільової послідовності зонди, які зберігають здатність до схрещування з цільовими послідовностями, можуть бути розроблені за допомогою традиційних методів. [0028] У контексті цього винаходу термін "стандартне відхилення повторюваності (RSDr)» означає стандартне відхилення результатів досліджень, отриманих в умовах повторюваності. "Умови повторюваності" — це умови, за яких результати випробувань отримують одним і тим самим методом, в одній і тій самій лабораторії й одним і тим самим оператором, з використанням одного й того самого обладнання протягом коротких проміжків часу. [0029] У цьому документі термін "стандартне відхилення відтворюваності (RSDR)» означає стандартне відхилення результатів випробування, отримане в умовах відтворюваності. Умови відтворюваності — це умови, за яких результати випробування отримують одним і тим самим методом, на ідентичних об'єктах випробувань у різних лабораторіях, різними операторами, з використанням різного обладнання. Стандартне відхилення відтворюваності вказує на відхилення між лабораторіями. [0030] "Стійкість" методу — це міра його здатності не зазнавати впливу незначних, але умисних відхилень від експериментальних умов, описаних у цій процедурі. [0031] "Селективність" методу — це здатність методу реагувати виключно на характеристику або аналіт, які вивчаються. Наприклад, селективність методу ПЛР, описаного в прикладі 1, в якому використовуються праймери, розкриті в SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2, забезпечує виявлення винятково Bt11 ДНК. [0032] "Достовірність" методу — це близькість його узгодження між середнім значенням, отриманим із великої серії результатів випробувань, та прийнятим еталонним значенням. Міра точності зазвичай виражається в процентах відхилення. Достовірність методу, що пропонується цим винаходом, складає у всьому динамічному діапазоні ±5 %. [0033] У контексті цього винаходу термін "унікальний" стосовно Bt11 означає явно характерну для об'єкта Bt11 або розпізнавальну ознаку об'єкта Bt11. Таким чином, унікальні для об'єкта Bt11 нуклеїнові кислоти не містяться в інших рослинах кукурудзи, які не належать до лінії Bt11. [0034] Цей винахід пропонує композиції та вдосконалені методи для кількісного виявлення специфічної для Bt11 ДНК у біологічних зразках, що мають відношення до ендогенного гена кукурудзи adh1. Таке кількісне визначення ДНК Bt11, наприклад у суміші зерен кукурудзи, що включає зерно лінії Bt11 та зерно, відмінне від Bt11, засновано на використанні пари праймерів та зонду, призначених для виявлення послідовності 5'-з'єднання у Bt11. [0035] Один варіант здійснення цього винаходу пропонує метод для визначення кількості ДНК об'єкта Bt11 у біологічному зразку, що містить нуклеїнові кислоти кукурудзи, у цьому варіанті здійснення метод включає (a) вступ біологічного зразка в контакт із першою парою праймерів, що містить перший праймер, який складається з SEQ ID NO: 1, і другий праймер, який складається з SEQ ID NO: 2, і зондом, маркованим флуоресцентним барвником, який містить SEQ ID NO: 3, в якому перша пара праймерів при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнових кислот із геномною ДНК кукурудзи лінії Bt11, утворює перший амплікон, що містить SEQ ID NO: 4, і в якому перший амплікон вказує на наявність об'єкта Bt11; (b) вступ біологічного 4 UA 105044 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зразка в контакт із другою парою праймерів, що містить перший праймер, який складається з SEQ ID NO: 5, і другий праймер, який складається з SEQ ID NO: 6, і з другим зондом, маркованим флуоресцентним барвником, який містить SEQ ID NO: 7, в якому друга пара праймерів при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнових кислот із геномною ДНК кукурудзи утворює другий амплікон, що містить SEQ ID NO: 8, і в якому другий амплікон вказує на наявність гена кукурудзи adh1; (c) забезпечення умов для реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти та інструменту ПЛР, здатного провести кількісну ПЛР у реальному часі; (d) проведення кількісної ПЛР у реальному часі з використанням праймерів і зондів (a) та (b), утворюючи таким чином перший і другий амплікони; (e) одночасне виявлення першого та другого ампліконів при їх утворенні за допомогою цього інструмента ПЛР та (f) підрахунок відносної кількості першого амплікону порівняно з кількістю другого амплікону, за якого кількість першого амплікону вказує на кількість ДНК Bt11 у біологічному зразку. [0036] В одному варіанті здійснення цього винаходу межа кількісного визначення (LOQ) методу не перевищує 0,08 % концентрації ДНК Bt11. [0037] В іншому варіанті здійснення цього винаходу межа виявлення (LOD) методу не перевищує 0,04 % концентрації ДНК Bt11. [0038] У ще одному варіанті здійснення цього винаходу середній коефіцієнт лінійності (R2) методу становить не менше 0,99. [0039] У ще іншому варіанті здійснення цього винаходу відносне стандартне відхилення відтворюваності методу (RSDR) не перевищує 24 % за концентрації ДНК Bt11 0,090 %. [0040] У ще іншому варіанті здійснення цього винаходу відносне стандартне відхилення повторюваності методу (RSDr) не перевищує 17 % за концентрації ДНК Bt11 0,090 %. [0041] У ще іншому варіанті здійснення цього винаходу достовірність методу у всьому динамічному діапазоні не перевищує ±5 %. [0042] В іншому варіанті здійснення цей винахід пропонує пару праймерів, що містять перший праймер, який складається з SEQ ID NO: 1, і другий праймер, який складається з SEQ ID NO: 2, які діють сумісно в ПЛР за присутності матриці ДНК кукурудзи лінії Bt11 у біологічному зразку для отримання амплікону, який вказує на наявність кукурудзи лінії Bt11. [0043] В одному варіанті здійснення цього варіанту винаходу амплікон містить SEQ ID NO: 4. [0044] У ще іншому варіанті здійснення цей винахід пропонує маркований флуоресцентним барвником зонд, який містить SEQ ID NO: 3. [0045] Описані нижче приклади призначені винятково для ілюстрації одного або більше варіантів здійснення цього винаходу, яким надається перевага, і не повинні тлумачитися як такі, що обмежують область застосування цього винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1. Розробка методу кількісної ПЛР Bt11 у реальному часі (RT-qPCR) [0046] У цьому прикладі описано вдосконалений специфічний для Bt11 метод кількісної ПЛР у реальному часі (RT-qPCR) для визначення відносної кількості ДНК Bt11 до загальної кількості ДНК кукурудзи в біологічному зразку. [0047] Аналіз TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) є технічним прийомом виявлення за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі, при цьому накопичення продукту ПЛР відстежується безпосередньо в процесі реакції ПЛР. Розщеплення молекул зонда, призначених для заданої мети, внаслідок діяльності екзонуклеази від 5' до 3' полімерази ДНК Taq протягом кожного циклу ампліфікації призводить до накопичення флуоресценції. Зростання рівнів флуоресценції безпосередньо пов'язане з накопиченням продукту ПЛР і виявляється протягом кожного циклу ампліфікації за допомогою використання спеціалізованої установки ПЛР, включаючи ABI PRISM™ 770 або ABI PRISM™ 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). [0048] Порогові значення циклу (Ct) автоматично задаються інструментом ПЛР для кожного зразка відповідно до циклу, за якого флуоресценція перевищує певний фоновий рівень. Зразки з вищими рівнями матриці на початку реакції ампліфікуються до рівнів виявлення швидше й виробляють нижчі значення Ct. Для визначення кількості ДНК об'єкта Bt11 у дослідному зразку для розрахунку формули ∆Ct еталонної кривої за допомогою лінійної регресії використовуються нормалізовані значення ∆Ct калібровочних зразків. Потім вимірюються нормалізовані значення ∆Ct невідомих зразків і за допомогою розрахованої формули регресії підраховується відносна кількість ДНК об'єкта Bt11 в невідомому зразку. Описаний тут аналіз TaqMan® може використовуватися для точного кількісного визначення рівня ДНК Bt11, пов'язаного з ендогенним калібровочним геном кукурудзи. Оскільки ендогенна калібровочна послідовність залишається незмінною відносно загальної кількості геномної ДНК кукурудзи, будь-яке відхилення у рівні ДНК, специфічної для Bt11, по відношенню до ендогенного гена вказує на відмінність у кількості копій. 5 UA 105044 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1.1. Система ПЛР, специфічна для кукурудзи лінії Bt11 [0049] Системи ПЛР, отримані з обох областей з'єднання між введеною та геномною ДНК об'єкта Bt11, були протестовані на основі інформації про послідовності вставки ДНК і її фланкування 5'- і 3'- граничних послідовностей. За допомогою програмного забезпечення для розробки дизайну олігонуклеотидів (Primer Express™ V2.0) були створені три зонди та шість ампліфікаційних праймерів для 5'-кінця, а також один зонд і три ампліфікаційних праймери для 3'-кінця. Потім експериментальним способом були випробувані всі можливі комбінації цих праймерів і зондів. [0050] Порівняння значень Ct, значень ΔRn, форм графіків ампліфікації й ефективності ПЛР привели до вибору для подальшої оптимізації комбінації одної пари праймерів/зонда. [0051] Оптимальна пара праймерів і зонд розташовані на з'єднанні 5' генома-вставки; вони дали кращі за праймери на 3'-з'єднанні результати. Прямий праймер розташований у геномній ДНК; місце зв'язування зворотного праймера розташовано в межах вставки об'єкта Bt11, тоді як зонд охоплює з'єднання вставки-5'-генома. Для конкретного виявлення ДНК об'єкта Bt11 фрагмент нуклеїнової кислоти з 68 пар основ, який перекриває гетерологічну вставну ДНК і геномну ДНК кукурудзи, фланкуючу 5'-кінець вставки, ампліфікується з допомогою наступних праймерів: Bt11-ev-f1: 5'- TGTGTGGCCATTTATCATCGA-3" (SEQ ID NO: 1) Bt11-ev-r5: 5'-CGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3' (SEQ ID NO: 2). [0052] Продукти ПЛР вимірюються при кожному циклі (у реальному часі) за допомогою такого специфічного для заданої мети олігонуклеотидного зонду: Bt11-ev-p1: 5'-TTCCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGT-3' (SEQ ID NO: 3), поміченого репортерним барвником, флуоресцеїном (FAM), на своєму 5'-кінці і барвником-гасителем, тетраметилродаміном (TAMRA) на своєму 3'-кінці. [0053] За допомогою цих праймерів у реакції з ДНК кукурудзи Bt11 в якості матриці утворюється амплікон, що містить SEQ ID NO: 4, який є унікальним для об'єкта Bt11 і вказує на його наявність. 1.2. Еталонна система ПЛР, специфічна для кукурудзи (Adh1) [0054] Для відносного кількісного визначення ДНК об'єкта Bt11 була використана попередньо існуюча специфічна для кукурудзи еталонна система ПЛР (Hernandez et al., 2004. J. Agric. Food Chem. 52:4632-4637), яка ампліфікує фрагмент з 135 пар основ ендогенного гена алкогольдегідрогенази 1 (adh1) (Genbank accession no. AY691949) в якості еталонної системи для конкретного виявлення послідовностей Zea mays. У цій еталонній системі використовуються наступні праймери: Zmadh1-F: 5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCT-3' (SEQ ID NO: 5) Zmadh1-R: 5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3' (SEQ ID NO: 6) [0055] Продукти ПЛР вимірюються при кожному циклі (у реальному часі) за допомогою такого специфічного для заданої мети олігонуклеотидного зонду: Zmadh1-P: 5'-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-3' (SEQ ID NO: 7), поміченого барвником VIC™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) на 5'-кінці та TAMRA на 3'-кінці. [0056] За допомогою цих праймерів у реакції з ДНК кукурудзи в якості матриці утворюється амплікон, що містить SEQ ID NO: 8, який вказує на наявність кукурудзи adh1. 1.1 Розрахунок калібровочної кривої [0057] Калібровочна крива складається з п'яти зразків із фіксованим процентним вмістом ДНК Bt11 у загальній кількості 250 нг ДНК кукурудзи. Концентрація ДНК Bt11 у стандартних зразках коливалася від 10 % до 0,08 %. Калібровочну криву отримували шляхом нанесення значень ∆Ct калібровочних зразків залежно від логарифму відповідної концентрації Bt11 %; кут нахилу (a) та проміжок між двома точками (b) калібровочної кривої (y=ax+b) потім використовували для розрахунку середнього процентного вмісту Bt11 контрольних зразків на основі їх нормалізованих значень ∆Ct. [0058] В ході реакції TaqMan™ програмне забезпечення, використовуване разом із пристроєм ABI PRISM™ 7900 HT, виявляє накопичення продукту ПЛР шляхом накопичення флуоресценції. Будується залежність нормалізованої флуоресценції, що відноситься до встановлених початкових рівнів (∆Rn), від номеру циклу. Значення Ct отримують шляхом нанесення довільного порогу через реакції, так щоб лінія проходила через логарифмічну фазу кожної реакції. Програмне забезпечення системи виявлення послідовності за допомогою пристрою ABI PRISM™ 7900 HT надає номер циклу, при якому накопичення флуоресценції (продукту ПЛР) певної реакції виходить за межі порогового значення (Ct). Значення FAM Ct (Bt11) порівнюється зі значенням VIC Ct (adh1) для нормалізації значення FAM Ct кожної реакції до рівня загальної кількості наявних нуклеїнових кислот для отримання ∆Ct[∆Ct=Ct(FAM) – 6 UA 105044 C2 5 10 15 Ct(VIC)]. Завдяки такому розрахунку усуваються будь-які відхилення, викликані нерівноцінними матрицями на вході реакції. Оскільки кількість копій ендогенного гена кукурудзи на один геном залишається незмінною, зміна значення ∆Ct відповідає зміні кількості (або копії) ДНК Bt11. Шляхом порівняння значення ∆Ct невідомих зразків зі значеннями ∆Ct відомої контрольної групи отримують ∆∆Ct [∆∆Ct = ∆Ct(невідомий) – ∆Ct (відомий)]. Потім кількість копій можна розрахувати за допомогою значення ΔΔCt, застосовуючи рівняння: Кількість копій = 2(ΔΔCt). 1.2 Порядок проведення ПЛР у реальному часі [0059] ПЛР проводять у 96-лункових плашках. Процедура являє собою нерезервовану систему, у якій одночасно у окремих лунках проводять ендогенний аналіз калібровочної кукурудзи adh1 і аналіз цільового Bt11. У двох реакційних пробірках, одній для системи Bt11 та одній для системи adh1, на льоду додають компоненти (за винятком ДНК), представлені в таблицях 1 і 2, у перерахованому порядку для приготування майстер-міксів. Мікс 2X Sigma Jumpstart Ready Mix доповнюють 550 мкл 1 моля MgCl2 та 20 мкл 10000x сульфородаміну 101. Потім обережно змішують і швидко центрифугують. Готують ще дві реакційні пробірки, одну для Bt11 і одну для майстер-міксів adh1, для зразків ДНК зі стандартною кривою, невідомих зразків ДНК і контрольних зразків ДНК. У кожну реакційну пробірку додають належну кількість майстерміксу (наприклад, 20 × 3=60 мкл майстер-міксів для трьох повторів ПЛР-реакцій). У кожну реакційну пробірку додають належну кількість ДНК, вказану в таблицях 1 і 2 (наприклад, 5 × 3=15 мкл ДНК для трьох повторів ПЛР-реакцій). 20 Таблиця 1 Суміш для реакції ампліфікації в кінцевому об'ємі/концентрації на одну реакційну лунку для еталонної системи кукурудзи adh1 Компонент Sigma Jumpstart ReadyMix (2x) Праймер Zm adhl-F (10 мкмоль) Праймер Zm adhl-R (10 мкмоль) Зонд Zm adhl-P (10 мкмоль) Вода без нуклеази Матрична ДНК (не більше 250 нг) Кінцева концентрація 1x 300 нмоль 300 нмоль 200 нмоль # # мкл на реакцію 12,5 0,75 0,75 0,50 5,50 5 Загальний об'єм реакційної суміші: 25 Таблиця 2 Суміш для реакції ампліфікації в кінцевому об'ємі/концентрації на одну реакційну лунку для системи, специфічної для Bt11 Компонент Sigma Jumpstart ReadyMix (2x) Праймер Bt11-ev-f1 (10 мкмоль) Праймер Bt11-ev-r5 (10 мкмоль) Зонд Bt11-ev-p1 (10 мкмоль) Вода без нуклеази Матрична ДНК (не більше 250 нг) Кінцева концентрація 1x 200 нмоль 200 нмоль 150 нмоль # # Загальний об'єм реакційної суміші: 25 мкл на реакцію 12,5 0,50 0,50 0,38 6,12 5 25 [0060] Кожну пробірку струшують протягом близько 10 секунд, щоб сприяти зниженню мінливості між повторами кожного зразка. Пробірки повільно обертають у мікрофузі. 25 мкл розфасовують аліквотами в кожну реакційну лунку для ПЛР. Плашку герметизують за допомогою оптичного ковпака або оптичних кришок. Плашку центрифугують при 250x g протягом близько 1 хвилини в діапазоні температур від 4 °C до температури, близької до кімнатної. Плашку встановлюють у пристрій для проведення ПЛР і проводять ПЛР в умовах циклу, описаних у таблиці 3. 30 7 UA 105044 C2 Таблиця 3 Циклова програма для систем кукурудзи Bt11/adh1 Етап 1 2 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Стадія Темп. (°C) UNG 50 °C Первинна денатурація 95 °C Денатурація 95 °C Відпал і вставний 60 °C матеріал Час (сек) 120 600 15 60 Збір даних Ні Ні Ні Так Цикли 1 1 40 1.3. Аналіз даних [0061] Після проведення вищеописаного протоколу ПЛР у реальному часі результати аналізуються за допомогою наступної процедури: [0062] Для встановлення порогового значення криві ампліфікації однієї системи (наприклад, Bt11) відображаються в логарифмічному режимі. Порогову лінію розташовують у зоні кривої, де профілі ампліфікації паралельні (експоненційна фаза ПЛР). У разі необхідності значення Ct актуалізуються. Перехід до лінійного режиму здійснюють, клацнувши на осі Y графіка ампліфікації, а потім перевіряють, щоб попередньо встановлений поріг знаходився в геометричній фазі кривих. [0063] Для встановлення початкового рівня визначають номер циклу, при якому порогова лінія перетинає першу криву ампліфікації, і початковий рівень встановлюють за три цикли до цього значення (наприклад, найбільш раннє значення Ct=25, перетин початкового рівня слід встановити при значенні Ct=25 – 3=22). [0064] Описану вище процедуру повторюють на графіках ампліфікації іншої системи (напр., системи adh1). [0065] Після встановлення порогового значення у межах логарифмічної фази ампліфікації згідно з вищенаведеним описом за допомогою програмного забезпечення пристрою розраховують значення Ct для кожної реакції. Еталонну криву Ct створюють шляхом нанесення значень Ct, виміряних для калібровочних точок, залежно від логарифму процентного вмісту Bt11 і шляхом включення в ці дані лінії лінійної регресії. Після цього для розрахунку відносної кількості ДНК Bt11 у невідомих зразках ДНК застосовують формулу регресії. [0066] Селективність аналізу Bt11 (прямі/зворотні праймери і зонд) було перевірено дослідним шляхом у реакції ПЛР у реальному часі залежно від ДНК, виділеної зі зразків, що містили відому в даній сфері трансгенну кукурудзу, у тому числі Bt11, Bt10, NK603, MON810, MON863, MON810 x MON863, TC1507, MIR604, Bt176, GA21, MON88017, T25 і Herculex® RW (DAS-59122-7). [0067] Результати демонструють, що жодна з протестованих вищезгаданих ліній трансгенної кукурудзи, окрім позитивного контролю Bt11, не утворювала ампілкони у повторних вибірках у випадку застосування для однієї реакції всього 100 нг ДНК. Приклад 2. Підтвердження наявності Bt11 методом кількісної ПЛР у реальному часі (RTqPCR) [0068] Описаний у прикладі 1 метод оптимізовано з метою кількісного визначення ДНК Bt11 у біологічних зразках, які складаються з суміші насіння Bt11 та традиційної кукурудзи. Цей метод використовує унікальну послідовність ДНК на ділянці між вставкою і геномом рослини. Ця послідовність специфічна для кукурудзи лінії Bt11 і, таким чином, забезпечує селективність цього методу стосовно об'єкта. 2.1. Точність/достовірність/динамічний діапазон/LOQ/LOD [0069] Для визначення точності, достовірності, динамічного діапазону, LOQ та LOD було реалізовано експериментальний проект, що складається з восьми незалежних серій. [0070] Були створені калібровочні зразки (від Std1 до Std6) шляхом приготування розчинів 50 нг/мкл (250 нг на реакцію) загальної кількості геномної ДНК зі вмістом 100 %; 10 %; 5 %; 1 %; 0,5 % та 0,1 % ДНК об'єкта Bt11 у фоні ДНК нетрансгенної кукурудзи. Схема розведення стандарту Bt11 і відповідний загальний вміст геномної ДНК у ПЦР-реакції показані в таблиці 4. 8 UA 105044 C2 Таблиця 4 Схема розведення калібровочних зразків Кількість у кожному стандарті (нг) Код зразка Std1 Std2 Std3 Std4 Загальний вміст ДНК у ПЛР 250 250 250 250 Загальний вміст ДНК Bt11 у 250 25 12,5 2,5 ПЛР 5 10 15 Std5 250 Std6 250 1,25 0,25 [0071] Калібровочну криву отримували шляхом нанесення середніх значень ∆Ct калібровочних зразків залежно від логарифму відповідного відсоткового вмісту Bt11; кут нахилу (a) та проміжок між двома точками (b) калібровочної кривої (y=ax+b) потім використовували для розрахунку середнього процентного вмісту Bt11 контрольних зразків на основі їх нормалізованих значень ∆Ct. [0072] Для підтвердження чистоти реагентів використовували три негативні контролі (NTC) на одну систему. Кожен еталонний зразок (що містив різні пропорції ДНК об'єкта Bt11 у фоні ДНК нетрансгенної кукурудзи) аналізували за допомогою 250 нг геномної ДНК на кожну реакцію в трьох ідентичних копіях. [0073] Аналіз даних проводили з використанням установки початкового рівня 3-19 для системи Adh1 і 3-21 для системи виявлення, специфічної для об'єкта Bt11. Порогові значення склали: 0,4 (Adh1) і 0,7 (Bt11) на системі виявлення ABI 7900 HT. [0074] Для кожного з 5 зразків (які містять від 5,0 % до 0,08 % ДНК об'єкта Bt11 у ДНК нетрансгенної кукурудзи) з метою визначення достовірності та повторюваності розрахували середнє значення (MEAN), відносне відхилення від очікуваного значення (BIAS), а також стандартне відхилення (STDEV) і відносне стандартне відхилення (RSDr) результатів кількісного визначення. Результати представлено в таблиці 5. 20 Таблиця 5 Результати кількісного визначення 8 незалежних серій ПЛР в умовах повторюваності для об'єкта Bt11 25 30 35 Рівень Bt11 Mean Bias Stdev RSDr 5,0 % 5,4 % 8,0 % 0,32 % 5,9 % 2,0 % 1,9 % -5,0 % 0,18 % 9,5 % 0,90 % 0,90 % 0,0 % 0,070 % 7,8 % 0,50 % 0,53 % 6,0 % 0,076 % 14,3 % a 0,080 % 0,068 % -15,0 % 0,0111 % 16,3 % b 0,040 % Усі позитивні a Межа кількісного визначення (LOQ) b Межа виявлення (LOD) [0075] Відносне відхилення середнього значення від очікуваного (істинного) значення коливалося від –13,8 % до 0 % у всьому динамічному діапазоні. [0076] Значення точності (стандартне відхилення повторюваності RSDr) для всіх зразків із концентрацією Bt11 у межах від 5,0 % до 0,08 % коливалися від 5,9 % до 16,3 % відносного стандартного відхилення. [0077] Було визначено, що відносна межа виявлення (LOD) цього методу склала не більше 0,04 % у 250 нг загальної кількості ДНК кукурудзи. [0078] Відносна межа кількісного визначення (LOQ) цього методу склала не більше 0,08 % у 250 нг загальної кількості ДНК кукурудзи. 2 2.2. Ефективність ампліфікації та коефіцієнт R [0079] Для оцінки ефективності ампліфікації (E) та коефіцієнту R2 специфічної для об'єкта Bt11 (одиничної) системи ПЛР було проведено лінійно-регресійний аналіз значень Ct Bt11 залежно від логарифму[% вміст Bt11]. Було оцінено лінії регресії стандартів 8 незалежних серій (див. пункт 2.1 вище) і було визначено параметри регресії, включаючи кут нахилу, відрізок між двома точками та коефіцієнт R2. Ефективність ампліфікації було розраховано за допомогою наступного рівняння: E = [10(-1/нахил)] – 1. Результати представлено в таблиці 6. 9 UA 105044 C2 Таблиця 6 Параметри регресії й ефективність ПЛР ліній регресії, специфічних для об'єкта Bt11 Кут нахилу Серія 1 Серія 2 Серія 3 Серія 4 Серія 5 Серія 6 Серія 7 Серія 8 MEAN 5 -3,48 -3,61 -3,48 -3,53 -3,51 -3,40 -3,57 -3,55 -3,52 Проміжок між двома точками 31,7 31,9 31,7 31,8 31,7 31,5 31,6 31,5 31,7 R 2 1.000 0.999 0.999 0.999 0.999 1.000 0.999 1.000 0.999 E 0.94 0.89 0.94 0.92 0.93 0.97 0.90 0.91 0.93 [0080] Для оцінки ефективності ампліфікації E та коефіцієнту R2, заснованого на значенні ∆Ct методу виявлення об'єкта Bt11 було проведено лінійно-регресійний аналіз значень ΔCt залежно від логарифму[% вміст Bt11]. Було оцінено лінії регресії стандартів 8 незалежних серій (див. пункт 4.3) і було визначено параметри регресії, включаючи кут нахилу, відрізок між двома точками та коефіцієнт R2. Ефективність ампліфікації було розраховано за допомогою наступного рівняння: E = [10(-1/нахил)] -1. Результати представлено в таблиці 7. Таблиця 7 Параметри регресії й ефективність ПЛР калібровочних кривих, заснованих на значеннях ∆Ct калібровочних зразків Кут нахилу Серія 1 Серія 2 Серія 3 Серія 4 Серія 5 Серія 6 Серія 7 Серія 8 MEAN 10 15 -3,43 -3,55 -3,42 -3,45 -3,46 -3,34 -3,50 -3,50 -3,46 Проміжок між двома точками 9,2 9,3 9,2 9,2 9,5 9,4 9,5 9,4 9,3 R 2 1.000 0.999 0.999 0.999 0.999 0.998 1.000 0.999 0.999 E 0.96 0.91 0.96 0.95 0.95 0.99 0.93 0.93 0.95 [0081] Для оцінки стійкості методу проводили ПЛР-реакції при різних концентраціях майстерміксу і температурах відпалу. [0082] Для визначення стабільності обох систем виявлення стосовно змін концентрації основних компонентів реакції проводили експеримент при +20 % та при –20 % концентрації майстер-міксу. Три зразки (що містили 0,080 %, 0,90 % та 5,0 % ДНК об'єкта Bt11 у ДНК нетрансгенної кукурудзи) аналізували за допомогою 250 нг геномної ДНК на кожну реакцію. Середні значення триплікатів представлено в таблиці 8. 10 UA 105044 C2 Таблиця 8 Результати кількісного аналізу +/-20 % майстер-міксу Очікуване (істинне) значення (%Bt11) 0,080 % 0,90 % 5,0 % Майстер-мікс +20 % Результати кількісного аналізу Відносне відхилення від результату 0,056 % 0,74 % 4,7 % -30,0 % істинного -17,8 % -6,0 % 0,74 % 5,3 % -17,8 % 6,0 % Майстер-мікс -20 % a Результати кількісного аналізу 0,060 % Відносне відхилення від істинного -25,0 % результату a Виключено одне значення, що різко відхилялося 5 [0083] Для оцінки впливу зміни температури відпалювання було проаналізовано три зразки (які містили 0,080 %, 0,90 % і 5,0 % ДНК об'єкта Bt11 у фоні ДНК не модифікованої генетично кукурудзи) з вмістом 250 нг геномної ДНК на кожну реакцію з температурами відпалу 58 °C і 62 °C на системі виявлення послідовності ABI 7900 HT. Результати представлено в таблиці 9. Таблиця 9 Результати кількісного аналізу з використанням різних температур відпалу Результат кількісного аналізу 1 Відносне відхилення від результату Результат кількісного аналізу 2 Відносне відхилення від результату Результат кількісного аналізу 1 Відносне відхилення від результату Результат кількісного аналізу 2 Відносне відхилення від результату 10 Очікуване (істинне) значення (%Bt11) 0,080 % 0,90 % 5,0 % 58 °C 0,057 % 1,09 % 5,9 % істинного -28,8 % 21,0 % 18,0 % 0,060 % 0,90 % 5,5 % -25 % 0,0 % 10,0 % 62 °C 0,071 % 0,89 % 5,2 % -11,3 % -1,1 % 4,0 % 0,056 % 0,93 % 5,6 % -30,0 % 3,3 % 12,0 % істинного істинного істинного [0084] Для оцінки впливу різних платформ ПЛР у реальному часі було проаналізовано три зразки (які містили 0,080 %, 0,90 % і 5,0 % ДНК об'єкта Bt11 у фоні ДНК не модифікованої генетично кукурудзи) з вмістом 250 нг геномної ДНК на кожну реакцію, кожен зразок на системі виявлення ABI PRISM® 7700, 7500 fast (використовувана не у швидкому режимі) та Stratagene Mx 3005P. Два результати кількісного аналізу, отримані для кожного зразка, показані в таблиці 10. 15 11 UA 105044 C2 Таблиця 10 Результати кількісного аналізу з використанням різних платформ Очікуване (істинне) значення (%Bt11) 0,080 % 0,90 % 5,0 % ABI 7500 fast Результат кількісного аналізу 1 Відносне відхилення від істинного результату Результат кількісного аналізу 2 Відносне відхилення від істинного результату 0,077 % 5 -8,9 % 14,0 % 0,072 % 0,85 % 5,6 % -10,0 % -5,6 % 12,0 % 0,082 % 0,85 % 5,9 % 2,5 % -5,5 % 18,0 % 0,058 % 0,92 % 4,8 % -27,5 % 2,2 % -4,0 % 0,057 % 1,09 % 4,7 % -28,8 % 21,1 % -6,0 % 0,083 % 0,81 % 4,0 % 3,8 % Stratagene Mx 3005P Результат кількісного аналізу 1 Відносне відхилення від істинного результату Результат кількісного аналізу 2 Відносне відхилення від істинного результату 5,7 % -3,75 % ABI PRISM® 770 Результат кількісного аналізу 1 Відносне відхилення від істинного результату Результат кількісного аналізу 2 Відносне відхилення від істинного результату 0,82 % -10,0 % -20,0 % [0085] Для оцінки результатів випробування в умовах відтворюваності було проведено дві серії з кількісного визначення у двох різних лабораторіях, Lab 1 і Lab 2. Були проаналізовані різні зразки, що містили 0,08–5,0 % концентрації ДНК Bt11 (кожен у трьох ідентичних копіях), зі вмістом 250 нг геномної ДНК на кожну реакцію на різних системах виявлення послідовностей. У таблиці 11 представлені два результати кількісного аналізу для кожної концентрації ДНК Bt11 у кожній з лабораторій. Було підраховано, що стандартне відхилення відтворюваності (RSDR) складає близько 9,0 % при концентрації Bt11 0,08 %. 10 Таблиця 11 Результати кількісного аналізу в умовах відтворюваності (між лабораторіями). 0,080 % Результат кількісного аналізу 1 Відносне відхилення від істинного результату Результат кількісного аналізу 2 Відносне відхилення від істинного результату 0,50 % 0,90 % Lab 1 (ABI PRISM 7900 HT) 2,0 % 5,0 % 0,068 % 0,49 % 0,96 % 2,1 % 4,6 % -15,0 % -2,0 % 6,7 % 5,0 % -8,0 % 0,080 % 0,57 % 0,88 % 2,1 % 4,7 % 0% 14,0 % -2,2 % 5,0 % -6,0 % 12 UA 105044 C2 Продовження таблиці 11 Lab 2 (ABI PRISM 7700) Результат кількісного аналізу 1 Відносне відхилення від істинного результату Результат кількісного аналізу 2 Відносне відхилення від істинного результату 5 10 15 20 25 30 0,076 % 0,49 % 0,96 % 2,0 % 5,0 % -5,0 % -2,0 % 6,7 % 0% 0% 0,065 % 0,51 % 1,14 % 2,3 % 5,9 % -18,8 % 2,0 % 26,7 % 15,0 % 18,0 % [0086] Описаний тут метод кількісного аналізу було представлено Об'єднаному науковому центру Європейської комісії (JRC, Відділ біотехнології і ГМО Інституту здоров'я та захисту споживачів), а також Еталонній лабораторії Товариства з виявлення генетично-модифікованих харчових продуктів та кормів (CRL-GMFF). Центром JRC було організовано міжнародне спільне дослідження за участю 12 лабораторій. Кожна лабораторія провела тестування п'яти концентрацій ДНК Bt11, включаючи концентрації 0,09 %, 0,40 %, 0,90 %, 5,00 % та 8,00 %. Результати мультилабораторного валідаційного аналізу були оголошені у публікації CRL CRLVL10/07VR (2008), яка доступна на веб-сайті gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/. Середній коефіцієнт лінійності методу (R2) становить 0,99, значення RSDr – 17 % при концентрації Bt11 0,09 %, значення RSDR – 24 % при концентрації Bt11 0,09 %, а максимальне значення відхилення (точність) дорівнює -5 % при концентрації Bt11 5 %. Приклад 3. Оцінка попереднього методу [0087] Є опубліковані описи інших методик кількісного визначення об'єкта Bt11 (Ronning et al., 2003. Eur. Food Res. Technol. 216:347-354, а також публікація Еталонної лабораторії товариства (CRL) JRC Європейської комісії, 2004 р., розміщена на веб-сайті: gmocrl.jrc.it//summaries/Bt11-protocol.pdf, заснована на використанні методу, описаного у Ronning et al.). [0088] Для оцінки цього методу кількісного визначення незалежна лабораторія провела аналізи ПЛР на сумішах ДНК Bt11 і нетрансгенній ДНК згідно з описом у вищезгаданій публікації CRL. У цьому аналізі були використані праймери та зонди, призначені для зв'язування ділянки 3' генома-вставки. Результати численних експериментів дозволяють припустити, що ефективність ПЛР-реакцій Bt11 з використанням цього методу не є адекватною. Кути нахилу ліній регресії стандарту Bt11 дають підставу припустити відсутність ефективності ПЛР порівняно з лініями регресії стандарту adh1. У 5 з 6 експериментів, відповідність реакцій стандарту Bt11 була гіршою, ніж для реакцій стандарту adh1 при ідентичних розчинах ДНК, використовуваних для серій стандарту Bt11 та adh1. Окрім того результати дають підставу припустити, що попередній метод також має недоліки у плані точності, повторюваності та стійкості. [0089] Усі публікації та опубліковані документи, згадані у цьому описі винаходу, включені у цей документа за посиланням таким чином, ніби кожна окрема публікація або патентний документ були конкретно й окремо вказані як такі, що підлягають включенню у цей документ за посиланням. Перелік послідовностей 35 Syngenta Participations AG Hart, Hope 40 УДОСКОНАЛЕНИЙ МЕТОД ДЛЯ КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ ДНК 72563P1 8 45 PatentIn version 3.5 1 21 13 UA 105044 C2 ДНК Штучна послідовність 5 Bt11-ev-f1 передній Bt11 праймер 1 tgtgtggcca tttatcatcg a 21 10 2 21 ДНК Штучна послідовність 15 Bt11-ev-r5 Bt11 зворотній праймер 20 25 2 cgctcagtgg aacgaaaact c 21 3 29 ДНК Штучна послідовність Bt11-ev-p1 Bt11 зонд 30 3 ttccatgacc aaaatccctt aacgtgagt 35 40 29 4 68 ДНК Штучна послідовність Bt11 5` амплікон 4 tgtgtggcca tttatcatcg acttccatga ccaaaatccc ttaacgtgag ctttcgttcc 45 actgagcg 50 55 68 5 21 ДНК Штучна послідовність ZmAdh1-F передній праймер 5 cgtcgtttcc catctcttcc t 21 60 14 60 UA 105044 C2 6 20 ДНК Штучна послідовність 5 Zmadh1-R зворотній праймер 10 15 6 ccactccgag accctcagtc 20 7 27 ДНК Штучна послідовність ZmAdh1-P зонд 20 7 aatcagggct cattttctcg ctcctca 25 30 27 8 134 ДНК Штучна послідовність Adh1 амплікон 8 cgtcgtttcc catctcttcc tcctttagag ctaccactat ataaatcagg gctcattttc 60 35 tcgctcctca caggctcatc tcgctttgga tcgattggtt tcgtaagtgg tgagggactg agggtctgga gtgg 40 45 50 55 120 134 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб визначення кількості ДНК об'єкта Bt11 у біологічному зразку, що містить нуклеїнові кислоти кукурудзи, спосіб включає: (a) вступ біологічного зразка в контакт із першою парою праймерів, що містить перший праймер, який складається з SEQ ID NO:1, і другий праймер, який складається з SEQ ID NO:2, і зондом, маркованим флуоресцентним барвником, який містить SEQ ID NO:3, у якому перша пара праймерів при застосуванні у реакції ампліфікації нуклеїнових кислот з геномною ДНК кукурудзи лінії Bt11, створює перший амплікон, що містить SEQ ID NO:4, і в якому згаданий перший амплікон вказує на наявність об'єкта Bt11; (b) вступ згаданого біологічного зразка в контакт із другою парою праймерів, що містить перший праймер, який складається з SEQ ID NO:5, і другий праймер, який складається з SEQ ID NO:6, і з другим зондом, маркованим флуоресцентним барвником, який містить SEQ ID NO:7, у якому згадана друга пара праймерів при застосуванні у реакції ампліфікації нуклеїнових кислот з геномною ДНК кукурудзи створює другий амплікон, що містить SEQ ID NO:8, і у якому згаданий другий амплікон вказує на наявність кукурудзи adh1; (c) забезпечення умов для реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти та інструмента ПЛР, здатного провести кількісну ПЛР у реальному часі; (d) проведення кількісної ПЛР у часі з використанням праймерів і зондів (а) та (b), утворюючи таким чином згадані перший і другий амплікони; 15 UA 105044 C2 5 10 15 20 (е) одночасне виявлення згаданих першого та другого ампліконів при їх утворенні за допомогою цього інструмента ПЛР; а також (f) підрахунок відносної кількості згаданого першого амплікону порівняно з кількістю згаданого другого амплікону, за якого кількість першого амплікону вказує на кількість ДНК Bt11 у згаданому біологічному зразку. 2. Спосіб за п. 1, в якому межа кількісного визначення (LOQ) згаданого способу не перевищує 0,08 % концентрації ДНК Bt11. 3. Спосіб за п. 1, в якому межа виявлення (LOD) згаданого способу не перевищує 0,04 % концентрації ДНК Bt11. 2 4. Спосіб за п. 1, в якому середній коефіцієнт лінійності (R ) згаданого способу становить не менше 0,99. 5. Спосіб за п. 1, в якому відносне стандартне відхилення відтворюваності згаданого способу (RSDR) не перевищує 24 % за концентрації ДНК Bt11 0,090 %. 6. Спосіб за п. 1, в якому відносне стандартне відхилення повторюваності згаданого способу (RSDr) не перевищує 17 % за концентрації ДНК Bt11 0,090 %. 7. Спосіб за п. 1, в якому значення достовірності способу у всьому динамічному діапазоні не перевищує ±5 %. 8. Пара праймерів, яка містить перший праймер, що складається з SEQ ID NO:1, і другий праймер, який складається з SEQ ID NO:2, які діють сумісно за присутності матриці ДНК кукурудзи лінії Bt11 у біологічному зразку для отримання амплікону, який вказує на наявність кукурудзи лінії Bt11. 9. Полінуклеотидний зонд, який складається з SEQ ID NO:3. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 16