Тест-система для визначення якісного та кількісного вмісту генетично модифікованих організмів (гмо) в харчових продуктах методом полімерної ланцюгової реакції в реальному часі (плр-рч)

Реферат: Тест-система для визначення якісного та кількісного вмісту генетично модифікованих організмів (ГМО) в харчових продуктах методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (ПЛРРЧ). UA 72083 U (12) UA 72083 U UA 72083 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, зокрема, до ДНК-технології та молекулярної діагностики. Діагностичні тест-системи для якісного та кількісного визначення ГМО складаються з шести виконань. До кожного виконання належать декілька тест-систем, призначених для визначення наявності ділянок рекомбінантної ДНК певних видів рослин. Виконання тест-систем умовно поділено на три серії: "ГМО скринінг", "ГМО кількість" та "ГМО ідентифікація". 1. Три тест-системи для якісного визначення ГМ сої, кукурудзи та ріпаку: "ГМО соя (35s/Nos скрінінг)", "ГМО кукурудза (35s/Nos скрінінг)", "ГМО ріпак (СР4 epsps/Pat/Bar/Nos скринінг)". 2. П'ять тест-систем для кількісного визначення ГМ сої та кукурудзи: "ГМО соя (35S кількість)", "ГМО кукурудза (35S кількість)", "ГМО кукурудза (Nos кількість)", "Соя лінія GTS40-3-2 (ГМ кількість)", "Кукурудза лінія MON810 (ГМ кількість)". 3. П'ять тест-систем для ідентифікації ліній ГМ сої (GTS40-3-2, А2704-12, А5547-127, MON89788, DP356043). 4. Сімнадцять тест-систем для ідентифікації ліній ГМ кукурудзи (MON87460, MON88017, MON89034, DAS-59122-7, 3272, MIR 162, LY038, 98140, Bt176, Bt11, Ga21, Mon810, Mon863, Nk603, T25, Тс1507, Міr604). 5. Сім тест-систем для ідентифікації ліній ГМ ріпаку (MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, RT73, Т45, HCN28, HCN92). 6. Вісім тест-систем для ідентифікації інших видів ГМ рослин: "Цукровий буряк Н7-1 (ГМ ідентифікація)", "Картопля лінія АМ04-1020 (ГМ ідентифікація)", "Картопля лінія ЕН92-527-1 (ГМ ідентифікація)", "Рис лінія LLRICE62 (ГМ ідентифікація)", "Вірус CaMV/бактерія Agrobacterium tumefaciens (ідентифікація)", "Соя/томати/картопля (ідентифікація)", "Кукурудза/рис/пшениця (ідентифікація)", "Ріпак/цукровий буряк (ідентифікація)". Кожна тест-система комплектується набором для виділення ДНК (лізуючий буфер, буфер для преципітації, буфер для осаджування, буфер для елюції, хлороформ і гексан) та набором для проведення ПЛР (ПЛР-РЧ суміш, Taq-полімераза, негативний контрольний зразок, позитивні контрольні зразки). Розроблений метод визначення ГМО в харчових продуктах та продовольчій сировині рослинного походження засновано на використанні полімеразної ланцюгової реакції з детекцією результатів у режимі реального часу. Метод ПЛР у реальному часі базується на детектуванні сигналу флуоресценції, що дозволяє спостерігати процес нагромадження продукту в процесі реакції. Сигнал флуоресценції наростає пропорційно збільшенню кількості продукту ампліфікації в досліджуваному зразку. Момент помітного збільшення сигналу та відрив його від базової лінії, так званий граничний цикл, залежить від вихідної кількості ДНК-мішені. Чим більше кількість ДНК у зразку, тим раніше спостерігається початок росту сигналу флуоресценції, тим менше граничний цикл [1]. Кількісне визначення ГМО рослинного походження засновано на розрахунку відношення кількості ДНК певної лінії ГМ рослини до загальної кількості ДНК аналізованої рослини, вираженого у відсотках. У кожній розробленій нами тест-системі для кількісного визначення ГМО одночасно проводяться дві незалежні реакції в одній пробірці. Одна реакція дозволяє виявити ДНК аналізованої рослини (соя або кукурудза). Інша реакція дозволяє виявити послідовність, специфічну для 35 S промотору. Протікання кожної реакції детектується за допомогою специфічного зонду. Для виявлення ДНК аналізованого об'єкта (соя, кукурудза) використовується зонд, мічений барвником R6G, а для виявлення 35S промотору - FAM. Визначення відсоткового вмісту ГМО відбувається з використанням сертифікованих стандартних зразків, які являють собою суміші борошна рослини дикого типу (0 % ГМО) та ГМ (100 % ГМО) у певному процентному співвідношенні [1, 2]. Різниця значень граничних циклів двох реакцій для сертифікованих стандартних зразків використовується для побудови калібрувальної прямої. За допомогою калібрувальної прямої розраховується відсотковий вміст ДНК ГМО в аналізованих зразках. Критерії вірогідності результатів. Результати аналізу зразків приймають, якщо коефіцієнт кореляції калібрувальної кривої, побудованої за сертифікованими стандартними зразками, за 2 методом найменших квадратів (R )>0,97. Метрологічні характеристики методу. Межі інтервалу, в якому похибка визначення знаходиться з довірчою ймовірністю Р=0,95, становлять від 0,1 до 5 %. Нижню й верхню межі похибки визначають доступними сертифікованими стандартними зразками, а стандартні відхилення повторюваності результатів (d) становлять від 0,067 (для стандарту 0,1 %) до 0,540 (для стандарту 5 %), що відповідає похибці сертифікованих контрольних зразків [1, 3]. На сьогоднішній день крім ПЛР-РЧ використовуються і інші методи діагностики ГМО, такі як імуноферментний аналіз, класична ПЛР і метод мікроматриць [4, 5]. Однак, у порівнянні із 1 UA 72083 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 запропонованим методом, вони характеризуються рядом недоліків. Так, до основних недоліків імуноферментного методу можна віднести низьку чутливість та відсутність можливості проведення аналізу продуктів, які пройшли термічну обробку. Метод класичної ПЛР характеризується великим відсотком хибнопозитивних результатів за рахунок контамінації на стадії електрофорезу, а метод мікроматриць - своєю дороговизною. Сьогодні на вітчизняному ринку діагностиками представлені тест-систем, на основі методу ПЛР-РЧ, винятково російського і європейського виробництва. Ці системи характеризуються дороговизною та відсутністю належного сервісного обслуговування, тому задачею корисної моделі було створення діагностичних наборів на основі оптимального для рішення поставлених завдань методу - ПЛР-РЧ, які дозволяють виявляти якомога більш повний спектр існуючих ГМО та характеризуються низькою собівартістю. Поставлена задача вирішується в тест-системі для визначення якісного та кількісного вмісту генетично модифікованих організмів (ГМО) в харчових продуктах методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (ПЛР-РЧ), яка містить набір реагентів для екстрагування ДНК, суміш для проведення полімеразної ланцюгової реакції, Taq-полімеразу, сертифіковані стандартні зразки ДНК трансгенних культур, згідно з корисною моделлю, містить оригінальну панель олігонуклеотидних праймерів та зондів до регуляторних послідовностей p35s і tNos, генів CP4epsps, Pat і Ваг, конструкт-специфічних послідовностей GTS40-3-2, А2704-12, А5547127, MON89788, DP356043, MON87460, MON88017, MON89034, DAS-59122-7, 3272, MIR 162, LY038, 98140, Btl76, Bt11, Ga21, Mon810, Mon863, Nk603, T25, Тс1507, Mir604, MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, RT73, Т45, HCN28, HCN92, Н7-1, АМ04-1020, ЕН92-527-1, LLRICE62, що дозволяє ідентифікувати більшість зареєстрованих ГМО та проводити мультиплексну реакцію, коли в одній реакційній суміші визначається від двох і більше мішеней. Поставлена задача була вирішена в такий спосіб. Тест-системи для якісного визначення ГМ рослин було розроблено таким чином, що в одній пробірці проходять три незалежні реакції. Одна реакція дозволяє виявити фрагмент ДНК 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV), що є присутнім у всіх відомих і вирощуваних у промислових масштабах ГМ рослинах. Інша реакція дозволяє виявити фрагмент ДНК NOS термінатора з Agrobacterium tumefaciens, що також є присутнім у багатьох промислово вирощуваних ГМ рослинах. Наявність позитивної динаміки для однієї або обох реакцій говорить про наявність у зразку ДНК ГМ рослини. Третя реакція - реакція внутрішнього позитивного контролю (ВПК), який дозволяє виключити хибнопозитивні результати. Для сої ВПК є фрагмент гена лектину (lес), кукурудзи - ген алкоголь дегідрогенази (adh). Протікання кожної з трьох реакцій детектується за допомогою специфічного зонда, міченого заданим флуоресцентним барвником. Для виявлення 35S промотору використовується зонд, мічений барвником FAM, для NOS термінатора - барвником ROX, а для ВПК - барвником R6G. Як мішені для визначення ГМ ріпаку було вибрано послідовності ДНК, притаманні більшості трансгенних рослин: термінатор NOS із Agrobacterium tumefaciens, гени фосфінотрицин Nацетилтрансферази із Streptomyces viridochromogenes (PAT) або Streptomyces hygroscopicus (BAR), 5-енолпірувілшикимат-3-фосфат синтази (СР4 epsps) із Agrobacterium tumefaciens CP4, ВПК для ріпаку виконував фрагмент гена круцеферіну (сru). Для виявлення термінатора NOS використовується зонд, мічений барвником ROX, фрагмента гена СР4-FAM, генів PAT/ BARR6G, а для ВПК барвник Су5. У кожній тест-системі для визначення ГМ лінії (ідентифікація) одночасно проводяться дві незалежні реакції в одній пробірці. Одна реакція дозволяє виявити ДНК аналізованої рослини, інша реакція дозволяє виявити послідовність, специфічну для конкретної лінії ГМ рослини. Перебіг кожної реакції детектується за допомогою специфічного зонду. Для виявлення ДНК рослини використовується зонд, мічений барвником R6G, а для виявлення генетичної вставки барвники FAM або ROX. З метою забезпечення стабільності результатів, тест-системи обладнані наборами реагентів для кожного етапу аналізу і стандартними зразками, що дозволяють уникнути помилки при аналізі результатів. Використана в тест-системах методика екстракції ДНК забезпечує високий вихід рослинної ДНК із продуктів, які пройшли термічну обробку, і видалення всіх інгібіторів ПЛР, тим самим сприяючи добрій відтворюваності результатів кількісного аналізу. Для виготовлення тест-систем використовували реагенти фірм "Sigma", "Fluka", "Fermentas" та "Синтол". Тест-системи адаптовано під більшість приладів (Bio-Rad, Applied Biosystems, Corbett Research, Синтол, ДНК-технология), якими обладнано діагностичні лабораторії України. В процесі розробки тест-систем велика увага приділялася оцінці їх ефективності, тобто аналітичним характеристикам - специфічності, чутливості, межі детектування, межі кількісного виміру, повторюваності та відтворюваності результатів аналізу, що проводилася відповідно до 2 UA 72083 U 5 10 15 вимог Об'єднаного Центру досліджень ГМО (JRC) Європейського Союзу, рекомендованих до подібних розробок. Оцінка ефективності роботи тест-систем проводилася з використанням сертифікованих стандартів ГМО, що випускаються Інститутом контрольних матеріалів і методів (Institute for Reference Materials and Methods, Бельгія). Джерела інформації: 1. Ребриков Д.В. ПЦР в реальном времени / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семѐнов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. // БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009.-223 с. 2. http://irmm.irc.ec.europa.eu/Pages/homepage.aspx. 3. Методи виявлення генетично модифікованих організмів і продуктів з їхнім вмістом / Кількісні методи на основі аналізування нуклеїнової кислоти ДСТУ ISO 21570:2008 // К.: Держспоживстандарт України, 2009. - 79 с. 4. Сорочинський Б.В. Генетично модифіковані рослини / Сорочинський Б.В., Данильченко О.О., Кріпка Г.В. // К.: Фітосоціонцентр, 2005. - 204 с. 5. Генетически модифицированные источники пищи: оценка безопасности и контроль / Под редакцией В.А. Тутельяна // М.: РАМН, 2007. - 442 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Тест-система для визначення якісного та кількісного вмісту генетично модифікованих організмів (ГМО) в харчових продуктах методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі (ПЛРРЧ), яка містить набір реагентів для екстрагування ДНК, суміш для проведення полімеразної ланцюгової реакції, Taq-полімеразу, сертифіковані стандартні зразки ДНК трансгенних культур, яка відрізняється тим, що містить оригінальну панель олігонуклеотидних праймерів та зондів до регуляторних послідовностей p35s і tNos, генів CP4epsps, Pat і Ваг, конструкт-специфічних послідовностей GTS40-3-2, А2704-12, А5547-127, MON89788, DP356043, MON87460, MON88017, MON89034, DAS-59122-7, 3272, MIR 162, LY038, 98140, Btl76, Bt11, Ga21, Mon810, Mon863, Nk603, T25, Тс1507, Mir604, MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, RT73, Т45, HCN28, HCN92, Н7-1, АМ04-1020, ЕН92-527-1, LLRICE62. 30 Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3