Спосіб одержання стабільних рекомбінантних штамів бактерій escherichia coli, із геном mycoplasma hominis для продукування аргініндезимінази

УКРАЇНА (19) UA (11) 107399 (13) C2 (51) МПК A61K 38/50 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 9/14 (2006.01) C12R 1/19 (2006.01) C12R 1/35 (2006.01) ДЕРЖАВНА СЛУЖБА ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ УКРАЇНИ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (21) Номер заявки: a 2013 04065 (22) Дата подання заявки: 01.04.2013 (24) 25.12.2014 Дата, з якої є чинними права на винахід: 10.10.2014, Бюл.№ 19 Публікація відомостей про заявку: 25.12.2014, Бюл.№ 24 Публікація відомостей про видачу патенту: (41) (46) (72) Винахідник(и): Сибірний Андрій Андрійович (UA), Фаюра Любов Романівна (UA), Пиняга Юрій Володимирович (UA), Борецький Юрій Романович (UA) (73) Власник(и): ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИН НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, вул. Драгоманова, 14/16, м. Львів-5, 79005 (UA) (56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою: Sezonov G. Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth /Guennadi Sezonov, Daniele Joseleau-Petit, Richard D'Ari // J. Bacteriol.- 2007. - vol. 189. -№. 23. - Р.87468749. Nicky C. Caiazza. SadB Is Required for the Transition from Reversible to Irreversible Attachment during Biofilm Formation by Pseudomonas aeruginosa PA14 / Nicky C. Caiazza, George A. O'Toole // J. Bacteriol. – 2004. - vol. 186. -№ 14. – Р. 4476-4485. Hiroshi Nikaido. The Limitations of LB Medium [Інтернет публікація] ULR: http://web.archive.org/web/20110725022154/ http://schaechter.asmblog.org/schaechter/2009/11/thelimitations-of-lb-medium.html (збережено WayBack Machine 25.07.2011, знайдено 25.09.2014). Barbara L. Schneider. Arginine Catabolism and the Arginine Succinyltransferase Pathway in Escherichia coli / Barbara L. Schneider, Alexandros K. Kiupakis, Lawrence J. Reitzer // J Bacteriol. – 1998, - № 180(16). – Р.4278–4286. RU 2276686 C2, 20.05.2006. UA 97610 C2, 27.02.2012. US 20050129706 A1, 16.06.2005. Arun Sivashanmugam, Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli /Arun SivashanmugamVictoria Murray, Chunxian Cui, Yonghong Zhang, Jianjun Wang,* Qianqian Li // Protein Sci. – 2009. - № 18(5). – Р. 936–948. F. William Studier. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures / F. William Studier // Protein Expression and Purification. – 2005. - № 41. - 207–234. (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ СТАБІЛЬНИХ РЕКОМБІНАНТНИХ ШТАМІВ БАКТЕРІЙ ESCHERICHIA COLI, ІЗ ГЕНОМ MYCOPLASMA HOMINIS ДЛЯ ПРОДУКУВАННЯ АРГІНІНДЕЗИМІНАЗИ (57) Реферат: Винахід належить до способу одержання стабільних рекомбінантних штамів бактерій Escherichia coli, із геном Mycoplasma hominis для продукування аргініндезимінази (АДІ), причому, для селекції трансформантів-продуцентів АДІ, їх зберігання та вирощування UA 107399 C2 (12) UA 107399 C2 стартової культури продуцента АДІ використовують LB середовище з додаванням 0,2 % аргініну і 0,5 % глюкози. UA 107399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі медичної біотехнології і є способом стабілізації рекомбінантного штаму продуцента ферменту аргініндезимінази (рАДІ), яка використовується для лікування певних типів онкозахворювань. Відомо, що замінна амінокислота L-аргінін присутня в кров'яному руслі ссавців. Нормальні клітини цих організмів можуть синтезувати L-аргінін із цитруліну в реакціях, каталізованих аргінінсукцинатсинтазою і аргінінсукцинатліазою. Тоді як у клітинах деяких видів пухлин людини і тварин аргінінсукцинатсинтаза не експресується [1, 2] і наявність L-аргініну в крові є необхідною умовою їх росту. Відомо, що голодування пухлинних клітин меланоми, гепатокарциноми, деяких видів саркоми та ін. за аргініном веде до індукції їх загибелі внаслідок апоптозу [1, 3, 4]. Ферменти, котрі здатні деградувати аргінін, можуть викликати значне зниження його рівня у кров'яному руслі людини та інгібувати ріст злоякісних клітин [4]. Аргініндезиміназа (АДІ, ЕС3.5.3.6), яка каталізує реакцію гідролізу L-аргініну до L-цитруліну та аміаку, [5], виявлена у клітинах деяких мікроорганізмів [2, 6, 7]. Гідролізуючи аргінін за допомогою АДІ [5], неферментуючі бактерії Mycoplasma hominis використовують його як негліколітичне джерело енергії [8]. У деяких роботах показано інгібування росту пухлинних клітин як наслідок дефіциту аргініну, утвореного при додаванні АДІ [1, 2, 3, 9, 10]. Також показано, що АДІ є супресуючим фактором реплікації вірусу імунодефіциту людини ВІЛ [11]. Gong і співавтори повідомляють, що АДІ є приблизно в 100 раз більш ефективною при інгібуванні проліферації клітин лімфатичної лейкемії, порівняно з використовуваною в клінічній онкології L-аспарагіназою [12]. У провідних онкологічних клініках світу проводяться клінічні випробовування ензимотерапії онкозахворювань за допомогою АДІ. Проте широкому практичному використанню АДІ в онкологічній практиці заважає дуже висока ціна препаратів ферменту, отриманого розробленими та запатентованими [13] методами. Запропоновано значно дешевший спосіб індукції синтезу та активації рАДІ [14]. Необхідно наголосити, що продуценти АДІ є нестабільними і швидко втрачають здатність до надпродукції АДІ як при зберіганні, так і у процесі вирощування [15]. Тому суттєвим недоліком описаних раніше способів отримання АДІ є необхідність кожен раз розпочинати процес виробництва із трансформації клітин кишкової палички плазмідою із геном АДІ та селекції високопродуктивних клонів трансформантів Е.coli. В основу винаходу поставлено задачу стабілізувати штами продуценти АДІ і тим самим оптимізувати запатентовані [14] способи одержання АДІ. Поставлена задача вирішується тим, що у способі стабілізації рекомбінантних (містить ген АДІ М. hominis з покращеною трансляцією) штамів бактерій Е.coli, згідно з винаходом, оптимізуються умови селекції і зберігання трансформантів, а також вирощування стартової культури продуцента АДІ, що приводить до суттєвого зниження собівартості виробництва ферменту. Запропоновані нами модифікації LB середовища для зберігання та вирощування стартової культури штамів продуцентів АДІ бактерій Е.coli дозволяють зберігати їх здатність до надпродукції цільового білка незмінною впродовж 50 днів. Тоді як у запатентованому способі культивування бактерій та індукції синтезу АДІ за допомогою лактози (автоіндукція) використовується тільки свіжа культура трансформантів. Найбільш близькими до запропонованого є описані у літературі умови кріозберігання при 70 °C штамів продуцентів різних рекомбінантних білків [16, 17]. Проте при зберіганні при -70 °C рекомбінантного штаму бактерій Е.coli продуцента АДІ із М. hominis його здатність до надекспресії ферменту за допомогою індукції лактозою не зберігається [14]. У запропонованому способі використовуються наступні методи: трансформація бактерій методом електропорації, виділення плазмід із бактерій, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі, електрофорез білків в поліакриламідному гелі в денатуруючих умовах [18]. Спосіб стабілізації рекомбінантного штаму бактерій Е.coli продуцента АДІ із М. hominis пояснюється кресленнями. На фіг. 1 показано електрофоретичний аналіз продукції рАДІ М. hominis у трансформантів Е.coli при їх селекції, зберігання (7 діб) та культивуванні стартової культури на середовищі LB з різними додатками: LB (1-5); LB+0,2 % аргініну (6-10); LB+0,2 % глюкози (11-15); LB+0,2 % аргініну і 0,2 % глюкози (16-20). На фіг. 2 показано залежність продукції рАДІ М. hominis у трансформантів Е.coli від концентрації глюкози (0,2 % (1,3) або 0,5 % (2,4) у середовищі LB, яке використовувалось для культивування стартової культури. На фіг. 3 зображено рівень продукції рАДІ М. hominis у трансформантів Е.coli у залежності від часу зберігання (1,3-7 діб; 2,4-50 діб) продуцента при 4 °C на середовищі LB з додатком 0,5 % глюкози. 1 UA 107399 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Етап 1 Плазміду, що містить оптимізований ген АДІ М. hominis, під контролем промотора гена РНКполімерази бактеріофага Т7 вводять (трансформують) у клітини Е.coli BL-21 методом, описаним раніше [14, 18]. Селекцію трансформанти проводять при 37 °C на LB середовищі з 100 мкг/мл ампіциліну (NaCI 1 %, пептон 1,5 %, дріжджовий екстракт 0,5 %, агар мікробіологічний 2 %), що містить: 1-0,2 % аргініну; 2-0,2 % глюкози; 3-0,2 % аргініну і 0,2 % глюкози. На середовищі аналогічного складу зберігають та вирощують стартову культуру, продуцента рАДІ Для аутоіндукційної гетерологічної експресії АДІ використовується мінеральне середовище та методика, запропоновані раніше [14]. Як індуктор експресії використовується α-лактоза. Електрофоретичний аналіз залежності продукції рАДІ М. hominis бактеріями Е.coli від складу селекційного середовища, середовищ їх зберігання (7 діб) при 4 °C) та культивування стартової культури представлено на фіг. 1. Максимальний рівень експресії цільового білка спостерігається у клітин трансформантів, культивованих на LB середовищі з 0,2 % аргініну і 0,2 % глюкози. Збільшення концентрації глюкози у LB середовищі до 0,5 % (фіг. 2) приводить до зростання продукції рАДІ під час автоіндукційного культивування. Продуцент ферменту не втрачає здатності до надекспресії рАДІ при зберіганні 50 діб при 4 °C на середовищі LB з додатками 0,2 % аргініну та 0,5 % глюкози (фіг. 3). Джерела інформації: 1. Philip R., Campbell F., Wheatley D.N. Arginine deprivation, growth inhibition and tumour cell death. Part 2. Enzymatic degradation of arginine in normal and malignant cell cultures. Br.J. Cancer. 2003. - Vol. 88, N 4. - P. 213-283. 2. Takaku H., Matsumoto M., Misawa S., Miyazaki K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma arginini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. - 1995. - Vol. 86, N 9. - P. 840-846. 3. Sugimura K., Ohno Т., Kusuyama Т., Azuma L. High sensitivity of human melanoma cell lines to the growth inhibitory activity of mycoplasmal arginine deiminase in vitro. Melanoma Res. - 1992. Vol. 2, N 3. - P. 191-196. 4. Takaku H., Takase M., Abe S., Hayashi H., Miyazaki K. In vivo anti-tumor activity of arginine deiminase purified from Mycoplasma arginine. Int. J. Cancer. - 1992. -Vol. 51, N2. - P. - 244-249. 5. Barile M. F., Schimke R.T., Riggs D.B. Presence of the arginine dehydrolase pathway in Mycoplasma. J. Bacteriology. - 1966. - Vol. 91, N1. - P. 189-192. 6. Shibatani Т., KamimotoT., Chibata I. Crystalization and properties of L-arginine deiminase of Pseudomonas putida. J. Biol. Chem. - 1975. - Vol. 250, N12. - P. 4580-4583. 7. Kim J.E., Hur H.J., Lee K.W., Lee H.J. Antiinflammatory effects of recombinants arginine deiminase originating from Lactococcus lactis ssp. lactis ATCC 7962. J. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - Vol. 17, N9. - P. 1491-1497. 8. Schimke P.T., Berlin С.М., Shweeney E.W., Carroll W.R. The generation of energy by the arginine dehidrolase pathway in Mycoplasma hominis. J. Biol. Chem. - 1966. - Vol. 241, N10. - P. 2228-2236. 9. Park I.S., Kang S.W., Shin Y.J., Chac K.Y., Park M.O., Kim M.Y., Wheatley D.N., Min B.H. Arginine deiminase a potential ingibitor of angiogenesis and tumour growth. Br. J. Cancer. - 2003. Vol. 89, N5. - P. 907-914. 10. Matsumoto M., Hayashi H. High-level expression of Mycoplasma arginine deiminase in Escherichia coli and its efficient renaturation as an anti-tumor enzyme. Biotechnol. - 1994. - Vol. 36, N2. - P. 145-155. 11. Kubo M., Nishitsuji H., Kurihara K., Hayashi T., Masuda Т., Kannagi M. Suppression of human immunodeficiency virus type 1 replication by arginine deiminase of Mycoplasma arginine. J. Gen. Virol. - 2006. - Vol. 87, N6. - P. 1589-1593 12. Gong H., Zolzer F., von Recklinghhausen G., Havers W., Schweigerer L. Arginine deiminase inhibits proliferation of human leukemia cells more potently than asparaginase by inducing cell cycle arrest and apoptosis. Leukemia. - 2000. - Vol. 14, N5. - P. 826-829. 13. Патент США, Pub. No.: US 2005/0129706 AI, заявка від 15.01.2004, МПК А61К 39/02, C12N 9/10 // Modified arginine deiminase // Опубліковано 16.06.2005. 14. Патент України на винахід, N97610, заявка від 19.05.2011, МПК А61К 38/50, C12N1/21, C12N9/14 / Поліпшений спосіб одержання аргініндезімінази Mycoplasma hominis із рекомбінантних штамів бактерій Escherichia coli // Зареєстровано 27.02.2012. 15. Misawa S., Aoshima M., Takaku H., Matsumoto M., Hayashi H. High-level expression of Mycoplasma arginine deiminase in Escherichia coli and its efficient renaturation as an anti-tumor enzyme. Biotechnol. - 1994. - Vol.36, N2. - P. 145-155. 2 UA 107399 C2 5 16. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. - 2005. - Vol. 41, N1. - P. 207-234. 17. Sivashanmugam A., Murray V., Cui C, Zhang Y., Wang J., Li Q. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Sci. - 2009. Vol. 18, N5. - P. 936-948. 18. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1989. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 Спосіб одержання стабільних рекомбінантних штамів бактерій Escherichia coli, із геном Mycoplasma hominis для продукування аргініндезимінази (АДІ), який відрізняється тим, що для селекції трансформантів-продуцентів АДІ, їх зберігання та вирощування стартової культури продуцента АДІ використовують LB середовище з додаванням 0,2 % аргініну і 0,5 % глюкози. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3