Біомаркерний аналіз для детектування або вимірювання інгібування активності tor-кінази

Реферат: Заявлений винахід стосується способу детектування і/або вимірювання активності TOR-кінази у пацієнтів, які страждають на захворювання, пов'язане з TOR-кіназою. UA 111724 C2 (12) UA 111724 C2 UA 111724 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ОПИС Дана заявка заявляє пріоритет попередньої заявки США № 61/369455, поданої 30 липня 2010 року, повний зміст якої включений в даний документ шляхом посилання. 1. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ У даному документі надані способи детектування і/або вимірювання інгібування активності TOR-кінази у пацієнтів і пов'язані з ними застосування. 2. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Зв'язок між анормальним фосфорилуванням білків і причинами або наслідками хвороб відома більше 20 років. Відповідно, протеїнкінази стали дуже важливою групою мішеней для ліків. Див. Cohen, Nature Reviews Drug Discovery, 1:309-315 (2002). Різні інгібітори протеїнкіназ використовувалися в клініці для лікування різноманітних захворювань, таких як рак і хронічні запальні захворювання, включаючи діабет і інсульт. Див. Cohen, Eur. J. Biochem., 268:5001-5010 (2001), Proteinkinase Inhibitors for the Treatment of Disease: The Promise and the Problems, Handbook of Experimental Pharmacology, Springer Berlin Heidelberg, 167 (2005). Протеїнкінази являють собою велике і різноманітне сімейство ферментів, які каталізують фосфорилування білків і відіграють критично важливу роль в клітинній сигналізації. Протеїнкінази можуть викликати позитивні або негативні регуляторні ефекти, залежно від білків, які є їх мішенями. Протеїнкінази залучені до специфічних сигнальних шляхів, які регулюють клітинні функції, такі як метаболізм, проходження клітинного циклу, адгезія клітин, судинна функція, апоптоз і ангіогенез, але не обмежуючись ними. Порушення клітинної сигналізації пов'язані з багатьма захворюваннями, найбільш характерні з яких включають в себе рак і діабет. Регуляція передачі сигналу цитокінами і зв'язок сигнальних молекул з протоонкогенами і генами-супресорами пухлинного росту добре документована. Схожим чином був показаний зв'язок між діабетом і пов'язаними з ним станами, і порушеннями рівня протеїнкінази. Див. наприклад, Sridhar et al. Pharmaceutical Research, 17(11): 1345-1353 (2000). Вірусні інфекції і стани, що належать до них також пов'язані з регуляцією протеїнкінази. Park et al. Cell 101 (7): 777-787 (2000). Протеїнкінази можуть бути розділені на великі групи на основі тієї амінокислоти (амінокислот), які є їх мішенями (серин/треонін, тирозин, лізин і гістидин). Наприклад, тирозинкінази включають в себе рецепторні тирозинкінази (RTK), такі як фактори росту, і нерецепторні тирозинкінази, такі як сімейство src-кіназ. Існують також протеїнкінази подвійної специфічності, для яких мішенями є і тирозин, і серин/треонін, такі як циклінзалежні кінази (CDK) і мітогенактивовані протеїнкінази (MAPK). Оскільки протеїнкінази регулюють майже всі клітинні процеси, включаючи в себе метаболізм, клітинну проліферацію, клітинне диференціювання і виживання клітини, вони є привабливими мішенями для терапевтичного втручання при різних хворобливих станах. Наприклад, контроль клітинного циклу і ангіогенез, в яких протеїнкінази відіграють центральну роль, є клітинними процесами, пов'язаними з численними хворобливими станами, такими як рак, запальні захворювання, патологічний ангіогенез і захворювання, пов'язані з ним, атеросклероз, дегенерація жовтої плями, діабет, ожиріння і болі, але не обмежуючись ними. Протеїнкінази стали привабливими мішенями при лікуванні ракових захворювань. Fabbro et al… Pharmacology & Therapeutics 93:79-98 (2002). Було зроблене припущення, що залучення протеїнкіназ до розвитку злоякісного росту у людини може відбуватися шляхом: (1) перебудов генома (наприклад, BCR-ABL при хронічному мієлобластному лейкозі), (2) мутацій, які ведуть до постійної активності кіназ, таких як при гострому мієлобластному лейкозі і шлунково-кишкових пухлинах, (3) порушення регуляції активності кінази внаслідок активації онкогенів або втрати функції супресії пухлин, такі як при ракових захворюваннях за участю онкогенного RAS, (4) порушення регуляції активності кінази внаслідок оверекспресії, як у випадку EGFR і (5) ектопічної експресії факторів росту, яка може вносити внесок в розвиток і підтримку неопластичного фенотипа. Fabbro et al., Pharmacology & Therapeutics 93:79-98(2002). Демонстрація складності сигнальних шляхів протеїнкінази і складність взаємозв'язків і взаємодій між ними і між різними протеїнкіназами і кіназними шляхами указала на важливість розвитку фармацевтичних агентів, здатних діяти як модулятори, регулятори або інгібітори протеїнкінази, які мають корисну активність на численні кінази або численні кіназні шляхи. Відповідно, залишається потреба в нових модуляторах кінази. Білок, який називається mTOR (мішень рапаміцину у ссавців), який також називається FRAP, RAFTI або RAPT1), являє собою Ser/Thr-протеїнкіназу з 2549 амінокислот, яка, як було показано, є одним з найбільш важливих білків шляху mTOR/PI3K/Akt, який регулює клітинний ріст і проліферацію. Georgakis and Younes Expert Rev. Anticancer Ther. 6(1): 131-140 (2006). mTOR існує в двох комплексах: mTORC1 і mTORC2. Тоді як mTORC1 чутливий до аналогів 1 UA 111724 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рапаміцину (таким як темсиролімус або еверолімус), mTORC2, загалом, нечутливий до рапаміцину. Варто зазначити, що рапаміцин не є інгібітором TOR-кінази. Декілька інгібіторів mTOR були оцінені в клінічних випробуваннях по лікуванню раку або знаходяться в стадії оцінки. Темсиролімус був затверджений для застосування при карциномі клітин нирки в 2007 р., а еверолімус був затверджений в 2009 р. для пацієнтів з карциномою клітин нирок, які поліпшувалися при дії інгібіторів рецепторів факторів росту. Крім того, сиролімус був затверджений в 1999 р. для профілактики відторгнення ниркових трансплантатів. Цікавий, але що не обмежується ним, клінічний успіх цих інгібіторних сполук mTORC1 показує придатність інгібіторів mTOR для лікування раку і відторгнення трансплантатів, і збільшує потенціал сполук з інгібіторною активністю відносно і mTORC1, і mTORC2. Внаслідок потенційної застосовності інгібіторів активності TOR-кінази, існує потреба в способах детектування і/або вимірювання інгібування активності TOR-кінази in vivo. Цитування або ідентифікація якого-небудь джерела в Розділі 2 даної заявки не повинне розглядатися як твердження, що джерело являє собою попередній рівень техніки по відношенню до даної заявки. 3. СУТЬ ВИНАХОДУ У даному документі представлені способи детектування або вимірювання інгібування активності TOR-кінази у пацієнтів, які включають вимірювання кількості фосфорилованого 4EBP1 (що також позначається в даному документі як p4EBP1) в біологічному зразку від згаданого пацієнта, наприклад, зразку периферичної крові до і після введення інгібітору TORкінази згаданому пацієнту. У одному з варіантів здійснення кількість p4EBP1 вимірювали за допомогою протокової цитометрії. Передбачається, що способи, представлені в даному документі, придатні для контролю інгібування TOR-кінази у пацієнта. Також в даному документі представлені способи визначення залежності "доза-ефект" при введенні інгібітору TOR-кінази пацієнту, при яких згаданому пацієнту вводять варіюючі дози згаданого інгібітору TOR-кінази і величину інгібування активності TOR-кінази у згаданого пацієнта, виникаючу від кожної дози згаданого інгібітору TOR-кінази, визначалася з використанням способу, представленого в даному документі. Також в даному документі представлені способи визначення того, чи чутливий пацієнт до інгібітору TOR-кінази, що включають введення згаданому пацієнту згаданого інгібітору TORкінази і визначення того, інгібується чи ні активність TOR-кінази у згаданого пацієнта, за допомогою способу, представленого в даному документі. Також в даному документі представлені способи визначення ефективної кількості інгібітору TOR-кінази для лікування або контролю захворювання у пацієнта, що включають введення згаданому пацієнту варіюючих доз згаданого інгібітору TOR-кінази і визначення у згаданого пацієнта рівня інгібування активності TOR-кінази, виникаючого при дії кожної з доз згаданого інгібітору TOR-кінази за допомогою способу, представленого в даному документі. Також в даному документі представлені способи лікування або контролю захворювання, пов'язаного з TOR-кіназою у пацієнта, який страждає на захворювання, пов'язане з TOR кіназою, що включають введення згаданому пацієнту ефективної кількості інгібітору TOR-кінази, де ефективне кількості згаданого інгібітору TOR визначається за допомогою способу, представленого в даному документі. У певних варіантах здійснення способи, представлені в даному документі, реалізовуються шляхом контакту біологічного зразка від пацієнта з інгібітором TOR-кінази ex vivo. Також в даному документі представлені набори, що містять один або більше контейнерів, заповнених реагентами для детектування p4EBP1 за допомогою протокової цитометрії, і інструкції для детектування p4EBP1 за допомогою протокової цитометрії. Дані варіанти здійснення можуть бути зрозумілі більш повно по посиланню на детальний опис і приклади, які направлені на представлення необмежувальних варіантів здійснення. 4. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1. Представляє гістограми, що показують клітинні популяції необроблених клітин (затінені [криві]), клітин, оброблених ДМСО (пунктирна лінія), клітин, оброблених специфічним блокуючим пептидом (цільна лінія), і клітин, оброблених сполукою 1 (точкова лінія). (А) представляє клітини PC3, оброблені 10 мкМ сполуки 1. (В) Представляє гістограми, що представляють моноцити CD91+ з цільної крові нормальних здорових добровольців, оброблені ex vivo 30 мкМ сполуки 1. (С) Представляє гістограми, що представляють моноцити CD91+ з цільної крові пацієнтів, які страждають на рак легенів, оброблені ex vivo 30 мкМ сполуки 1. Фіг. 2. Ілюструє відтворюваність тесту p4EBP1 залежно від варіацій p4EBP1 в моноцитах день за днем від тих же здорових донорів (кров забирали від 3 здорових донорів протягом 3 послідовних днів). (А) Ілюструє середню інтенсивність флуоресценції для всіх 3 донорів в різні 2 UA 111724 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дні. (В) Ілюструє інгібування сполукою 1. (С) Представляє ілюстративну гістограму, що представляє клітинні популяції необроблених клітин (затінена), клітин, оброблених ДМСО (пунктирна лінія), клітин, оброблених специфічним блокуючим пептидом (суцільна лінія) і клітин, оброблених сполукою 1 (точкова лінія). Фіг. 3. Ілюструє стабільність сигналу p4EBP1 в зафіксованих заморожених клітинах. Всі зразки цільної крові були оброблені ДМСО або сполукою 1 при 37ºC протягом 2 годин, а PBMC були зафіксовані і заморожені без стабілізуючого буфера. (А) Представляє гістограми моноцитів CD91+ з свіжоприготованої цільної крові. (В) Представляє стовпчасту діаграму, що ілюструє стабільність сигналу p4EBP1 в популяції моноцитів CD91+ із заморожених клітин протягом періоду в 1 місяць. (С) Представляє таблицю, підсумовуючу життєздатність і середню інтенсивність флуоресценції (MFI) оброблених клітин. Фіг. 4. (А) Ілюструє обробку ex vivo цільної крові від здорових донорів сполукою 1 протягом 2 годин при кімнатній температурі. Зразки обробляли в триплетах. Обробка 5 мкМ і 0,5 мкМ сполуки 1 показала істотне інгібування (р