Мутагенізований саджанець тютюну як посівна культура при виробництві олії для використання в енергетиці, промисловості та харчуванні

Номер патенту: 87007

Опубліковано: 27.01.2014

Автор: Фогер Корадо

Є ще 11 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Мутагенізована рослина тютюну з високою насіннєвою продуктивністю, яка відрізняється тим, що вона продукує насіння у кількості щонайменше 2000 кілограм з гектара при щільності посіву близько 125000 рослин на гектар і отримана способом, який включає наступні етапи:

a) мутагенез насіння шляхом проведення міжвидового схрещування в роді Nicotiana з подальшим зворотним схрещуванням індивідів F1 і індукцією амфідиплоїдів обробкою колхіцином конусів наростання рослин, отриманих вказаним схрещуванням, або насіння, отриманого вихідним схрещуванням між індивідами одного виду, що належать до дикого типу або до відібраних різновидів;

b) пророщування зазначеного насіння і відбір рослин поколінь М2-М4 за наступними параметрами:

і) наявність однієї або кількох явних фенотипічних характеристик, вибраних з: рослина висотою 80-120 см, листя з тонкою листовою пластиною і прямостояче, компактне суцвіття, кількість квітів більше ніж 100, кількість коробочок більше ніж 100, кількість насіння на коробочку більше ніж 5000, здерев'яніле і міцне стебло, глибокорозташоване коріння;

іі) стабільність вибраної ознаки в поколіннях, наступних після М2;

ііі) перевірка спадкування вибраної ознаки;

c) пророщування насіння, відібраного в стадії b) і регенерація рослин з листового мезофільного калюса, індукована in vitro в присутності фітогормонів, і відбір рослин, які зберігали ознаки, відібрані в пункті b), в поколіннях R0-R2;

d) посів у відкритому полі рослин, відібраних на стадії с) і подальший відбір рослин, які продукують щонайменше 2000 кілограм насіння з гектара при щільності посіву близько 125000 рослин/га.

2. Рослина за п. 1, яка відрізняється тим, що вказана кількість насіння становить близько 5000 кілограм з гектара або близько 7000 кілограм з гектара, або близько 9000 кілограм з гектара при щільності посіву близько 125000 рослин на гектар.

3. Рослина за будь-яким з пп. 1 або 2, яка відрізняється тим, що у неї генетичною трансформацією додатково модифікований метаболізм жирних кислот та тим, що вона виробляє насіння, яке містить олію, йодне число якої є нижчим за або дорівнює 120.

4. Рослина за будь-яким з пп. 1-3, яка відрізняється тим, що у неї генетичною трансформацією додатково модифікований метаболізм жирних кислот та тим, що вона виробляє насіння, яке містить олію у процентному відношенні між приблизно 40 % та 60 % від маси насіння.

5. Рослина за будь-яким з пп. 3 або 4, яка відрізняється тим, що є модифікованою трансформацією з одним або більше експресійними векторами, які містять насіннєспецифічну експресійну касету, яка містить спрямовану від 5' до 3' послідовність ДНК, що кодує промотор гена рослини, специфічного для експресії у накопичувальних органах насіння; послідовність ДНК, що кодує сигнальну послідовність рослинного білка, здатного спрямовувати зазначений білок до ендоплазматичного ретикулюму (ЕР); послідовність ДНК, що кодує сигнальну послідовність, здатну спрямовувати білок в пластиду або послідовність ДНК, що кодує білок, вибраний з групи, яка містить гени ацетил-КоА-карбоксилази (ACCase), діацилгліцеринацилтрансферази (DGAT), лізофосфатидатацилтрансферази (LPAT), фосфотидатфосфогідролази (PAPase) носія ацильованих білків (АСР), малоніл-КоА:АСР трансацилази, кетоацил-АСР синтази (KAS), кетоацил-АСР редуктази, 3-гідроксіацил-АСР дегідрази, еноїл-АСР редуктази, стеароїл-АСР десатурази, ацил-АСР тіоестерази, гліцерин-3-фосфатацилтрансферази, і-ацил-sn-гліцерин-3-фосфат ацилтрансферази, цитидин-5-дифосфат-діацилгліцеринсинтази, фосфатидилгліцерофосфатсинтази, фосфатидилгліцерин-3-фосфат фосфатаза, FAD 1-8 десатурази, фосфатази фосфатидної кислоти, моногалактозилдіацилгліцеринсинтази, дигалактозилдіацилгліцеролсинтази, білка біосинтезу фосфоліпідів, синтази довголанцюгового ацил-КоА, гліцеро-1-3-фосфатацилтрансферази (GPAT), діацилгліцеринхолінфосфотрансферази, фосфатидилінозитолсинтази, ацил-КоА діацилгліцеринацилтрансферази, ацил-АСР десатурази, лінеоїлдесатурази, сфінголіпіддесатурази, олеат 12-десатурази, ацетиленази жирних кислот, епоксигенази жирних кислот, діацилгліцеринкінази, холінфосфатцитидилтрансферази, холінкінази, фосфоліпази, фосфатидилсериндекарбоксилази, фосфатидилінозитолкінази, кетоацил-КоА синтази, транскрипційного фактора CER, олеозину, 3-кетоацил-КоА тіолази, ацил-КоА дегідрогенази, еноїл-КоА гідратази, ацил-КоА оксидази та сигнал поліаденілювання.

6. Рослина за будь-яким з попередніх пунктів, яка відрізняється тим, вона додатково модифікована генетичною трансформацією для набуття стійкості до пошкоджень комахами, гербіцидної стійкості та стійкості до пошкоджень грибами.

7. Рослина за будь-яким з пп. 1-6, призначена для отримання насіння для виготовлення тютюнової олії, паливних олій, біодизеля, дієтичних добавок для тварин, твердого палива, дієтичних добавок для людини, мастильних речовин.

8. Рослина за будь-яким з пп. 1-6, призначена для виробництва біомаси для біохімічної переробки або для термохімічної переробки процедурами прямого спалювання, коксування, піролізу, газифікації, анаеробного розщеплювання, аеробного розщеплювання, спиртової ферментації або здійснення обробки паром.

Текст

Реферат: Мутагенізована рослина тютюну з високою насіннєвою продуктивністю, модифікована із застосуванням технологій мутагенезу та міжвидової гібридизації, за чим слідують поліплоїдизація та застосування технологій рекомбінантної ДНК. UA 87007 U (33) Код держави-учасниці IT UA 87007 U UA 87007 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Рівень техніки Тютюн спочатку було культивовано як декоративну та медичну рослини, яку поступово стали сприймати головним чином як предмет розкоші, який увійшов до культури людини, змінивши її звичаї та звички. Тютюн, серед інших сільськогосподарських культур, займає позицію, незрівняну з іншими культурними рослинами та має наступні відмітні риси: 1) він є однією з небагатьох рослин, товарною частиною якої є листя; 2) він є головною рослиною, яку не використовують у харчових цілях, з об'ємом виробництва більше ніж чотири мільйони гектарів у всьому світі; 3) у багатьох країнах він є дуже важливим знаряддям економічної та фінансової політики; 4) його споживання базується на перетворенні його листків у продукти для куріння, порошок для вдихання та продукти для жування; 5) з урахуванням його характеристик як наркотичної речовини та його небезпечності для здоров'я людини, завжди були спроби заборонити його вживання та, тим самим, - виробництво. Еволюція роду Nicotiana у різних середовищах, спочатку шляхом натуральної селекції та поліплоїдизації та, надалі, шляхом штучної селекції людиною, призвела до виникнення великої кількості різних видів, які були відібрані на основі властивостей листків, оскільки листки є єдиною цінною частиною цієї рослини. Останнім часом були виявлені альтернативні шляхи використання тютюну, окрім вищеназваних: 1. виробництво харчових білків шляхом їх отримання з листків тютюну (Long R.C. 1979. Tobacco production for protein. Project n. 03245. North Carolina State university, Raleigh NC); 2. отримання корисних із фармакологічної точки зору компонентів, які за звичайних умов присутні у листках (Baraldi Μ. et al. 2004. Presenza di sostanze Benzodiazepino-simili in estratti di foglie di tabacco (Nicotiana tabacum). Atti 1st. Sper. Tab., 23 Aprile, Roma, pp.45-52); 3. виробництво рекомбінантних білків, які присутні у листках або насінні генетично модифікованих рослин (Twyman et al. 2003. Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends Biotechnol. 21:570-578). Рослина тютюну має дуже велику площу листка, невелике суцвіття та відношення її надземної частини до коріння є найвищим серед відомих сільськогосподарських культур (Went, 1957. The experimental control of plant growth, pp. 343. Chronica Botanica, Waltham, Mass.). Ураховуючи економічну обґрунтованість культивації тютюну, не зважаючи на стрімке зростання нікотинізму серед наймолодших, Європа надає гранти на його культивацію, тим самим викликаючи нерозуміння з боку етики та економіки. Європейська Комісія стверджує на своєму Інтернет сайті (www.ec.europa.eu/agriculture/publi/fact/tobacco): "не існує економічно обґрунтованих альтернатив цій культурі, які не потребують доброго ґрунту для зростання. Заохочення вирощування тютюнової культури забезпечує виживання сільського прошарку населення та створює промислову діяльність для виживання областей, яким загрожує перетворення на пустелю". Негативні, з точки зору захисту навколишнього середовища, наслідки використання видобутого палива та обмежений доступ до нафти говорять про необхідність пошуку нових енергетичних джерел. Серед таких джерел біопаливо має найкращу перспективу завдяки його здатності до відновлення. Розглядаючи біопаливо органічного походження, яке існує на сьогоднішній день, вибір зупинився на виробництві біоетанолу, починаючи з рослин для виробництва моносахаридів (наприклад, сахароза) або полісахаридів (наприклад, целюлоза). Зразковими рослинами для такого виробництва були визначені цукрова тростина, кукурудза, пшениця, тапіока, цукровий буряк, ячмінь, сорго й т. ін.. Поширення культур, спрямоване на максимізацію виробництва біомас для їх подальшої переробки на етанол шляхом бродіння, або на виробництво біопалива або газового палива шляхом газифікації, може мати такий самий обсяг. Як альтернатива, останні досягнення спрямовані на виробництво паливної олії та біодизельного палива з олійних та не олійних сортів, які багаті на олію, таких як соя, соняшник, ріпак, арахіс, льон, кукурудза, сезам, пальма, копра, кокос, рицина та ін.. Важливою умовою вибору ідеальних сортів для виробництва біопалива є виконання наступних вимог: 1. визначення чистого енергетичного прибутку у різниці між вкладанням у культуру та виходом продукції, під час розрахунку чого враховуються енергетичні витрати на виробництво 1 UA 87007 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сільськогосподарського обладнання та на процеси переробки сировини для отримання та трансформації/очищення олії; 2. визначення переваг для навколишнього середовища від підтримки сільськогосподарського виробництва, зменшення викидів СО 2 та твердих часток (наприклад, РМ-10) внаслідок згорання палива, та від обмеженого використання агрохімікатів, таких як пестицидів, гербіцидів та добрива; 3. здатність до конкурентоспроможності в економічному сенсі та, можливо, визначення соціальних переваг, які здатні підвищити економіку системи, наприклад, шляхом зниження непрямих витрат на санітарну систему, також ураховуючи те, що енергія видобутого палива, яка зараз використовується, спричиняє витрати на охорону навколишнього середовища, які зазвичай не враховують під час визначення витрат; біопаливо матиме переваги як із боку конкурентоспроможності за ціною, так і з боку охорони навколишнього середовища; 4. доступність у великій кількості без зменшення при цьому об'єму продуктів харчування; використання сільськогосподарських рослин, які традиційно вирощують для виробництва харчових продуктів, не припускає їх використання для виробництва біопалива без зниження джерел продуктів харчування, які виробляють із таких рослин, тим самим підвищуючи ціну сировини; 5. рослинна культура, з якої його отримують, має займати, за можливістю, неродючі землі, на яких, скоріше за все, не вирощуватимуть альтернативні культури. За сучасних технологій до рослин, з яких виробляють олію, належать: соя (Glycine max), соняшник (Helianthus annuus), ріпак (Brassica napus), арахіс (Arachis hypogaea), рицина (Ricinus communis), льон (Linum usitatissimum), кукурудза (mais), сезам (Sesamum indicum), пальма (фрукт, Aracaceae), пальмове ядро (насіння, Агасасеае), копра (кокос, Cocos nucifera), сафлор (Carthamus tinctorius), олива (Olea europea), бавовна (Gossypium sp.), акажу (Anacardium occidentale), конопля (Cannabis sativa), мак (Papavers sp.), гірчиця (Brassica sp.), виноград (Vitis sp.), абрикос (Prunus armeniaca), сосна (Pinus sp.), аргана (Argania spinosa), авокадо (Persea americana), мигдаль (Prunus amygdalus), фундук (Corylus avellana), горіх (Juglans regia), нім (Azadirachfa indica), нуг (Guizotia abyssinica), жожоба (Simmondsia chinensis), рис (Oryza sativa), гарбуз (Cucurbita sp.), крамбе (Crambe abyssinica). Навпаки, на відомому рівні техніки, тютюн завжди вважався сільськогосподарською культурою, придатною до виробництва листків. Лише в трьох нижченаведених публікаціях у літературі говориться про можливість іншого використання існуючих видів тютюну, виведених для виробництва листків, у якості джерела насіння, яке зазвичай є побічним продуктом, для отримання олії. Саме Джианнелос та ін. (Tobacco seed oil as an alternative diesel fuel: physical and chemical properties. Industrial Crops and Products, 2002, 16:1-9), які сказали, що "насіння є побічним продуктом виробництва листків у Греції", заявили про можливість використати зазначене насіння для виробництва палива, описавши методи отримання олії з насіння тютюну із застосуванням розчинників, однак, наголошуючи, що олію, отриману з тютюну, не можна використовувати як біодизельне паливо через високий йодний вміст у ньому. Уста Н. (Use of tobacco seed oil methyl ester in a turbocharged indirect injection diesel engine. Biomass and Bio-energy, 2005, 28:77-86) заявив, що олія насіння тютюну є побічним продуктом світового виробництва листків, підрахував результат світового виробництва насіння з тютюну, який культивується задля листків, та описав процес отримання олії з насіння шляхом застосування розчинників. Нарешті, Пател та ін. (Production potential and quality aspects of tobacco seed oil. Tobacco Research, 1998, 24:44-49) підрахували, що виробництво насіння тютюну, як побічного продукту листків в Індії, становить 1171 кг/га із вмістом олії - 38 % у масовому відношенні, та описали процес його отримання шляхом застосування розчинників. Технологічні процеси отримання олії складаються з механічних (прес) та хімічних (розчинники) методів. На практиці ці дві системи часто комбінують. Загалом, метод механічного отримання застосовують для насіння із вмістом олії більше 20 % (наприклад, ріпак та соняшник), розмір яких підходить для метода пресування. Насіння тютюну, наприклад, через його дуже малий розмір, підлягає вилученню олії шляхом хімічної обробки. Загалом, можливість механічного отримання олії полегшує її пряме отримання на місцях виробництва насіння та на рівні виробництва на невеликих установках для сільськогосподарського застосування. Якщо вміст олії менший, застосовується хімічний метод отримання, який також можна застосувати до макухи, яка залишилася після механічного отримання, для отримання тих 612 % олії, які залишаються після механічної обробки. Олія, вилучена за допомогою розчинників 2 UA 87007 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (наприклад гексану), до комерціалізації для використання у харчуванні, має пройти процедуру очищення. Основним продуктом процесу отримання є неочищена олія; далі в процесі механічного отримання отримують білкову макуху, а у хімічному вилученні - борошно. Останнє, яке застосовують у годуванні тварин, значним чином впливає на економіку виробництва та обробку олійного насіння. В окремих випадках виробництво тісно пов'язане із замовленнями протеїнового борошна (наприклад сої). Неочищену олію можна поступово очистити шляхом проведення ряду фізикохімічних процедур (наприклад, регулювання рівня рН, фільтрація, рафінація гідратацією, знебарвлення й т. ін.), залежно від цільового призначення. Баланс мас у цілому процесі коливається залежно від видів рослин, наприклад, з урахуванням, що вміст олії у соняшниковому насінні – 42 %, на тону насіння (яке є головним продуктом) розглядається 2,6 тонні побічного продукту (біомаси), із виробництвом 420 кг неочищеної олії, 580 кг макухи, отримуючи на заключному етапі 390 кг очищеної олії та 30 кг відпрацьованих залишків. З урахуванням того, що середній врожай соняшникового насіння складає приблизно 2,6 т/га (+/- 15 %), можна розрахувати, що врожай олії на гектар дорівнює приблизно одній тонні. Таке саме відношення можна застосувати до інших видів рослин, особливо до ріпаку, залежно від процентного вмісту олії. Овочеві олії можна застосовувати прямо як паливну олію для виробництва теплової енергії (у пічках та котлах) або механічної енергії (двигуни), із використанням їх вищої теплотворної здатності, яка становить приблизно 8500 ккал/кг, або після їх переробки у біодизельне паливо шляхом переетерифікації. Овочеві олії можна використовувати зі звичайними горілками, замінивши промислове або дизельне паливо для опалення на овочеву олію. Таке рішення є досить цікавим через той факт, що: (і) замінене видобуте паливо часто має однакову ціну з автомобільним дизельним паливом та підлягає дуже високим акцизним зборам; (іі) використання олії в котлах потребує організації дуже простого агроенергетичного процесу, який матиме кінець прямо у сільському середовищі, де виробники палива та його споживачі розташовані дуже близько один до одного або, навіть, пов'язані. Іншим важливим аспектом при розгляді питання місцевого застосування біопалива є складність або легкість процесу отримання олії. Економіка виробництва та більш-менш сприятливий енергетичний баланс головним чином залежатимуть від виробництва паливної олії на гектар землі. Використання овочевих олій у дизельних двигунах потребує, з одного боку, проведення хімічної процедури переетерифікації з метанолом та певною композицією жирних кислот, у підсумковому значенні чого показник йоду має бути не вище 120. Овочеві олії також часто застосовують у харчовій галузі. Залежно від рослини, виробництво може бути спрямоване головним чином на харчову галузь або на енергетичну, а іноді - на обидві галузі одночасно. У рамках вищеназваних питань, доцільним буде, з екологічних міркувань переробляти побічні продукти тютюнової індустрії, які не є шкідливими для людини. Виявлення альтернативного та економічно доцільного використання тютюну пропонує нову цікаву, з економічної точки зору, тему для розгляду всього світу. Суть корисної моделі Заявлена корисна модель розкриває шляхи реалізації тютюну, який здатен на високу продуктивність його окремого компонента: насіння. Названі рослини були отримані шляхом методів соматичного, хімічного або фізичного мутагенезу в штучних умовах та/або шляхом міжвидового схрещення та подальшої хромосомної дуплікації. Надалі такі рослини можуть додатково змінюватись методом генної інженерії. як кінцевий продукт. Таким чином, ніколи не проводилася селекція цих рослин задля максимізації виробництва насіння та не зверталася на це увага. Отже, існує можливість застосувати тютюн для максимізації виробництва насіння, перешкоджаючи виробництву листків. Було несподівано виявлено, що завдяки селекції рослин тютюну шляхом застосування небіологічних методів хімічного, фізичного та соматичного мутагенезу в штучних умовах, міжвидового схрещення, за чим слідує введення амфідиплоїдів, та, додатково, шляхом застосування технологій рекомбінантних ДНК, можна отримати рослини тютюну, яким притаманні наступні якості: - вони демонструють ідеальні характеристики для трансформації сільськогосподарської тютюнової культури з культури для виробництва листків на культуру для виробництва насіння; - вони здатні виробляти насіння в об'ємі з 2000 кілограмів/гектар до 5000 кілограм/гектар, до 7000 кілограм/гектар та навіть до 9000 кілограм/гектар із потенціалом подальшого покращення цього показника насіння/гектар; 3 UA 87007 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - вони мають вміст олії в насінні, який складає до 38 % від маси насіння, до 40 % від маси насіння, до 48 % від маси насіння, до 52 % від маси насіння, до 58 % від маси насіння та навіть до 60 % від маси насіння; - вони мають дуже низьку потребу в агрономічних інвестиціях для захисту від паразитів та бур'янів. Більш того, зовсім не очікувано, з огляду на невеликий розмір насіння тютюну, яке є одним із найменших серед усіх культивованих культур, заявлена корисна модель демонструє, що із цього насіння олію можна вилучати шляхом пресування, таким чином вилучаючи приблизно 80 % всієї олії в насінні, приблизно 90 % всієї олії в насінні, та навіть 95 % всієї олії в насінні, тим самим надаючи можливість здійснювати отримання олії на невеликих установках для сільськогосподарського застосування. Таким чином, задачею корисної моделі є рослини тютюну, які мутагенізовані та/або отримані шляхом міжвидового схрещення, за чим слідують диплоїдизація та селекція, які характеризуються сприянням виробництву насіння в обсязі принаймні 2000 кілограмів/гектар, вказані рослини, які надалі додатково змінюють методом генної інженерії, використання названих рослин для виробництва насіння, виготовлення олії та її похідних, використання названих рослин для виробництва біомас для біохімічної або термохімічної переробки, метод виробництва та селекції названих рослин, насіння названих рослин та їх використання для виробництва олії та її похідних, олія, яка походить з названого насіння, біодизельне паливо, отримане з названого насіння, харчові добавки, отримані з тютюну, тверде паливо, яке містить макуху, яку отримують після пресування насіння тютюну, метод отримання олії з насіння тютюну шляхом пресування. Докладний опис креслень Фіг. 1. Загальні характеристики рослини тютюну, отриманої шляхом хімічного мутагенезу, внутрішньо- та міжвидового схрещення, поліплоїдизації, селекції, введення сомаклональної мінливості, генетичної трансформації для максимізації виробництва насіння на одиницю площі, з високим вмістом олії та із властивостями, необхідними для використання як енергетичного джерела, для застосування у промисловості, та у харчуванні людини та тварини. Головні індуковані та селекційні характеристики: глибока та широка структура коріння; тонкі, прямі ланцетовидні листки; міцне стебло в основі з довгими міжвузлями; компактне широке або колоноподібне суцвіття у формі коробочки; дво- або багатоклапанні коробочки з насінням із прямою верхівкою, які самостійно не розкриваються, розташовані на короткій стеблині, які вміщають приблизно 5000 насінин/коробочку; насіння овальної або еліптичної форми довжиною > 1 мм; висота рослини між 50 та 120 см, стійкість до ушкодження комахами, гербіцидна стійкість, стійкість до ураження грибками, засухостійкість, непостійне співвідношення між компонентами жирних кислот. Фіг. 2. Приклад олії та макухи, вироблених із насіння тютюну шляхом пресування із застосуванням гвинтового преса типу Komet (IBG). Після пресування олію було профільтровано крізь папір, отже вона має високу прозорість. Докладний опис корисної моделі Таким чином, корисна модель пов'язана з отриманням рослин виду Nicotiana як ідеальних культур для виробництва насіння, з якого отримуватимуть паливну олію, біодизельне паливо, протеїни, олію для зоотехнічного використання, для промислового використання, для використання у харчуванні людини. До різновиду сортів Nicotiana, які можна використати як батьківські рослини для виведення рослин цієї корисної моделі, можуть належати, наприклад, наступні види: N. tabacum, N. rustica, N. glauca, N. paniculata, Ν. knightiana, Ν. solanifolia, Ν. benavidesii, Ν. cordifolia, Ν. raimondii, Ν. thyrsi flora, Ν. tomentosa, Ν. tomentosiformis, Ν. otophora, Ν. setchellii, Ν. glutinosa, Ν. ondulata, Ν. arentsii, Ν. wigandioides, Ν. trigonophylla, Ν. palmeri, Ν. sylvestris, Ν. langsdorffii, Ν. alata, Ν. forgetiana, Ν. bonariensis, Ν. longiflora, N. plumbaginifolia, N. repanda, N. stocktonii, N. nesophila, N. moctiflora, N. tomentosiformis, N. otophora, Ν. setchellii, Ν. glutinosa, Ν. petunioides, Ν. acaulis, Ν. ameghinoi, Ν. acuminata, Ν. pauciflora, Ν. attenuata, Ν. miersii, Ν. corymbosa, Ν. linearis, Ν. spegazinii, Ν. bigelovii, Ν. clevelandii, N. nudicaulis, Ν. maritima, Ν. velutina, Ν. gossei, Ν. excelsior, Ν. megalosiphon, Ν. exigua, Ν. goodspeedii, Ν. ingulba, Ν. stenocarpa, Ν. occidentalis, Ν. rotundifolia, Ν. debneyi, Ν. benthamiana, Ν. fragrans, Ν. suaveolens, Ν. obtusifolia. Згідно з корисною моделлю, рослину буде виведено завдяки технологіям мутагенезу, які дозволяють вивести рослину, здатну виробляти більшу кількість насіння, ніж звичайно, порівняно з батьківськими екземплярами. Мутагенез можна викликати шляхом використання стандартних хімічних та/або фізичних технологій обробки насіння тютюну, або завдяки введенню сомаклональних мутантів у штучних умовах. Можна отримати навіть більший обсяг 4 UA 87007 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виробництва насіння завдяки генеруванню гібридних рослин шляхом міжвидового схрещення, з подальшою диплоїдизацією набору хромосом (щоб виключити випадки стерильності у міжвидових гібридів) за допомогою хімічної обробки колхіцином. Рослини, виведені шляхом міжвидового схрещення, можуть бути далі мутагенізовані із застосуванням стандартних хімічних та/або фізичних технологій. Після того як мутантів отримано, їх буде відібрано за ознакою продуктивності насіння, щоб ізолювати та відібрати рослини, які виробляють принаймні 2000 кілограмів насіння на один гектар посіву культури. Згідно з корисною моделлю, рослину буде створено, починаючи з насіння, яке вироблене шляхом: 1) схрещення екземплярів одного виду або 2) схрещення екземплярів різних видів з однаковим числом хромосом (наприклад N. tabacum × N. clevelandii), або шляхом такого схрещення, після чого застосовують методи ембріонних культур та введення поліплоїдів шляхом обробки мутаген колхіцином із застосування технологій, які добре відомі серед спеціалістів у цій сфері, для отримання амфідиплоїдів, або 3) схрещення екземплярів різних видів із різним числом хромосом (наприклад, N. tabacum × N. Trigonophylla), після чого застосовують методи ембріонних культур та введення поліплоїдів шляхом обробки мутаген колхіцином із застосування технологій, які добре відомі серед спеціалістів у цій сфері, для отримання амфідиплоїдів. Як зазначено вище, за відсутністю введення диплоїдизації, як у випадках 1 та 2, насіння буде мутагенізоване із застосуванням хімічних та/або фізичних технологій; коли мутація числа хромосом викликана диплоїдизацією, як у випадках 2 та 3, можна проводити селекцію зазначеного мутованого насіння, яке отримане таким чином, або яке надалі мутагенізоване із застосуванням хімічних та/або фізичних технологій. Можуть бути застосовані стандартні технології мутації, відомі професіоналам у цій сфері, такі як, наприклад, обробити насіння етилметан-сульфонатом (ЕМС) (наприклад, у водному розчині - у концентрації 0,5 %) та залишити ЕМС у контакті з насінням на певний час, наприклад, як зазначено в прикладі 1, або, як раніше було зазначено, - колхіцином, щоб таким чином викликати поліплоїдизацію, або проведенням X або Гаммаопромінення у потрібних полях, або відповідно до будь-якого запису в літературі, який використовували для мутагенезу рослин або проведення великомасштабного добору. Таким чином оброблене насіння проросте, та рослини покоління М 2 будуть відбиратись на основі наступних характеристик: форма суцвіття, кількість коробочок, кількість насіння в коробочці, розмір насіння, форма листків, розмір структури коріння, стеблина листка та ін… Згідно з корисною моделлю, будуть відібрані рослини з наступними характеристиками: висота рослини 80-120 см, листки з тонкою пластиною та прямою стеблиною, компактне суцвіття, кількість квіток - більше 100, кількість коробочок - більше 100, кількість насіння у коробочці - більше 5000, дерев'янисте та міцне стебло, глибоке коріння. Кількість насіння, яке виробляють відібрані рослини, потім перевірятиметься у відкритому полі, та будуть відібрані лише ті рослини, які виробляють принаймні 20 центнерів насіння на гектар, з густиною посіву приблизно зі 125000 до 250000 рослин на гектар. Із застосуванням хімічного та фізичного мутагенезу та соматичного мутагенезу отримують мутантів різного класу, тим самим підвищуючи вірогідність отримати потрібні варіанти. Наприклад, мутант із ланцетоподібним листком та прямою вертикальною стеблиною допомагає підвищити густоту посіву, який не перешкоджатиме надходженню світла, важливого для фотосинтезу, та, таким чином, збільшити об'єм виробництва насіння на гектар площі. А, наприклад, більш глибока структура коріння мутанта, сприяє його кращому закріпленню та кращому надходженню поживних речовин до рослини. Наприклад, мутант із більш компактним суцвіттям та більшим числом коробочок сприяє підвищенню кількості насіння, яке виробляє кожна окрема рослина. Корисна модель охоплює таким чином отримані та виведені рослини, які виробляють насіння в обсязі принаймні 2000 кілограмів/гектар. Рослини, відібрані за цією корисною моделлю, змінюють задля забезпечення виробництва насіння в обсязі до 9000 кілограмів на гектар посіву, отже - 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 кілограмів на гектар посіву проти 1000-1200 кілограмів, які зазвичай виробляють рослини тютюну, виведені для виробництва листків. Рослини за цією корисною моделлю також можна отримати шляхом введення сомаклональних варіантів, у яких вищезазначене насіння може бути оброблене за допомогою гіпохлориту натрію, а потім 70 % етанолу; з рослин, які проросли з такого насіння, беруть листові частини і викликають утворення калюсів та відновлюють їх у штучних умовах у 5 UA 87007 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перемінному часі зі вказаних частин. З таких калюсів рослини отримують нові характеристики, такі як: форма суцвіття, кількість коробочок, кількість насіння в одній коробочці, розмір насіння, форма листків, розмір структури коріння, стеблина листка, об'єм виробництва насіння, вміст олії у насінні, композиція жирних кислот в олії, вміст протеїнів у насінні та інші перероджені якості, при чому, такі рослини відбирають за вищевказаними параметрами. Рослини цієї корисної моделі можуть бути надалі відібрані за наявністю наступних характеристик: відсотковий вміст олії у насінні, композиція жирних кислот олії, вміст протеїну в насінні та ін. Вищеописані рослини можуть бути далі змінені із застосуванням технологій рекомбінантної ДНК для отримання більш вигідних характеристик, якщо такі характеристики не були вже притаманні селекційним мутантам, таких як: підвищення процентного вмісту олії у насінні, різна композиція жирних кислот, залежно від цільового призначення олії, стійкість до ушкодження комахами, гербіцидна стійкість, стійкість до ушкодження грибками й т. ін.. Для генетичної трансформації рослин цієї корисної моделі можуть бути використані вектори, необхідні для трансформації клітин рослини, а також касети експресії, які допомагають експресії важливого гена усередині рослини. Залежно від того, де має бути експресований важливий ген: у зеленій частині рослини (наприклад, гени для стійкості до ушкоджень паразитами або до гербіцидної стійкості) або у насінні (наприклад, гени, задіяні у метаболізмі жирних кислот), можна вибрати вектори, відомі у цій сфері, які забезпечать експресію зазначених генів у необхідній частині рослини. Отже, можна застосовувати вектори з конститутивними активаторами, які відомі за сучасних технологій, або з індуцибельними активаторами, наприклад, при атаках паразитів, або у формуючій капсулі. Оскільки рослини цієї корисної моделі вибрані для високої продуктивності насіння та являють собою продукт вказаного необхідного насіння, вектори, які складаються зі спеціальних касет експресії насіння, які забезпечать експресію гетерологічних введених генів у насінні рослини корисної моделі, підходитимуть найбільше. Для генетичної трансформації можна застосувати Agrobacterium tumefaciens або систем для фізичного транспортування ДНК. Під час практичного виконання цієї корисної моделі вигідним буде створити рослини, які матимуть не лише високу продуктивність насіння, а й стійкість до пошкодження комахами, гербіцидну стійкість, стійкість до пошкодження грибками, засухостійкість, що значно зменшить витрати на культивацію, збільшить продуктивність цієї культури та знизить вплив на навколишнє середовище. У цих випадках можна застосувати вектори, які складаються з гена стійкості до канаміцину як показника, регулюючого області, які дозволяють конститутивну експресію (наприклад, 35S або промотор убіквітину) важливих генів, таких як край ген Bacillus thuringiensis, aroA ген Salmonella typhimurium, Rptl ген N. obtusifoli. Ці гени сприяють, у тому ж порядку, утворенню рослин, стійких, відповідно, до: комах, гербіцидів, грибкових захворювань, та можуть бути введені із застосуванням стандартних технологій передачі генів, відомих спеціалістам у цій сфері. Якості стійкості можуть бути введені після одного або більше процесів трансформації з кількома векторами або, завдяки тому факту, що рослини можна легко схрещувати, стійкості можуть бути введені в єдиному числі у різні екземпляри однієї селекції та поступово зібрані у тому ж екземплярі шляхом схрещення. У цьому випадку буде легко отримати гомозиготність для всіх ознак шляхом дуплікації гаплоїдів, отриманих із культур пильників in vitro. Генетичну трансформацію можна провести аналогічним чином для метаболічної інженерії, спрямованої на підвищення кількості олії, зібраної в насінні, та на модифікацію шляху метаболізму жирних кислот. У цьому випадку можливо використати регулюючі області зі специфічною активністю насіння, як промотор глобулінів, та спрямувати ферментні білки до ендоплазматичного ретикулюма, де вони можуть бути стабілізовані із введенням спеціального сигналу, такого як KDEL, або звідки вони можуть бути переміщені до пластид із введенням спеціальних сигналів амінокислоти, наприклад, лідерної послідовності маленької субодиниці RuBisCO. Наприклад, кількість олії та її склад жирних кислот можна змінити шляхом зміни експресії генетичного кодування ферментів, таких як, лиш як приклад, ацетил-СоА карбоксилаза (ACCase), діацил-гліцерол ацилтрансфераза (DGAT), лізофосфатидат ацил трансфераза (LPAT), Фосфатидат фосфогідролаза (PAPase) білок, який переносить ацил (АСР), малонілСоА:АСР трансацилаза, кетоацил-АСР синтаза (KAS), кетоацил-АСР редуктаза, 3-гідроксіацилАСР дегідраза, еноїл-АСР редуктаза, стеароїл-АСР десатураза, ацил-АСР тіоестераза, 6 UA 87007 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 гліцерол-3-фосфатеацилтрансфераза, 1-ацил-sn-гліцерол-3-фосфат ацилтрансфераза, цитидин-5-дифосфат-діацилгліцерол синтаза, фосфатидил гліцерофосфат синтаза, фосфатидил гліцерол-3-фосфат фосфатаза, FAD1-8 десатураза, фосфатаза фосфатидної кислоти, моногалактозил діацил гліцерол синтаза, дигалактозил діацил гліцерол синтаза, білок біосинтезу сульфоліпіду, довголанцюгова ацил-соА синтаза, гліцерол-3-фосфат ацилтрансфераза (GPAT), діацилгліцерол холінфосфіновий трансфераза, фосфатдилінозит синтаза, ацил-СоА діацилгліцерол ацилтрансфераза, ацил-АСР десатураза, лінеоїл десатураза, сфінголіпід десатураза, олеат 12-десатураза, ацетиленаза жирної кислоти, епоксигеназа жирної кислоти, діацилгліцерол кіназа, холінфосфат цитидил трансфераза, холін кіназа, фосфоліпаза, фосфатидилсерин декарбоксилаза, фосфатидилінозит кеназа, кетоацилСоА синтаза, фактор транскрипції CER, олеозин, 3-кетоацил-СоА тіолаза, ацил-СоА дегідрогеназа, еноїл-СоА гідратаза, ацил-СоА оксидаза. Відповідно до цієї корисної моделі, збільшення загального вмісту олії у насінні можна отримати, встановивши надмірну експресію ацетил СоА карбоксилази тютюну або такого ж ферменту іншого виду (наприклад, винограду). Наприклад, зміну у профілі жирної кислоти, а звідси - і у кількості йоду, можна отримати шляхом "виключення" за допомогою експресії антизначеннєвих компонентів, генетичного кодування олеат для олеат десатурази пластиду та ендоплазматичного ретикюлюма. Експресія або "виключення" одного або більше таких генів у насінні рослин цієї корисної моделі приводить до того, що олію, яку виробляє таке насіння, можна прямо використовувати для виробництва біодизельного палива, оскільки вміст йоду у ньому менший за або дорівнює 120. Експресія вказаних генів може також вплинути на процентний вміст олії у насінні, та рослини за цією корисною моделлю можна далі добирати за вмістом олії у насінні, який може дорівнювати приблизно 38 % від маси насіння, 40 %, 48, 52 %, 58 % та навіть 60 %. Вищевказані гени можна також ввести у векторах для спеціальної експресії, таких, які описані у патентній заявці WO03073839, керуючись технологіями, описаними у цій заявці. Отже, для втілення цього, експресійний вектор має складатися з: а) промотору гена рослини, призначеного для експресії у органах накопичення насіння; б) кодування послідовності ДНК для послідовності сигналів білка рослини, який здатен направити продукт необхідного гену до органів накопичення насіння через ендоплазматичний ретикюлюм; в) кодування послідовності ДНК для вказаного необхідного гену, позбавленого власної послідовності сигналів; г) стоп сигнал. Промотори та лідерні послідовності можуть належати, наприклад, глобуліну 7S сої або гену сої бета-конгліциніну, або генетичному кодуванню запасних білків насіння тютюну. Вищезазначені гени можна ввести після одного або більше процедур трансформації, або шляхом трансформації із застосування кількох векторів, або як альтернативи, оскільки рослини можна легко схрещувати, ці гени можна вводити поодиноко у різні екземпляри однієї селекції та поступово згрупувати їх у тому самому екземплярі шляхом схрещення. У такому випадку буде легко отримати гомозиготність усіх ознак шляхом дуплікації гаплоїдів, отриманих від культур пильників у штучних умовах. Склад жирних кислот окремих сортів тютюну, відібраних лише після мутагенезу або сконструйованих та відібраних для зміни шляху метаболізму жирних кислот, та відібраних задля стабільності ознаки. У таблиці подані результати, отримані завдяки мутагенезу та генетичному втручанню шляхом введення окремих генів із вищенаведеного переліку для зміни кислотного складу; олія у трьох останніх стовпчиках має показник йоду, який підходить для трансформації цієї олії у біодизельне паливо. Таблиця 1 Компонент Пальмітинова кислота Пальмітолеїнова кислота Стеаринова кислота Олеїнова кислота Лінолеїнова кислота Ліноленова кислота Арахідинова кислота Ейкозанова кислота PLT 103 6,31 % 0,11 % 2,58 % 12,62 % 77,48 % 0,65 % 0,13 % 0,13 % PLT 256 8,26 % 0,18 % 5,20 % 22,58 % 58,78 % 4,15 % 0,85 % 0,58 % PLT 318 7,15 % 0,18 % 8,50 % 25,56 % 52,00 % 5,25 % 0,80 % 0, 56 % PLT 335 17,20 % 1,25 % 12,50 % 53,27 % 6,45 % 7,80 % 0,85 % 0,68 % Об'єктом цього дослідження також виступає насіння рослин, як сказано вище, яке, будучи насінням мутантних рослин, також є мутантним та мітить модифікації ДНК, які відрізняють його 7 UA 87007 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 від дикого типу насіння. Більш того, як зазначено вище, це насіння може мати інше число хромосом, порівняно з їх первинними рослинами (наприклад, поліплоїдів) та, в багатьох випадках, буде трансформоване з вищезазначеними векторами. Після здійснення трансформації за допомогою векторів, які експресують гени, пов'язані з метаболізмом жирних кислот, які вказані вище, такому насінню також буде притаманний вміст олії з показником йоду не вище за 120 та процентний вміст олії - між 38 % та 60 % від загальної маси насіння. Об'єктом цієї заявки також є метод виробництва рослини за цією корисною моделлю, який складається з наступних етапів: a) насіння, отримане шляхом початкових схрещень між екземплярами одного виду, який належить до дикого типу; або одібрані зразки підлягають мутагенезу; b) таке насіння проростає, та рослини поколінь М2-М4 відбираються за наступними параметрами: і) наявність характеристик, які проявляються на фенотипному рівні відібраної групи, до яких належать: висота рослини 80-120 см, листки з тонкою пластинкою та прямою стеблиною, компактне суцвіття, кількість квіток вища за 100, кількість коробочок вища за 100, кількість насіння у одній коробочці - вища за 5000, міцне та дерев'янисте стебло, глибоке коріння; іі) стабільність селекційних ознак у поколіннях після покоління М2; ііі) перевірка спадковості селекційної ознаки; c) насіння, одібране на стадії b) проростає та рослини регенеруються починаючи з калюсу, який отримують з індукованого у штучних умовах мезофілу листка у присутності фітогормонів; відбираються рослини, у яких підтримуються ознаки, відібрані на стадії b) у поколінь R0-R2; d) рослини, відібрані на стадії с) висаджуються у відкритому полі, та рослини, які виробляють принаймні 2 000 кілограмів насіння на гектар посіву, вибираються. У цьому описаному методі рослини, отримані на стадії а), також можна отримати шляхом а') здійснення міжвидового схрещення в рамках виду Nicotiana, після чого проводиться зворотне схрещення F1, або шляхом введення амфідиплоїдів під час обробки верхівки пагону колхіцином. Рослини, отримані за допомогою вищенаведених методів, можна далі передавати на стадію е) та/або f) та на кінцеву стадію g), як зазначено нижче: e) генетична трансформація рослин, отриманих на стадіях a-d або a'-d за допомогою векторів, які містять експресійні касети, які експресуються у рослинних генах стійкості до пошкодження комахами, гербіцидної стійкості та/або стійкості до грибкових захворювань, одібраних у групу, до складу якої входять cry ген Bacillus thuringiensis, aroA ген Salmonella typhimurium, Rpt1 ген N. Obtusifolia, та селекція таким чином трансформованих рослин у поколіннях Т0-Т4 за стійкістю до пошкодження комахами, гербіцидної стійкості та/або стійкості до грибкових захворювань; f) генетична трансформація рослин, отриманих на стадіях a-d або a'-d за допомогою одного або більше векторів, які містять експресійні касети, які експресуються у генах метаболізму жирних кислот насіння, одібраних до групи, до складу якої входять ацетил-СоА карбоксилаза (ACCase), діацил-гліцерол ацилтрансфераза (DGAT), лізофосфатидат ацил трансфераза (LPAT), фосфатидат фосфогідролаза (PAPase) білок, який переносить ацил (АСР), малонілСоА:АСР трансацилаза, кетоацил-АСР синтаза (KAS), кетоацил-АСР редуктаза, 3-гідроксіацилАСР дегідраза, еноїл-АСР редуктаза, стеароїл-АСР десатураза, ацил-АСР тіоестераза, гліцерол-3-фосфатеацилтрансфераза, 1-ацил-sn-гліцерол-3-фосфат ацилтрансфераза, цитидин-5-дифосфат-діацилгліцерол синтаза, фосфатидил гліцерофосфат синтаза, фосфатидил гліцерол-3-фосфат фосфатаза, FAD1-8 десатураза, фосфатаза фосфатидної кислоти, моногалактозил діацил гліцерол синтаза, дигалактозил діацил гліцерол синтаза, білок біосинтезу сульфоліпіду, довголанцюгова ацил-соА синтаза, гліцерол-3-фосфат ацилтрансфераза (GPAT), діацилгліцерол холінфосфіновий трансфераза, фосфатдилінозит синтаза, ацил-СоА діацилгліцерол ацилтрансфераза, ацил-АСР десатураза, лінеоїл десатураза, сфінголіпід десатураза, олеат 12-десатураза, ацетиленаза жирної кислоти, епоксігеназа жирної кислоти, діацилгліцерол кіназа, холінфосфат цитидил трансфераза, холін кіназа, фосфоліпаза, фосфатидилсерин декарбоксилаза, фосфатидилінозит кеназа, кетоацилСоА синтаза, фактор транскрипції CER, олеозін, 3-кетоацил-СоА тіолаза, ацил-СоА дегідрогеназа, еноїл-СоА гідратаза, ацил-СоА оксидаза, після чого проводять селекцію рослин у поколіннях Т0-Т4 за такими характеристиками, як загальний вміст олії у насінні та склад його жирних кислот; g) схрещення матеріалів, отриманих на стадіях a-f або a'-f, та селекція отриманого в результаті цього потомства за наступними характеристиками: висока продуктивність насіння, 8 UA 87007 U 5 10 15 20 25 30 35 високий вміст олії у насінні, різний склад жирних кислот олії, залежно від її цільового призначення, стійкість до пошкодження комахами, гербіцидна стійкість та стійкість до грибкових захворювань. Рослини на стадіях між b та f можуть, наприклад, бути відібрані за наявністю характеристик, які можна виявити під час хімічного аналізу, таких як загальний склад олії насіння та/або склад окремих кислотних компонентів насіння та/або білковий склад насіння. Наступним об'єктом цієї корисної моделі є метод отримання олії з насіння тютюну, якщо вихід олії дорівнює показникам від 70 % до 95 % вмісту олії у такому насінні, який складається з наступних етапів: a) механічне отримання такої олії шляхом пресування, внаслідок чого отримують олію та макуху; b) фільтрація олії, отриманої на етапі а) за допомогою паперового або тканинного фільтру. Як не дивно, але вищезазначений метод забезпечує вихід вище 70 %, що є зовсім не очікуваним результатом після застосування названого методу пресування до такого дрібного насіння, як насіння тютюну. За умов цієї корисної моделі, де відібрані рослини з високою продуктивністю насіння для підвищення виробництва тютюнової олії на одну рослину, відкриття, що метод пресування, застосований до насіння тютюну, забезпечує вихід продукції, який можна порівняти з виходом після його застосування до крупного насіння, можна дуже вигідно застосувати. Окрім менших витрат на виробництво та зовсім неочікуваного виходу продукції, цей метод дозволяє вилучати тютюнову олію прямо на місцях, де його треба застосувати у енергетичних цілях. Як спосіб реалізації цього методу, насіння за цією корисною моделлю можна піддати холодному пресуванню із застосуванням гвинтового преса або преса іншого виду, в який завантажується насіння. Такий прес може досягати температури приблизно 60 °C при безперервній роботі, а віджата з насіння олія збирається та фільтрується крізь папір або крізь фільтрувальну тканину преса. Для пресування тютюнового насіння можна також застосовувати інші пресувальні системи, які підходять для насіння. Для того, щоб покращити результативність методу за цією корисною моделлю, для досягнення максимального виходу олії з насіння, можна виконати наступний крок: c) хімічне отримання, із застосуванням розчинників, залишкової олії з макухи, яку отримують на етапі а). Характеристики тютюнової олії, отриманої шляхом пресування насіння та фільтрування. У таблиці наведені вищий показник вищої теплотворної здатності, нижчий показник вмісту сірки та нижчий показник в'язкості, порівняно з іншими овочевими оліями. Таблиця 2 Параметр Точка займання Сірка Зола В'язкість при 50 °C Точка плавлення Теплотворність Об'ємна маса при 15 °C Число омилення 40 45 Показник 236,0

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Mutagenized tobacco plant as seed culture for the production of oil for energetic, industrial and alimentary uses

Автори англійською

Fogher, Corrado

Автори російською

Фогэр Корадо

МПК / Мітки

МПК: C12N 15/82, A01H 1/06

Мітки: саджанець, енергетиці, використання, промисловості, виробництві, олії, харчуванні, тютюну, посівна, культура, мутагенізований

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/19-87007-mutagenizovanijj-sadzhanec-tyutyunu-yak-posivna-kultura-pri-virobnictvi-oli-dlya-vikoristannya-v-energetici-promislovosti-ta-kharchuvanni.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Мутагенізований саджанець тютюну як посівна культура при виробництві олії для використання в енергетиці, промисловості та харчуванні</a>

Подібні патенти