Терапевтичні композиції кератиноцитарного фактора росту

1. Композиція ліофілізованого кератиноцитарного фактора росту (КФР), що включає КРФ, буферний гістидин, наповнювач, цукор та поверхнево-активну речовину, де КРФ включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NО:2, SEQ ID NО:3 та їхніх варіацій. 2. Композиція за п.1, яка відрізняється тим, що КФР включає амінокислотну послідовність SEQ ID NО:2. 3. Композиція за п.1, яка відрізняється тим, що КФР включає ∆N23 КФР і представлений в SEQ ID NО:3. 4. Композиція за п.1, яка відрізняється тим, що наповнювач є манітолом. 5. Композиція за п.4, яка відрізняється тим, що манітол знаходиться у концентрації від приблизно 2% до приблизно 5% (w/v). 6. Композиція за п.5, яка відрізняється тим, що манітол знаходиться у концентрації 4 %. 7. Композиція за п.1, яка відрізняється тим, що цукор є сахарозою. 2 (19) 1 3 88497 4 а) регулювання рН розчину відносно рН між приблизно 6,0 та приблизно 8,0; б) готування розчину, що включає кератиноцитарний фактор росту; в) буферний обмін розчину із стадії (б) на розчин із стадії (а); г) додавання відповідної кількості поверхневоактивної речовини, та д) ліофілізацію суміші із стадії (г). 21. Спосіб за пунктами 19 або 20, який відрізняється тим, що кератиноцитарний фактор росту вибраний із групи, що складається з SEQ ID NО:2, SEQ ID NО:3 та їхніх варіацій. 22. Спосіб за пунктами 19 або 20, який відрізняється тим, що кератиноцитарний фактор росту включає амінокислотну послідовність SEQ ID NО:2. 23. Спосіб за пунктами 19 або 20, який відрізняється тим, що кератиноцитарний фактор росту включає ∆N23 КФР, представлений в SEQ ID NО:3. 24. Спосіб за п.20, який відрізняється тим, що поверхнево-активна речовина являє собою ефір поліоксіетиленової жирної кислоти 20. 25. Спосіб лікування пацієнта, що страждає на хворобу, шляхом підвищення КФРопосередкованою стимуляцією росту епітеліальної тканини, який включає керування об'єктом ефективною кількістю ліофілізованого кератиноцитарного фактора росту за п.1. 26. Спосіб за пунктом 25, який відрізняється тим, що хворобою, на яку страждає пацієнт, може бути токсичність кишки; запалення слизової; опік або інше місцеве або глибоке враження; пересадження фолікул волосся, потових залоз та сальних залоз; аднексальна структурна проліферація; бульозний епідермоліз; облисіння, спричинене хіміотерапією; чоловіче облисіння; виразки шлунку; виразки дванадцятипалої кишки; ерозивні гастрити; езофагітний або стравохідний рефлюкс; запалення кишки; хвороба гіалінової мембрани; пошкодження від вдихання диму; емфізема; цироз печінки; недостатність функції печінки; гострий вірусний гепатит, інші токсичні враження печінки або хвороба „трансплантант проти хазяїна" (РТПХ). 27. Комплект для приготування водної фармацевтичної композиції, що включає перший контейнер з композицією ліофілізованого кератиноцитарного фактора росту (КФР) за будь-яким з пп.1-18 та другий контейнер з фізіологічно придатним розчинником для ліофілізованої композиції. 28. Комплект за п.27, який відрізняється тим, що кератиноцитарний фактор росту вибраний з групи, що складається з SEQ ID NО:2, SEQ ID NО:3 та їхніми варіаціями. 29. Комплект за п.27, який відрізняється тим, що кератиноцитарний фактор росту включає амінокислотну послідовність SEQ ID NО:2. 30. Комплект за п.27, який відрізняється тим, що кератиноцитарний фактор росту включає ∆N23 КРФ, представлений в SEQ ID NО:3. Даний винахід відноситься до композицій ліофілізованого кератиноцитарного фактору росту і способів виготовлення ліофілізованої композиції, що включає кератиноцитарний фактор росту. Кератиноцитарний фактор росту (КФР) - це фактор росту характерний для епітеліальних клітин, який був вперше отриманий в кондиціонованому середовищі колонії ебріологічних фібробластичних клітин легенів людини [Rubin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 802-806 (1989)]. Експресія молекули РНК для КФР була виявлена в декількох колоніях стромальних фібробластичних клітин, отриманих з епітеліальних тканин на багатьох стадіях розвитку. Транскрипт для КФР був також очевидним в РНК, що була отримана з нормальної нирки дорослої людини та органів шлунковокишкового тракту [Finch et al., Science 245: 752-755 (1989)]. Очевидно, що КФР виділено з фібробластів в культурі і виражено in vivo в дермісі, але епідерміс не вказує на те, що КФР може бути важливим стандартним паракриновим ефектором в кератиноцитарній проліферації. Дослідження показали, що КФР є настільки ж ефективним як і епідермальний фактор росту (ЕФР) в стимуляції проліферації первинних або вторинних людських кератиноцитів в тканинній культурі [Marchese et al., J. Cell. Phys. 144: 326-332 (1990)]. КФР виробляють з клітин мезенхіми біля епітелію багатьох органів, включаючи епідерміс, ротовий та нижній шлунково-кишковий епітелій, підшлункову залозу, печінку, легені, уротелій, епітелій простати та інші. [Finch et al, supra, Housely et al., J Clin Invest. 94: 1764-77, (1994); Yi et al., Am J Path. 145: 80-85, (1994); Pierce et al., J Exp. Med. 179831-40, (1994); Yi et al., J Urol. 154: 1566-70, (1995); та Ulich et al., J Clin Invest. 93: 1298-1306, (1994)]. Очищення КФР від кондиціонованого середовища колонії ебріологічних фібробластичних клітин людини, також часткове секвенування амінокислотою очищеного КФР, клонування КФР гену, та експресія гену в бактеріальних клітинах для отримання біологічно активного рекомбінантного КФР, описані в міжнародній патентній публікації WO 90/08771. Ця публікація також розкриває, що КФР або КФР-подібні поліпептиди використовуються в якості ранозаживляючих агентів для опікових ран або для стимуляції пересадженої роговичної тканини. Ex vivo та in vivo дослідження нормальних дорослих тварин показали, що КФР-1 (надалі «КФР») викликає зміни у морфогенезі фолікул волосся, проліферації клітини печінки та проліферації епітеліальних клітин легенів, грудей, підшлункової залози, шлунку, малого кишечника та великого кишечника [Panos et al., J. Clin. Invest. 92: 969-977 (1993); Ulich et al., Am. J. Path. 144: 862-868 (1994); Yi et al., Am. J. Path. 145: 80-85 (1994); та Ulich et al., J. Clin. Invest. 93: 1298-1306 (1994)]. Роль КФР в розвитку ембріону та новонародженого зараз вивчається; однак, КФР був відмічений як важлиий 5 фактор розвитку сім'янного пухирця у новонародженої миші [Alarid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1074-1078 (1994)]. Крім твго, зверхвиражений КФР у печінкових клітинах мишей виявляє полікістозні нирки [Nguyen et al., Oncogene 12: 2109-19, (1996)], в той час як зверхвираження КФР в легенях з використанням поверхнево-активної речовини в якості активатора призводить до мишей з легеневим цистадемонасом [Simonet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 12461-65, (1995)], демонструючи важливість КФР в нормальному печінковому і легеневому розвитку. КФР був виявлений для підвищення повторної епітелізації та підвищеної щільності епітелію, в той час як рекомбінантний КФР був локально використаний для ран, спричинених хірургічним шляхом, у вусі кроля або шкірі свині. [Pierce et al., J. Exp. Med. 179: 831-840 (1994); Staiano-Coico et al., J. Exp. Med. 178: 865-878 (1993)]. Bosch, et al., [J. Clin. Invest. 98: 2683-2687 (1996)] повідомили, що використання кератиноцитарного фактору росту стимулюватиме проліферацію клітин печінки. В основному, очищені поліпептиди виявляються стабільними тільки у рідкому стані та переносять хімічну та фізичну деградацію, що приводить до втрати біологічної активності протягом обробки та збереження. Крім того, поліпептидні композиції у водному розчині переносять гідроліз, такий як дезамідування та пептидне розщеплення зв'язку. Ці дії являють собою серйозну проблему для терапевтично активних поліпептидів, які призначені для введення людині у визначеному дозованому об'ємі, основаному на біологічній активності. Введення очищеного кератиноцитарного фактору росту залишається багатообіцяючим засобом для лікування багатьох хвороб, які спричиняють шкоду людям. Однак, здатність КФР залишатися стабільною фармацевтичною композицією протягом часу при різних умовах зберігання і потім бути ефективним для пацієнтів in vivo не була направленою. Таким чином, існує потреба в здатності забезпечувати кератиноцитарний фактор росту в стабільних композиціях, що використовуються в якості терапевтичних агентів для лікування багатьох хвороб, які мають користь від КФРпроміжного стимулювання зростання епітеліальної клітини. Даний винахід представляє нову композицію, корисну для ліофілізації кератиноцитарного фактору росту (КФР), що приводить до надзвичайно стійкого КФР-продукту. Стійкий КФР-продукт використовується як терапевтичнй агент при лікуванні людей, які страждають на розлади або стани, які можуть покращитися при введенні КФР. В одному аспекті, винахід представляє композицію ліофілізованого кератиноцитарного фактору росту, що включає гістидін, наповнювач, поверхнево-активну речовину, і цукор, як стабілізуючий цукор. При одному виконанні, композиція КФР включає амінокислотну послідовність SEQ ID NО:2 або її варіант. Варіант КФР білків включає алельні варіації, або делеції, заміщення або включення амінокислот, включаючи, фрагменти, химерні або 88497 6 гібридні молекули природного КФР. Наприклад, винахід розглядає КФР як ΔΝ23 КФР (SEQ ID NО:3), де перші 23 амінокислоти природного КФР видалені. Варіанти включають молекули, описані тут, такі як поліпептиди із змінним зарядом, де один обо більше амінокислотних залишків 41-154 природного КФР (SEQ ID NО:2) вилучені або замінені на нейтральний залишок або негативно заряджений залишок, вибраний для виготовлення білка із зменшеним позитивним зарядом. Наступний приклад КФР включає, але не обмежується, білки, виготовлені заміною принаймні однієї амінокислоти, що має вищий петлеформуючий потенціал для щонайменше однієї амінокислоти в петлеформуючій зоні Asn115-His116-Туr117-Asn118-Thr119 природного КФР. Наступний приклад включає білки, що мають одине або більше амінокислотних заміщень, делецій або додатків в зоні амінокислот 123-133 (амінокислоти SEQ ID NО:2 154-164) природного КФР. В одному аспекті, винахід розглядає використання наповнювача/регуляторного агенту осмотичного тиску. Наповнювачі можуть бути або кристалічними (наприклад, гліцин, манітол), або аморфними (наприклад, L-гістидін, сахароза, полімери такі як, декстран, полівінлпіролідон, карбоксиметилцелюлоза та лактоза). При одному виконанні наповнювач - це манітол. В наступному ваконанні манітол був включений при концентрації від приблизно 2% до приблизно 5% w/v. При ще наступному виконанні концентрація становить від приблизно 3% до приблизно 4,5% w/v. В наступному виконанні манітол знаходиться у концентрації 4% w/v. В іншому аспекті, винахід представляє композицію, що включає стабілізуючий цукор. Цукри, що розглядаються для використання, включають, але не обмежуються, сахарозу, трегалозу або гліцин. При одному виконанні цукор являє собою сахарозу. При подібному виконанні сахароза знаходиться в концентрації приблизно 1-3% w/v. При подальшому виконанні сахароза знаходиться у концентрації - 2%. Передбачається, що композиція винаходу приведена до рН в межах від приблизно 5.0 до приблизно 8.0. При одному виконанні КФРкомпозиція має рН в межах від приблизно 6.0 до приблизно 8.0. При іншому виконанні КФРкомпозиція має рН в межах від приблизно 6.0 до приблизно 7.0. При подальшому виконанні композиція має рН приблизно 6.5. Надалі композиція розглядає використання поверхнево-активної речовини. Передбачається, що використання поверхнево-активної речовини включає, але не обмежується, ефір поліоксіетиленової жирної кислоти 20 або ефір поліоксіетиленової жирної кислоти 80. При одному виконанні поверхнево-активна речовина являється ефіром поліоксіетиленової жирної кислоти 20. При подібному виконанні концентрація ефіру поліоксіетиленової жирної кислоти 20 знаходиться в межах від приблизно 0.1% до приблизно 0.004% w/v. При подальшому виконанні концентрація ефіру поліоксіетиленової жирної кислоти 20 становить приблизно 0.01% w/v. 7 В одному аспекті, винахід розглядає ліофілізований керотиноцитарний фактор росту, який включає 10mМ гістидіну, 4% манітолу, 2% сахарози та 0.01% ефіру поліоксіетиленової жирної кислоти 20, де композиція має рН6.5. Винахід далі представляє спосіб утворення ліофілізованого кератиноцитарного фактору росту, що включає наступні стадії: а) приготування розчину гістидіну, наповнювача, стабілізуючого цукру; та поверхнево-активної речовини; та b) ліофілізацію вказаного КФР. В подібному аспекті винахід розглядає спосіб утворення ліофілізованого кератиноцитарного фактору росту, що надалі включає, перед стадією ліофілізації: b) регулювання рН розчину до рН між приблизно 6.0 до приблизно 8.0; с) приготування розчину, що містить кератиноцитарний фактор росту; d) буфер, який замінює розчин стадії (с) на розчин стадії (b); e) додавання відповідної кількості поверхнево-активної речовини, та f) ліофілізацію суміші із стадії (e). Далі передбачається, що КФР може бути КФР-білком, який виражається в SEQ ID NО:2, SEQ ID NО:3 або їхніх різновидностях. В одному аспекті спосіб винаходу представляє використання наповнювача/регуляторного агенту осмотичного тиску, де наповнювачі можуть бути або кристалічними (наприклад гліцин, манітол) або аморфними (наприклад, L-гістидін, сахароза, полімери, такі як, декстран, полівінлпіролідон, карбоксиметилцелюлоза, та лактоза). При одному виконанні, наповнювач - це манітол. При наступному виконанні манітол знаходиться в концентрації від приблизно 2% до приблизно 5% w/v. При подібному варіанті концентрація становить від приблизно 3% до приблизно 4,5% w/v. В наступній варіації манітол знаходиться у концентрації 4% w/v. В іншому аспекті, спосіб винаходу представляє композицію, що включає цукор, де він представляє собою стабілізуючий цукор. Цукри, що розглядаються для використання в способі, включають, але не обмежуються, сахарозу, трегалозу або гліцин. При одному виконанні цукор являє собою сахарозу. При подібному виконанні сахароза знаходиться у концентрації приблизно 1-3% w/v. При подальшому виконаним сахароза знаходиться у концентрації 2%. Передбачається в способах винаходу, що рН приведений до фізіологічного рН. При одному виконанні рН приведений до приблизно від 5.0 та приблизно до 8.0. При іншому виконанні рН приведений до приблизно від 6.0 та приблизно до 8.0. При подальшому виконанні рН приведений до приблизно від 6.0 та приблизно до 7.0. В ще подальшому виконанні рН приведений до значення рН6.5. В наступному аспекті способи винаходу розглядають використання поверхнево-активної речовини. Передбачається, що використання поверхнево-активної речовини включає, але не обмежується, ефір поліоксіетиленової жирної кислоти 20 або ефір поліоксіетиленової жирної кислоти 80. При одному виконанні поверхнево-активна речовина є ефіром поліоксіетиленової жирної кислоти 20. При подібному виконанні концентрація ефіру поліоксіетиленової жирної кислоти 20 скла 88497 8 дає приблизно від 0.1% до приблизно 0.004% w/v. При подальшому виконанні концентрація ефіру поліоксіетиленової жирної кислоти 20 складає приблизно 0.01% w/v. В одному аспекті винахід розглядає спосіб утворення композиції ліофілізованого кератиноцитарного фактору росту, що включає 10mМ гістидіну, 4% манітолу, 2% сахарози, та 0.01% (w/v) ефіру поліоксіетиленової жирної кислоти 20, де композиція має рН приблизно 6.5. Далі винахід розглядає спосіб лікування хвороби підвищенням КФР-проміжної стимуляції росту епітеліальної клітини, включаючи введення пацієнту ефективної кількості композиції ліофілізованого фактору росту винаходу. Передбачається, що хвороба, для якої призначене лікування - це токсичність кишечника; мукозит; обпік або інші часткові та сильні пошкодження; пересадка фолікул волосся, пітних залоз, та сальних залоз; аднексальна структурна проліферація; епідермоліз буллоза; облисіння, спричинене хіміотерапією; чоловіче облисіння; виразки шлунку; виразки дванадцятипалої кишки; ерозивні гастрити; стравохідний рефлюкс; хвороба запалення кишки; хвороба гіалінової мембрани; пошкодження від вдихання диму; емфізема; цироз печінки; недостатність функції печінки; гострий вірусний гепатит, інші токсичні враження печінки; або хвороба "трансплантант проти хазяїна" (РТПХ). Також винаходом заявляється комплект для приготування водної фармацевтичної композиції, яка включає перший контейнер, який містить композицію ліофілізованого кератиноцитарного фактору росту, та другий контейнер, який містить фізіологічно придатний відновлюючий розчин для ліофілізованої композиції. Передбачається, що КФР білок виражається в SEQ ID NО:2, SEQ ID NО:3, або його варіантами. Фізіологічно придатний відновлюючий розчин може бути яким-небудь фармацевтично придатним носієм або розчинником, який включає, але не обмежується, деякі або всі розчинники, що використовуються клінічно, дисперсійне середовище, покриття, антибактеріальні та протигрибкові фактори, ізотонічні та поглинаючі затримуючі фактори і такі, що включають згадані тут фактори. Крім того, композиція КФР може бути введеною пацієнту будь-яким шляхом, який лікуючий лікар визнає за підходящий, включаючи оральний, місцевий, трансдермальний, парентеральний, за допомогою спрею для вдихання, вагінальний, ректальний, або шляхом внутрішньочерепної ін'єкції. Термін "парентеральний", що використовується тут, включає підшкірні ін'єкції, внутрішньовенні, внутрішньом'язові, інтрацистернальні ін'єкції, або способи введення. Введення внутрішньовенної, інтрадермальної, внутрішньом'язової, інтрамаммарної, інтраперитонеальної, інтратекальної, ретробульбарної, внутрішньолегеневої ін'єкції та або хірургічна імплантація на будьяке певне місце також можливі. Фіг.1 показує розмір-виключення (SE)-HPLC (Фіг.1А) та заміну катіона (СЕ)-HPLC (Фіг.1B) при аналізі розчинного білку в рідких КФР композиціях з рН, що відрізняється. 9 Фіг.2 показує зворотньо-фазові (RP)-HPLC хроматограми, що включають КФР композиції, ліофілізовані в 10mМ гістидіну, 0.01% ефіру поліоксіетиленової жирної кислоти 20, та або 4% манітолу/2% сахарози або 3% манітолу/2% сахарози. Фіг.2А показує початок вщрахунку часу після ліофілізації, в той час, як Фіг.2В показує продукт після збереження протягом 1 року при 4°С. Вкладиш показує ділянку навколо головної верхньої точки. Фіг.3 представляє виражену у відсотках верхню точку як результат білкової концентрації від SE-HPLC аналізу ліофілізованої КФР композиції після зберігання протягом 24 тижнів при 45°С. Даний винахід відноситься до композицій для ліофілізації очищеного кератиноцитарного фактору росту, які забезпечують стійкий білковий продукт та підвищення терміну зберігання очищеного білку. Винахід далі представляє спосіб утворення ліофілізованої композиції, що включає кератиноцитарний фактор росту. Як було вже зазначено, "кератиноцитарний фактор росту" або "КФР" відноститься до полінуклеотиду кератиноцитарного фактору росту (SEQ ID NO : 1, Genbank Accession No. NM_002009) або поліпептиду, зазначеного далі в SEQ ID NО:2 (Genbank Accession No. NP_002000) або його аналогу, або альтернативно активного фрагменту кератиноцитарного фактору росту або його аналогу, такого як ΔΝ23 КФР (SEQ ID NО:3), або фактору, що зв'язує і активує рецептор кератиноцитарного фактору росту. При переважному використанні КФР являє ΔΝ23 КФР, рекомбінантно виготовлена форма КФР, в якій перші 23 амінокислоти аміно-термінуса були видалені із зрілого КФР (без приєднання сигнальної послідовності). Дивіться, наприклад, патент US No.5,677,278; 6,677,301, 6,074,848, 5,843,883, 5,863,767 та 5,773,586, всі, що належать CHIRON Соф., U.S. Pat. No.5,731,170, та заявка РСТ No.WO 90/08771, опублікована 9 серпня 1990р. (спрямовані на форми повної довжини КФР та варіанти); та заявка РСТ No.WO 96/11949, опублікована 25 квітня 1996; заявка РСТ No.WO 96/11951, опублікована 25 квітня 1996; та заявка РСТ No.WO 98/24813, опублікована 11 червня 1998 (спрямована на стійкі аналоги КФР), всі з яких об'єднані тут по відношенню до їхньої цілісності, включаючи фігури. КФР аналоги, що мають зростаючу стабільність більш ніж природний КФР, описані в міжнародній публікації РСТ WO 96/11951 та патент U.S. No.6,677,301, і такі КФР аналоги представлені винаходом. Альтернативно, будь-який фрагмент цілого КФР поліпептиду або його аналогу, який вміщує повну або навіть часткову активність КФР також тут передбачається. Має бути зрозуміло, що терміни "кератиноцитарний фактор росту" та "КФР", що використовуються у цьому описі, призначені включати, та означати почерзі за виключенням зазначених, природного КФР та аналогових білків КФР (або "мутеїнів"), характеризованих пептидною послідовністю, головним чином такою ж самою, як усі або частина пептидної послідовності природного КФР, та утримуючи декілька або всю біологічну активність природного КФР, особливо проліферації не 88497 10 фібробластичних епітеліальних клітин, наприклад, показ щонайменше 500-разової більшої стимуляції BALB/MK кератиноцитних клітин, ніж NIH/3T3 фібробластичних клітин, і щонайменше приблизно 50разової більшої стимуляції BALB/MK кератиноцитних клітин, ніж для BS/589 епітеліальних клітин або для СС1208 епітеліальних клітин, встановлених Н-тимідиновим об'єднанням. Також винаходом розглядаються пептиди "характеризовані пептидною послідовністю, в основному такою ж як пептидна послідовність природного КФР", який відноситься до пептидної послідовності, закодованої ДНК-послідовністю здатною зхрещуватися з кодуючою областю SEQ ID NО:1, при середніх аж до високо точних умов гібридизації, які приведені тут в якості приклада. Точні умови, в контексті гібридизації, будуть точними умовами, об'єднаними з солі, температури, органічних розчинників та інших параметрів звичайно контрольованих в реакціях гібридизації. Типові точні умови гібридизації - це гібридизація в 4х SSC при 62°-67°С, що супроводжується обмиванням в 0.1´SSC при 62°-67°С приблизно однієї години. Альтернативно, типові точні умови гібридизації - це гібридизація в 45-55%-ному формаміді, 4´SSC при 40°-45°С. [див., Т. Maniatis et. al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), стор.387-389.] КФР білки включають алельні варіації, або делеції, заміщення, або включення амінокислот, включаючи фрагменти, химерні або гібридні молекули природного КФР. Переважна молекула КФР цього винаходу - це ΔΝ23 КФР. Інші зразки КФР включають, без обмежень, білки із залишками, які відповідають Cys1 та Cys15 SEQ ID NО:2, переміщені або вилучені, з одержаною в результаті молекулою з покращеною стійкістю порівняно з материнською молекулою (як зазначено в патенті U.S. 6,008,328). Інший зразок КФР включає, але не обмежується, поліпептиди із змінним зарядом, де один або більше амінокислотних залишків 41-154 природного КФР (переважно залишки Arg41, Gin43, Lys55, Lys95, Lys128, Asn137, Gin138, Lys139, Arg144, Lys147, Gin152, Lys153 або Thr154) вилучені або заміщені нейтральним залишком або негативно зарядженим залишком, вибраним для вироблення білку зі зменшеним позитивним зарядом. Наступний зразок КФР включає, але не обмежується, білки, утворені заміщенням щонайменше однієї амінокислоти, яка мае вищий петлеутворюючий потенціал для щонайменше однієї амінокислоти в сердині петлеутворюючої області Asn115 - His116 - Туг117 Asn118 -Thr119 природного КФР (як зазначено в патенті US 6,008,328). Подальший зразок включає білки, що мають один або більше амінокислотних заміщень, делецій або добавок в області амінокислот 123-133 (амінокислоти 154-164 SEQ ID NО:2) природного КФР. Більш точно представлені КФР білки, що включають наступні КФР молекули (зв'язані залишком, знайденим в тій позиції в сформованому білку (без сигнальної послідовності), вираженому в SEQ ID NО:2, за яким слідує та амінокислотна позиція в дужках і потім або заміщений залишок або "-" для визначення делеції): ΔΝ15, ΔΝ16, ΔΝ18, 11 ΔΝ23, ΔΝ24, ΔΝ25, ΔΝ26, or ΔΝ27 КФР, C(1,15)S, ΔΝ15-ΔΝ24, AN3/C(15)S, AN3/C(15)-, AN8/C(15)S, AN8/C(15)-, C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, AN23/R(144)Q, C(1,15,40)S, C(1,15,102)S, C(1,15,102,106)S, ΔΝ23/Ν(137)Ε, ΔΝ23/Κ(139)Ε, ΔΝ23/Κ(139)Ο, AN23/R(144)A, AN23/R(144)E, AN23/R(144)L, ΔΝ23/Κ(147)Ε, AN23/K(147)Q, ΔΝ23/Κ(153)E, AN23/K(153)Q, AN23/Q(152)E/K(153)E; R(144)Q та H(116)G. Проліферативні дії КФР щодо великої кількості різних типів епітеліальних і ендотеліальних клітин включають його для придатної терапії при лікуванні багатьох станів або хвороб, шкідливих для людини. Наступним є опис хвороб та медичних станів, що можуть лікуватись за допомогою винаходу з КФР. Кишкова токсичність - це головний обмежуючий фактор в радіаційному і хіміотерапевтичному лікувальних режимах. Попереднє лікування за допомогою КФР може мати цитопротекторну дію на слизову облонку тонкого кишечника, дозволяючи підвищити дози таких терапій під час зменшення потенціальної фатальної сторони дій кишкової токсичності. Остання фаза І клінічних досліджень пацієнтів, яким вводили рекомбінантний людский КФР перед лікуванням з хіміотерапевтичним агентом 5-фторурацилу, наводить на думку, що лікування за допомогою КФР призведе до зменшення частоти захворювання на мукозит [Meropol et al., J Clin Oncol. 21: 1452-8 (2003)]. Добре відомі стандартні моделі in vivo токсичності кишечника, визваної радіацією, які дозволяють передбачати результати тестування речовин, що мають терапевтичну дію на людину, [Withers та Elkind, "Microcolony Survival Assay for Cells of Mouse Intestinal Mucosa Exposed to Radiation", Int. J. Radiat, 17: 261-267 (1970). Добре відомі стандартні моделі in vivo токсичності кишечника, спричиненої хіміотерапією, які дозволяють передбачати результати тестування речовин, що мають терапевтичну дію на людину. Sonis, et al., "An Animal Model for Mucositis Induced by Cancer Chemotherapy, Oral Surg.", Oral Med. Oral Pathol, 69: 437-431 (1990); та Moore, "Clonogenic Response of Cells of Murine Intestinal Crypts to 12 Cytotoxic Drugs", Cancer Chemotherapy Pharmacol, 15: 11-15(1985)]. Лікування КФР мае стійку дію на вироблення слизу в шлунково-кишковому тракті. Ця властивість може бути використана в захисті слизової оболонки кишечника від шкідливих речовин, що всмоктуються, або в обмеженні поширення пошкоджень в таких станах, як запальні хвороби кишечника. Стимуляція проліферації та диференціації аднексальних структур, таких як волосяні фолікули, пітні залози, сальні залози є особливо важливою в регенерації епідермісу та дерми у пацієнтів з опіками та іншими місцевими та глибокими пошкодженнями. В данний момент поверхневі дефекти заживляються утворенням шраму та кератиноцитним реставруванням; повна регенерація шкіри ще не можлива. Пересадка волосяних фолікул, пітних залоз та сальних залоз не відбувається зараз при дуже глибоких дефектах шкіри, включаючи опіки. Використання КФР може дати можливість такої 88497 12 пересадки. Стандартні моделі in vivo поліферації та стимулювання аднексальної структури, передбачення результатів тестування речовин, що мають терапевтичну дію на людину для опіків та інших місцевих та глибоких ушкоджень також добре відомі [Mustoe, et al., "Growth factor-induced acceleration of tissue repair through direct and inductive activities in a rabbit dermal ulcer model" J Clin. Invest, 87: 694-703 (1991); Pierce, et al., "Platelet-derived growth factor (BB homodimer), transforming growth factor-beta 1, and basic fibroblast growth factor in dermal wound healing. Neovessel and matrix formation and cessation of repair" Am. J. Path. 140: 1375-88 (1992); та Davis, et al., "Seconddegree burn healing: the effect of occlusive dressings and a cream." J. of Surgical Res. 48: 245-248 (1990)]. Бульозний епідермоліз - це дефект у зрощуванні епідермісу і основного шару шкіри, що веде до часто відкритих болючих пухирів, що можуть викликати важку захворюваність. Прискорена реепіталізація цих пошкоджень, така як лікування за допомогою КФР, призведе до зменшення ризику інфекціювання, зменшення болю та зменшення турботи про рану. Спричинене хіміотерапією облисіння може бути спричинено, коли пацієнти лікуються курсами хіміотерапії проти злоякісних пухлин. На сьогодні немає терапій, які були б ефективними для запобігання втрати фолікул волосся. КФР надає таку можливість. Відомі стандартні моделі in vivo спричиненого хіміотерапією облисіння, які дозволяють передбачати результати тестування речовин, що мають лікувальну дію для людини [Sawada, et al., "Cyclosporin A Stimulates Hair Growth in Nude Mice", Laboratory Investigation, 56(6): 684 (1987); Holland, "Animal Models of Alopecia", Clin. Dermatol, 6: 159:162 (1988); Hussein, "Protection from Chemotherapy-induced Alopecia in a Rat Model", Science, 249: 1564-1566 (1990); and Hussein, et al., "Interleukin 1 Protects against 1-B-DArabinofuranosyulcytosine-induced Alopecia in the Newborn Rat Animal Model", Cancer Research, 51: 3329-3330 (1991)]. Чоловіче облисіння загально поширене та по суті невиліковне. Поступова втрата волосся чоловіками та жінками - це серйозна косметична проблема. КФР непідходящого мишиного експонату куйовдить нерозчісане хутро, в той час як КФР рецептор вишибає представлену тонку шкіру, низьку кількість волосяних фолікул та запізнення лікування рани [Werner et al., Science 266: 819-22 (1994)]. В експериментальних моделях облисіннія, попереднє лікування за допомогою рекомбінантного КФР захищає від приблизно 50% облисіння, спричиненого введенням хіміотерапевтичного фактору цитозину арабіноциду (ARA-c) [Danilenko et al, Am J Path. 147:145-54, (1995)]. Ці стани могли б лікуватися за допомогою КФР або систематично, або локально, якщо ліки могли би бути введені та поглинатися через шкіру голови, або спреєвим введенням в шкіру голови, використовуючи розпилювальний пістолет або подібні технології. Добре відома стандартна модель in vivo чоловічого облисіння, що дозволяє передбачати результати тестування сполук, що спричинюють терапевтичну 13 дію на людину. [Uno, "The Stumptailed Macaque as a Model for Baldness: effects of Minoxidil", InternationalJournal of Cosmetic Science, 8: 63-71 (1986); Porter R., "Mouse models for human hair loss disorders" JAnat. 202: 125-31 (2003)]. Дослідження показали, що введення КФР може спричинити ріст клітин в шлунково-кишковому тракті [Playford et al., J Pathol. 184: 316-22, (1998)]. Виразки шлунку, хоча і лікуються Н2 антагоністами, спричиняють значну захворюваність і повторюваність, і заживляються з утворенням шраму слизової оболонки. Можливість регенерації залозистої слизової оболонки у пацієнтів із шлунковими виразками, наприклад, лікуванням за допомогою КФР, запропонувала б істотне терапевтичне удосконалення в лікуванні виразок шлунку. Стандартні моделі in vivo виразок шлунку, що дозволяють передбачати результати тестування речовин, що мають терапевтичну дію на людину, добре відомі, наприклад, Tarnawski, et al., ["Indomethacin Impairs Quality of Experimental Gastric Ulcer Healing: A Quantitative Histological та Ultrastructural Analysis", In: Mechanisms of Injury, Protection та Repair of the Upper Gastrointestinal Tract, (eds) Garner та O'Brien, Wiley & Sons (1991); та Astudillo et al., ["Gastroprotective activity of oleanolic acid derivatives on experimentally induced gastric lesions in rats та mice" JPharm Pharmacol. 54: 583-8 (2002)]. Виразки дванадцятипалої кишки, як і виразки шлунку, можна вилікувати, але розвиток терапевтичного фактору до більш глибокої та більш швидкої регенерації слизитої оболонки дванадцятипалої кишки було б важливим досягненням. Крім того, терапевтичний фактор регенеративно виліковує ці виразки та зниження їхнього повторення було б досить спродвижливо. КФР має такий потенціал. Добре відомі Стандартні моделі виразок дванадцятипалої кишки in vivo, що дозволяють передбачати результати тестування речовин, що мають терапевтичну дію на людину [Berg, et al., "Duodenal ulcers produced on a diet deficient in pantothenic acid", Proc. Soc. Exp. Biol. SvJed., 1314-376 (1949); Szabo та Pihan, "Development та Significance of Cysteamine та Propionitrile Models of Duodenal Ulcer", Chronobiol. Int., 6: 31-42 (1987); Robert, et al., "Production of Secretatogues of Duodenal Ulcers in the Rat", Gastroenterology, 59: 95-102 (1970); та Keshavarzian et al., "Gastroduodenal ulcers in rats induced by 1-methyl-4phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine (MPTP): requirement for gastric acid secretion та the role of prostaglтains" Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 70:21-48 (1990)]. Ерозії шлунку та стравоходу, як ерозійні гастрити, езофагіти, або рефлюкс стравоходу, виліковні, але розвиток терапевтичного агенту до більш повної та швидкої регенерації слизової оболонки шлунку та стравоходу було б важливим досягненням. Крім того, терапевтичний агент регенеративно лікує ці ерозії, та зниження їхнього повторення було б досить сприятливим. КФР має такий потенціал. Добре відомі Стандартні моделі in vivo ерозій шлунку та стравоходу такі, як ерозійний гастрит, езофагіт, або запалення стравоходу, що дозволя 88497 14 ють передбачати результати тестування речонив, що мають терапевтичну дію на людину. [Geisinger et al, "The histologic development of acid- induced esophagitis in the cat", Mod-Pathol, 3: 619-624 (1990); Carlborg et al., "Tetracycline induced esophageal ulcers. A clinical та experimental study", Laryngoscope, 93: 184-187 (1983); Carlborg et al., "Esophageal lesions caused by orally administered drugs. An experimental study in the cat", Eur-SurgEthanol on esophageal motility in cats, Alcohol-ClinExp-Res., 15: 116-121 (1991), та Katz et al., "Acidinduced esophophagitis in cats is prevented by sucralfate but not synthetic prostagrrain E.", Dig-DisSci., 33: 217-224 (1988)]. Запальні кишкові хвороби, такі як хвороба Крону (ураження перш за все тонкої кишки) і виразковий коліт (ураження перш за все товстої кишки), - хронічні хвороби невідомої етіології, які приводять до руйнування поверхні слизової оболонки, запалення, шраму і утворення спайки протягом відновлення, і значної хворобливості хворих. Терапія в такий час спрямована контролювати запалення, проте, лікування КФР було показане, щоб спричинити проліферацію епітелію шлунковокишкового тракту в ВБК заражених тварин [Housley et al., J Clin Invest. 94: 1764-77, (1994)]. Терапія, така як КФР для стимулювання заміни поверхні слизової оболонки, що приводить до швидшого видужання, може бути сприятливим в регульованій послідовності прогресування хвороби. Добре відомі стандартні моделі in vivo хвороби запалення кишечника, що дозволяють передбачати результати тестування речовин, що мають лікувальну дію для людини. [Morris, et al., "Hapteninduced Models of Chronic Inflammation та Ulceration in the Rat Colon", Gastroenterology, 96:795-803 (1989); Rachmilewitz, et al., "Inflammatory Mediators of Experimental Colitis in Rats", Gastroenterology, 97: 326-327 (1989); Allgayer, et al., "Treatment with 16,16'-dimethyl-prostaglтain E2 before та after induction of colitis with trinitrobenzenesulfonic acid in Rats", Gastroenterology, 96: 1290-1300 (1989); "Review. Experimental Colitis in Animal Modete", Бета. J. Gastroenterol, 27: 529-537 (1992)]. Хвороба гіалінових мембран новонароджених виникає при відсутності виробництва поверхневоактивної речовини типу II пневмоцитів в легенях, що приводить до руйнування альвеолі. Хвороба гіалінових мембран може мати дві фази: гостру та хронічну. Гостра фаза хвороби гіалінових мембран (дитячий респіраторний дистресовий синдромДРДС) лікується механічним насищенням повітря і лікуванням за допомогою 80-100% концентрацій додаткового об'єму кисню та введенням екзогенної поврехнево-активної речовини. Ті пацієни, що проходять продовжений курс лікування, можуть розвити хронічну фазу хвороби гіалінових мембран (бронхопульмонарна дисплазія БПД). В той час як поверхнево-активні речовини повністю скоротили смертність, пов'язану з ДРДС, захворюваність, пов'язана з БПД залишається високою. Тому не має необхідності розвивати ефективне лікування для прискорення дозрівання легенів та виділення поверхнево-активної речовини у новонароджених для зменшення впливу БПР. Хоча кортикостероїди 15 можуть прискорити процес дозрівання та секреції в двадцяти-восьми тижневих зародків та старших аж до досягнення ними великих розмірів, на сьогодні немає лікування для молодших ембріонів, результатом чого є значна смертність та хворобливість такої популяції. Історія БПР наводить на думку, що вдосконалення при лікуванні ДРДС відповідає механічному насищенню повітрям навіть менших новонароджених дітей та наступне збільшення падіння БПД у цих менших дітей. Терапевтичний фактор, такий як КФР, який би знизив проліферацію та диференціацію типу II пневмоситів [Yi et al., Inflammation 22: 315-25 (1998)] був би дуже сприятливим для лікування цієї хвороби. Добре відомі стандартні моделі in vivo ДРДС, які дозволяють передбачати результати тестування речовин, які мають терапевтичну дію на людину. Seider, et al., "Effects of antenatal thyrotropinreleasing hormone, antenatal corticosteroids, та postnatal ventilation on surfactant mobilization in premature rabbits", Am. J. Obstet. Gynec, 166:15511559 (1992); Ikegami, et al., "Corticosteroid and thyrotropin-releasing hormone effects on preterm sheep lung function", J Appl. Physiol., 70:2268-2278 (1991). Добре відомі стандартні моделі in vivo БПР, які дозволяють передбачати результати тестування речовин, які мають терапевтичну дію на людину [Yuh-Chin, et al., "Natural surfactant та hyperoxide lung injury in primates I. Physiology та biochemistry", J Appl. Physiol. 76: 991-1001 (1994); та Galan, et al., "Surfactant replacement therapy in utero for prevention of hyaline membrane disease in the preterm baboon", Am. J. Obstet. Gynecol., 169: 817824 (1993)]. Вдихання диму є значною причиною захворюваності і смертності в тиждень, слідуючи за опіковим пошкодженням, що спричиняє омертвіння бронхіолярного епідермісу та альвеолі. Фактор росту, такий як КФР, який може стимулювати проліферацію та диференціацію цих структур, та примушує їх оновлюватись та регенеруватись, був би сприятливим при лікуванні дихальних пошкоджень. Добре відома стандартна модель in vivo пошкоджень димом, яка дозволяє передбачати результати тестування речовин, які мають терапевтичну дію на людину. Hubbard, et al., "Smoke inhalation injury in sheep", Am. J. Pathol, 133: 660663 (1988). Емфізема призводить до прогресуючої втрати альвеолі. Фактор росту такий як КФР, який може стимулювати новий ріст, або який є цитозахисним для непошкодження альвеолі. [Kaza et al., Circulation. 106(12 Suppl I):1120-4 (2002)], міг би бути терапевтично сприятливим. На сьогодні ефективне лікування не можливе. Добре відома стандартна модель in vivo емфіземи, яка дозволяє передбачати результати тестування речовин, які мають терапевтичну дію на людину. [Stolk et al., "Induction of emphysema and bronchial mucus cell hyperplasia by intratracheal instillation of lipopolysaccharide in the hamster." J. Pathol, 167:349-56(1992)]. Цироз печінки, що є побічним результатом вірусного гепатиту та алкоголізму, є значною причиною захворюваності та смертності. Цитозахищен 88497 16 ня, проліферація та диференціація гепатоцитів таке, як використання КФР [Danilenki, D., Toxicol Pathol. 27: 64-71 (1999)] для підвищення функції печінки могло б сприяти зниженню або попередженню розвитку цирозу. Добре відома стандартна модель in vivo гепатичного цирозу, що дозволяє предикативне тестування сумішей, які мають терапевтичну дію на людину. [Tomaszewski, et al., "The production of hepatic cirrhosis in rats", J Appl. Toxicol, 11: 229-231(1991)]. Швидкоплинна хвороба печінкової недостатності це стан, що загрожує життю, та буває на останній стадії цирозу. Агент такий як КФР, що може сприяти проліферації залишених гепатоцитів, що було б дуже сприятливим при лікуванні цієї хвороби, та на данний момент можливе тільки при трансплантації печінки. Добре відомі стандартні моделі in vivo швидкоплинної хвороби відсутності функції печінки, які дозволяють передбачати результати тестування сумішей, що мають терапевтичну дію на людину. [Mitchell, et al., "Acetaminophen- induced hepatic necrosis I. Role of drug metabolism", J Pharmcol Exp. Ther., 187: 185194 (1973); та Thakore та Mehendale, "Role of hepatocellular regeneration in CC14 autoprotection", Toxicologic Pathol. 19: 47-58 (1991)]. Гострий вірусний гепатит звичайно субклінічний та самовиліковний. Хоча, у меншості пацієнтів сильне пошкодження печінки може спливати на протязі багатьох тижнів. Цитопротективний фактор, такий як КФР міг би протидіяти дегенерації клітин печінки. Токсичні враження - печінки спричинені ацетамінофеном, галотаном, тетрахлоридом вуглецю та іншими токсинами, можуть поліпшитися за допомого фактору росту (КФР), який є цитопротективним для гепатоцитів. Добре відомі стандартні моделі in vivo токсичності печінки, які дозволяють передбачати результати тестування речовин, що мають терапевтичну дію на людину. [Mitchell, et al. (1973), supra, та Thakore та Mehendale (1991), supra)]. Хвороба "трансплантант проти хазяїна" (РТПХ) (хронічна або гостра) є причиною неправильної трансплантації кісткового мозку або гематопетичних клітин пацієнтам. РТПХ веде до втрати багатьох систем органів завдяки підвищеній регуляції імуномодуляторних та цитоксичних факторів. РТПХ є результатом втрати великих площин, включаючи шлунково-кишковий тракт, легені, печінку, шкіру, та сльозні залози очей, слинні залози роту, залози поверхні шлунку та кишечника. Недавні дослідження на тваринах показали, що rНuКФР-лікувальні реципієнти не розвивали кишковий РТПХ, не розвивали ендотоксимію і не помирали. [Panoskaltsis-Mortari et al., "Keratinocyte growth factor facilitates alloengraftment and ameliorates graft-versus-host disease in mice by a mechanism independent of repair of conditioninginduced tissue injury" Blood. 96: 4350-6 (2000)]. Ці данні вказують на те, що КФР запобігає розвитку гострого летального РТПХ, протидіючи пошкодженню епітеліальних клітин, будучи проміжною ланкою TNF-альфа, NO, та іншими можливими цитотоксичними факторами. Фактор, такий як КФР, 17 який може спричиняти проліферацію у великій кількості типів таких клітин, був би дуже сприятливим для лікування РТПХ в людських трансплантантних реципієнтах. Композиції та введення КФР білки або пептиди корисні для використання у фармацевтичних композиціях при лікування людських хвороб, як описано вище. КФР може бути приготовлений як рідка або як ліофілізована композиція. В переважному випадку КФР композиції -ліофілізовані. Ліофілізація може бути здійснена при використанні технічних прийомів загальних для даної області техніки і була б оптимальною для розвитку композиції. [Tang et al., Pharm Res. 21: 191-200, (2004) та Chang et al., Pharm Res. 13: 243-9 (1996)]. Цикл ліофілізації звичайно складається з трьох стадій: заморожування, первинне висушування та вторинне висушування [А.Р. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, SerB, Biol 278: 167 (1977)]. На стадії заморожування розчин замерзає до початкового стану льоду і завершеності. Далі ця стадія переходить у кристалізацію наповнювача. Лід сублімує у стадію первинного висушування, що супроводжується зменшенням тиску посудини нижче від тиску випаровування льоду, використовуючи вакуум та впроваджуючи жару для підвищення сублімації. Наприкінець, адсорбована або зв'язана вода переходить до другого висушування під зменшеним тиском посудини і збільшеним рівнем температури. Даний процес виготовляє матеріал відомий як ліофілізований осад. Після цього осад може бути відновлений або стерильною водою для ін'єкцій, або відповідною мультидозою відновлення розчином, що використовувася раніше. Цикл ліофілізації не тільки визначає кінцевий фізичний стан ексципієнтів, але також впливає на інші параметри, такі як час відновлення, поява, стабільність і кінцевий водний стан. Структура композиції в замороженому стані проходить через декілька перехідних періодів (наприклад, періоди скла та кристалізації), що відбуваються при специфічних температурах і можуть використовуватись для розуміння і оптимізації процесу ліофілізації. Температура переміщення скла (Тд) може надати інформацію про фізичний стан і може бути виміряна спеціальним скануючим калориметром (ССК). Це важливий параметр, який треба прийняти до уваги при проектуванні ліофілізованого циклу. Крім того, в сухому стані температура скловаріння надає інформацію про температуру збереження кінцевого продукту. При кращому виконанні даних композицій стабілізатор додається до ліофілізованої композиції для попередження або зменшення ліофілізації, індукованої або індукованої шляхом збереження агрегації та хімічної деградації. Неясний або каламутний розчин при розведенні вказує на те, що білок осаджений. Термін «стабілізатор» позначає наповнювач, що здатен запобігати агрегації або іншим фізичним деградаціям, а також хімічній деградації, (наприклад, аутолізісу, деамідуванню, окисленню і т.д.) у водному чи твердому стані. Стабілізатори, що умовно використовуються у фа 88497 18 рмацевтичних композиціях, включаючи, але не обмежуючись ними, сахарозу, трехалозу або гліцин, можуть бути використані [Carpenter et al., Develop. Biol. Straard 74: 225, (1991)]. Стабілізатори поверхнево-активної речовини, такі як ефір поліоксиетиленової жирной кислоти 20 (Tween 20) або ефір поліоксиетиленової жирной кислоти 80 (Tween 80), можуть також бути додані у відповідних кількостях, щоб запобігти явищу агрегації поверхні під час заморожування і сушіння [Chang, В, J. Pharm. ScL 85: 1325, (1996)]. При необхідності ліофілізовані композиції також містять необхідні кількості наповнювача та агента, що регулює осмотичний тиск, придатних для формування ліофілізованого осад». Наповнювачі можуть бути або кристалічними (наприклад, манітол, гліцин) або аморфними (наприклад, сахароза, полімери, такі як декстран, полівінілпіролідон, карбоксиметилцелюлоза). При одному виконанні, наповнювачем виступає манітол. При наступному виконанні, манітол знаходиться в концентрації від приблизно 2% до приблизно 5% w/v, і при більш подальшому виконанні в концентрації від приблизно 3% до приблизно 4,5% w/v, для вироблення механічно та фармацевтично стабільного та гарного за формою осаду. При іншому виконанні, концентрація манітолу складає 2% w/v. Вибір фармацевтично-прийнятного буферу та рН також був винайдений, щоб впливати на стабільність даних композицій. Присутність буферної системи у композиціях вибрана, щоб бути фармацевтично придатною та для підтримання необхідного рН в повторно призначеному розчині, так як у розчині перед ліофілізацією. Переважно, буфери мають розмір буферного рН від приблизно рН6.0 до приблизно рН8.0. Серії відбірних дослідів, що об'єднують вищезазначені параметри, типово виконані для того, щоб вибрати найбільш стабільний стан для композиції. Композиції очікуються бути стабільними на щонайменше 2 роки при температурі від 2°С до 8°С у ліофілізованому стані. Ця довготривала стабільність корисна при продовженні терміну зберігання фармацевтичного продукту. Даний винахід надалі розглядав способи для приготування даних КФР композицій. В одному аспекті, способи для приготування ліофілізованої КФР композиції включають в себе стадії: (а) змішування вказаної КФР композиції в буфері, що включає в себе гістидін, наповнювач, цукор та поверхнево-активну речовину; (b) ліофілізацію вказаного КФР. Дані способи надалі включають один або більше з наступних стадій: додавання стабілізуючого агенту до зазначеної суміші перед ліофілізацією, додавання щонайменше одного агенту, вибраного з наповнювача та агенту, що регулює осмотичний тиск, та поверхнево - активної речовини до зазначеної суміші перед ліофілізацією. Наповнювач може бути яким-небудь наповнювачем зазначеним вище. Переважно, наповнювач це манітол. Цукром може бути будь-який стабілізуючий цукор, зазначений вище. При одному виконанні, стабілізуючий агент - це сахароза. Поверхнево-активна речовина може бути будь-якою 19 поверхнево-активною речовиною, зазначеною вище. При одному виконанні, поверхнево-активна речовина - це ефір поліоксиетиленової жирної кислоти 20. Практично стандартне відновлення для ліофілізованого матеріалу - це додавання об'єму чистої води або стерильної води для ін'єкції (ВДI) (в основному еквівалент до об'єму, зміщений під час ліофілізації), хоча розведені розчини антибактеріальних агентів інколи використовуються у виробництві лікарських препаратів для парентерального введення [Chen, Drug Development та Industrial Pharmacy, 18: 1311-1354(1992)]. Ліофілізована КФР композиція може бути відновлена як водний розчин. Різноманітність водних носіїв, наприклад, стерильна вода для ін'єкцій, вода з консервантами для мультидозованого використання або вода з придатними кількостями поверхнево-активних речовин (наприклад, ефір поліоксиетиленової жирної кислоти 20), 0.4% сіль, 0.3% гліцин, або водні суспензії можуть містити активну суміш в домішці з екципієнтами, придатними для виробництва водних суспензій. Такі ексципієнти являють собою суспензуючі агенти, наприклад, карбоксиметилцелюлоза натрію, метил целюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза, альгінат натрію, поліввінілпіролідон, трагакантова камедь та гуміарабік; диспегуючі або зволожуючі агенти можуть бути природним фосфатидом, наприклад, лецитин, або конденсаційними продуктами оксиду алкілену з жирними кислотами, наприклад, стеарат поліоксіетилену, або конденсаційними продуктами оксиду етилену з довгим ланцюжком аліфатичних спиртів, наприклад, гептадекаетиленеоксіцетанол, або конденсаційними продуктами оксиду етилену з частковими естерами, отриманими з жирних кислот та гекситолу, такі як поліоксіетилен сорбітол моноолеат, або конденсаційними продуктами оксиду етилену з частковими естерами, отриманими з жирних кислот та ангідридів гексітолу, наприклад, поліетилен сорбітан моноолеат. Водні суспензії можуть також містити один або більше консервантів, наприклад, етил, або n-пропіл, р-гідроксибензоат. Для введення композицій винаходу людині або піддослідним тваринам, бажано сформулювати композиції в композицію, яка б включала в себе один або більше фармацевтично-придатних носіїв. Фрази «фармацевтично» або «фармацевтичнопридатні» відносяться до молекулярних об'єктів та композицій, що є стабільними, деградації затримуючого білку такої, як агрегація та розщеплення продуктів, та додатково не спричиняють алергічні або інші шкідливі реакції при введенні добре відомих в області техніки, як описано нижче. «Фармацевтично придатні носії» включають будь-який або всі корисні розчинники, дисперсійний носій, оболонки, антибактеріальні та протигрибкові препарати, ізотонічні та абсорбційні затримуючі агенти та подібні, включаючи агенти, зазначені вище. Композиції кератиноцитарного фактору можуть бути введені орально, локально, трансдермально, парентерально, за допомогою інгаляційного спрею, вагінально, ректально, або шляхом внутрішньочерепної ін'єкції. Термін «парентераль 88497 20 ний», як він тут використовується, включає підшкірні ін'єкції, внутрішньовенні, внутрішньом'язові, інтрацистернальні ін'єкції, або спосіби введення. Введення шляхом внутрішньовенної, внутрішньодермальної, внутрішньом'язової, інтрамамарної, внутрішньобрюшинної, внутрішньооболонкової, ретробульбарної, внутрішньолегеневої ін'єкції та або хірургічної імплантації на якесь певне місце також маються на увазі. Взагалі, композиції по суті не містять пірогени, так як і інші забруднення, які можуть бути небезпечними для реципієнта. Комплекти Як додатковий аспект, винахід містить комплекти, що включають одну або більше сумішей, поміщених таким чином, що полегшує їхнє використання для введення пацієнтам. При одному використанні, такий комплект містить суміш або композицію, описані тут (наприклад, композиція, що включає кератиноцитарний фактор росту), поміщений у ємність, так як закупорена пляшка або посуд з ярликом, прикріпленим до ємності або поміщеним в упаковку, що описує використання суміші або композиції під час випробування способу. При одному втіленні, комплект містить перший контейнер з ліофілізованою композицією кератиноцитарного фактору росту і другий контейнер з фізіологічно придатною сіллю відновлення для ліофілізованої композиції. Переважно, суміш або композиція поміщена в порційну форму. Комплект може надалі містити прилад, що застосовується для введення композиції відповідно до певного шляху введення. Переважно, комплект містить етикетку, що описує використання композиції кератиноцитарного фактору росту. Додаткові аспекти та деталі винаходу будуть очевидними з наступних прикладів. Приклад 1 Рідка КФР композиція Стабільність продукту, термін зберігання та біоактивність є важливими аспектами для будьякої терапевтично ефективної композиції. Дизайн та формування композиції, що є стабільними, коли зберігаються при рекомендованих температурах зберігання на подовжені терміни часу, але вміщують значну біологічну активність, є ключовими елементами фармацевтичних композицій. В попередніх експериментах, рідкі композиції КФР показали значну агрегацію та послідуючу втрату білку при збільшених температурах (37°С). Для визначення рН, що забезпечило найвищу стабільність КФР композицій, рН рідкої композиції кератиноцитарного фактору випробували при рівні рН від 3.0 до 9.0. КФР, використаний в послідуючих експериментах, наприклад, Приклади 1-3, був ΔΝ23 КФР молекули. рН розчину був встановлений при використанні або концентрованої НСІ, або гідроксиду натрію. Зразки КФР композиції (0.5мг/мл, 10mМ буверу, 0.1Μ NaCI) при різних рН були взяті за час від 0,6 до 28 годин після інкубації при температурі 37°С (Фіг.1). Процент регенерованого білку був зважений SE-HPLC (Фіг.1А) або CE-HPLC (Фіг.1B). Для виключення за розміром HPLC (SE-HPLC), приклади (40µr) були завантажені в G2000SW´1 колонку (7.8мм´30см), приєднану до HP 1090/1050 21 установки. Білок був елюйований за допомогою 20mМ фосфату натрію (NaP), 1M NaCI при рН7.0. Білок досліджували поглинанням при 215nm. Мономерна найвища точка показує на те, що в КФР композиції мало показників. Катіонний обмін (CE)-HPLC був виконаний за допомогою HP 1090/1050 установки, оснащеної Mono-S колонкою при кімнатній температурі. 40µg КФР білку було загружено в колонку і вилучено за допомогою 20mМ натрій фосфатного буферу, рН8.0, і градієнта солоності (IМ NaCI). Елюйований білок досліджували поглинанням при 215nm. Зворотна фаза HPLC (RP-HPLC) була виконана в HP 1090/1050 установці, використовуючи С4 колонку з Vydac, (4.6´250mm) розмір пор 300 А. Білок (30µr) був введений в колонку і вилучений за допомогою ацетонітрилу (АЦН) градієнта з 0.1% трифтороцтовою кислотою (ТФК) (ν/ν) та 90% АЦН, 0.1% ТФК у воді (ν/ν). Найвищі точки білку досліджували поглинанням при 215nm. Повне відновлення білку було проведено з початку відрахунку часу при рН більше ніж рН 5.0 до 9.0. Хоча при рН 3.0 повна втрата білку була проведена, і рН4.0 спричинило приблизно 80% втрату білку через безпосереднє осадження. Після 6 годин при 37°С, розчинний білок не було отримано з рН зразків 4.0. Процент білку, відновленого після 28 годин при 37°С, коли розчинний КФР був отриманий при рН5 до 9, був меншим ніж 20%. Хоча, при рН7.0 тільки 20% загального білку було втрачено. Втрата в розчинному білку після 28 годин при 37°С була головним чином через агрегацію. Ці результати вказують на те, що КФР білок в рідких композиціях найбільш стабільний при нейтральному рН, хоча навіть при цьому оптимальному рН рівні, збереження КФР як рідини приводить до значної втрати білку через агрегацію. Приклад 2 Склад КФР композиції для ліофілізації Для розвитку більш стабільної КФР композиції, було вирішено виразити КФР як продукт ліофілізації. Попередні спроби у вираженні ліофілізованої КФР композиції були пов'язані з маніпуляцією відновленого розчину, результатом чого є композиція, що утворює менше білкових агрегатів, що залежать від композиції відновленого розчину [Zhang et al, Pharrn. Res. 12: 1447-52 (1995)]. Хоча, у цьому попередньому досліді, будь-яку агрегацію, що спостерігається протягом відновлення, було б дуже важко або неможливо повернути назад. Цей приклад описує ліофілізацію білку у розчині, який запобігає агрегації на незалежному відновленні відновленого розчину, виключити необхідність для відновленого розчину споживача. Для визначення складу стабільної ліофілізованої КФР композиції, наприклад, ΔΝ23 КФР, ліофілізували з різними умовами, змінюючи параметри такі як рН, наповнювач, концентрацію цукру, та концентрацію поверхнево-активної речовини. Довгий час стабільність зберігання КФР була визначеною при рекомендованій температурі зберігання. Цикл ліофілізації Для ліофілізації, зразки були загружені в VirTis Genesis 12 EL дослідний осад (Virus, Gardiner, N. Υ.) ліофілізатор, який був попередньо охолодже 88497 22 ний до кімнатної температури приблизно 4°С. Зразки були заморожені швидко (приблизно 1°С/хв. до -50°С) і тримались при такій температурі щонайменше 2 години. Один раз зразки були поміщені в ліофілізатор, температура збереження була знижена до -50°С на рівні приблизно 27°С/год. Зразки тримали при -50°С 2 години для гарантії повного замороження. На додатковій фазі кристалізації манітолу температура збереження підвищилась до -25°С на рівні 10°С/год, досягаючи рівноваги 2-3 години, і тоді охолодження до -55°С на рівні 9°С/год. Після додаткового тримання щонайменше 2год, був застосований вакуум приблизно 100mТоrr. Температура зберігання підвищилась до -35°С для первинного висушування, але можливо у межах -45°С до -10°С Первинне висушування було продовжено до 40год., але можливо у межах 24-48 годин. Температура зберігання підвищилась від +20°С до +25°С на рівні 5°С/год, для другого висушування, і вакуум зменшився приблизно до 50mTorr. Друге висушування було виконано за 36 годин, але може бути виконано будь-де за 24-72 годин. В результаті другого висушування, зразки були закупорені під вакуумом (