Спосіб одержання бактеріального концентрату “біфідін” для кормових продуктів

Винахід відноситься до біотехнології і може застосовуватися для одержання бактеріального препарату і продуктів з його використанням, які призначаються для профілактики шлунково-кишкових інфекцій молодняка великої рогатої худоби. Відомо спосіб приготування бактеріального концентрату "Лактоцидін" для виробництва кормового продукту "Ацидокорм", який передбачає культивування ацидофільної палички, відібраної за антагоністичною активністю щодо збудників кишкових інфекцій молодняка сільськогосподарських тварин (ТУ 10.16 УССР 4 - 86). Однак до складу мікрофлори цього бактеріального концентрату залучено тільки один вид мікроорганізмів Lactobacillus acidophilus, що обмежує лікувально-профілактичні властивості концентрату. Відомо також спосіб приготування пропіоновоацидофільної бульйонної культури (ПАБК) для профілактики шлунково-кишкових інфекцій молодняка сільськогосподарських тварин (ТУ 46 - 794 - 72). Недоліком цієї культури є низька концентрація бактеріальних клітин - в межах десятків-сотен мільйонів в 1мл. Даний спосіб також не передбачає відбір культур за антагоністичною активністю щодо збудників шлунково-кишкових захворювань молодняка тварин, хоча встановлено, що серед ацидофільних бактерій поряд з високоактивними штамами є штами, яким не властива висока антагоністична активність. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб одержання сухого бактеріального препарату біфідобактерій і молочнокислих бактерій "Біфілакт А", який використовується для виробництва лікувально-профілактичних кормових засобів (ТУ 491016 - 85). Згідно з цим способом в живильне середовище, яке готується на основі ферментного гідролізату знежиреного молока і яке містить стимулятори росту, вносять інокулят культури біфідобактерій та ацидофільної палички. Накопичення бактеріальної маси здійснюють при температурі 36 38°C протягом 14 - 16 годин. Потім біомасу відокремлюють від культуральної рідини, змішують з захисним середовищем, заморожують і висушують. Спосіб дозволяє одержати бакконцентрат, який містить в 1г 1 × 109 життєздатних клітин біфідобактерїй і 5 × 107 ацидофільних паличок. Недоліком відомого способу є низький вміст клітин мікроорганізмів в 1г концентрату, крім того, спосіб не передбачає відбору штамів за властивостями, що забезпечують біологічну активність препарату в цілому. Основним завданням винаходу, що пропонується, є розробка способу одержання бактеріального концентрату, в якому шляхом зміни технологічних параметрів та складу мікрофлори забезпечується підвищення концентрації клітин бактерій та біологічної активності концентрату, завдяки чому кінцевий продукт має лікувально-профілактичні властивості. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі, який заявляється, при одержанні бактеріального концентрату передбачається цілеспрямований відбір мікроорганізмів за їх біологічною активністю, складання ефективної композиції з числа найбільш активних штамів і удосконалення технології накопичення біомаси. Особливістю запропонованого способу є використання як посівний матеріал трьох різних видів мікроорганізмів, які відповідають нормальній мікрофлорі кишечника великої рогатої худоби, а саме біфідобактерій, пропіоновокислих і молочнокислих бактерій. При цьому з біфідобактерій використано штам B. animalis 135, з пропіоновокислих - P. freudenreichii ssp. schermanii H-110, а з лактобактерій - L.acidophilus 38 и 20y. Ці мікроорганізми відібрані за величиною антагоністичної активності щодо збудників кишкових інфекцій молодняка великої рогатої худоби, адгезивної і вітамінсинтезуючої здатності. Відбір найбільш активних штамів за вищевказаними критеріями зумовлює підвищення біологічної активності бактеріального концентрату. Основні фізіолого-біохімічні властивості штамів, що використовуються для приготування бакконцентрату Біфідін, наведено в табл.1. Відібрані штами відрізняються один від одного за своїми температурними оптимумами і активністю. Вони стійкі до високих концентрацій жовчі, фенолу і хлориду натрію. Штами пропіоновокислих і біфідобактерій характеризуються досить високими індексами адгезивності - 2,7 і 2,8 відповідно. Комплекс цих властивостей забезпечує колонізацію кишківника і проживлення в ньому. Крім того, штам P.schermanii H-110 має здатність до синтезу вітаміну B12, котрий є життєво важливим для тварини. Всі штами активно затримують розвиток патогенних серотипів кишкової палички, протеїв, сальмонел і стафілококів. Завдяки цьому бактеріальний концентрат і продукт, що виготовляєтья з його використанням, пригнічує розвиток небажаної мікрофлори та нормалізує мікробний ценоз травної системи великої рогатої худоби (табл.2). Для стимуляції розвитку молочнокислих бактерій спосіб, що заявляється, передбачає збагачення живильного середовища нативним казеїном. З цією метою в готове живильне середовище вносять 1% стерильного знежиреного молока. Це забезпечує збільшення кількості біомаси і чисельності мікроорганізмів в сухому бакконцентраті. Крім того, відмінною особливістю способу, що пропонується, є те, що для підвищення ефективності накопичення числа біфідобактерій, їх культивують разом з пропіоновокислими бактеріями протягом 6 - 7 годин, після чого вносять лактобактерії. При цьому накопичення біомаси проводять з періодичною або безперервною нейтралізацією культуральної рідини. В результаті отримують бактеріальний концентрат, який містить в 1г не менше 1 × 1010 життєздатних клітин біфідобактерій, 1 × 108 молочнокислих і 1 ×108 пропіоновокислих бактерій. Це в 10 разів більше, ніж у бактеріальному концентраті, який одержано згідно з відомим способом. Порівняльна характеристика відомого і запропонованого бакконцентратів наведена в табл.3. Спосіб здійснюється таким чином. Для приготування живильного середовища відновлене сухе знежирене молоко гідролізують протосубтіліном. Потім додають буферні солі і стимулятори росту. Середовище стерилізують, охолоджують до температури 37°C і встановлюють pH 6,8 - 7,0. В готове середовище вносять 1% стерильного знежиреного молока і посівний матеріал: 5% культури Bifidobacterium animalis 135 и 2% Propionibacterium freudenreichii ssp. schermanii H-110. Накопичення бактеріальної маси здійснюють при температурі 37 ± 1°C протягом 6 - 7 годин, після чого вносять по 0,5% кожної з культур Lactobacillus acidophilus 38 і Lactobacillus acidophilus 20y та витримують при вищевказаній температурі ще протягом 7 ± 1 годин. Після закінчення процесу накопичення біомасу відокремлюють від культуральної рідини і змішують з захисним середовищем, яке містить 10% сахарози і 5% натрію лимоннокислого. Одержану таким чином суспензію заморожують при температурі мінус 35 - 40°C, і висушують у сублімаційній сушилці. Суху біомасу подрібнюють, розфасовують у стерильну тару і закупорюють. Приклад 1. Одержання бактеріального концентрату. У 70л водопровідної води розчиняють 2100г сухого знежиреного молока, встановлюють pH 6,8, суміш нагрівають до 55°C, вносять 12г протосубтіліну активністю 70од. і витримують у цих умовах 2,5 години. Після гідролізу в середовище вносять 350г лактози, 350г тризаміщеного лимоннокислого натрію, 1,4л кукурудзяного екстракту, 3,5г сірчанокислого заліза. В середовищі встановлюють pH 7,4 шляхом додавання 30% розчину гідрооксиду натрію і стерилізують при температурі 121°C протягом 30 хвилин. Активна кислотність середовища після стерилізації - 6,8од. pH. Середовище охолоджують до 37°C, вносять 0,7л знежиреного молока, 3,5л біфідобактерій B.animalis 135 і 1,4л пропіоновокислих бактерій P.schermanii P110 і культивують при 37°C протягом 6 годин. Після цього вносять 0,35л L.acidophilus 38 і 0,35л L.acidophilus 27y та витримують ще 8 годин для остаточного накопичення біомаси. В процесі культивування проводять розкислення культуральної рідини 25% водним розчином аміаку до pH 6,6 - 7,0. В кінці росту культуральну рідину охолоджують до 12°C, нейтралізують до pH 6,8 і центрифугують,. Одержану біомасу змішують у співвідношенні 1 : (1 - 2) з захисним середовищем такого складу (в г/л): сахарози 10; натрію лимоннокислого тризаміщеного 5; води - до 1л. Суспензію клітин у захисному середовищі розливають у кювети з висотою шару рідини 6мм, заморожують і висушують у сублімаційній сушилці. В 1г сухого бакконцентрату, який одержано згідно з запропонованим способом, міститься не менше 1 × 1010 життєздатних клітин біфідобактерій, 1 × 108 - пропіоновокислих бактерій і 1 × 108 ацидофільних паличок. Концентрат має високу активність - сквашує молоко за 6 годин і пригнічує розвиток патогенних серотипів E.coli при сумісному культивуванні в 1 - 2 розведеннях. Приклад 2. Спосіб здійснюють аналогічно прикладу 1 за винятком того, що ацидофільні бактерії вносять після 9 годин культивування біфідобактерій та пропіоновокислих бактерій. Одержаний концентрат містить 1 × 1010 біфідобактерій, 1 × 108 пропіоновокислих бактерій і 1 × 106 ацидофільних паличок. Він малоактивний і сквашує молоко за 10 годин. Приклад 3. Клінічна апробація бакконцентрату, який одержано за прикладом 1. Клінічна апробація бакконцентрату проводилася на базі колгоспу "Україна" Тернопільського району Тернопільської області, агрофірми "Волинь" і радгоспу їм. Котовського Кременецького району Тернопільскої області. Кількість піддослідних новонароджених телят дорівнювала 232 голови, з котрих у контрольну групу було залучено 65, в дослідну - 167. Дослідна група телят, у свою чергу, підрозділялася ще на 3 підгрупи згідно зі схемою застосування препарату: до першого випоювання молозива (11 голів), після першого випоювання молозива (119 голів) і після другого та третього випоювання молозива (37 голів). 1г бактеріального концентрату ресуспендували в 100 - 150мл стерильного ізотонічного розчину і призначали одноразово новонародженим телятам згідно з наведеною вище схемою. Дослідження показали, що у телят всіх дослідних підгруп шлунково-кишкові захворювання виникали значно рідше, ніж у контрольній групі (табл.5). Якщо вони і спостерігалися, то проходили значно легше і швидше виліковувалися - навіть без традиційного лікування. Летальних випадків у дослідній групі не спостерігалося, в той час коли в контрольній групі, незважаючи на лікування, загинуло 12% телят. Слід відмітити, що чим скоріше застосовувався бакконцентрат після народження телят, тим його профілактична ефективність була вищою. На основі одержаних результатів прийшли до висновку, що бакконцентрат "Біфідін" може використовуватись як ефективний засіб для профілактики шлунково-кишкових захворювань у новонароджених телят. Таким чином, спосіб, що заявляється дозволяє одержати бакконцентрат, який містить більш високу чисельність життєздатних клітин бактерій, а також підвищити біологічну активність препарату, завдяки чому він застосовується як ефективний профілактичний засіб для попередження шлунково-кишкових захворювань молодняка великої рогатої худоби.