Спосіб діагностики chlamydia trachomatis

Спосіб діагностики Chlamydia trachomatis, що включає дослідження біологічного зразка методом полімеразної ланцюгової' реакції (ПЛР) з використанням праймерів СТС та CTD, який відрізняється тим, що в реакційну суміш одночасно додатково вводять штучно синтезований фрагмент ДНК внутрішній контроль ампліфікації, довжиною 763 нп, який містить у внутрішній частині фрагмент ДНК фага лямбда, довжиною 709 нп, а на зовнішніх частинах - олінуклеотидні послідовності, комплементарні до праймерів СТС та CTD, і якщо після проведення ПЛР утворюється продукт ампліфікації - фрагмент ДНК довжиною 763 нп, то діагностують відсутність Chlamydia trachomatis в зразку, при детекції двох фрагментів: 457 нп та 763 нп - діагностують присутність Chlamydia trachomatis в зразку, якщо після ПЛР не детектують жодного з двох можливих продуктів ампліфікації, то таку реакцію вважають за хибнонегативну, а такий результат не враховують як діагностичний. Корисна модель належить до медицини, а більш конкретно - до фундаментальної медицини і може бути використаною для діагностики хламідійної інфекції методом полімеразної ланцюгової реакції. Відомо, що ампліфікаційні методи, розроблені для детекції Chlamydia trachomatis в уретральних, цервікальних зразках та зразках сечі демонструють більшу чутливість, ніж методи клітинних культур та детекція антигену [Black C. /Current methods of laboratory dagnosis of Chlamydia trachomatis infections. // ClmMicrobial Rev.-1997 - V.10. - P. 160184]. Найбільш поширеним ампліфікаційним методом є полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), продукти якої' детектуються методом електрофореза в агарозному гелі. Цей метод має недолік - низьку чутливість при наявності інгібіторів реакції' в клінічних зразках, що може привести до появи хибнонегативних результатів аналізу [Persmg D.H./ln vitro nucleic acid amplification techniques.ln D.H. Persing, T.F. Smith, Tenover F.C., White T.J. Diagnosis Molecular microbiology. Principle and Applications, American Society for Microbiology, Washington D.C. - 1993. - p. 51-87; Verkooyen R.P., Luijendick A.// Detection of PCR inhibitors in cervical specimens by using the Amplicor Chlamydia tracbomatis assay. J.Cfin.Microbiol -1996. - V.34. - P. 3072-3074]. Відомий спосіб детекци Chlamydia trachomatis методом полімеразної ланцюгової реакції запропоновано в роботі Е.М. Elnifro [Е.М. Elnjfro, С.С. Storey, D.J. Morris, А.В. Tullo / Polymerase chain reaction for detection of Chlamydia trachomatis in conjunctival swabs// Br.J.Ophtalmol.,1997; 81. P.497500]. Для ампліфікації були застосовані праймери, що гібридизувались до регіонів 5331-5357 (СТС) та 5788-5762 (CTD) на хламідійній плазміді та ампліфікували 457нп фрагмент [Comanducci M.Ricci S., Ratti G. /The structure of a plasmid of Chlamydia trachomatis believed to be required for growth within mammalian cells.// Molecul. Microbiol,1988. - №2. P.531-538]. Продукти ПЛР детектувались методом горизонтального електрофорезу в агарозному гелі. Даний спосіб є найбільш близьким по технічній суті та результату, що може бути досягнутим, до заявленого способу, тому його обрано в якості прототипу. До недоліків цього способу відносять те, що він при використанні в ПЛР діагностиці Chlamydia trachomatis може мати низьку чутливість при наявності інгібіторів в клінічних зразках і це може бути причиною появи хибно - негативних результатів. В основу корисної моделі покладено задачу 00 11480 підвищення точності і надійності ПЛР-дІагностики хламідійної інфекції. Задача, яку покладено в основу корисної моделі вирішується тим, що у відомому способі діагностики хламідійної' інфекції, який включає дослідження біологічного зразка методом ПЛР з використанням праймерів СТС та CTD, згідно з корисною моделлю одночасно додатково вводять штучно синтезований фрагмент ДНК - внутрішній контроль ампліфікації, довжиною 763нп, який вміщує у внутрішній частині фрагмент ДНК фага лямбда, довжиною 709нп, а на зовнішніх частинах олінуклеотидні послідовності, комплементарні до праймерів СТС та CTD, і якщо після проведення ПЛР утворюється продукт ампліфікації - фрагмент ДНК довжиною 763нп, то діагностують відсутність Chlamydia trachomatis в зразку, при детекції двох фрагментів: 457нп та 763нп - діагностують присутність Chlamydia trachomatis в зразку, якщо після ПЛР не детектують жодного з двох можливих продуктів ампліфікації, то таку реакцію вважають за хибно-негативну, а такий результат не враховують як діагностичний. Таким чином, якщо додавати такий штучний фрагмент ДНК до клінічних зразків, в яких треба методом ПЛР виявити Chlamydia trachomatis, то детекція фрагменту довжиною 763нп - внутрішнього контролю ампліфікації - буде доказом відсутності інгібіціі ПЛР в зразку. Ознаками корисно! моделі, що відрізняють її від прототипу є використання в якості показника присутності інгібіторів ПЛР внутрішнього контролю ампліфікації. Відсутність детекції внутрішнього контролю ампліфікації вказує на присутність інгібіторів полімеразноі ланцюгової' реакції в зразку, таку реакцію вважають як хибно-негативну, а такий результат не враховують, як діагностичний. Спосіб діагностики Chlamydia trachomatis виконують наступним чином. Внутрішній контроль ампліфікації конструюють за допомогою ПЛР з використанням гібридних праймерів, структура яких вміщувала на З'-кінцях послідовності праймерів СТС та CTD та на 5'кінцях - послідовності праймерів, комплементарних до фрагменту ДНК фага лямбда довжиною Комп'ютерна верстка А. Крулевський 709нп. Матрицею для ПЛР було використано препарат ДНК фага лямбда. Отримують продукт ПЛР довжиною 763нп, який вміщував во внутрішній частині фрагмент ДНК фага лямбда. Таким чином, отриманий фрагмент ДНК ампліфікується за допомогою СТС та CTD, але вміщує во внутрішній частині фрагменти ДНК фага лямбда та відрізняється за довжиною від специфічного фрагменту дезоксірібонуклеїнової кислоти (ДНК) Chlamydia trachomatis на ЗОбнп. Це дозволяє ампліфікуватись одночасно в одній пробірці двом фрагментам які детектуються як окремі полоси при електрофорезі. Наявність причинно-слідчого зв'язку між істотними ознаками і досягнутими технічними результатами підтверджується даними дослідження 10 клінічних зразків хворих на урогенітальні запалення з метою виявлення Chlamydia trachomatis. Зразки досліджують методом ПЛР, з використанням праймерів до фрагменту ДНК Chlamydia trachomatis довжиною 457нп, з додаванням в реакційну суміш внутрішнього контролю ампліфікації. В двох зразках методом ПЛР було детектовано два фрагменти ДНК-довжиною 457нп Chlamydia trachomatis та 763нп - ДНК внутрішнього контролю ампліфікації. Такі зразки були враховані, як позитивні. В 7 зразках після проведення ПЛР було детектовано один фрагмент ДНК - внутрішнього контролю-763 нп. Ці зразки були враховані, як негативні. В одному зразку після проведення ПЛР не було детектовано жодного фрагмента ДНК. Цей зразок враховано, як хибно-негативний і результат не враховувався як діагностичний. В такому випадку необхідно проводити додаткове діагностичне обстеження хворого ПЛР методом, або, при неможливості отримати коректний результат, іншим діагностичним методом. Отримані дані підтверджують необхідність використання внутрішнього контролю ампліфікації в ПЛР-діагностиці Chlamydia trachomatis. Таким чином, запропонований спосіб забезпечує підвищення точності і надійності ПЛРдіагностики хламідійної інфекції і може бути використаним при діагностиці Chlamydia trachomatis. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти І науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м Київ - 42, 01601