Спосіб визначення ефективності антиатерогенних препаратів

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к методам исследования патогенеза и профилактики атеросклероза, и может быть использовано для тестирования новых лекарственных средств, а также для изучения механизмов атерогенеза и действия антиатерогенных препаратов. Известен способ получения пенистых клеток из макрофагов мыши (см. авт. св. №1784922, кл. G 01 N 33/554, прототип), по которому In vivo воздействуют на макрофаги мышей окисленными холестерином или липопротеидами низкой плотности путем их внутрибрюшинного введения. Через 24 ч из перитонеальной полости мышей извлекают макрофаги, трансформированные в пенистые клетки. Недостаток прототипа состоит в том, что он отличается трудоемкостью и малой специфичностью, так как для исследования используют макрофаги мыши, неадекватные макрофагам человека. Задачей авторов является повышение специфичности способа тестирования лекарственных препаратов антиатерогенного действия, а также упрощение методики его использования. Для решения поставленной авторами задачи предложен способ определения эффективности антиатерогенных препаратов, заключающийся в воздействии на макрофаги человека модифицированными липопротеидами низкой плотности для образования пенистых клеток. Исследования проводят на макрофагах человека In vitro. В качестве модифицированных липопротеидов низкой плотности используют иммунные комплексы, в частности липопротеид низкой плотности-антитело, которые выделяют из сыворотки крови больного ишемической болезнью сердца. Одновременно проводят инкубацию контрольной пробы, состоящей из макрофагов с иммунными комплексами и исследуемой, состоящей из макрофагов, иммунных комплексов и тестируемого антиатерогенного препарата. Затем определяют эффективность антиатерогенного препарата по снижению числа образовавшихся пенистых клеток и уменьшению внутриклеточного содержания эфиров холестерина по сравнению с контрольной пробой. Проведение исследований на макрофагах человека в условиях in vitro обусловлено доступностью и простотой получения материала, возможностью экстраполяции полученных данных на целостный организм. Использование в качестве модифицированных липопротеидов низкой плотности: иммунных комплексов липопротеид низкой плотности-антитело, выделенных из крови больных ишемической болезнью сердца, а не химически модифицированых липопротеидов, как в прототипе, обеспечивает более: адекватное моделирование патологического процесса. Одновременная инкубация макрофагов с иммунными комплексами обеспечивает достаточно быстрое получение модельных пенистых клеток, а возможность проводить параллельное тестирование контрольных и исследуемых проб позволяет проводить эффективный скрипинг антиатерогенных препаратов. Снижение числа образовавшихся пенистых клеток, являющихся основным морфологическим маркером атеросклеротических поражений, и уменьшение внутриклеточного содержания эфиров холестерина подтверждают антиатерогенное воздействие исследуемых препаратов, т.е. их эффективность (см. Brown M.S., Goldstein J.L.//Ann.Rev.Blochem. - 1983. - v.52. - p.223-261). Использование заявляемого способа в экспериментальной медицине и клинической практике позволит упростить способ и повысить его специфичность, а также даст возможность определять индивидуальную чувствительность к препаратам. Заявляемый способ осуществляют следующим образом. 1. Выделяют моноциты из цельной крови человека на градиенте плотности верографин-фиколл (d = 1080) по известному методу Recalde H. (см. J.Immunol.Meth. -1984. - v.69. - р.71-72). 2. Инкубируют моноциты в полистироловых культуральных планшетах (d = 5мм и 20 мм, концентрация 104 и 106 клеток на лунку, соответственно) и в круглодонных полистироловых пробирках (10 клеток на мл) в течение 1 ч при 37°С в среде Игла с добавлением 20 ммоль Hepes, бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) и антибиотиков (200 мкг/мл стрептомицина, 100 Ед/мл пенициллина). 3. Готовят контрольную пробу, добавляя к принкубированным макрофагам (105 клеток на 1 мл) иммунные комплексы, в частности липопротеид низкой плотности-антитело (80 мкг холестерина/мл инкубационной среды), которые выделяют из сыворотки крови больных ишемической болезнью сердца по известному методу Стручкова И.В. др. (см. Лаб. дело -1985. - №7. - С.411-412). 4. Готовят исследуемую пробу, добавляя антиатерогенный препарат, например антагонист кальция дилтиазем к пробам, состоящим из мононуклеарных клеток и иммунных комплексов. 5. Одновременно проводят инкубацию контрольной и исследуемой проб при 137°С в течение 16 ч. 6. Определяют количество образовавшихся пенистых клеток в контрольной и исследуемой пробах методом электронной микроскопии. 7. Определяют внутриклеточное содержание эфиров холестерина в контрольной и исследуемой пробах методом тонкослойной хроматографии (Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. Пер. с нем. М., 1981, т.1, с.283). 8. Оценивают эффективность антиатерогенного препарата по снижению числа образовавшихся пенистых клеток и уменьшению внутриклеточного содержания эфиров холестерина. Пример, подтверждающий осуществимость заявляемого способа, посвящен исследованию антиатерогенного действия антагогиста кальция-кардила (дилтиазема; фирма Орион, Финляндия). В экспериментах используют стабилизированную 0,1% ЭДТА донорскую кровь (мужчины в возрасте от 25 до 45 лет). Выделяют моноциты из цельной крови на градиенте плотности верографин-фиколл (d = 1080). Полученные клетки инкубируют в полистироловых культуральных планшетах (d = 5 мм, 20 мм, концентрация 104 и 106 клеток на лунку, соответственно) и в кругло-донных полистироловых пробирках (10 клеток на мл) в течение 1 ч при 37°С в среде Игла с добавлением 20 мМоль Hepes, бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) и антибиотиков (200 мкг/мл стрептомицина, 100 Ед/мл пенициллина). Готовят контрольную пробу, добавляя к преинкубированным макрофагам (105 клеток на 1 мл) иммунные комплексы, в частности липопротеид низкой плотности-антитело (80 мкг холестерина/мл инкубационной среды), которые выделяют из сыворотки крови больных ишемической болезнью сердца. Готовят исследуемую пробу, добавляя антиатерогенный препарат, например антагонист кальция дилтиазем к пробам, состоящим из мононуклеарных клеток и иммунных комплексов. Одновременно проводят инкубацию контрольной и исследуемой проб при 137°С в течение 16 ч. Определяют количество образовавшихся пенистых клеток в контрольной и исследуемой пробах методом электронной микроскопии Определят внутриклеточное содержание эфиров холестерина в контрольной и исследуемой пробах методом тонкослойной хроматографии. Оценивают эффективность антиатерогенного препарата по снижению числа образовавшихся пенистых клеток и уменьшению внутриклеточного содержания эфиров холестерина. Количество пенистых клеток и внутриклеточное содержание эфиров холестерина в макрофагах человека под влиянием кардила (см. таблицу). Полученные результаты представлены в таблице и свидетельствуют, что кардил препятствует превращению макрофагов в пенистые клетки и снижают внутриклеточное содержание эфиров холестерина, что связано с его антиатерогенным действием. Заключение: тестируемый лекарственный препарат - кардил обладает антиатерогенным действием. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить пенистые клетки, соответствующие клеткам в живом организме человека, которые могут быть использованы для определения эффективности лекарственных препаратов антиатерогенного действия, а также для определения индивидуальной чувствительности конкретного больного к исследуемому препарату.