Спосіб розділення гепатоцитів

ОП>£ЛИКОВМ О 13 91 JL ДЛЯ СЛУЖ'І ЬТПГГЇГЇЇППЬЗОП М1ИЯ J K j N" 0 1 w СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК GD .f C .1 2 N 5/00 _ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTFT ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГННТ СССР и (21) 4272263/28-1Л (22) 29 06.87 (71) Институт проблем криобиологии ч ^риомедицины Ah VCCP (7?*1 А.Ю Петренко, А.Н.Сукач и Л. П, Крав-ієн» о (53) 612,015(088.8) (56) In v i t i o , 1985, v . 2 1 , № 9, 526-530. Р о \54> СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ГППАТОЦИТОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а -іменно к способам оідел^ни-* жизнеспособных гепатощ-тов от поврежденньх. Це^ыо изобретения Изобретение относится к биотехночогиИэ а именно к способам отделения жизнеспособных гепатоцитов от поврежденных. Целью изобретения является увеличение выхода >ияиеспособных клеток эа счет разделения клеток в изотонической сахарозной среде при следующем содержании компонентов: 250 мМ сахарозы, S мм КС1, 0,4 мМ КН^РО 4 , 1,6 мМ Na 2 HPO^, 0,8 мі! MgCl a , 1,2 мМ CaCl^» 1 % алюбумпна. П р и м е р 1 . ПерсЬузию печени крыс-самцов массой 700-250 г проводили in situ. Для этого брюшную полость анестезированного тиопенталом животного вскрывали, вводили инъекционную иглу в воротную вену и закрепляли лигатурой, а верхнюю полую подсекли в месте ответвления правой почечной вены для оттока 35-89 является увеличение выхода жизнеспособных клеток. Суспензию гепатоцитов в изотонической сахарозе» содержащую 0,8 мМ MgCl, 5 мК КС1» 1,6 мМ Na 2 HP0 4 , 0,4 мМ КН^РО^, 1,2 мМ СаС1 2 и ї%-альбумин центрифугируют при 50 g в течение А мин. При этом суспензия клеток разделяется на 2 Фракции: нижнюю бопее темную и верхнюю светлую, Фракции разделяют, после чего суспендируют в солевом растворе и определяют дизнеспособностЬс Интактные кретки содержатся в нижней, более темной фрак ции. 1 табл. < перфузатап На первом этапе печень отмывали от крови со скоростью 2535 мл/мин раствором, содержащим: 140 мМ NaCl, 5 мМ КС1, 3 мМ NaHCO 3 , 27 мМ лимоннокислого натрия, который насыщали газовой смесью 95% 0 2 и 5% С0 2 до рН 7,4 в течение 10 мин при 37°С со скоростью 25-35 мл/мин. На втором этапе перфузию проводили с той же скоростью в течение 20-30 мин. На этом этапе в среду вводили ЭДТА до конечной концентрации 2 мМ. После окончания перйузии печень извлекали из брюшной полости, быстро охлаждали до 0°С и измельчали ножницами в среде, содержащей 250 мМ сахарози, 5 мМ КС1, 1,6 мМ Na^HPO,,, 0,4 мМ К Н 2 Р 0 4 , 0,8 мМ MgCl,, 1,2 мМ СаСІ^, П альбумина (рН 7,4). Кусочки ткани подвергали вибрации в охлажденной сахарозно-солевой среде с частотой 50 Гц Г11 3 1510356 в течение 60 с с помощью устройства, электродвигатель которого приводит в возвратно-поступательное движение пестик, Полученную после вибрации суспеняию клеток фильтровали через нейпон и центрифугировали при 50 g в течение 4 мин. При этом суспензия клеток разделилась на 2 фракции: нижнюю более темную и верхнюю свет10 лую,, Фракции разделяли, после чего суспендировали в солевом растворе, содержащем 140 мМ NaCl, 5 мМ КС1, 0,8 мМ MgSO + , 1,6 мМ N a 2 H P 0 4 , 0,4 мМ 15 КН^РО 4 , 25 мМ NaHCO,, 1 мМ СаС1 2 (рН 7,4). Полученные после промывки клетки исследовали. Жизнеспособность определяли методом окрашивания трипановым синим, скорость эндогенного ды- 20 хания (УЭНД) в отсутствии и присут ствии сукцииата (5 мЧ) определяли полярографически. Результаты представлены в таблице. Из таблицы видно, что в нижней фракции находятся интактные клетки (жизнеспособность 93%), обладающие высоким эндогенным дыханием. Эндогенное дыхание клеток нижнего слоя слабо стимулируется сукцинатом, в норме не проникающим через плазматическую мембрану. В верхнем слое большинство клеток прокрашивается трипановым синим, эндогенное дыхание в 8 раз ниже, чем в клетках нижней фракции. Сукцинат * стимулирует дыхание более чем в 1 1 ' раз. Выход жизнеспособных клеток из всей печени в процентах составил 28,3% по предлагаемому способу * (количество_жизнеспособных клеток^j_00% общее количество клеток 25 и 19,6% по известному способу, т . е . выше на 44% по предлагаемому способу. т растворе, о о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода жизнеспособности клеток, фракционирование проводят в изотонической саФ о р м у л а и з о б р е т е н и ч 30 харозной среде при следующем содер- жании компонентов: 250 м М сахарозы, Способ разделения гепатош^ов 5 м хлористого калия, 0,4 м фос* ? М М путем дезагрегации печени, фракциофорнокислого калия однозамещенного, нирования полученных клеток в среде ! , 6 м фосфорнокислого натрия двуМ разделения на две фракции, отделения замещенного, 0,8 м хлористого магМ нижней фракции с последующей очисткой ния, 1,2 м хлористого кальция, 1 М % альбумина. * гепатоцитов промыванием в солевом Фракция Жизнеспособность, V СцК нмоль мл/мин 0 2 / 1 0 б кл/мин ЫМОЛЪ 0/10 эид •7 Нижняя Ш 93± 2 Верхняя 5 г/, У+2, 2 3+1 2,2+0, 2 Редактор А. Кондрахнна 22 24 7+2 5 1,33+0, 1 11,24+0, 7 Составитель Л. Сабурова Техоед А.Кравчук Корректор В„Кабаций Заказ 1773/ДСП Тираж 367 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113О35ч Москва, Ж-35, Раушская н а б . , д . 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101