Спосіб одержання фосфоліпідів

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до способу одержання фосфоліпідів, які знаходять широке застосування в парфюмерній, фармакологічній, харчовій промисловостях та в кормовиробництві. Найбільш близьким до пропонованого способу і вибраний в якості прототипу є спосіб одержання комплексу фосфоліпідів із промислових відходів головогогих молюсків, що включає подрібнення вологої сировини, ліофільну сушку її на протязі 8 годин, екстракцію загальних ліпідів етиловим спиртом при співвідношенні сировини і етилового спирту 1 : 10 - 1 : 20, відокремлення спиртової фракції і відгонку спирту, перерозчинення одержаного залишку ліпідів в гексані і виділення комплексу фосфоліпідів з гексанової фракції упарюванням. Відомий спосіб дозволяє одержувати комплекс фосфоліпідів із тваринної сировини, але має ряд вагомих недоліків, основними із яких є довготривалість процесу, тр удомісткість, енергоємність і пов'язана з цим втрата нативних якостей ліпідів, що приводить до зниження виходу цільового продукту. Використання великої кількості етилового спирту також створює умови для, окислення фосфоліпідів і втрати нативних якостей їх під час його упарювання. Крім того, відомий спосіб не передбачає можливості одержання окремих складових сполук комплексу фосфоліпідів. В основу винаходу поставлена задача створення способу одержання фосфоліпідів із сировини тваринного походження, в якому шляхом зміни умов процесів гомогенізації і зневоднення вологої сировини та екстракції, створюється можливість зменшення довготривалості і трудомісткості способу, одержання продукту з більш високим виходом і збереженними нативними якостями, а також можливість одержання комплексу фосфоліпідів і його складових сполук. Поставлена задача досягається тим, що в способі одержання фосфоліпідів, який включає подрібнення вологої сировини, її зневоднення, екстракцію органічними розчинниками ліпідів та виділення цільового продукту упарюванням, згідно способу, подрібнення і зневоднення виконують шляхом поєднаної гомогенізації сировини разом з речовинами із водопоглинаючими властивостями, після чого протиточною екстракцією органічними розчинниками з різною екстрагуючою здатністю послідовно відокремлюють комплекс фосфоліпідів або окремі його складові. Як водопоглинаючу речовину використовують безводний сульфат натрію або суміш його з силікагелем чи оксидом алюмінію у співвідношенні до сировини 1 : 1 - 1 : 2. Органічними розчинниками ліпідів на стадії екстракції беруть ацетон, хлороформ і аліфатичні спирти. Складові комплексу фосфоліпідів отримуються шляхом рівномірної зміни екстрагуючої здатності суміші розчинників в залежності від співвідношення хлороформ аліфатичний спирт на протязі всього процесу екстракції: дифосфатиділгліцерин - від 95 : 5 до 92 : 8, дифосфатиділетаноламін - від 92 : 8 до 88 : 12, фосфа тиділхолін - від 88 : 12 до 75 : 25. Для збереження ліпідів від деградації процес поєднаної гомогенізації і зневоднення проводять в атмосфері інертного газу (азоту чи гелію) при температурі 2 4°C. Авторами встановлено, що проведення поєднаної гомогенізації дозволяє одержати зневоднений матеріал, в якому сировина рівномірно розподілена між частинками водопоглинаючої речовини, що запобігає утворенню агрегантів і сприяє повноті екстракції. В якості речовин із водопоглинаючими властивостями використовують неорганічні речовини або їх суміші, які інертні до органічних розчинників, активно зв'язують воду, мають адсорбційні властивості і не впливають на нативні властивості кінцевого продукту. В результаті такого процесу одержують матеріал у вигляді тонкодисперсного порошку, який і направляють на екстракцію. Низька температура процесу гомогенізації і атмосфера інертного газу забезпечують збереження нативних якостей ліпідів і оберігають високоненасичені ліпіди від окислення киснем атмосферного повітря. При цьому при температурі вище 4°C збільшується ймовірність зниження нативних якостей ліпідів за рахунок окислення їх киснем повітря і ферментної взаємодії, зниження ж температури нижче 2°C не є доцільне, так як не впливає на кінцевий результат. Застосування протиточної екстракції такої суміші дозволяє набагато зменшити тривалість процесу, знизити витрати розчинників і забезпечує можливість одержання комплексу фосфоліпідів і окремих його сполук. Використовуючи в якості розчинника суміші хлороформ аліфатичний спирт у різному співвідношенні дозволяє досить повно виділити комплекс фосфоліпідів, а також одержати необхідні окремі його сполуки. Як аліфатичні спирти використовують метиловий або етиловий спирт. Спосіб виконують слідуючим чином: в ультрадиспергатор поміщають сировину і водопоглинаючу речовину у співвідношенні від 1 : 1 до 1 : 2 і гомогенізують при температурі 2 - 4°C на протязі 10 - 15хв в атмосфері інертного газу. Одержаний гомогенний матеріал засипають в екстракційну колонку із співвідношенням внутрішнього діаметра до довжини від 1 : 5 до 1 : 20 і промивають охолодженим ацетоном (-20°C). Таким чином відокремлюють нейтральні ліпіди, а також пігментні речовини. Після цього колонку промивають сумішшю хлороформ - аліфатичний спирт. Змінюючи співвідношення хлороформу і спирту можна одержати комплекс фосфоліпідів або окремі його сполуки. Процес вимивання цільових продуктів контролюють методом мікротонкошарової хроматографії. Одержані екстракти очищають відомими способами, упарюють розчинник і отримують цільовий продукт. Суть способу пояснюється прикладами конкретного виконання. Приклад 1. Одержання фосфоліпідів із мідій. 100г тканин мідій засипають 200г безводного сульфату натрію і гомогенізують при температурі 4°C в атмосфері азоту 15хв. Одержану суміш засипають в колонку і промивають 150мл холодного (-20°C) ацетону. Перша фракція, яку отримують (50мл) збагачена пігментними речовинами сировини і послідуючі збагачені нейтральними ліпідами. Після цього колонку промивають сумішшю хлороформметанолу (1 : 2, 300мл) до повного виділення фосфоліпідів. Очистку екстракту проводять промиванням 0,05М розчином сульфіту натрію в дистильованій воді і упарюють на роторному випарювачі. Із 100г сирих тканин чорноморської мідії із району м.Севастополя одержують 6,75г (6,75%) ліпідів, з яких 5,2 (5,2%) фосфоліпідів, що становить 99,0% їх загального вмісту визначеного класичним способом. Кількість окислених продуктів, що контролювали по спектрах поглинання в ультрафіолетовій області не перевищувала 0,1%, що свідчить про збережену нативність одержаних речовин. Приклад 2. Диференційне одержання фосфоліпідів із мідій. 100г тканин мідій засипають 120г безводного сульфату натрію, 100г силікагелю і гомогенізують при температурі 4°C в атмосфері азоту 15хв. Одержану суміш засипають в колонку, яка на одну четверть об'єму заповнена силікагелем і промивають холодним (-20°C) ацетоном. Після цього колонку промивають сумішшю хлороформу метанолу і хлороформу - метанолу - аміаку, створюючи лінійний градієнт концентрації хлороформу - метанолу від 100 : 0 до 70 : 30. Появу цілевих продуктів контролюють мікро-ТШХ. При цьому спочатку одержують фракцію збагачену дифосфатиділгліцерином (0,16г) при градієнті концентрації хлороформу - метанолу від 95 : 5 до 92 : 8, фракцію збагачену фосфатиділетаноламіном (0,42г) при градієнті концентрації хлороформу метанолу від 92 : 8 до 88 : 12 в присутності аміаку, фракцію збагачену фосфатиділхоліном (1,2г) при градієнті концентрації хлороформу - метанолу від 88 : 12 до 75 : 25 в присутності аміаку. Фосфатиділсерин, сфінгомієлін та інші ліпіди отримують аналогічно при визначених співвідношеннях розчинників. Чистота цільових продуктів 80 - 90%. Приклад 3. Одержання фосфоліпідів із мозку с/г тварин. 100г тканин мозку с/г тварин засипають 180г безводного сульфату натрію і гомогенізують при температурі 3°C в атмосфері гелію 10хв. Одержану суміш засипають в колонку і промивають холодним (-20°C) ацетоном (200мл), одержуючи фракцію збагачену нейтральними ліпідами. Після цього колонку промивають сумішшю хлороформ метанолу (1 : 2,300мл) до повного виділення фосфоліпідів. Очистку екстракту проводять промиванням 0,05М розчином сульфіту натрію в дистильованій воді і упарюють. Одержують 5г фосфоліпідів, що становить 97% їх вмісту в сировині. Приклад 4. Одержання фосфатиділхолінів із мозку свині. 100г тканин мозку свині засипають 100г безводного сульфату натрію, 100г оксиду алюмінію і гомогенізують при температурі 4°C в атмосфері азоту 15хв. Одержану суміш засипають в колонку і промивають хлороформом (300мл), а потім сумішшю хлороформ - етанолу (9 : 1, 300мл). Збирають фракції, де контролюють появу фосфа тиділхолінів мікро-ТШХ. Фракції, що містять фосфа тиділхоліни об'єднують і упарюють. Вихід фосфа тиділхоліну 1,2г, що становить 80% їх кількості в мозку. Приклад 5. Одержання фосфоліпідів із яєчних жовтків. 5 жовтків засипають 200г безводного сульфату натрію і гомогенізують при температурі 2°C 5хв. Одержану суміш засипають в колонку і промивають холодним (-20°C) ацетоном до повного вимивання нейтральних ліпідів. Після цього колонку промивають сумішшю хлороформ - етанолу у співвідношенні 1 : 2 до повного вимивання фосфоліпідів. Одержують 16г фосфоліпідів, що становить 98% їх вмісту в сировині. Приклад 6. Одержання фосфатиділхолінів із яєчних жовтків. 5 жовтків засипають 200г безводного сульфату натрію і гомогенізують при температурі 4°C 4хв. Одержану суміш засипають в колонку і промивають холодним (-20°C) ацетоном до повного вимивання нейтральних ліпідів. Після цього колонку промивають сумішшю хлороформ етанолу, створюючи градієнт концентрації хлороформу - етанолу від 100 : 0 до 90 : 20. Появу цільових продуктів контролюють мікро-ТШХ. Фракції збагачені фосфатиділхоліном одержують при градієнті концентрації хлороформу - етанолу біля 90 : 10, іх об'єдн ують і упарюють. Вихід 3,5г, що становить 95% їх початкової кількості в сировині. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє одержувати фосфоліпіди із будь-якої, придатної для цього, сировини тваринного походження. При цьому цільовий продукт може представляти собою, як комплекс фосфоліпідів, так і їх суміші збагачені певними сполуками, а також індивідуальні сполуки. Спосіб не довготривалий, легкий у виконанні і не потребує великих витрат органічних розчинників. Спосіб забезпечує збереження нативних якостей фосфоліпідів, що приводить до збільшення виходу кінцевого продукту.