Спосіб одержання церулоплазміну медичного призначення

Винахід відноситься до технології одержання ферменту крові людини - церулоплазміну і може бути застосованим в галузі виробництва лікарських препаратів. Церулоплазмін - білок плазми крові, що містить мідь, який відноситься до групи білків "гострої фази" і є одним із факторів природного захисту організму. Він приймає участь у процесах транспорту міді, здатний каталізувати окислення багатьох біоорганічних сполук, має радіозахисні та антиоксидні властивості. Усе це свідчить про можливості його широкого застосування в медицині та біології. Застосування церулоплазміна, як медичного препарату, дозволено рішенням Фармкомітета СРСР №411 від 19.10.90. Реєстраційний номер препарата 90/411/1. Відомі методи одержаний церулоплазміну основані на сорбції його на ДЕАЕ-сорбентах з наступним очищенням методами гель-фільтрації, сольового або спиртового осадження, перекристалізації. Істотним недоліком усіх відомих промислових засобів одержання церулоплазміну є довготривалість процесу його одержання та досить великі втрати на різних етапах роботи, як сорбента, при сорбції та відмивці, так і препарата, при його ліофільному сушінні. Найбільш близьким по технічній суті до запропонованого винаходу є спосіб одержання церулоплазміну (А.с. №1826193), який використовується нами як спосіб-прототип. Спосіб полягає в гомогенізації вихідної сировини в 0,05М розчині хлористого натрію при температурі 4°C та pH 6,3, сорбції церулоплазміну з гомогенату на іонообмінник, десорбцію баластних білків, пов'язаних разом з ферментом при сорбції, 0,12М розчином хлористого натрію, елюцію церулоплазміну з сорбента, його очищення сумішшю спирту-хлороформу та спиртовим осадженням. Осад церулоплазміну підлягає розчиненню, стерилізації та ліофілізації. Даний спосіб передбачає ліофілізацію препарата по методу, описаному в а.с. №991633. Згідно цієї методики розчин церулоплазміну спочатку заморожують на протязі 6 годин при температурі -55°C, а потім завантажують в сублімаційну камеру, завчасно охолоджену до 20°C. При цій температурі препарат витримують 3 години, а потім температуру доводять до +10°C, при якій препарат знаходиться 5 годин. Потім температуру згідно графіка (див. фіг.2) підіймають до +35° - +40°C і при цій температурі препарат знаходиться до кінця висушування. Повний процес ліофілізації займає біля 3 діб. Завданням винаходу є здешевлення та спрощення промислової технології одержання препарату церулоплазміну, не знижуючи його фізико-хімічних властивостей. Поставлена задача досягається шляхом зміни умов гомогенізації вихідної сировини та ліофілізації кінцевого продукту. На першому етапі одержання церулоплазміну вихідну сировину гомогенізують у 0,1М розчині хлористого натрію при pH 6,6 - 6,8 та температурі 10 - 12°C. В цих умовах церулоплазмін, присутній у розчині гомогенату, має перевагу порівняно з іншими білками при сорбції на іонообмінник. В зв'язку з цим на 20 - 30% підвищується специфічна ємкість сорбенту відносно церулоплазміну і процес відмивки іонообмінника від баластних білків зводиться, головним чином, до відмивки сорбента від вихідної сировини. На останньому етапі одержання препарату розчин церулоплазміну спочатку заморожують на протязі 12 - 18 годин при температурі -38 - -40°C і завантажують в завчасно охолоджену до -25 - 30°C сублімаційну камеру при атмосферному тиску 2,3 ´ 10-1мм рт.ст. Дані умови дозволяють максимально зберегти нативність препарату, та значно зменшити його втрати при висушуванні. При цій температурі препарат витримують 3 - 4 години, і далі, згідно графіка (фіг.2), поступово збільшують температуру камери до +38°C. В цих умовах процес висушування препарата займає близько двох діб, що у 1,5 рази швидше в порівнянні зі способом-прототипом. Таким чином запропонований нами спосіб дозволяє, не знижуючи фізико-хімічних властивостей церулоплазміну, виключити з процесу його одержання стадію десорбції баластних білків і скоротити час висушування препарата, що значно прискорює технологічний процес (див. фіг.1, 3). Суть винаходу полягає в слідуючому: вихідну сировину гомогенізують в 0,1М розчині хлористого натрію при pH 6,6 - 6,8 та температурі 10 - 12°C, добавляють у гомогенат іонообмінник, на якому сорбується церулоплазмін, відмивають сорбент від залишків вихідної сировини, елюірують церулоплазмін 0,25М розчином хлористого натрію, доводять pH елюата до 5,2, температуру до 25°C, добавляють етиловий спирт і хлороформ до кінцевої концентрації відповідно 25об.% і 4об.%, осад, що утворився, відділяють центрифугуванням, доводять концентрацію спирту у центрифугаті до 55об.%, витримують при -10°C десять годин і знову центрифугують. Сформований осад церулоплазміну розчиняють у 0,14М розчині хлористого натрію, який стерилізують. Після стерилізації розчин препарата заморожують на протязі 12 - 18 годин до температури -38 - -40°C і завантажують в завчасно охолоджену до -25 - 30°C сублімаційну камеру при атмосферному тиску 2,3 ´ 10мм рт.ст. В цих умовах препарат витримують 3 - 4 години, і далі, згідно фіг.2, температуру поступово збільшують до +38°C і при цій температурі препарат знаходиться до кінця висушування. Приклад 1. 300г осаду 3 фракції по Кону плацентарної сироватки гомогенізують у 1л 0,1М розчині хлористого натрію при температурі 10°C і pH 6,6, який доводять 0,1М NaOH. До одержаної суспензії добавляють 20г ДЕАЕ-цілюлози і суміш при слабкому перемішуванні оставляють на 18 годин. Целюлозу з сорбованим церулоплазміном відмивають від залишку гомогената 0,1М NaCl і проводять елюцію препарата 0,25М розчином хлористого натрію. Одержані 50мл елюата доводять за допомогою 1М HCl до pH 5,2, добавляють етиловий спирт і хлороформ відповідно до кінцевої концентрації 25 і 4об.% і суміш на протязі 30 хвилин перемішують при температурі 25°C. Одержаний осад відділяють центрифугуванням на протязі 1 години при 3тис.об./хв. До центрифугату добавляють етиловий спирт до кінцевої концентрації 55об.% І витримують на холоді (-10°C) 18 годин. Сформований осад церулоплазміну відділяють центрифугуванням при 3тис.об./хв на протязі 1 години. Отримали 0,200г осаду, який розчинюють у фізіологічному розчині і стерилізують. Стерилізований розчин церулоплазміну заморожують на протязі 12 годин при температурі -38°C і завантажують в завчасно охолоджену до 25°C сублімаційну камеру при атмосферному тиску 2,3 ´ 10-1мм рт.ст. Далі, згідно динаміці графіка (фіг.2) температуру поступово підіймають до 38°C. Весь процес висушування займає біля 48 годин. Кінцевий вихід препарату в даному прикладі складає 0,6мг церулоплазміну на 1г вихідної сировини. Оптичний коефіцієнт Е610/280 дорівнює 0,04. Біологічна активність - 17умов.од. Препарат апірогенний. Приклад 2. 300г осаду 4 фракції по Кону донорської сироватки гомогенізують у 1л 0,1М розчині NaCl при температурі 12°C і pH 6,8. До одержаної суміші добавляють 20г ДЕАЕ-целюлози, яку перемішують на протязі 18 годин при тій же температурі. Після відмивки від залишків гомогенату 0,1М розчином NaCl препарат церулоплазміна елюїрують з сорбента 0,25М розчином NaCl. Одержали 60мл елюату, іонну силу якого доводять до 5,2, добавляють 20мл 96% спирту і 3,2мл хлороформу, що забезпечує кінцеву концентрацію цих інградієнтів відповідно 24 і 4об.%. Суміш на протязі 30хв. перемішують при 25°C і центрифугують 1 годину при 3тис.об./хв. Осад викидають, а до центрифугату добавляють етиловий спирт (37,7мл), що забезпечує кінцеву концентрацію 55об.% і витримують на холоді (10°C) 18 годин. Осад церулоплазміна (180мг) відділяють центрифугуванням (3тис.об./хв - 1год), розчиняють у фізіологічному розчині і стерилізують. Розчин церулоплазміна заморожують на протязі 18 годин до -40°C і завантажують у сублімаційну камеру, температура якої -30°C і атмосферний тиск 2,3 ´ 10-1мм рт.ст. В цих умовах препарат витримують 4 години і відповідно графіка (фіг.2) температуру поступово підіймають до 38°C. Процес висушування займає біля 48 годин. Кінцевий вихід препарату в даному прикладі дорівнює 0,53мг на 1г вихідної сировини, оптичний коефіцієнт (E610/E280) дорівнював 0,039. Біологічна активність - 18ум.од. Препарат апірогенний. Приклад 3. 1кг осаду 3 - 4 фракції по Кону суміші плацентарної та донорської сироватки гомогенізують в 3л 0,1М розчину NaCl при pH 6,7 і температурі 11°C. До гомогенату додають 66г ДЕАЕ-целюлози і перемішують на протязі 18 годин. Далі сорбент відмивають від залишків гомогенату 0,1М розчином NaCl і елюїрують з нього церулоплазмін. Одержують 200мл елюату, до якого при pH 5,2 добавляють етиловий спирт і хлороформ до кінцевої концентрації відповідно 24 і 4об.%. Суміш на протязі 30хв. перемішують при 25°C і центрифугують 1год. при 3тис. об./хв. Осад відкидають, а до центрифугату добавляють етиловий спирт до кінцевої концентрації 55об.% і ставлять на холоді (-10°C) на 18 годин. Сформований осад церулоплазміну віддаляють центрифугуванням (1год. 3тис.об./хв) і розчинюють у фізіологічному розчині, який стерилізують. Для ліофілізації препарату розчин церулоплазміна заморожують на протязі 16 годин до -39°C і завантажують у сублімаційну камеру при температурі -30°C і атмосферному тиску 2,3 ´ 101 мм рт.ст. В цих умовах препарат витримують на протязі 4 годин і відповідно динаміки графіка (фіг.2) температуру у камері поступово підіймають до 30°C. Процес висушування займає біля 48год. Кінцевий вихід препарату в даному прикладі дорівнює 0,62мг/г вихідної сировини, оптичний коефіцієнт - 0,04, біологічна активність - 17ум.од., препарат апірогениий.