Спосіб визначення імунокомпетентних клітин

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано при оценке иммунного статуса человека. Известен традиционный способ определения иммунокомпетентных клеток, включающий забор крови, выделение лейкоцитарной взвеси, инкубацию лейкоцитов в присутствии индикаторных частиц, подсчет розеткообразующих клеток [I]. Для этого забор крови осуществляют из локтевой вены в пробирку с раствором гепарина, отделяют плазму от клеток крови центрифугированием в течение 40 мин, а затем отделяют лейкоцитарную взвесь от эритро-цитарной массы и отмывают ее (лейкоцитарную взвесь) буферным раствором. Для сохранения функциональной способности лейкоцитарных клеток в лейкоцитарную взвесь добавляют питательную среду 199 и для устранения шока клетки инкубируют в течение 60 мин при 37°С. Осуществляют инкубацию лейкоцитов в присутствии индикаторных частиц, для чего при определении Т-лимфоцитов к лейкоцитарной взвеси добавляют 0,5%-ную суспензию эритроцитов барана и инкубируют в течение 10 мин при 37°С, а затем пробу центрифугируют 5 мин и инкубируют в течение 12 часов гфи 4°С. Для фиксации образовавшихся розеток добавляют 1,5%-ный водный раствор глюта-рового альдегида, выдерживают 5 мин и из полученной взвеси готовят препарат, высушивают его на воздухе с последующей фиксацией этого препарата в абсолютном этиловом спирте и окрашивают Азур-Эозином по Романовскому, промывают, высушивают и микроскопируюг с иммерсионной системой. Параллельно дпя определения В-лимфоцитов к оставшейся части лейкоцитарной взвеси добавляют сенсибилизированные эритроциты барана, смешанные с комплементом, смесь инкубируют в течение 45 мин при 37°С, образовавшиеся розетки фиксируют глютаровым альдегидом, из полученной взвеси аналогично готовят препарат, микро-скопируют. Определяют Т-лимфоциты по количеству эритроцитарных клеток барана, образующих Т-розетку с лимфоцигарной клеткой и В-лимфоциты по количеству сенсибилизированных лейкоцитарных клеток барана, смешанных с комплементом, образующих В-розетку с лимфоцитарной клеткой. В обоих случаях за розетку принят лимфоцит, который присоединил 3 и более эритроцитарных клеток барана. Существенным недостатком способа является его многозтапность, что усложняет и увеличивает длительность определения. Способ не нашел широкого применения в медицинской практике из-за невозможности длительного хранения эритроцитов барана, трудоемкости отбора пробы крови у животных и высокой стоимости реактивов. Эффективность способа снижается также из-за необходимости определения Ти В-лимфоцитов с использованием разных препаратов, что не позволяет учесть содержание О-лимфоцитов, а следовательно, снижает его информативность. Наиболее близким техническим решением к изобретению по технической сущности является способ определения иммунокомпетентных клеток путем забора крови, выделения лейкоцитарной взвеси с последующей обработкой ее маркером [2]. Согласно известному способу забор крови осуществляют из концевой фаланги пальца, а затем путем гемолиза эритроцитов с последующим центрифугированием выделяют лейкоцитарную взвесь, в которую вносят питательную среду 199. и для устранения шока клетки, инкубируют в течение 10 мин при 37°С. Затем лейкоцитарную взвесь обрабатывают маркером, для чего в нее вносят по 0,1 мл 0,3%-ной суспензии эритроцитов барана и 0,1 %-ную суспензию комплекса зи-мозан-комплемент, после чего проводят мягкое осаждение лейкоцитарных клеток центрифугированием в течение 1 минуты и инкубируют в течение 30 мин при 4°С. Для фиксации образовавшихся розеток добавляют 0,1 мл 1,5%-ного водного раствора глю-тарового альдегида, выдерживают 5 мин, сливают надосадочную жидкость и добавляют 0,1 мл физиологического раствора. Из полученной смеси готовят мазок, который высушивают и фиксируют в абсолютном этиловом спирте. Для микроскопирования с целью определения содержания иммуно-цомпетентных клеток, мазок окрашивают по Романовскому. Содержание Т-лимфоцитов определяют по количеству эритроцитарных клеток барана, образующих Трозетку с лимфоцитарной клеткой, а содержание В-лимфоцитов - по количеству индикаторных частиц комплекса зимозанкомплемент, образующих В-розетку с лимфоцитарной клеткой. При этом за 0-лимфоциты принимают лимфоцитарные клетки, которые не присоединили индикаторные частицы. По сравнению с ранее описанным данный способ, хотя и незначительно, но сокращает длительность определения, так как определение иммунокомпетентных клеток проводится в одном~мазке. Однако, как и в традиционном способе, многоэтапиость проведения определений, их сложность и трудоемкость не исключаются. Кроме этого, информативность известного способа недостаточно высокая. Это обусловлено тем, что выбранный параметр информативности -способность клеток к розеткообразованию -подвержен влиянию как экзогенных условий, так и условий проведения исследований in vitro, что может привести к ошибке дифференциации и определения содержания групп иммунокомпетентных клеток. Недостатком способа является также и то, что он требует для своего осуществления дефицитных и дорогостоящих реактивов. В основу изобретения поставлена задача создать такой способ определения имму-нокомпетентных клеток, в котором параметр их дифференциации не зависел бы от условий проведения исследований и исключал бы влияния на них экзогенных и эндогенных факторов, позволил бы обеспечить возможность определения содержания Т-, В- и 0- лимфоцитов в лейкоцитарной взвеси без ее предварительной подготовки и за счет этого повысить информативность способа, упростить и сократить его длительность, снизить трудоемкость. Решение задачи достигается тем, что в способе определения иммунокомпетентных клеток, включающем забор крови, выделение лейкоцитарной взвеси, обработку ее маркером, согласно изобретению лейкоцитарную взвесь обрабатывают фуксин-сернистой кислотой (реактив Шиффа), определяют содержание ДНК в лимфоцитах и по содержанию гранул ДНК в протоплазме лимфоцитов дифференцируют иммунокомпетентные клетки на Т-, В-, О-лимфоциты. Предложенный параметр дифференциации иммунокомпетентных клеток по уровню ДНК в лимфоцитах является стабильным, так как ДНК является функциональной единицей лимфоцитарной клетки и ее содержание в протоплазме не изменяется в процессе жизнедеятельности клетки, а уровень ДНК определяет, как известно, специфику иммунокомпетентной клетки, и поэтому исключается возможность влияния на уровень ДНК изменения условий проведения исследований, что обеспечивает повышение информативности способа. Использование в качестве маркера лейкоцитарной взвеси фуксин-сернистой кислоты позволяет выявить и учесть наличие ДНК в лимфоцитах без предварительной обработки лейкоцитарной взвеси (питательной средой 199, суспензией эритроцитов барана, комплексом зимозан-комплемент, глютаровым альдегидом), что значительно упрощает и удешевляет способ, сокращает его длительность и делает более доступным к практическому применению. Способ осуществляют следующим образом. У обследуемого проводят забор крови, которую затем центрифугируют для отделения лейкоцитарной взвеси. Из выделенной лейкоцитарной взвеси получают мазок, который фиксируют смесью абсолютного спирта, хлороформа и ледяной уксусной кислоты, а затем термостатирую.т, после чего обрабатывают маркером, в качестве которого используют фуксин-сернистую кислоту. В препаратах микроскопически определяют содержание ДНК и по количеству гранул ДНК в протоплазме лимфоцитов дифференцируют иммунокомпетентные клетки на Т-, В- и О-лимфоциты. При этом при микроско-пировании подсчитывают 100 лимфоцитов, из которых определяют процентное содержание каждого вида иммунокомпетентных клеток. За Т-лимфоциты принимают клетку, в протоплазме которой содержится от 1 до 6 гранул ДНК, за Влимфоцит принимают клетку, в протоплазме которой содержится от 6 до 10 гранул ДНК и за 0-лимфоцит принимают клетку, в протоплазме которой содержится от 10 и более гранул ДНК. Реализация способа подтверждена следующим конкретным примером. Из концевой фаланги пальца проводят забор крови в количестве 0,05 мл, в пробирку, содержащую 0,01 мл 10%-ного водного раствора гепарина и центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а из лейкоцитарной взвеси готовят мазок, высушивают на воздухе и фиксируют 10 мин смесью абсолютного спирта, хлороформа и ледяной уксусной кислоты взятых в соотношении 1:0.5:0,2 соответственно. Препарат термостатируют при температуре 37°С в течение 1 часа, после чего его обрабатывают красителем маркером фуксин-сернистой кислотой в течение 1 часа, промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой. При этом в каждой клетке 100 лимфоцитов определяют количественное содержание ДНК гранул и по их количеству дифференцируют иммунокомпетентные клетки на Т-, В- и 0-лимфоциты. Высокая информативность способа по изрбретению подтверждена исследованиями, проведенными в условиях Облклинбольницы и клиники, НИИ гигиены труда и профзаболеваний при обследовании контингента лиц с различными заболеваниями организма, в том числе и у женщин-работниц гальванических цехов в период климактерия. Для сравнительной оценки параллельно проводились обследования этих же лиц способом по прототипу. Данные приведены в таблице (табл. 1). Как видно из данных таблицы, исследование по предлагаемому способу позволило установить более высокую информативность его и сократило время проведения исследования в два раза.