Спосіб визначення ступеня деструкції клітин

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ДЕСТРУКЦИИ КЛЕТОК, включающий получение исследуемого материала и в о з действие на клеточные суспензии э к с тремального фактора с последующей регистрацией физико-химических иёме- , нений в реакционной смеси, о т л и ч а ю щ и й с я тем, ч т о , с целью повышения точности и ускорения спо~ с о б а , к клеточным суспензиям добавляют Ю"2"-^' 10~2 М раствор 2 , 2 , 6 , б-тетрамєтил-4-оксопипєридин-і-оксила и 0 , 5 - 2 , 0 М раствор хлористого никеля и по величине сигнала электропарамагнитного резонанса определяют степень деструкции клеток. 1049808 Изобретение относится к криобиологии, в частности к способам определения степени деструкции клеток ткани. Известен способ определения д е струкции клеток злокачественных опу~ . холей в организме человека, который состоит в qпpeдeлeнии количества клеток в МОЧЙ человека, разрушенных этерификацией высшими жирными кислотами при рН 4,2 - 5,8 и 80 - 85°С [1]. 10 Однако способ применим только к злокачественным клеткам и не позволяет непосредственно наблюдать псвреждения клеток в процессе экстремальных воздействий. Известен также способ определения 15 степени деструкции клеток ткани и клеточных суспензий, включающий получение исследуемого материала и в о з действие на клеточные суспензии экстремального фактора с последующей 20 регистрацией физико-химических изменений в реакционной смеси [2] . Однако способ применим только для эритроцитов, исключает возможность непосредственного наблюдения повреж- 25 дения , а также определяет только грубые нарушения мембраны клеток (диаметр молекулы гемоглобина больше 80 А), является длительным {40 60 мин), Целью изобретения является повыше- 30 ние точности и ускорения способа. Поставленная цель достигается тем, что согласие способу определения с т е пени деструкции клеток, включающему 35 получение исследуемого материала и (Воздействие на клеточные суспензии экстремального фактора, к клеточным суспензиям добавляют 10 - 2-10"гМ раствора 2,2,6,6-тетраметил-4~оксо~ пиперидин-1-оксила и 0,5 - 2,0 М раствор хлористого никеля и по в е л и чине сигнала электропарамагнитного резонанса определяют степень д е с т р у к ции клеток. 45 Способ осуществляют следующим о б разом. В исследуемую в з в е с ь клеток в в о дят водный р а с т в о р , который содержит стабильный иминоксильный радикал с концентрацией 1 0 - 2 • Ю М , проникаю- 50 щий в цктоэоль клеток и дающий с и г нал электропарамагнитного резонанса (ЭПР), регистрируемый на радиоспектрометре. Затем добавляют парамагнит55 ную соль концентрации 0,5 - 2 М (в норме не проникающую через мембрану) , что приводит вследствие обменных взаимодействий к уширению (исчезновению) сигнала ЭПР от радикала', находящегося во внеклеточной жидкос- 60 ти, в результате чего наблюдается сигнал исключительно от радикалов в цитозола, нарушение целостности мембраны клеток "приводит к проникновению парамагнитных ионов в цитозоль и к 65 полному или частичному исчезновению сигнала ЭПР. При-этом уменьшение сигнала ЭПР пропорционально количеству разрушенных клеток ткани или клеточной суспензии. В стеклянную ампулу вводят 0,1 1,0 мл водного раствора иминоксильного радикала концентрации 10*'- 2* «10 М, 0,1 - 1,0 мл парамагнитной с о - • ли концентрацией 0,5 - 2,0 М и 0 , 8 8,0 мл в з в е с и клеток, в р е з у л ь т а т е чего наблюдают сигнал ЭПР от радикалов, проникших в нитоэоль 'клеток. Затем исследуемую в з в е с ь подвергают температурному, химическому, радиоактивному или другим воздействиям. Если в р е з у л ь т а т е происходит повреждение мембраны клеток, регистрируе™ мый спектр имеет меньшую или нулевую интенсивность, в зависимости от числа поврежденных клеток * Отношение Ь о г к п а д а е т процент неповрежденных клеток. • П р и м е р і . В стеклянную ампулу вводят 0,1 мл водного р а с т в о р а иминоксильного радикала 2 , 2 , 6 , 6 - т е т раметил-4-оксопипєридин-і-оксил с концентрацией 10~*М; 0,1 мл водного раствора парамагнитной соли NiClg и 0,8 мл взвеси эритроцитов. Охлаждение в з в е с и клеток до температуры 3°С с кристаллизацией суспензии и последующий отогрев ее ^приводит к уменьшению исходного сигнала ЭПР за счет разрушения части к л е т о к . Отно~ сительная величина неповрежденных э р е з у л ь т а т е кристаллизации и отогрева клеток составляет 56%. П р и м е р 2. В стеклянную ампулу вводят _0,1 мл водного раствора_ 1 радикала 2,2,6,&-тетраметил~4-оксопипєридин-1-оксил с концентрацией 1 ІСГ^М и кусочек ткани кожи человека весом 100 мг. Затем осуществляют инкубацию при комнатной температуре в .течение 30 мин. После э т о г о добавлЯ- 1 ют 0,1 мл раствора соли N1СLgконцентрацией 0,05 М и наблюдают сигнал от радикала в цитозоле клеток т к а ни кожи. Медленное замораживание образца со скоростью 3 град/мин-- до 196°С и медленное оттаивание до комнатной температуры приаодит к падению интенсивности исходного сигнала, на 15%, что свидетельствует о разрушении 15% клеток. П р и м е р з . В стеклянную ам« пулу вводят 0,1 мл водного раствора -иминоксильного радикала с концентрацией 10*М; 0,1 мл водного раствора с парамагнитной соли NiC±2 концентрацией 0,5 М и 0,8 мл в з в е с и эритроцитов. Наблюдают спектр ЭПР от радикалов в цитозоле эритроцитов. Далее медленно нагревают в з в е с ь со скоростью 2 - 3 град/мин. Выше температуры _+56°С ^происходит резкое исчезновение 1045808 П р и м е р 5, 3 стеклянную ампусигнала ЭПР вследствие разрушения клеток эритроцитов. лу вводят 0,1 мл растйора__цминоксйльП р и м е р 4 . В стеклянную ампуного радикала концентрацией lO-Mf лу вводят 0,1 мл водного раствора 0,1 мл раствора соли ги.С1з(0,5 м) 'иминоксильного радикала с концентран 0,8 мл в з в е с и эритроцитов. Наблюг цией 1СГ М; 0,1 мл раствора соли NiCl, 5 дают спектр ЭПР от зондов в цитолпаз(0,5 М) и 0,8 мл взвеси эритроцитов." ме. Затем добавляют раствор химичесНаблкщают спектр ЭПР от радикалов в кого д е т е р г е н т а тритона Х-І00 а гонцитоплазме эритроцитов. Затем д о б а в центрации 0,1%. Время инкубации при ляют 0,1 мл раствора прижина т а к , комнаткой температуре 5 мин = Регистчто конечная концентрация е г о о к о 10 рация спектров после этого показывало 3%, Взвесь ичкубируют при 38° С ет полное исчезновение сигнала в течение 40 мин. Берут пробы через +2, вследствие проникновения ионов каждые 10 мин. Сигнал ЭПР с теченив клетки и з - з а раэрушечия клеток. ем времени постепенно падает и через 40 мин его интенсивность с о с т а в л я е т Таким образом, предлагаемый спо40% от исходной, т . е . о с т а е т с я 40% соб по сравнению с известным позволяцелых клеток. Таким образом, наблюет добиться высокой точности опредедают кинетику разрушения эритроциления за счет оценки количества нетов с помощью протєолитнческого ферповрежденных клеток во время воздеймента прижинаF который расщепляет ствия экстремального фактора, а такгшнтидные связи поверхностных мемб- 20 же сократить время определения до ] ранных белков эритроцитов. 3 - 5 мин. Редактор Н.Бобкова Составитель Е.Житникова Техред А,Бабинец Корректор А.Зимокосов Заказ 8407/41 Тираж 8 73 Подписное t ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5 1 Филиал ППП ''Патент ' f г.Ужгород, ул-Проектная, 4