Спосіб видобування нативної та денатурованої дезоксирибонуклеїнової кислоти з біологічних розчинів

Винахід належить до медицини, тобто до сорбційної терапії, зокрема, до способів вилучення нуклеїнових кислот та токсичних продуктів їх розпаду з крові та Інших рідин. Використання способу засновано на тому, що в крові хворих на пухлинні захворювання, а також при радіаційних впливах, навіть у малих дозах, підвищується концентрація генотоксичних продуктів розпаду та радіолізу дезоксирибонуклеїнової (ДНК)та рибонуклеїнової (РНК) кислот. В клінічній практиці відомі способи детоксикації організму із застосуванням адсорбентів, які активно сорбують низькомолекулярні речовини з біологічних рідин [Лолухін Ю.М. "Гемосорбція", М„.1985.С.10-11]. Як правило, відомі адсорбенти, такі як целюлоза, сефадекси, агарози, сілікагелі, окис алюмінію сорбуют з біологічних рідин організму (крові, лімфи), не тільки токсини, але й формульні елементи крові, порушуючи тим її склад, що в свою чергу призводить до порушення гомостазиса. Класичний спосіб вилучення ДНК з біологічних рідин - застосування як адсорбента оксиапатита [Остерман A.A. Хроматографія білків та нуклеїнових кислот. М., Наука, 1985, с. 48-64]. Оксиапатит (торгівельна марка "Віо-Рао") - адсорбує кислі та лугові білки, нативну та денатуровану ДНК та РНК. Недоліком адсорбента "ВіоРао" є низька його селективність. Крім того, "Віо-Рао" майже не сорбує короткі пептиди та нуклеотиди, а також продукти розпаду ДНК та РНК, тому його застосування для детоксикації організму малоефективно. Оксиапатит по цій причині вживається, в основному, для дослідницьких цілей. Найбільш близьким до заявляємого по технічній суті та вибрання як прототип є спосіб вилучення ДНК з біологічних рідин із застосуванням як адсорбенту активованих вуглів, активованих вуглеродних волокон АУВМ, які сорбують 5-16 кг/г носія нативної ДНК [Снежкова Е.А., Никитин A.A. Некоторые характеристики ДНКсодержащих сорбентов на основе активированных углей. Тезисы докладов VIII Международного симпозиума по гемосорбции. Киев, Наукова думка, 1986, с. 29]. До недоліків описаного вище способу спід віднести низьку ємність та визначену неспецифічну адсорбцію глобулінів та фібріногена плазми крові. В основу винаходу поставлена задача створення способу вилучення нативної та денатурованої дезоксирибонуклеїнової кислоти з біологічних розчинів, в якому шляхом заміни адсорбента створюється можливість підвищення ефективності вилучення з біологічних рідин організму ДНК та зменшення неспецифічної сорбції глобулінів. Поставлена задача досягається тим, що в способі вилучення нативної та денатурованої дезоксирибонуклеїнової кислоти з біологічних розчинів шляхом їх фільтрації через адсорбент, згідно способу, як адсорбент використовується дисперсний хімічно модифікований графіт. При цьому дисперсний графіт може використовуватись окисленим і мати на поверхні групи - HSO3 або групи С-Вr. Визначеними особливостями хімічно-модифікованого дисперсного графіту є висока адсорбційна ємність по відношенню до молекул нативної та денатурованої ДНК, продуктам розладу та радіолізу ДНК та РНК, Дана властивість адсорбента забезпечується його структурно-хімічними параметрами: - в шаровій структурі графіту міжплощинні відстані близькі до стекінгових між основами нуклеїнових кислот, що при адсорбції розплетених фрагментів ДНК та РНК, а також нуклеозидів призводить до енергетичної вигідності конформацій молекул адсорбату, в котрій на краєвих дефектах решітки графіту локалізуються молекулярні групіровки сахарофосфатного остова. При цьому Інформаційні одиниці-основи нуклеїнових кислот, які забезпечують селективність нуклеїнових впізнаваній та білково-нуклеїнових взаємодій, орієнтовані нормально по відношенню до поверхні часток хімічно-модифікованого адсорбенту, що й забезпечує високу ефективність процесу сорбції нуклеїнових кислот та низькомолекулярних продуктів їх розпаду. Відомо, що раніше графіти з хімічно-модифікованою поверхнею не застосовувались, що для заявляємого способу відповідає критерію "новізна". Далі сутність винаходу пояснюється прикладами його застосування, а також таблицями, в яких подаються дані про кількість сорбуємої нативної ДНК (мГ/г сорбенту) та продуктів її денатурації по заявляємому способу та по способу-прототипу. Приклад 1. Адсорбент - дисперсний графіт марки С-ОО Завальєвського родовища і питомою поверхнею 500 м2/г, який має на поверхні групи HSO3. Перед використанням адсорбент відмивають у 0,01 М фосфатному буфері (pH 7,4), який містить 0,14 М хлористого натра та 0,015 М цитрату катра. До 10 мГ відмитого сорбенту додавали 1 мл фосфатного буферу, який містить 1 мГ міченої 3Н-тімідіном нативної ДНК Е.С І. Проби при трикратному повторенні Інкубують 2 години при 4°С з періодичним перемішуванням, центрифугують 15 хвилин при 2000 об/хвил. Осад відмивають тричі у 8 мл фосфатного буфера та визначають його радіоактивність на фільтрах в лічильнику "Intertechnique." Приклад 2. Адсорбент - дисперсний графіт марки С-OO Завальєвського родовища з питомою поверхнею 500 м2/г, який містить на поверхні групи С-Вr, обробляють так само, як у прикладі 1. Далі процес сорбції препарату ДНК проводять аналогічно прикладу 1. Приклад 3. 10 мГ адсорбенту -. графіту марки С-OO Завальєвського родовища з питомою поверхнею 500 м2/г, який містить на поверхні групи - С-В, використовують для вилучення термоденатурованої дезоксирибонуклеїнової кислоти (д - ДНК) з 1 мл фосфатного буфера, який містить 1 мкг/мл міченої 3Нтімідіном д-ДНК Е.Со і (питома активність 40750 імп/хв та 999 мкг/мл наміченої д-ДНК селезінки теля. Оброблений адсорбент змішують з 1 мл розчину фосфатного буферу, який містить ДНК. Суміш інкубують на протязі 2 годин, потім центрифугують осад, відмивають та визначають радіоактивність. Приклад 4 (негативний). Аналогічно проведена сорбція н-ДНК та д-ДНК на вуглеродистих волокнах АУВМ (по прототипу). Порівняльні результати адсорбції на графітах з модифікованою поверхнею, оксиапатиті "ВіоРао" та на активованих вугіллях представлені в табл. 1. Проведені випробування та отримані дані про кінетику (швидкість) адсорбції ДНК, по заявленому способу. Результати представлені в табл. 2. Таким чином, використання заявленого способу вилучення ДНК з розчинів та біологічних рідин в порівнянні з відомим, базовим об'єктом-прототипом (див. роботу Е.А. Снєжкової та Інших) - активованими вуглеродними волокнами АУВМ, показала, що цей спосіб забезпечує більш ефективну (майже в 100 разів) адсорбцію нативної та денатурованої дезоксирибонуклеїнової кислоти та продуктів її розпаду, Вказані якості дозволяють використовувати дисперсні хімічні модифіковані графіти при селективному вилученні ДНК та пошкодженого матеріалу клітин. Розроблені сорбенти можуть бути використані для вилучення з організму шляхом ентеросорбції та гемосорбції усіляких генотоксичних та ембріотоксичних продуктів розпаду нуклеїнових кислот (д-ДНК), концентрація яких у крові онкологічних хворих значно перевищує норму при патологічному стані організму, при токсикозах, які супроводжуються значним розпадом тканин, при численних травмах.