Спосіб кількісного визначення адаптогенів

Корисна модель відноситься до медицини, а саме до проблеми використання адаптогенів з метою профілактики захворювань. Як відомо, адаптогени - це речовини, які підвищують резистентність організму і цим самим запобігають захворюванням [Меерсон Ф.З. Адаптогенная медицина: механизм и защитные эффекты адаптации - М. -1993]. Для визначення адаптогенів існують різноманітні способи: біологічні, цитологічні, мікробіологічні, хроматографічні. Біологічні методи [Макаров В.Г. и др. Экспериментально-клиническое изучение гастропротекторного и холеретических эффектов фитопрепарата «Эликсир Демидовский» // Впросы биол. мед. и фармацевт, химии.- 1998. - № 2. - С. 38 - 41; Потапович А.И., Костюк В.А. Сравнительное исследование антиоксидантных свойств и цито-протекторной активности флавоноидов // Биохимия. - 2003. - Т.68, вып. 5. -С. 632 - 638; Горовая А.И., Климкина И.И. использование цитологического тестирования для оценки экологической ситуации и эффективности оздоровления детей и взрослых природными адаптогенами // Довкілля та здоров'я. 2005. - № 4. - С. 28 - 31] полягають в тому, що визначення адаптогенів здійснюється в експериментах на тваринах, у яких відтворюють ту чи іншу патологію. В цьому разі результат біологічної дії адаптогену визначають за змінами в показниках стану здоров'я (нездоров'я). Недоліки цих методів полягають в тому, що дослідження вимагає досить тривалого часу, воно напівкількісне і треба використовувати велику кількість препарату. В цитологічних методах [Потапович А.И., Костюк В.А. Сравнительное исследование антиоксидантных свойств и цитопротекторной активности флавоноидов // Биохимия. - 2003. - Т.68, вып. 5. - С. 632 - 638] використовують культури клітин і тканини, що потребує спеціального обладнання і підготовлених кадрів. Мікробіологічні методи [Бочарова О.А. и др. Способ биологического контроля комплексного фитоадаптогена // БЭБИМ - 2003. - т. 136. №12 - С. 694 - 696] вимагають спеціально обладнаних приміщень, підготовлених кадрів і також дають напівкількісне визначення. Існує велика кількість хроматографічних методів з використанням тонкого шару сорбентів, іонообмінної хроматографії, ВЕРХ, HPLC та інші [Лобанова А.А. и др. Исследование биологически-активных флавоноидов в экстрактах из растительного сырья // Химия раст. сырья. - 2004. - № 1. - С. 47 - 52]. Як правило, ці методи мають наступні недоліки: вони специфічні по відношенню до хімічної будови адаптогену і тому для різних адаптогенів треба підбирати спеціальні умови і методи. Окрім того, хроматографічні методи вимагають багатовартісного обладнання і високої кваліфікації лаборантів. Найближчим аналогом запропонованого методу є визначення адаптогенів за їх здатністю пригнічувати вільне радикальне окиснення ліпідів мікросомальними ферментами [Потапович А.И., Костюк В.А. Сравнительное исследование антиоксидантных свойств и цитопротекторной активности флавоноидов // Биохимия. - 2003. - Т.68, вып. 5. - С. 632 - 638]. В цьому методі попередньо виділяли за допомогою ультрацентрифугування мікросомальну фракцію з печінки щурів. Наступна інкубація мікросом з НАДФН+ або з CCl4 викликала утворення МДА, який визначали за допомогою тіобарбітурової кислоти. Недоліки найближчого аналога полягають в тому, що необхідно мати можливість отримувати мікросоми (наявність щурів, ультраценгрифуги). Окрім того, між показниками антиоксидантної активності і адаптогенною (цитопротекторною) властивістю препаратів відсутня лінійна залежність, що значно ускладнює розрахунки. Важливо також підкреслити, що механізм біологічної дії адаптогенів не обмежується їх антиоксидантними властивостями [Harvard Health Lett. - 2002. - v. 27, № 4. - p. 1 - 3]. Задачею даної корисної моделі було створення такого методу визначення адаптогенів, який би враховував їх функціональну активність, а не особливості хімічної будови молекул різних адаптогенів, щоб не вимагав складного обладнання і великої кількості препарату адаптогену для його визначення і був кількісним. Для вирішення даної задачі було запропоновано використовувати здатність адаптогенів пригнічувати активність ключового ферменту розвитку патологічних процесів в організмі фосфоліпази А 2 (ФЛА2), яка розщеплює молекулу фосфоліпідів (лецитину) з утворенням лізофосфоліпідів і арахідонової кислоти, яка під дією циклооксігенази і ліпоксігенази перетворюється в дуже реактивні сполуки ейкозаноїди (простагландини, лейкотрієни, тромбоксани). Завдяки ФЛА2 відбувається руйнування біомембран, розпочинається запалення та інші патологічні процеси. Практично кожний адаптоген пригнічує ФЛА2, причому ступень пригнічення активності ФЛА2 в більшій мірі залежить від кількості адаптогену, ніж від його хімічної будови. Суть запропонованого методу визначення адаптогенів полягає в тому, що до розчину ФЛА2 в визначених умовах додають розчин адаптогену і після певного часу предінкубації визначають залишкову активність ФЛА2 за допомогою гідролізу фосфоліпідного субстрату (наприклад фосфоліпідів яєчного жовтка). Оцінюють активність за кількістю вільної жирної кислоти (титруванням або колориметричними методами). За різницею між активністю ФЛА2 в контролі та активністю ФЛА 2 в досліді (тобто, в присутності адаптогену) розраховують гальмівну активність препарату адаптогену. Для визначення кількості адаптогену показник гальмівної активності препарату поділяють на питому гальмівну активність чистої субстанції адаптогену. Конкретний приклад. Визначали вміст адаптогенів в препараті поліфенолів винограду “Еноант". Використовували розведення 1:5, 1:10 и 1:20 препарату. Активність ФЛА2 з підшлункової залози визначали за методом [Литвинко Н.М., Кучуро С.В. Определение действия химических соединений на активность фосфолипазы А 2 // Приклад, биохимия и микробиология. - 1999. - т.35. № 4. - С. 388 - 396]. В якості чистої субстанції адаптогену використовували хімічно чистий препарат кверцетину. Результати наведено в таблиці. Таблиця Визначення вмісту адаптогенів в препараті “Еноант" № 1 2 3 4 5 Адаптоген + ФЛА2 Без адаптогену Еноант (1:5) Еноант (1:10) Еноант (1:20) Кверцетин Концентрація адаптогену, мг/мл 0 3,2 1,6 0,8 1,0 Гальмівна активність, од/мл 0 12,2 5,4 3,0 3,6од/мг Визначений вміст адаптогену, мг/мл 3,39 1,50 0,83 1,0 Як видно з цих даних, вміст адаптогенів, визначений запропонованим методом, практично співпадає з фактичною концентрацією поліфенолів.