Штам культивованих клітин макротомії барвлячої arnebia ( maсrotomia) euchroma (royle) pauls продуцент шиконіну

Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використаний у медичній, харчовій, парфюмерній та текстильній промисловості. Шиконін і його похідні є природними червоними пігментами нафтохіноїдної природи. Шиконін відомий з давніх часів як барвник, а також як медпрепарат. Він має протизапальну, ранозагоюючу, антибактеріальну, детоксикаційну і протипухлинну дію. Сировиною для отримання шиконіну є деякі рослини з родини Бурачникових. Альтернативним джерелом отримання шиконіну є культивовані клітини цих рослин. Боітехнологія отримання шиконіну з культивованих клітин горобинника лікарського впроваджена у промислове виробництво в Японії в 1984 р. [1]. Відомий штам АЕ-1 (МЕ-75) суспензійної культури клітин макротомії барвлячої, що є продуцентом шиконіну (прототип). Штам походить від клітинної лінії "75" культури клітин макротомії барвлячої (Arnebia (Macrotomia) euchroma (Royle) Pauls), яка була отримана в 1987 p. в HBO "ВІЛР" (Москва, РФ) Г2]. Штам вирощується одностадійним способом з використанням, одного й того ж живильного середовища (середовище НВП "ВІЛР" без кінетину) на протязі всього ростового циклу, який триває 14 днів. За вказаних умов штам АЕ-1 накопичує до 150 мг шиконіну на 1 л живильного середовища [3], що є недостатнім рівнем продуктивності. Завданням винаходу є підвищення продуктивності культивованих клітин макротомії барвлячої по накопиченню шиконіну. Завдання вирішується створенням нового штаму культивованих клітин макротомії. Штам Макротомія АЕ-2 походить від клітинної лінії "80" зазначеної вище культури клітин макротомії барвлячої [2]. Штам отримано шляхом клонування дрібних клітинних агрегатів лінії "80" та тривалої селекції у вигляді постійного відбору субкультур за найбільшою" інтенсивністю забарвлення та періодичного відбору фракції дрібних забарвлених клітинних агрегатів. Вирощування штаму проводиться одностадійним способом в середовищі НВП "ВІЛР". Штам Макротомія АЕ-2 зберігається в колекції клітинних культур Інституту молекулярної біології і генетики НАН України під номером 7. Штам характеризується такими ознаками. Морфологічні та цитологічі ознаки. Біомаса культивованих клітин штаму Макротомія АЕ-2 складається з окремих щільних клітинних агрегатів від сіро- І рожевого до темно-бордового кольору. Максимальний розмір клітинних агрегатів досягає 0,5 см в діаметрі. Більші клітинні агрегати є скупченням дрібних. Ріст культури в окремих випадках супроводжується '. спонтанним коренеутворенням. Ростуча к ультура має фруктовий запах (полунично-малиновий). Культуру складають округлі, подовжені, а також неправильної форми клітини. Останні спостерігаються переважно серед клітин малого розміру. Розміри клітин - від 11,7 до 187,5 мкм, середній розмір - біля 60 мкм. Ядра клітин по формі округлі. Розміри ядер - від 0,57 до 32,0 мкм, середній розмір - біля 18 мкм. Фізіологічні ознаки. Приріст біомаси штаму на 14 день росту складає 9-13 г, в окремих випадках до 15 г сухої маси на 1 л живильного середовища. Ростовий індекс - 3-4. На протязі пасажу (тривалість посажу - 14 днів) спостерігається один підйом мітотичної активності клітин на 3-5 день росту із значенням мітотичного індексу 1,5-2,5%. Каріологічні ознаки. Культура є міксоплоїдною клітинною популяцією. Межі варіювання мітотично активних клітин за числом хромосом - від 16 до 160. Більш як 90% клітин мають від 20 до 48 хромосом. Модальний клас складають клітини, що мають 24 хромосоми (25-30% від загального числа метафаз). Частота анафаз з абераціями хромосом та порушеннями мітотичного апарату - біля 36%. Біохімічні та фітохімічні ознаки. Нафтохіноїдні пігменти накопичуються в біомасі культивованих клітин, а також в живильному середовищі в розчиненому та кристалічному вигляді. В живильне середовище переходить до 30% пігментів. Сумарний вміст нафто хінонів становить 150-350 мг на 1 л живильного середовища. Висушена при 55-60°С біомаса містить 50-70% від того вмісту нафто хінонів, який визначається в свіжій культурі (біомасі І середовищі). Крім нафтохінонів в культурі накопичуються жовті пігменти бензохіноїдної природи. Винахід Ілюстр ується такими прикладами. Приклад 1.В конічні колби Ерленмайєра місткістю 250-3Ö0 мл розливають по 50 мл живильного середовища (середовище НВП "ВІЛР"), склад якого наводиться нижче. Посуд з середовищем стерилізують гарячою парою при 115-120°С протягом 15 хв. Маса інокуляту для засівання становить 2-3 г (розрахунок по сухій біомасі) на 1 л середовища. Культур у вирощують протягом 14 днів. Умови вирощування: температура 23-24°С, вологість повітря - 70-80%, відсутність освітлення, постійне перемішування на качалці при 80 об/хв. На 14 добу біомасу разом із середовищем аналізують спектрофотометричним або фото-колориметричним способом на загальний вміст нафтохінонів. Результати, наведені в таблиці, свідчать про те. що штам Макротомія АЕ-2 культивованих клітин мікротомі і перевищує відомий штам АЕ-1 по накопиченню шиконіну в 1,5-2,0 рази при майже однаковому накопиченні біомаси При цьому Інтенсивність накопичення біомаси штаму Макротомія АЕ-2 вища, бо дозволяє використовува ти в 1,5-2,0 рази меншу посівну доз у клітин - 2-3 г/л (розрахунок по сухій біомасі), ніж для штаму АЕ-1 - 4 г/л [3].