Спосіб отримання біопрепарату

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к способу получения биопрепарата для культивирования растений. Неблагоприятная экологическая обстановка, содержащая в мире, способствует поиску новых экологически чистых и дешевых биотехнологий, в частности, разработке способов получения новых дешевых и удобных в применении биопрепаратов для культивирования растений как альтернативы химическим средствам. Известны способы получения биопрепаратов, в которых микроорганизм (действующее начало, ДН) иммобилизуется на носителе, в качестве которого может служить торф [Авт. св. СССР N51490887], сапропель [Авт. св. СССР № 1314661], синтетический [Авт. ев СССР № 865158] или природный полимер [JP № 1030585; з. UA № 3814]. Для изготовления биопрепаратов на твердом носителе используется неэкологический энергоемкий способ стерилизации облучения носителя - лучами. Добыча таких носителей как торф, сапропель приводит к истощению их запасов в природе и нарушению экологического равновесия в экосистемах. Использование пенопласта в качестве носителя активного начала загрязняет окружающую среду. Использование альгината натрия для микрокапсуляции микроорганизмов экономически нерационально, так как этот продукт не производится в Украине и является дорогостоящим для закупки за рубежом. Использование экзополисахарида бактерий в качестве носителя является наиболее выгодным для производства биопрепаратов, однако является энергоемким. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения биопрепарата, заключающийся в иммобилизации живых микробных клеток на экзопо-лисахариде (ЭПС). ЭПС выделяют из культуры клеток В, mucilaginosus ВКПМ-В-4901 в несколько стадий, которые включают отделение клеток методом центрифугирования, переосаждение ЭПС 3-кратным объемом этилового спирта, диализ, высушивание, выращивание микроорганизма - ДН - и иммобилизация его на ЭПС. Таким образом, способ производства биопрепарата является многостадийным энерго- и ресурсоемким. В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа получения высокоэффективного биопрепарата для растениеводства за счет его упрощения и удешевления при обеспечении активности действующего начала. Поставленная задача решается тем, что в способе получения биопрепарата, включающем культивирование микроорганизмов в стерильной питательной среде и последующее их высушивание, согласно изобретению проводят совместное культивирование,. штамма бактерий – продуцента экзополисахарида Bacfflus mucilaginosus ВКПМ-В-4901 и штамма бактерий, продуцирующи х активное начало и не являющихся его антагонистами, например, клебсиеллы, псевдо-монасы, в жидкой питательной среде, содержащей (%) сахарозу - 2,0, Na2HPO4 -0,1; MgSO4 - 0,05; стекло -0,1; мел - 0.01; FeCl3 - 1 мл 10% раствора, при t 30°С в течение 48-72 часов, при этом объемное соотношение инокулятов в среде составляет 1:1, после чего культуральную жидкость подвергают высушиванию при 35-38°С. Штамм бактерий В. mucilaginosus ВКПМ-В-4901 выделен из супесчаных почв Киевской области Украины, идентифицирован по Краткому определителю Бэрги (1988) и определителю Красильникова (1949). Штамм имеет следующие морфолого-культуральные признаки. Клетки в виде палочек с закругленными концами размером 1 -1,3 x 9-9,07 мкм, грам-вариабельные. Споры овальной формы 1-1,2 x 1,7-2,0 мкм. Расположение их в клетке - субтерминальное. Зрелые споры звездчатой формы с 6-9 гребневидными выростами. На МПБ и ΜΠΑ рост отсутствует. Колонии на картофельном агаре и среде Эшби - прозрачные, блестящие, приподнятые в центре, с ровным краем. Физиолого-биохимические свойства. Ассимилируег глюкозу, сахарозу, фр уктозу, арабинозу, галактозу, лактозу, раффинозу, сорбит маннит, целлобиозу. Не использует глицерин, этанол, бутанол. инозит, цитрат натрия, янтарную и фумаровую кислоты. Рост на углеводах и многоатомных спиртах сопровождается образованием кислот, без газообразования Молоко не коагулирует. Желатин не разжижает, индол и сероводород не образует. Гидролизует крахмал. Каталазоположителен, образует пероксидазу. В качестве источника азота использует нитраты, хуже растет на аммонийном азоте. Отмечен рост на средах без азота. Аэроб, мезофил, температурные границы роста 10-45°С. оптимум 25-30°С, диапазон рН 4,0-11,0, оптимум рН 7.0-8,0. Штамм относится к авирулентным для теплокровных организмов. Штамм синтезирует полисахарид, состоящий из углеводов (70-75%), пировиног-радной кислоты (3,3%), уроновых кислот (8%), белков (3-5%). Молекулярная масса -85 МД ЛД5о полисахарида составляет 237 мг/кг веса. Культивирование В.mucilaginosus ВКПМ-В-4901 проводят совместно с ДН до достижения концентрации клеток ДН в смешанной культуре 9-1010 кл/мл (при этом обеспечивается активность ДН) и выхода ЭПС не ниже 20 г/л. Бактерии культивируют в жидкой питательной среде А-27, содержащей (%) сахарозу - 2,0, Nа2НРО4 - 0.1; MgSO4 - 0,05; стекло - 0.1; мел - 0,01: FeCI3 - 1 мл 10% раствора. Изменение оптимальной для B.mucilaginosis питательной среды в плане увеличения содержания источника углерода (поскольку в смешанной культуре энергетические потребности возрастают) не влияло на выход клеток ДН и ЭПС (табл. 1). В качестве инокулята используют 4-х суточн ую культур у B.mucMaginosus ВКПМ-В-4901, выращенную на-плотной питательной среде А-27 (агар-агар - 20%) и смытую жидкой питательной средой. В качестве инокулята ДН используют ночную культуру бактерий, выращенную в жидкой питательной среде А-27. Доза посевного материала составляет 2 объемных процента; объемное соотношение инокулятов 1:1. Смешанную культур у инкубируют при 25-30°С в условиях аэрации в течение 48-72 часов. Зависимость концентрации клеток ДН и выхода ЭПС οι времени культивирования представлено в табл. 2. Высушивание смешанной культуры проводят при температуре 35-38°С При этом титр живых клеток Д Η в сухом препарате составляет 1011 кл/г, В.mucilaginosus - 10 кл/г. Известно, что рабочая концентрация клеток ДН в препарате должна быть не менее 10 а кл/мл. При соблюдении такой нормы сухой препарат необходимо растворять в воде в соотношении 1:1000. В готовом для употребления препарате концентрация ЭПС составляет в среднем 0,2%, которая обладает стимулиоу-ющей активностью (UA з. № 3814). Кроме того, препарат содержит клетки В. mucilaginosus (107 кл/мл), известной свойствами выделять фитогормоны и витамины, улучшать минеральное питание растений. Выводы: изобретение предельно упрощает и удешевляет известные способы производства биопрепаратов для растений; получаемый благодаря заявляемому способу препарат обогащен клетками бактерии-продуцента ЭПС, которая имеет ряд полезных для растения свойств, что повышает эффективность получаемых препаратов.