Спосіб виділення днк з лейкоцитів периферійної крові

Корисна модель відноситься до галузі медицини, зокрема - медичної генетики, а саме до молекулярної генетики, і може бути використана для виділення ДНК з лейкоцитів периферійної крові людини. Відомі способи виділення ДНК з лейкоцитів периферійної крові людини, які грунтуються на тому, що клітини крові, забрані у флакони з антикоагулянтом, руйнують лізуючим розчином, лізат позбавляють білків за допомогою протеолітичних ферментів, ДНК очищають за допомогою фенолу, фенол - хлороформу, хлороформу ізоамілового спирту і осаджують етанолом [1,2]. Основним недоліком цього способу є висока токсичність реагентів, зокрема, фенолу, хлороформу і меркаптоетанолу. Найближчим аналогом є спосіб виділення ДНК з лейкоцитів периферійної крові, який включає традиційний забір крові, руйнування клітинних оболонок лізуючим розчином, позбавлення білкової фази за допомогою протеолітичних ферментів, висолювання ДНК хлоридом натрію з наступною концентрацією абсолютним етанолом кімнатної температури [3]. Недоліком аналогу є недостатнє очищення ДНК. Задачею корисної моделі є розробка такого способу виділення ДНК, який би за допомогою нетоксичних реактивів дозволяв отримати достатню кількість чистої ДНК. Поставлена задача вирішується тим, що у способі виділення ДНК, який включає забір периферійної крові, руйнування клітинних оболонок, позбавлення від білкової фази протеолітичними ферментами, висолювання ДНК хлоридом натрію та осадження етанолом, згідно з корисною моделлю, після забору крові, клітини 2-3 рази промивають 1-кратним ретикулюючим розчином, а після лізису клітин, очистки від білків, висолювання ДНК, її осаджують холодним 96% етанолом, промивають охолодженим 70% етанолом і розчиняють у ТЕ-буферному розчині. Спосіб забезпечує отримання достатньої кількості високомолекулярної очищеної ДНК при застосуванні нетоксичних реагентів. Спосіб використовують наступним чином: забирають 3-10мл периферійної крові у пластикові флакони з ЕДТА в якості антикоагулянта, промивають клітини крові 2-3 рази 1-кратним ретикулюючим розчином (140mM NaCl, 5mМ КС1, 7mМ MgC12 x 6H2O), суміш центрифугують при 2,5тис.об/хв впродовж 10хв., перемішують осад 5-10хв із свіжоприготовленим лізуючим розчином (131mМ NH4C1, 0,9mМ NH4CO3), центрифугують та відбирають надосадову рідину (процедуру повторюють 2-а рази), а осад ресуспендують у 3-5мл STE-розчину (100mМ NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 7,4, 1mМ EDTA), додають 100-200мкл 10% розчину SDS та 30-50мкл протеїнази К (10мкл/мл), інкубують при 37°С впродовж ночі, додають 1,5мл 6М NaCl, перемішують та центрифугують 10хв. при 4000об/хв., відбирають у скляну пробірку верхню в'язку ДНК-вмісну фазу, додають для осадження ДНК 2,5 об'єми охолодженого до -20°С 96% етанолу, 2-разово промивають осад ДНК охолодженим при +10°С 70%-им етанолом, підсушують та розчиняють у 200-800мкл ТЕ-буферного розчину (10mМ Tris-HCl, pH 7.5, 1mМ EDTA). Кількісні та якісні показники отриманої ДНК оцінювали у 10 пацієнтів. Дані зведено в таблиці Таблиця Пацієнти В.М. В.Н. В.Л. В.І. Р.Л. Д.М. Д.Л. Д.Р. Г.М. Г.І. Концентрація ДНК(мкг/мл) 176* 460 344 310 360 200 400 230 334 216 Чистота ДНК 2.38** 1.78 1.85 2.06 1.89 2.0 2.0 2.30 1.92 1.81 Примітки: Для визначення кількості та чистоти ДНК проводили спектрофотометричне вимірювання оптичної щільності розчину в області довжини хвилі 260нм та 280нм. * - показники кількості ДНК в мкг/мл, вирахувані з розрахунку того, що оптична щільність D=1 при 260нм відповідає 50мкг/мл ДНК; ** - показники чистоти ДНК вирахувані співвідношенням показів спектрофотометра при оптичній щільності D, виміряній в області 260нм до величини D, отриманій в області 280нм. Якщо препарати ДНК є чистими, то цей показник складає 1,8 - 2, якщо препарат ДНК має домішки білку, чи фенолу, то цей показник є значно нижчим. Приклад 1. Сім'я В. (В.М., В.Н. батьки, В.Л. - мати, В.І. - батько), яка проживає у Тернопільській обл., Теребовлянському р-ні, с.м.т. Дружба, звернулася у Львівський міжобласний медико-генетичний центр з приводу верифікації діагнозу муковісцидоз. У дітей В.М. (1992 р.н.) та В.Н. (1998 р.н.) зафіксовано часті бронхолегеневі та шлунково-кишкові розлади та підвищений рівень хлоридів у поті. Усім членам сім'ї проведені молекулярно-генетичні дослідження. З цією метою виділено ДНК вище описаним методом. Взірці ДНК отримали наступну нумерацію: № 779 (В.М.), №780 (В.Н.), №781 (В.Л.), № 782 (В.І.). Концентрацію ДНК вимірювали оптичним методом: кінцева концентрація складала 176- (№779), 460- (№780), 344(№781), 310мкг/мл (№782), при коефіцієнті чистоти 2.38, 1.78, 1.85 та 2.06, відповідно. Проби ДНК піддавали ампліфікації методом ПЛР та подальшому аналізу у поліакриламідному гелі (ПААГ). Отримані результати засвідчили: 1. Наявність мутації F508del у гомозиготному стані у дітей В.М.,1992р.н. та В.Н., 1998р.н.(генотип F508del/F508del); 2. Наявність гетерозиготного носійства мутації F508del у матері В.Л., 1969 р.н. та у батька В.І., 1964р.н. (генотипи F508del/-). Приклад 2. Сім'я Д. Звернулася у Львівський міжобласний медико-генетичний центр з приводу підозри фенілкетонурії у дитини (Д.М., 1998р.н.). Сім'я проживає за адресою: Волинська обл., Турійський р-н, с.Волиця. Усім членам родини проведено виділення ДНК вище описаним методом. Препарати ДНК отримали нумерацію: № Ф68 Д.М.,1998 р.н. - дитина, Ф69 - Д.Л., 1977 р.н. - мати, Ф70 - Д.Р., 1977 р.н. - батько, концентрація ДНК в цих пробах становила 200-, 400- та 230 мкг/мл, відповідно, при коефіцієнтах чистоти 2.0-, 2.0-, 2.30, відповідно. Молекулярно-генетичні дослідження гена фенілаланінгідроксилази засвідчили наявність мутації R408W у пробанда Д.М.,1998 р.н. та у батьків Д.Л., 1977 р.н. та Д.Р., 1977 р.н. Отримані результати показали: 1. Наявність мутації R408W у дитини Д.М. в гомозиготному стані (генотип R408W/ R408W); 2. Наявність гетерозиготного носійства мутації R408W у батьків (генотипи R408W/-). Отже, пропонований метод виділення ДНК дозволяє отримувати ДНК в такій кількості і такої якості, які задовольняють подальші молекулярно-генетичні дослідження порушень геному на рівні мутацій окремих генів. Джерела інформації: 1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. / Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. 1984.- Москва «Мир».-С. 403-410. 2. Efremov G.D., Dimovski A.J., Plaseska-Karanfilska D., Simjanovska L., Sukarova E., Koceva S. PCR based methods in the detection and characterization of inherited, infectious and malignant diseases / FEBS Advanced Theoretical/Practical Course 99/16 - 1999 - Skopje. 3. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucleic Acids Research. - 1988. - Vol.16. - No 3. -P.1215.