Спосіб визначення кінуреніну

Спосіб визначення кінуреніну шляхом проведення високоефективної рідинної хроматографії, осаджування білків за допомогою трихлороцтової кислоти і виготовлення стандартних розчинів на основі розчину альбуміну, який відрізняється тим, що використовують ціаносилільну нерухому фазу з розміром частинок 7 мкм та як рухому фазу - розчин оцтової кислоти з ацетатом амонію, неполярні сполуки вилучають за допомогою гексану. (19) (21) u200908150 (22) 03.08.2009 (24) 10.02.2010 (46) 10.02.2010, Бюл.№ 3, 2010 р. (72) ВАРИНСЬКИЙ БОРИС ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ПЕНЗЕВ МИКОЛА ДМИТРОВИЧ (73) ЗАПОРІЗЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, ВАРИНСЬКИЙ БОРИС ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ПЕНЗЕВ МИКОЛА ДМИТРОВИЧ 3 47508 Хроматографічні умови: Високоефективну рідинну хроматографію проводять з використанням ціаносилільної нерухомої фази (150мм´3,3мм внутрішній діаметр, упакована частками сорбенту розміром 7мкм). Рухома фаза складається з 10ммоль/л розчину ацетату амонію, що містить 2% оцтової кислоти (рН буфера 3,1). Використовується світлофільтр прозорий в області 365нм. Аналіз проводиться на швидкості рухливої фази 0,5мл/хв. Приготування осаджувача: Водний розчин 50% (3моль/л) трихлороцтової кислоти використовується для осадження білків. Приготування стандартного розчину порівняння: Вихідний стандартний розчин з концентрацією 326,5мкмоль/л готується розчиненням кінуреніну сульфату у воді з додаванням 10% ацетонітрила як консервант (розчин А). Розчин В (концентрація 32,65мкмоль/л) готується розбавленням вихідного розчину в 10 разів, з додаванням 10% ацетонітрила як консервант. Розчин С (концентрація 16,33мкмоль/л). Стандартний розчин порівняння (концентрація 4,9мкмоль/л) готується таким чином: до суміші 3,00мл розчину С і 7,00мл 10% розчину альбуміну (70г/л, що відповідало середньому вмісту білків в плазмі крові людини) додається 1,00мл 50% розчину трихлороцтової кислоти по краплях при струшуванні. Потім центрифугується 30хв при 8000об/хв. Відбирається супернатанат і фільтрується через мембранний фільтр за допомогою пристрою для фільтрації проби. При необхідності, якщо спостерігається помутніння повторно центрифугується і фільтрується. Для вилучення неполярних сполук до супернатанату додається п'ятикратна кількість гексану. Потім ретельно перемішується протягом 1хв. Центрифугується протягом 15хв для відділення органічної фази. Потім видаляється шар гексану за допомогою медичного шприца. Очищений супернатанат вводять в хроматограф за допомогою петлевого дозатору в об'ємі 20мкл. Приготовані розчини зберігають при -20°С. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 4 Приготування досліджуваних зразків: Венозну плазму крові від добровольців збирають в пробірки. Зібрані зразки центрифугують при 3000об/хв. на протязі 10хв. Отриману плазму заморожують і зберігають при -20°С. Перед визначенням плазму розморожують при кімнатній температурі і зразки плазми депротеїнізують таким чином: додають до 1,00мл плазми 100мкл 50% розчину трихлороцтової кислоти по краплях при струшуванні. Потім центрифугують 30хв при 8000об/хв. Відбирають супернатанат і фільтрують через мембранний фільтр за допомогою пристрою для фільтрації проби. При необхідності, якщо спостерігається помутніння повторно центрифугують і фільтрують. Для витягання неполярних сполук до супернатанату додають п'ятикратну кількість гексану. Потім ретельно перемішують протягом 1хв. Центрифугують протягом 15хв для відділення органічної фази. Потім видаляють шар гексану за допомогою медичного шприцу. Очищений супернатанат вводять в хроматограф за допомогою петлевого дозатору в об'ємі 20мкл. Якісний і кількісний аналіз: Наявність кінуреніну визначають за часом виходу піку на хроматограмі. Для кількісного визначення хроматографують по черзі стандартний розчин порівняння на основі альбуміну і досліджуваний супернатанат, вимірюють довжини піків. Приклад. Визначають вміст кінуреніну в плазмі хворого на епілепсію, а саме після обробки плазми крові, як зазначено вище, та хроматографування зразка супернатанату за допомогою рідинного хроматографа компанії Laboratorni Pristroje Praha, ціаносилільної нерухомої фази з розміром частинок 7мкм, 10ммоль/л розчину ацетату амонію, що містила 2% оцтової кислоти (рН буфера 3,1) в якості рухомої фази. Отримали результат вмісту кінуреніну в плазмі хворого: 1,97±0,02мкмоль/л. Висновок хворий знаходиться в стані ремісії (за даними літератури ремісія наступає при 4,21±0,29мкмоль/л. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601