Спосіб лікування дефектів і дегенеративних захворювань хряща із застосуванням тривимірного 3-d еквівалента хряща, змодельованого на основі in vitro культивованих хондроцитів, що містяться у підкладках натуральн

Спосіб відноситься до медицини і тканинної інженерії, а саме до хірургії, та може бути використаним у травматологічних і отоларінгологічних відділеннях для лікування дефектів і дегенеративних захворювань хряща за допомогою застосування біотехнологічної продукції. Основним біотехнологічним підходом у закритті хрящови х дефектів є трансплантація одноклітинної суспензії хондроцитів в область дефекту, з наступною фіксацією періостальним фрагментом [1, 2]. Така методика є найбільш близьким аналогом методиці закриття ранового дефекту тривимірним 3-D хрящовим еквівалентом. Основним недоліком відомого способу є необхідність фіксації одноклітинної суспензії хондроцитів у місці ранового дефекту за допомогою періостальної пластинки (фрагмента), оскільки доставка одноклітинних суспензій має обмежене значення для м'язово-кісткового застосування через те, що потрібно утримувати клітини в необхідній ділянці. Ізольованим хондроцитам не вистачає щільної адгезії з ушкодженою ділянкою, і такі суспензії відтворюють фіброзний хрящ, або маленькі часточки хряща в кращому випадку. В основу запропонованого способу поставлено задачу спростити процес фіксації тривимірного тканинного еквівалента хряща в місці ранового дефекту, оскільки 3-D підкладки, що складають основу тканинного еквівалента, є корисними у встановленні просторової конфігурації нової тканини і, потенційно, здатні підсилювати дозрівання і функціонування регенерованої тканини. Поставлена задача вирішується за рахунок застосування, замість одноклітинної суспензії хондроцитів і періостального фрагмента, тільки in vitro змодельованого тривимірного 3-D хрящового еквівалента, що складається з культивованих хондроцитів, які містяться у підкладках або натурального походження - колагеновий гель із включенням глікозаміногліканів, колагеновий гель з частково демінералізованою кістковою пудрою, агарозні гелі, альгінатні намиста, фібриновий гель, гіалуронова кислота, або синтетичного походження біодеградуючі полігліколева кислота, полімолочна кислота та їх співполімери. Спосіб використовується таким чином. Хондроцити людини одержують ферментативним методом із хрящового біоптата здорової тканини, взятого при артроскопії або інших оперативних втручаннях. Первинний біоматеріал, що підлягає заборові з метою подальшого культивування, проходить обов'язкове мікробіологічне і вірусологічне тестування: аналіз сироватки крові на наявність HBs-антигену, антитіл до Вілінфекції, збудника сифілісу, антитіл до вірусу гепатиту С, гепатиту В у відповідності з чинним законодавством з обстеження донорського матеріалу. Ізоляція, культивування і пасирування хондроцитів проводять за загальноприйнятою методикою [3]. Для створення 3-D хрящового еквівалента використовують клітини 2-8 пасажів. Тривимірний еквівалент хряща готують з дотриманням стерильних умов виробництва в пластикових чашках Петрі, ін'єкційних шприцах або в будь-якій іншій, підходящої для цих цілей, тарі, шляхом змішування розчинів, приготовлених за стандартними методиками,: або колагену з включенням глікозаміногліканів [4, 5]; або колагену з частково демінералізованою кістковою пудрою [6]; або агарози [7]; або альгінату [8]; або фібрину [9]; або гіалуронової кислоти [10]; або полігліколевої кислоти [11]; або полімолочної кислоти; або співполімерів полігліколевої і полімолочної кислот [12] з суспензією культивованих хондроцитів, що одержуються за методом Green WT [3]. Виготовлений у такий спосіб еквівалент хряща або відразу трансплантується на рановий дефект, або заморожується в парах рідкого азоту за стандартною методикою і далі зберігається в низькотемпературному морозильнику при -70°С до використання. Не пізніше ніж за 24 години до трансплантації, еквівалент розморожують на водяній лазні, при температурі 37°С, заливають культуральним середовищем і культивують в стандартних умовах. Аплікацію хрящового еквівалента проводять на заздалегідь підготовлену рану під час артроскопії або інших оперативних втручаннях. Обов'язковими умовами стану рани є: відсутність бактеріальної інфекції, повне видалення некротичних і висічення рубцево-змінених тканин в області дна і країв рани. Хрящовий еквівалент переносять на рану і розміщують таким чином, щоб він не тільки заповнював рановий дефект, але й приблизно на один сантиметр закривав навколишню тканину. Джерела інформації прийняті до уваги: 1. Brittberg M., Lindhal A., Nilsson A., Ohisson, C., Isaksson О., Peterson L. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med 1994; 331: 889-895. 2. Grande D.A., Pitman M.I., Peterson L., Menche D., Klein M. The repair of experimentally produced defects in rabbit articular cartilage by autologous chondrocytes transplantation. Orthop Res 1989; 7: 208-218. 3. Green WT Jr. Articular cartilage repair: behavior of rabbit chondrocytes during tissue culture and subsequent allografting. Clin Orthop 1977; 124: 237-250. 4. de Chalain T., Philips J.H., Hinck A. Bioengineering of elastic cartilage with aggregated porcine and human auricular chondrocytes and hydrogels containing alginate, collagen, and kappa-elastin. J Biomed Mater Res 1999; 44: 280-288. 5. Scouten W.H. Matrices and immobilization methods for cell adhesion/immobilization studies. Bioprocess Technol 1995; 20: 233-265. 6. Mi zuno S., Glowacki J. A three - dimensional composite of demineralized bone powder and collagen for in vitro analysis of chondroinduction of human dermal fibroblasts. Biomaterials 1996; 17: 1819-1825. 7. Buschmann M.D., Gluzband Y.A., Grodzinsky A.J., Hunziker E.B. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. J Cell Sci 1995;108: 1497-1508. 8. Beekman В., Verzijl N., Lindenhayn К., Sittinger M., Schultz O. Matrix-mixed culture: new methodology for chondrocyte culture and preparation of cartilage transplants. J Biomed Mater Res 2000; 49: 305-311. 10. Robinson D., Halperin N., Nevo Z. Regenerating hyaline cartilage in articular defects of old chickens using implants of embryonal chick chondrocytes embedded in a new natural delivery substance. Calcif Tissue Int 1990; 46: 246-253. 11. Freed L., Langer R., Martin I., Pellis N., Vunjak-Novakovic G. Tissue engineering of cartilage in space. Proc. Natl Acad Sci 1997; 94: 13885-13890. 12. Vacanti C.A., Langer R., Schloo B., Vacanti J.P. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast Reconstr Surg 1991; 87: 753-759.