Спосіб визначення терміну придатності сухого живильного середовища для культивування мікобактерій

Спосіб визначення терміну придатності сухого живильного середовища для культивування міко Винахід, що передбачається, відноситься до ветеринарної мікробіологи та біотехнологм Термін придатності сухого живильного середовища для культивування мікобактерій, розробленого лабораторією вивчення туберкульозу Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини (ТУУ 4615 063-95) (по аналогії з Живильним середовищем для виділення мікобактерій туберкульозу, сухим (середовище Левенштейна -Ієнсена) (ФС 42-250ВС-89)) було визначено у 2 роки Якщо по закінченню гарантійного терміну придатності якість середовища не знизилась, препарат підлягає подальшому використанню При одержанні позитивних результатів повторного контролю термін придатності середовища продовжується ще на рік Існують методи визначення елективності та біологічної активності названих вище сухих живильних середовищ Для контролю використовують 2 флакони кожної дослідної сери середовища Ростові властивості сухого живильного середовища для культивування мікобактерій визначають шляхом висіву 0,1см3 мікробної 2 суспензії збудника туберкульозу бичачого (Valle) та людського (H37RV) видів з розведень 10 5 -10 6 мг/см , а також проб патологічного матеріалу від хворих на туберкульоз тварин Пробірки з висівами парафінують, переносять в термостат для культивування при 37°С протягом 60 діб Врахування росту колоній проводять через кожні 7-10 діб після висіву ДЛЯ бактерій, що включає відбір проб сухого середовища, виготовлення з них щільного середовища та культивування на ньому тест-штамів мікобактерій H-37RV, Valle, Avium-780, для контролю ростових властивостей, який відрізняється тим, що відбирають проби, які зберігались протягом шести років, а як тест-штами додатково використовують авірулентні - BCG, М scrofulaceum №31/82, М mtracellulare №78/98, штами мікобактерій Для контролю Живильного середовища для виділення мікобактерій туберкульозу, сухого (середовище Левенштейна -Ієнсена) використовують тест-культуру збуднику туберкульозу людського виду штам H37RV Розведення мікобактерій штаму H37RV роблять таким чином Стерильним бактеріологічним шпателем знімають з живильного середовища бактеріальну масу кожної тесткультури і вміщують її у окремий стерильний флакон з бусами, попередньо зважений на аналітичних вагах Флакони з бактеріальною масою знову зважують на аналітичних терезах Різниця між вагою флакона з культурою і порожнього є вагою наважки бактеріальної маси Наважку бактеріальної маси гомогенізують у флаконі з бусами в стерильному фізрозчині (рН 7,0±0,2) з розрахунку 1см3 фізрозчину на 1мг бакмаси По 1см одержаної зависі кожного виробничого штаму переносять в пробірки, в які попередньо вливають по 9см 3 стерильного ІЗОТОНІЧНОГО розчину хлориду натрію Таким чином одержують розведення 10 1 По 1см цього розведення кожної тест-культури переносять в другу пробірку з 9см 3 фізрозчину, з другої пробірки 1см3 суміші переносять в третю, з третьої - в четверту з 9см 3 фізіологічного розчину, в якій одержують розведення 10 4 3 четвертого розведення кожної виробничої культури по 1см3 зависі переносять в тт ягу пробірку з 9мл фізрозчину, одержуючи таким чином розведення 10 5 При виготовленні кожного наступного розведення використовують окрему стерильну піпетку, а мікробні суміші ретельно змішують Завись бактеріальної маси культури H37RV з ю 54991 розведень 10 3 , 10 4 , 10 5 висівають на поверхню щільного живильного в 10 пробірок по 0,1см3 в кожну Пробірки поміщають в термостат в нахиленому положенні на 24 години Через 24 години пробки пробірок з посівами над вогнем спиртівки занурюють в пробірки й заливають розплавленим парафіном Посіви шкубують в термостаті при +37°С протягом 4 тижнів Проглядають посіви через 3-5 діб Недоліками приведених способів є те, що вони досить тривалі і не дають можливості встановити фактичний термін придатності препарату В основу винаходу, що передбачається, поставлене завдання розробити Спосіб визначення терміну придатності сухого живильного середовища для культивування мікобактерій, що включає відбір проб сухого середовища, виготовлення з них щільного середовища та культивування на ньому тест-штамів мікобактерій (H-37RV, Valle, Avium-780) для контроля ростових властивостей, шляхом відбору проб, які зберігались протягом шести років, а як тест- штами додатково використовують авірулентні (BCG, М scrofulaceum №31/82, М mtracellulare №78/98) штами мікобактерій, щоб забезпечити визначення терміну придатності та внесення змін в технічну документацію на сухе живильне середовище При реалізації способу визначення терміну придатності сухого живильного середовища для культивування мікобактерій з архіву контролеру відбирали по одному флакону "Сухого живильного середовища для культивування мікобактерій" від 10 серій, виготовлених протягом одного року Відбирали проби препарату (по 10 серій кожного року виготовлення), що були виготовлені три, шість та ВІСІМ років тому Флакони з сухим живильним середовищем зберігалися в архіві за умов додержання температури 6-8°С без доступу світла В кожен флакон з препаратом додавали по 200см3 стерильної дистильованої води, після розчинення середовище розливали в бактеріологічні пробірки, закривали ватними пробками й коагулювали та стерилізували при 90°С протягом 1 години в апараті для інактивації сироватки крові (АСІС) Стерильність середовища контролювали витримкою його в термостаті протягом тижня Контроль ростових якостей та біологічної активності (елективності) готового середовища кожної дослідної серії здійснювали шляхом висіву на нього тест-штамів патогенних (H37RV, Valle) та авірулентних штамів мікобактерій (BCG, М scrofuaceum-35, M mtracellulare-23) з розведень 5 6 3 10 -10 мг бактерійної маси в 1см фізрозчину Розведення мікобактерій тест-штамів робили таким чином Стерильним бактеріологічним шпателем знімали з живильного середовища бактеріальну масу кожної тест-культури патогенних та атипових мікобактерій і вміщували и у окремий стерильний флакон з бусами, попередньо зважений на аналітичних вагах Флакони з бактеріальною масою знову зважували на аналітичних терезах Різниця МІЖ вагою флакона з культурою і порожнього є вагою наважки бактеріальної маси Наважку бактеріальної маси гомогенізували у флаконі з бусами в стерильному фізрозчині (рН 7,0±0,2) з розрахунку 1см3 фізрозчину на 1мг бак маси По 1см одержаної зависі кожного тестштаму переносили в пробірки, в які попередньо вливали по 9см3 стерильного ІЗОТОНІЧНОГО розчину хлориду натрію Таким чином було одержано розведення 10 1 По 1см3 цього розведення кожної тест-культури переносили в другу пробірку з 9см 3 фізрозчину, з другої пробірки 1см3 суміші переносили в третю, з третьої - в четверту з 9см 3 фізіологічного розчину, в якій одержували розведення 10 4 3 четвертого розведення кожної тест-культури по 1см3 зависі переносили в п'яту пробірку з 9мл фізрозчину, з п'ятої - 1мл рідини вносили в шосту пробірку, одержуючи таким чином розведення 10 та 10 6 При виготовленні кожного наступного розведення використовували окрему стерильну піпетку, а мікробні суміші ретельно змішували Завись бактеріальної маси кожного тестштаму з розведень 10 5 -10 6 висівали на поверхню готового щільного живильного середовища для культивування мікобактерій в 10 пробірок по 1см3 в кожну Пробірки поміщали в термостат в нахиленому положенні під кутом в 5° на 24 години Через 24 години пробки пробірок з посівами парафінували над вогнем спиртівки Посіви інкубували в термостаті при +37°С протягом 8 тижнів Проглядали посіви через 3-5 діб Матеріали дослідження термінів та характеру росту і культуральних властивостей тест-культур наведеш в таблиці Приклад 1 За описаною вище методикою проводили висів тест-штамів патогенних (H37RV, Valle) та авірулентних штамів мікобактерій (BCG, М scrofulaceum-35, M mtracellulare-23) з розведень 10 5 -10 6 мг бактерійної маси в 1см3 фізрозчину на готове щільне живильне середовище, виготовлене з 10 відібраних з архіву контролеру флаконів (серій) "Сухого живильного середовища для культивування мікобактерій", що були виготовлені три роки тому Контролем були висіви тестмікроорганізмів на живильне середовище, виготовлене в поточному році Результати досліджень наведені в таблиці Матеріали таблиці свідчать про те, що терміни початку, інтенсивність та характер росту тест-культур дослідних серій не відрізняються від контролю Таким чином, сухе живильне середовище, виготовлене 3 роки тому цілком придатне до використання - забезпечує ріст тестштамів патогенних і авірулентних та атипових мікобактерій Приклад 2 За описаною методикою проводили висів тест- штамів патогенних (H37RV, Valle) та авірулентних штамів мікобактерій (BCG, М scrofulaceum-35, M mtracellulare-23) з розведень 10 5 -10 6 мг бактерійної маси в 1см3 фізрозчину на готове щільне живильне середовище, виготовлене з 10 відібраних з архіву контролеру флаконів (серій) "Сухого живильного середовища для культивування мікобактерій", що були виготовлені шість років тому Контролем були висіви тест-штамів на живильне середовище, виготовлене в поточному році Результати досліджень наведені в таблиці Матеріали таблиці свідчать про те, що терміни початку, інтенсивність та характер росту тесткультур дослідних серій не відрізняються від контролю Таким чином, сухе живильне середовище, виготовлене 6 років тому придатне до використання - забезпечує ріст тест-штамів патогенних і аві 54991 рулентних мікобаїсгерій ніше, а інтенсивність росту менша, тому сухе жиПриклад 3 За описаною методикою проводивильне середовище, що зберігалось 8 років, не ли висів тест- штамів патогенних (H37RV, Valle) та придатне до використання авірулентних штамів мікобактерій (BCG, Таким чином, спосіб визначення терміну приМ scrofulaceum-35, M mtracellulare-23) з розведень датності сухого живильного середовища для куль5 6 10 -10 мг бактерійної маси в 1см фізрозчину на тивування мікобактерій, що пропонується, дає моготове щільне живильне середовище, виготовлене жливість визначити фактичний термін придатності з 10 відібраних з архіву контролеру флаконів (сесухого живильного середовища для виділення та рій) "Сухого живильного середовища для культикультивування мікобактерій Його використання вування мікобактерій", що були виготовлені ВІСІМ дозволяють внести зміни в технічну документацію років тому Контролем були висіви тест-штамів на на препарат "Сухе живильне середовище для живильне середовище, виготовлене в поточному культивування мікобактерій" (ТУУ 46 15 063-95) і році Результати досліджень наведені в таблиці продовжити термін його використання до 4 років (з Матеріали таблиці свідчать про те, що терміни урахуванням положення, що при одержанні позипочатку та інтенсивність росту тест-штамів дослідтивних результатів повторного контролю препараних серій відрізняються від контролю Ріст тестту, що зберігався 4 роки, термін придатності серекультур на живильному середовищі, яке зберігадовища продовжується ще на 1 рік) лося в архіві контролеру 8 років починається пізТаблиця Терміни росту Тест-штами мікобактерій Початок росту (через діб) Характеристика колоній та форма росту MbovisfValle, BCG) R-форма (сухі, шорохуваті) М tuberculosis (H17RV) 11,0±2,0 25,0±0,6 R-форма (сухі, шорохуваті) М avium (780) 11,7±0,8 20,9±0,8 S-форма (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) М scrofulaceum 10 29,0±0,4 10,б±0,8 19,б±0,4 S-форма (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) М intracellulare Врикіад 1( препарат зберігався З роки) 19,2г0,б 11,4±0,4 21,8*1,4 S-форма (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) ~Mbovis(VaUe, BCC.) ~~ 10,0±2,0 26Д±1,0 R-форма (сухі, шорохуваті) М avium (780) 11,4±0,86 20,8±0,75 S-форма (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) М scrofulaceum 11,7±О,3 20,0±0,7 S-форш (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) М intracellulare Прикіад З (npt-гырат зберіг ївся і років) 29,3±0,3 М tuberculosis (H37RV) їїрик гад 2 (препарат 18,7±0,7 R-форма (сухі, шорохуяаті) 12,7±0,7 20,3±L7 S-форма (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) 27,5+0,9 37,4+0,95 R-форма (сухі, шорохуваті) 10 Кількю ть серій прелар ату Терміни росту 19,9±0„8 Інтенсивний ріст (через діб) 35,б±О,3 М avium (780) 18,9±1,1 33,І±0,5б S-форма (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) М scrofulaceum 17,б±0,4б S-форма (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) М intracellulare Приклади 17,О±О,45 27,3±0,5 S-форма (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) М bovis(Valle, BCG) 18,S±0,4 29,5±0,7 R-форма (сухі, шорохуваті) М tuberculosis (H47RV) 11,7±0,7 24,8±1Д R-форма (сухі, шорохуваті) М avium (780) 10,4±0,54 21,1+ЛД S-форма (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) М scrouslaceum П,2±0,б4 19,8±0,12 S-формз (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) М mt race llul are 9,4±0,8 22Д±0,45 S-форма (гладкі, м'які, закруглені, випуклі) Тест-штами \*іксбактерій М tuberculosis (H37RV) Контроль (Суке ж и м гьне и редивище для к \ л ы ивувзння мікобактерій поточного року виюювлення) 10 Початок росту (через діб) Характеристика колоній R-форма (сухі, шорохуваті) 54991 Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24