Живильне середовище для виділення і пересівання чистих культур вищих базидіоміцетів

Винахід відноситься до біотехнології і може бути використаний у науково-дослідних і промислових мікологічних лабораторіях для отримання з плодових тіл і пересівів чистих культур ви щих дереворуйнівних базидіоміцетів-продуцентів біологічно активних речовин для різних галузей промисловості, втому числі харчової і фармакологічної. Оптимізація умов штучного культивування та вивчення фізіологічно активних речовин базидіоміцетів перспективних об'єктів біотехнології є одним з важливих напрямків розвитку сучасної біології [1-6, 7, 9, 13]. Відоме живильне середовище для роботи з чистими культурами вищих базидіоміцетів - об'єктів промислового вирощування: гливи звичайної, печериці садової, зимового гриба і інших видів [10, 12]. Середовище містить малокоштовні і доступні компоненти: ростки картоплі, плоди лоху вузьколистого (Eleagnaceae angustifolia L.), агар-агар та воду. До недоліків відноситься відсутність даних з вмісту у живильному середовищі цукристих і білкових речовин - головних джерел вуглецевого і азотного живлення макроміцетів. Як слідство, не можливо порівняти його з відомими стандартними живильними середовищами. Живильне середовище для оновлення колекції штамів грибів роду глива містить відвар плодів кінського каштану (Aesculus hippocastanum L.) і плоди лоху вузьколистого (Eleagnaceae angustifolia L.), агар-агар та воду [11]. Тут, як і в попередньому випадку, відсутні дані з рівня вмісту цукристих і білкових речовин. Відомі агаризовані живильні середовища невизначеного складу: глюкозо - картопляний агар (ГКА), суслоагар (СА), картопляний агар (КА) та інші [8, 9]. Застосування цих живильних середовищ для виділення та вирощування міцеліальних культур макроміцетів обмежується коштовністю і малодоступністю компонентів знехміленого пивного сусла, глюкози, бульб картоплі. Картопляний агар, сусло-агар і картопляний агар близькі між собою за вмістом сухи х речовин (4-6%) і агар-агару (1,5-2%). Найбільш близьким за технічною суттю і досяжності результату є живильне середовище сусло-агар, яке містить знехмілене пивне сусло 4° за Баллінгом і широко застосовується у мікологічній практиці [10]. Приготування живильного середовища СА за прототипом дозволяє контролювати вміст поживних речовин, але потребує включення у його склад малодоступного знехміленого пивного сусла. В основу винаходу поставлено завдання створення живильного середовища для виділення і пересівів чистих культур ви щих базидіоміцетів – перспективних продуцентів фізіологічно активних речовин. Поставлене завдання вирішується тим, що живильне середовище для виділення і пересівів чистих культур ви щих базидіоміцетів, яке вміщує агар-агар і дистильовану воду згідно винаходу додатково містить відвар зерна ячменю при наступному співвідношенні компонентів, %: агар-агар 1,0-1,5 відвар ячменю 25,0-50,0 вода решта Експериментальні дані з лінійної швидкості росту (ЛШР) штамів їстівних грибів Р-01, НК-35 гливи звичайної - Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm., P-fl гливи флоридської - Pleurotus floridae, F-1, F-вв зимового опенька - Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing., Б-003, Б-004, Б-014 спарасису кучерявого - Sparassis crispa (Fr.) Fr. надані в таблиці. Використовували агаризований відвар ячменю в розведенні з водою 1:1® живильне середовище 1, 1:2 ®2 та 1:3®3, в якості контрольного середовища - сусло-агар. Температура культивування чистих міцеліальних культур їстівних макроміцетів була оптимальної для кожного штаму: гливи звичайної і флоридської - 27,5°С, зимового опенька -24,0°С і спарасису кучерявого -28,0°C. Результати лінійної швидкості росту штамів на дослідних і контрольному живильних середовищах свідча ть про наступне. Для виділення і вирощування штамів гливи звичайної найбільш придатні середовища 2 і 3; для гливи флоридської - всі три середовища достовірно не відрізнялися і були кращими за СА. Ріст культур зимового опенька на дослідних і контрольному середовищах достовірно не відрізнялись, а за рівнем ЛШР були кращими на середовищах 1 і 13. Штами спарасісу кучерявого достовірно швидко росли на середовищах 3 і СА, кращим для їх росту був сусло-агар. Таблиця Лінійна швидкість росту штамів їстівни х грибів на різних агаризованих поживних середовищах Штам 1 Р-01 НК-35 P-f1 F-вв F-1 Б-003 Б-004 Б-014 10,03±0,390 8,45±0,264 9,06±0,184 6,33±0,441 6,21±0,570 8,78±0,987 12,41±0,300 10,37±0,049 Живильне середовище 2 3 Швидкість росту, мм/добу 11,14±0,195 10,44±0,195 9,55±0,122 10,17±0,144 9,42±0,335 8,97±0,074 5,30±0,723 6,11±0,241 5,97±0,215 6,06±0,573 10,67±0,520 12,11±0,140 13,05±0,223 14,83±0,780 11,17±0,419 13,39±0,388 СА 7,83±0,288 7,00±0,140 7,08±0,250 5,53±0,480 5,11±0,503 12,31±0,361 14,95±1,163 15,69±0,326 Приклад конкретного виконання 1. Отримати агаризоване середовище для пересівів їстівних макроміцетів на основі ячмінного відвару [8]. Ячмінне зерно заливають водою у співвідношенні 1:1 і відварюють у відповідності до вимог отримання зернового міцелію, що існують у мікологічних виробничих або науково-дослідних лабораторіях. Відвар фільтрують на скляній воронці через ватяно-марлевий фільтр. Відвар зерна ячменю у ваговому співвідношенні зерна з водою 1:1, отримують як побічний продукт при приготуванні зернового міцелію. Відвар має вміст цукристих речовин на рівні 3,6-3,8° за Баллінгом і водорозчинних білкових речовин - 48,0-62,0мг/мл. Вміст білку визначали за допомогою кількісного спектрофотометричного аналізу на спектрофотометрі СФ-26, вимірюючи поглинання білків при 280нм та нуклеїнових кислот при 260нм. До фільтрованого відвару додають дистильовану, або водопровідну воду до потрібного розведення в залежності від виду гриба і 10-15г мікробіологічного агар-агару. Розчиняють агар-агар при слабкому підігріві суміші. Отримане живильне середовище розливають в лабораторні пробірки або чашки Петрі і стерилізують в автоклаві при тиску 1,5±0,2атм, температурі 128±2°С протягом 45-60хв. Пробірки після стерилізації розкладають на похилі штативи , агаризоване середовище охолоджують і застуджують на косяки. Через троє діб, контролю стерильності середовища, косяки засівають чистими культурами штамів їстівних грибів. Для засіву беруть шматочки міцелію розміром близько 5х5мм штамів їстівних макроміцетів, наприклад гливи звичайної - Pleurotus ostreatus, гливи флоридської - Pleurotus floridae, зимового опенька - Flammulina velutipes, спарасису кучерявого - Sparassis crispa та інші. Чисті культури, їх пересіви в якості маточного інокуляту получають на 7-10 добу, в залежності від ЛШР штаму та швидкості заростання середовища (таблиця). Приклад конкретного виконання 2. Отримати агаризоване середовище для виділення їстівних макроміцетів на основі ячмінного відвару [8]. Виконуються всі технологічні прийоми, які описані в прикладі 1, склад середовища у відповіді до виду гриба (таблиця). Після контролю стерильності середовища, косяки інокулюють шматочками різних частин свіже зібраних плодових тіл їстівних грибів, які відбирають з середини шляпки чи ніжки та обробляють перекисом водню для стерилізації їх поверхні. Для засіву беруть шматочки плодових тіл розміром близько 5х5мм їстівних макроміцетів, наприклад гливи звичайної - Pleurotus ostreatus, гливи флоридської - Pleurotus floridae, зимового опенька -Flammulina velutipes, спарасису кучерявого - Sparassis crispa та інші. Після початку росту міцелію, слідкують за його ростом, видаляють пробірки з зараженням бактеріями чи іншими грибами. Після 12-15 діб відбувається повне заростання середовища і отримана чиста культура макроміцету придатна для подальшої роботи чи зберігання. Приклад конкретного виконання 3. Отримати агаризоване середовище для вивчення культуральноморфологічних властивостей їстівни х макроміцетів на основі ячмінного відвару [8]. Виконуються всі технологічні прийоми, які описані в прикладі 1, склад середовища обирається згідно виду гриба. Живильне середовище розливають у пробірки чи чашки Петрі, стерилізують. Середовище засівають шматочками агаризованого середовища з чистою культурою і досліджують згідно мети і методів дослідження [3, 8]. Таким чином, отримане живильне середовище на основі відвару зерна ячменю - побічного продукту технології приготування зернового міцелію забезпечує, порівняно з прототипом, економію дефіцитного і малодоступного компоненту - знехміленого пивного сусла і здешевлює його виробництво. Нове середовище придатне для виділення і вирощування штамів різних їстівних грибів. Розробка живильного середовища на основі відвару ячмінного зерна дозволяє проводити його виготовлення безпосередньо в мікологічних лабораторіях грибівницьких підприємств з використанням побічного продукту, що значно спрощує і здешевлює виробництво, скорочується час приготування середовища. Джерела інформації, які використані при складанні заявки 1. Белова Н.В., Ефремова И.Я. Препараты из высших грибов - объект патентно-правовой охраны // Микология и фитопатология. - 1992. - 26, вып.4. - С.321-324. 2. Бисько Н.А., Дудка И.А. Биология и культивирование съедобных грибов рода вешенка. - К.: На ук. думка, 1987. - 148с. 3. Бисько Н.А., Бухало А.С., Вассер С.П. и др. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. - К.: Наук. думка, 1988. - 144с. 4. Бухало А.С. С учасні тенденції культивування грибів з роду Pleurotus (Fr.) Quel. II Укр. ботан. журн. 1990, т.47, №2. - С.101-103. 5. Бухало А.С., Соломко Е.Ф., Митропольская Н.Ю. Базидіальні макроміцети з лікарськими властивостями // Укр. ботан. журн. - 1996. - 53, №3. - С.192-201. 6. Даниляк M.I., Решетников С.В. Лікарські гриби. Медичне застосування та проблеми біотехнології. - К.: Інститут Ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, 1996. - 65с. 7. Дудка И.А., Вассер С.П., Бухало А.С. и др. Промышленное культивирование съедобных грибов. - К.: Наук. думка, 1978. - 264с. 8. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник. - К.: Наук. думка, 1982. - 550с. 9. Дудка И.А., Бисько Н.А., Билай В.Г. Культивирование съедобных грибов. - К.: Урожай, 1992. - 160с. 10. Патент 29725 А України. Живильне середовище для роботи з чистими культурами вищих базидіоміцетів - об'єктів промислового вирощування / Сичов П.А., Негруцький С.Ф., Ткаченко Н.П., Тимофеев О.А., Каліберда Г.В. Заявка №97020763 від 21.02.97, 6 A01G1/04, C12N1/14 (прототип). 11. Патент 29744 А України. Поживне середовище для оновлення колекції штамів грибів роду глива / Сичов П.А., Тимофеев О.А., Каліберда Г.В., Гарджала Л.І., Загуменний Р.А. Заявка №97041764 від 15.04.97, 6 A01G1/04, C12N1/14. 12. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник - М.: Агропромиздат, 1990. - 240с. 13. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности // ВНИСЭТИ: Обзорная информация, сер.3. - М., 1985. - 48с.