Імуноферментний діагностикум для визначення специфічних антитіл проти вірусу сказу

Винахід відноситься до галузі ветеринарної медицини, а саме до визначення антирабічних антитіл методом імуноферментного аналізу. Відомий спосіб визначення антирабічних антитіл за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА), який вибраний у якості прототипу (Наставление по применению набора препаратов для выявления антирабических антител методом иммуноферментного анализа: ВНИВИ, 1997), в якому використовують культуральний вірус сказу, штам "Овечий" ДНКІ, отриманий на культурі клітин ВНК-21, інактивований, очищений та концентрований ацетатом цинку за Skol F (1975). Недоліком відомого способу є те, що напруженість імунітету у вакцинованих тварин визначається лише у титрах ІФА, що не дає змогу стандартизувати всі отримані результати у міжнародних одиницях. Винаходом ставиться завдання розробки тест-системи на основі імуноферментного аналізу для визначення гуморальних антитіл та напруженості імунітету проти сказу у міжнародних одиницях. Поставлене винаходом завдання досягається тим, що у імуноферментному діагностикумі для визначення специфічних антитіл проти вірусу сказу, що включає аналіз сироваток крові на наявність антитіл до вірусу сказу та визначення рівня напруженості імунітету, згідно винаходу очищення та концентрування антигену (вірус сказу штам "Щолково-51 К"), призначеного для сенсибілізації імунологічних планшетів, проводять за допомогою поліетиленіміну, застосовують референс-сироватку під час визначення напруженості імунітету вакцинованих проти сказу тварин у міжнародних одиницях, тестують лише одне розведення досліджуваної сироватки, у якості кон'югату використовують рекомбінантний білок А помічений пероксидазою. Приклад. Імуноферментний діагностикум визначення специфічних антитіл проти вірусу сказу призначений для аналізу сироваток крові на наявність антитіл та напруженості імунітету проти сказу у собак, котів, лисиць, вовків, кролів, корсаків, мишей, морських свинок. Головний компонент набору - імуносорбент що являє собою рабічний антиген (концентрований за допомогою поліетиленіміну у 50 разів культуральний вірус сказу, штам "Щолково-51К"), фіксований на поверхні лунок полістиролових планшетів. При внесенні зразків сироваток в лунки таких планшетів специфічні до вірусу сказу антитіла зв'язуються з антигеном на твердій фазі, утворюючи комплекси антиген-антитіло. Після відмивання від незв'язаних компонентів в лунки планшетів вносять антивидовий iмуноферментний кон'югат, помічений пероксидазою, який зв'язується із специфічними імунними комплексами. Після відмивання незв'язаного кон'югату в лунки додають розчин ортофенілендіаміну (ОФД). Пероксидазну реакцію зупиняють додаючи стоп-реагент. Оптична густина суміші в лунках при довжині хвиль світла 492нм відносно 620нм пропорційна концентрації специфічних до вірусу сказу антитіл у зразках сироваток крові. Таблиця Склад набору розчинів (з розрахунку на два планшети) № флакону 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Назва компонентів Концентрат розчину для промивання планшетів Імуносорбент Розчин для робочого розведення сироваток Розчин для розведення кон'югату Концентрат розчину для приготування хромогену Кон'югат iмуноферментний Хромоген (ОФД) Референс-сироватка (К+) Негативна контрольна сироватка (К-) Стоп-реагент (H2SO4) Кількість 2фл. по 16мл 2 планшети 4фл. по 12мл 2фл. по 10мл 2фл. по 3мл 2амп. по 0,05мл 2 таблетки 2амп. по 0,1мл 2амп. по 0,1мл 1фл. 12мл Послідовність операцій та їх зміст для роботи з одним планшетом. Перед проведенням операцій тестсистему витримують при кімнатній температурі протягом 30хв. Приготовляють розчин №1 для промивання планшетів. Вміст одного флакону концентрату розчину інтенсивно струшують і розводять у 700мл дистильованої води. Якщо концентрат розчину кристалізований, його перед застосуванням прогрівають при температурі 35..37°С до повного розчинення кристалів. Виймають полістироловий планшет з упаковки, вносять в усі лунки по 300мкл розчину №1, витримують планшет залитим 30..40 секунд, видаляють розчин з лунок промивачем, або восьмиканальною піпеткою. Вносять в усі лунки розчин №3 по 120мкл з метою додаткової "забивки" поверхні лунок планшету, накривають кришкою планшет і витримують 30хв при температурі 22°С у темному приміщенні. Розчин видаляють з планшета і промивають його чотири рази розчином №1. В лунки В1, В2, С1, С2, D1, D2, Е1, Е2, Е3, F1, F2, F3, G1, G2, G3, Н1, Н2, Н3 вносять по 100мкл розчину №3. В лунки Α1, Α2 вносять по 180мкл розчину №3, в усі інші лунки-розчину №3 по 90мкл. В лунки А1, А2 вносять по 20мкл референс-сироватки (К+, гіперімунна сироватка кроля, активність якої визначена у міжнародних одиницях проти міжнародного стандарту у реакції нейтралізації на білих мишах), ретельно перемішують, відбирають по 100мкл з лунок А1, А2 і переносять в лунки В1, В2 і так далі, з лунок Н1, Н2 100мкл видаляють. Кожне розведення здійснюють користуючись окремим наконечником! В лунки A3, В3, С3, D3 вносять по 10мкл негативної контрольної сироватки (К-). Залишають без зразків лунки Е3, F3, G3, Н3 для визначення контролю кон'югату (КК). Досліджувані зразки сироваток вносять по 10мкл у лунку, при цьому на кожен зразок відводять по дві лунки. Після внесення зразка розчин у лунці ретельно перемішують. Кожен зразок вносять окремим чистим наконечником. Планшет накривають кришкою і інкубують його при 37°С протягом години. Для приготування розчину кон'югату в ампулу з кон'югатом вносять 0,3мл розчину №4 для його розведення. Після повного розчинення вміст ампули переносять у флакон №4 і ретельно перемішують. Процедуру повторюють тричі до повного вилучення кон'югату з ампули. Після інкубації видаляють сироватки з планшету за допомогою промивача і промивають лунки планшету розчином №1 шість разів, позбавляються вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу. При виконанні всіх промивок планшетів спочатку заповнюють всі ряди лунок планшета по 300мкл промивочним розчином і лише потім його видаляють. Таблиця Схема заповнення лунок планшета компонентами реакції А В С D Е F G Η 1 Р8 1/10 Р8 1/20 Р8 1/40 Р8 1/80 Р8 1/160 Р8 1/320 Р8 1/640 Р8 1/1280 2 Р8 1/10 Р8 1/20 Р8 1/40 Р8 1/80 Р8 1/160 Р8 1/320 Р8 1/640 Р8 1/640 3 Р9 1/10 Р9 1/10 Р9 1/10 39 1/10 4 С1 1/10 С2 1/10 С3 1/10 5 С1 1/10 С2 1/10 С3 1/10 6 7 8 9 10 11 12 КК КК КК КК Де: Р8- реагент №8 (референс-сироватка), Р9 - реагент №9 (негативна контрольна сироватка), С1, С2, С3...- досліджувані сироватки, КК - контроль кон'югату. В усі лунки промитого і обезволоженого планшету вносять по 100мкл розчину кон'югату, накривають планшет кришкою і інкубують його при 37°С у термостаті протягом 40хв. Видаляють розчин кон'югату з лунок планшету, планшет промивають шість разів розчином №1 і позбавляються зайвої вологи. Використовуючи час промивки планшета вошером готують розчин проявника. Для цього у флакон №7 вносять вміст флакону №5 і інтенсивно струшують (розчин не підлягає зберіганню). Дальше в усі лунки планшету вносять по 100мкл проявника, накривають планшет кришкою і інкубують його при 18...22°С в темному місці протягом 20хв. Зупиняють пероксидазну реакцію внесенням до всіх лунок планшету по 50мкл розчину сірчаної кислоти і не більш ніж через 1 хвилину визначають оптичну щільність у двохвильовому режимі (492нм відносно 620нм). При спектрометричному обліку проведення аналізу вважається коректним, якщо середнє значення оптичної щільності в лунках з негативним контролем (ОЩ К-) не вище 0,15, середнє значення в лунках А1, А2, (ОЩ К+) не нижче 2,0, а середнє значення ОЩ в лунках з кон'югатом (ОЩ КК) не ви ще 0,1. Результати тестування вважаються позитивними, якщо значення ОЩ досліджуваного зразка більше ОЩ К-+0,1. Всі інші результати вважаються негативними. Набір може бути використаний в процесі організації та проведення заходів щодо ліквідації сказу серед диких тварин - основного резервуару інфекції у природі, а також для визначення титру антитіл (напруги імунітету) у щеплених домашніх тварин (собаки, кішки) та лабораторних тварин (кролі, білі миші) в процесі одержання антирабічних сироваток.